ШТАММ БАКТЕРИЙ ARTHROBACTER TERREGENS ВСБ-570 - ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА И БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C12P21/00 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/06 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и касается получения кормового и технического белка на отходах сельского хозяйства и промышленности при использовании в качестве продуцента белка высокобелкового бактериального штамма Arihrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180.

Известно, что крупнотонажные заводы по производству белка как на растительных гидролизах, так и на углеводородах нефти в качестве продуцента белка использовали дрожжи видов: C.tropicalis, C.scottii, C.utilis, которые обеспечивают содержание сырого протеина в готовом продукте 46-56% на гидролизатах, дрожжи р. Candida 58-63% на парафинах [1,2]. Недостатком изобретения штаммов дрожжи рода Candida является относительно малое содержание сырого протеина в готовой продукции, слабый рост гидролизных дрожжей на отходах мясной, жировой промышленности и сырой нефти.

Изыскание дополнительных источников углерода для получения кормового белка для животноводства или технического белка для железобетонных конструкций или асфальта позволит его дефицит в стране. Различные отходы сельского хозяйства (отруби, некондиционное зерно,гидролизаты растительных материалов с повышенным содержанием таких ингибиторов, как фурфурол, летучие кислоты), отходы мясной и жировой промышленности позволяют решить несколько важнейших народно-хозяйственных задач: с одной стороны расширение дешевого ассортимента углеродного источника питания для получения дефицитного белка, с другой - экологические, снижение нагрузки на очистные сооружения предприятий.

Техническим результатом изобретения является повышение качества выпускаемой продукции по содержанию белка и выхода готовой продукции на различных отходах сельского хозяйства и промышленности.

Данный технический результат достигается путем применения высокоскоростной и высокобелковой непатогенной культуры Arthrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180.

Бактериальная культура Arthrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180 выделена как сопутствующая микрофлора при технологическом выращивании в непрерывном процессе дрожжей р.Candida maltosa на сырой Мангышлакской нефти. Штамм идентифицирован по определителю Берги (1980) как Arthrobacter terregens ВСБ-570 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика за номером ВКПМ-S-1180, в коллекции ГосНИИсинтезбелок хранится за N ВСБ-570.

Морфологические признаки: старые культуры состоят главным образом из кокковидных клеток, одиночных соединенных в пары или в виде скоплений, при пересевах на свежую среду рост происходит путем увеличения кокковидных клеток, после чего один или иногда оба конца клетки удлиняются, в результате образуются палочки. Размножаются делением. Палочки неподвижны, эндоспор не образуют. Размер клеток: кокков 0,63х0,63 мк, 0,63х0,77 мк и палочек 1,25х0,91 мк до 1,75х2,1 мк. Колонии на мясопептонном агаре (МПА) мелкие, от точечных до 2 мм, круглые, край гладкий, поверхность гладкая, слегка блестящая, приподнятая к центру, сероватого цвета. На МПБ рост в виде очень тонкой пленки по всей поверхности, муть слабая, осадок средний величины серовато-белого цвета, окраска по Граму положительная.

Физиологические признаки: аэроб, максимум роста при температуре 28-34^oC, pH среды 6,8-7,2. При посеве уколом в столбик мясо-пептонную желатину (МПЖ) рост наблюдается на поверхности в виде шляпки, укол четкий, нитевидный. Разжижения желатины не наблюдается, молоко лакмусом восстанавливает, свертывания молока не наблюдается. Содержание Г+Ц в ДНК в пределах 60-72 мол.%. Из углеродов ассимилирует; глюкозу, маннозу, сахорозу, мальтозу, галактозу, ксилозу, 1-арабинозу, рафинозу. Активно развивается на минеральной среде с автолизатом с использованием в качестве единственного источника углерода растительные отходы (рисовая, кукурузная лузга, кочерыжки, отруби, дефектное зерно), парафины широкой фракции, нефть, нефтяной дистиллят, этиловый спирт, отходы мясной и жировой промышленности.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Периодическое культивирование проведено в качалочных колбах на минеральной среде N 10 следующего состава: (NH₄)₂SO₄ 3 г/л, KH₂PO₄ 6,5 г/л, MgSO₄ 0,7 г/л, и микроэлементы FeSO₄ 12,5 мг/л, ZnSO₄ 12,5 мг/л, MnSO₄ 12,5 мг/л, CuSO₄ 3 мг/л, при температуре 30-32^oC, pH среды 7,0. В качестве источника углерода использовали отходы мясной и жировой промышленности в концентрации 20 об. % следующего состава: содержание жира 2 г/л (липопротеиновые вещества), взвешенных веществ 3 г/л, ХПК 4000 мг/л, БПК₅ 1500 мг/л. Выращивание в течение 48 ч на круговой качалке с 220 об/мин. Засев осуществляли по оптической плотности 0,1 ед односуточной культурой, смытой с МПА. В результате ферментации получили 3,9 г АСВ/л, снижение ХПК 90-100 мг/л, БПК₅ 10 мг/л.

Высушенная при 80^oC в сушильном шкафу биомасса характеризуется содержанием, %: сырого протеина 67, истинного белка 47-48, липидов 3, золы 7, влаги 8,3.

Пример 2. Периодическое культивирование проведено в качалочных колбах на минеральной среде, указанной в примере 1, в качестве источника углерода использовали гидролизат Краснодарского химкомбината следующего состава: редуцирующих веществ 3,5%, азота 4,74 г/л, фосфора 120 мг/л, фурфурола 0,01% летучие кислоты 0,34%, сухих веществ 1,61%, pH среды 6,85. Температура культивирования 32-34^oC, засевной материал вносили в виде односуточной суспензии штамма бактерий Arthrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180 по оптической плотности 0,1 ед.

В результате ферментации получили концентрацию биомассы 4,85 гАСВ/л следующего качества: содержание сырого протеина 68%, истинного белка 49%, липидов 8,3%. Штамм Arthrobacter terregens ВСБ-570 устойчив к таким ингибиторам как фурфурол и летучие кислоты.

Пример 3. Штамм бактерий Arthrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180 выращивали в камеральных условиях в периодическом режиме культивирования при температуре 30-32^oC, pH среды 6,8-7,0, в качестве источника углерода использовали отруби 5 вес.% или некондиционное зерно 5 вес.%, которые характеризуются по содержанию легкогидролизованные полисахариды 51,9 г/л, трудногидролизованные полисахариды 15 г/л, азот общий 2,7 г/л, клетчатка 1,1%, крахмал (связанные моносахара) 4,4%, зола 5,4%. На 100 мл воды кроме источника углерода дополнительно внесено 100 мг (NH₄)₂SO₄, 200 мг K₂HPO₄. Засев производился по оптической плотности 0,1 ед односуточной культурой бактерий Arthrobacter terreegens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180. В результате ферментации (36 ч) биомассу отделяли центрифугированием, сушили при 70^oC в сушильном шкафу, которая характеризуется содержанием сырого протеина 45-48%. Штамм бактерий обеспечил более глубокую утилизацию редуцирующих веществ до 0,06 г/л, углеводов до 0,95 г/л. В результате периодического эксперимента в лабораторных и камеральных условиях установлено, что штамм Authrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180 активно растет на отрубях и некондиционном зерне.

Пример 4. Эксперимент проведен в камеральных условиях в типовом ферментере объемом 10 л на питательной среде следующего состава, в г/л:
Ортофосфорная кислота (70%) - -2,5
Хлористый калий - 1,14
Сернокислый магний - 0.55
Сернокислое железо - 0,046
Сернокислый цинк - 0,033
Сернокислая медь - 0,004
Сернокислый марганец - 0,026
Азот в количестве 2,45 г/л подают в виде 6%-ного водного раствора аммиака, одновременно используя его для регулирования pH среды в интервале 6,8-7,0.

Температура ферментации 30-32^oC, pH среды 6,8-7,0. В качестве источника углерода использована сырая нефть в концентрации 1 об.% односуточный засевной материал вносился с качалочных колб в концентрации 0,4 г/л прессованной биомассы. При скорости протока среды Д = 0,25 ч^-1 достигли продуктивности ферментера 3,6 кг/м³/ч, выход от содержания н-алканов в сырье равен 97%.

Полученная биомасса характеризуется содержанием, в %: сырого протеина 68, истинного белка 51,2, липидов 6,0, углеводов 5,38, зола 11,7, влага 4,3, нуклеиновые кислоты 9,0, содержание серосодержащих аминокислот 2,3 к АСВ. Биомасса, полученная на нефти при мягкой сушке, может быть использована как биопрепарат для очистки от нефтепродуктов и для технических целей.

Таким образом предлагаемый штамм бактерий Arthrobacter terregens СВБ-570-ВКПМ-S-1180 обеспечивает получение дополнительного кормового вещества для животноводства на отходах мясной и жировой промышленности, сельского хозяйства: отруби, некондиционное зерно, гидролизаты растительных материалов с содержанием таких ингибиторов, как фурфурол, летучие кислоты.

При культивировании предлагаемого штамма бактерий на сырой нефти можно получить при мягкой сушке биопрепарат для очистки от нефтепродуктов и технический белок.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: мезофильный штамм бактерий Arthrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180, активно развивающийся на различных отходах: сельского хозяйства: отруби, некондиционное зерно, растительные гидролизаты, мясной и жировой промышленности, обеспечивает 15-20% более высокое содержание сырого протеина по сравнению с дрожжами вида C. maltosa (salmonicola), C. tropicalis, C. scottii, C. utilis. Штамм способен расти на сырой нефти, а высушенная в мягких условиях биомасса может быть использована как биопрепарат для очистки загрязненной почвы от нефтепродуктов. Биомасса, высушенная в жестких условиях, может быть использована для технических целей.

Штамм бактерий Arthrobacter terregens ВСБ-570-ВКПМ-S-1180 продуцент белка и биопрепарата для очистки от нефтепродуктов.