БИОРАЗЛАГАЕМАЯ ДВУХСЛОЙНАЯ МАТРИЦА ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ПОСЛЕХИРУРГИЧЕСКИХ СПАЕК, В ЧАСТНОСТИ, ПРИ ГЕРНИОПЛАСТИКЕ Российский патент 2024 года по МПК A61L31/06 A61L31/10 A61L31/14 

Настоящее изобретение относится к биоразлагаемой двухслойной матрице для предотвращения образования послеоперационных спаек, в частности, после восстановления мягких тканей в результате абдоминальной хирургической операции, например, при герниопластике в теле млекопитающего, как заявлено в пункте 1 формулы изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения биоразлагаемой матрицы, определенному в пункте 10 формулы изобретения.

После любой травмы ткани обычно следует заживление, которое, как правило, сопровождается образованием коллагеновой рубцовой ткани. Любая физическая, химическая или лучевая травма биологической ткани, состоящей из различных клеток, внеклеточного матрикса и соединительной ткани, может привести к гибели указанных клеток и структур. Процесс заживления поврежденных тканей включает различные стадии, которые также встречаются при воспалительных процессах. В частности, первые стадии при заживлении ран включают удаление некротических тканей, мертвых клеток и клеточного дебриса. На второй стадии удаленные ткани заменяются, помимо прочего, воспалительными клетками и фибробластами, которые отвечают за выработку коллагена в его различных формах, что приводит к образованию рубцовых тканей. Такое образование рубцов является необходимым для закрытия дефекта мягких тканей. Однако при повреждении двух или более тканей, находящихся в непосредственной близости друг к другу, процесс рубцевания также может привести к образованию нежелательного соединения изначально отдельных тканей. Такое соединение обычно называют с пайкообразованием.

При хирургических процедурах множественная травма тканей обычно происходит преждевременно и/или вызвана разрезом, сделанным хирургом для достижения области хирургического вмешательства. Вследствие этого послеоперационные спайки между тканями и/или органами являются одним из наиболее частых осложнений, возникающих после любого типа хирургического вмешательства. Такие события, как чрезмерное кровотечение и/или воспаление или тесный контакт между тканями, существенно увеличивают вероятность образования спаек в месте травмы. Последствиями для пациентов, вызванными такими спайками, часто являются хроническая боль и функциональные нарушения, при этом во многих случаях такие последствия требуют повторной операции.

Спайки могут иметь различную форму и прочность. В области абдоминальной хирургии спайкообразование вызывает особую озабоченность. Спайки в брюшной области часто возникают в результате травмы живота, которая часто случается при дорожно-транспортных происшествиях, или они появляются в результате хирургических процедур. Что касается последней причины, было обнаружено, что внутрибрюшные спайки часто возникают в месте хирургических или интервенционных процедур, при которых стенку брюшной полости необходимо открыть через все абдоминальные слои и брюшину. После зашивания разреза процесс рубцевания затрагивает все абдоминальные слои, в частности, также область брюшины вдоль разреза. В результате физиологические процессы заживления в брюшной полости в большинстве случаев вызывают образование спайки между тканями брюшины и прилегающими внутрибрюшными органами. Было показано, что такие спайки возникают в форме плотных спаек, образующих широкие перетяжки, или в виде прочных натянутых прожилок диаметром в несколько миллиметров, которые могут пересекать всю брюшную полость. Было даже обнаружено, что крайние формы спаек брюшной полости покрывают целые области брюшной полости, что делает невозможным разделение, например, петель тонкой кишки и брюшины и часто приводит к перфорации петель тонкой или толстой кишки во время эксплоративной операции.

Будучи в целом нежелательным, возникновение послеоперационных спаек вызывает особую озабоченность при хирургической пластике грыжи. Грыжа представляет собой состояние, определяемое как аномальное смещение органа или тканей, выступающих через стенку полости. Хотя грыжи могут возникать в самых разных местах, чаще всего они затрагивают брюшную полость, в частности, брюшную стенку, при этом наиболее распространенным местом является паховая область. Паховые грыжи чаще всего относятся к грыжам пахового типа, но могут также быть и бедренными. Абдоминальные грыжи возникают в определенных местах в пределах уязвимых мест брюшной стенки, например, грыжа пищеводного отверстия, пупочная грыжа, околопупочная грыжа или грыжа Шпигеля, но фактически они могут возникать в любом месте брюшной стенки. Особым типом является послеоперационная грыжа, которая представляет собой грыжу, возникающую в области ранее сделанного хирургического разреза или интервенционной операции.

Традиционно грыжу устраняют посредством открытой герниопластики с применением шовных материалов. В течение нескольких месяцев после операции по удалению грыжи на восстановленном участке постепенно накапливается рубцовая ткань, так что грыжевой дефект закрывается и брюшная стенка укрепляется.

Как было показано, к сожалению, у некоторых пациентов процесс образования рубцовой ткани нарушается, что приводит к образованию еще одной грыжи после герниопластики, то есть к так называемому возврату или рецидиву грыжи. Поэтому, в частности, для пластики грыж большего размера или в случае рецидива грыжи в настоящее время широко используют сетчатые имплантаты для восстановления и укрепления брюшной стенки. В настоящее время коммерчески доступные сетки, применяемые при хирургическом восстановлении мягких тканей, являются либо неразлагающимися, либо они полностью разлагаются и через определенное время рассасываются в теле пациента. Полностью разлагаемые сетки (часто называемые «биологическими» сетками) были разработаны в надежде, что они предотвращают образование спаек.

К сожалению, несмотря на их полезность в отношении обеспечения дополнительной стабильности восстановленной области бывшего дефекта мягких тканей, было показано, что как неразлагаемые, так и биоразлагаемые сетки вызывают образование послеоперационных спаек. В частности, при применении так называемых сеток «IPOM», то есть «внутрибрюшных предперитонеальных накладных сеток», для покрытия дефектов брюшной стенки было показано, что образование нежелательных воспалительных или фиброзных перетяжек или коллагеновых рубцов, соединяющих сетку и внутрибрюшные структуры, является причиной рецидивирующей боли и непроходимости тонкой или толстой кишки. Если последнее состояние не диагностировать вовремя, оно может вызвать омертвление кишечника, что обычно требует более обширных хирургических операций и процедур с высоким риском. По этой причине в случае пластики абдоминальной грыжи образование послеоперационных спаек может оказывать особенно серьезное воздействие на здоровье пациента.

Для предотвращения или по меньшей мере минимизации образования послеоперационных спаек, были предприняты попытки изолировать поврежденную ткань и отделить ее от любой прилегающей ткани с помощью биосовместимого материала. В результате были разработаны противоспаечные барьеры, которые в настоящее время доступны в форме физических пленок, тканей, гелей или других материалов, которые наносят между слоями тканей в конце хирургической операции пред закрытием места разреза. Находясь на месте, противоспаечный барьер действует как физический барьер для разделения поверхностей травмированных тканей, вследствие чего происходит предотвращение образования фибрина между заживающими поверхностями. Примеры коммерчески доступных противоспаечных барьеров для применения в хирургических процедурах включают, например:

- Preclude® (Преклюд) представляет собой тонкий лист пористого ePTFE (вспененный политетрафторэтилен; также называемый GoreTex). Он представляет собой нелипкую микропористую вставку, которая является биосовместимой и не вызывает воспаления. Однако Preclude® не рассасывается и не разлагается, поэтому для его удаления требуется дополнительная операция. Кроме того, его необходимо пришивать к ткани на месте. По этой причине Preclude® не был одобрен в США для предотвращения образования спаек.

- Seprafilm® (Сепрафильм) (производства компании Genzyme) представляет собой прозрачную липкую пленку, состоящую из натриевой соли гиалуроновой кислоты и карбоксиметилцеллюлозы (CMC). Seprafilm® (Сепрафильм) прилипает к тканям, на которые его наносят, и медленно рассасывается в теле в течение семи дней. Seprafilm® (Сепрафильм) одобрен для применения в некоторых типах хирургии органов таза или абдоминальной хирургии.

Interceed® (Интерсид) (производства компании Johnson & Johnson) представляет собой трикотажное полотно, состоящее из модифицированной целлюлозы, которая набухает и в конечном счете превращается в гель после размещения на поврежденном участке и, подобно Seprafilm, образует барьер и затем медленно рассасывается в течение нескольких дней. Interceed® (Интерсид) одобрен для применения в хирургии органов таза.

Однако большинство из указанных доступных в настоящее время противоспаечных барьеров не полностью предотвращают образование спаек. В частности, они не подходят для применения в хирургии герниопластики, поскольку в этом случае недостаточно предотвратить образование соединительных тканей между заживающей брюшной стенкой и подлежащими внутрибрюшными органами, но по меньшей мере также важно обеспечить достаточный рост ткани из прилегающих тканей в область грыжи с тем, чтобы щель в брюшной стенке была надежно закрыта. В частности, при применении для закрытия грыжи биоразлагаемых (временных) сеток или каркасов крайне важно вызвать фиброгенез и образование рубцов, то есть процессы, участвующие в заживлении ран, чтобы сформировать стабильную рубцовую бляшку, предотвращающую образование рецидивной грыжи. Следовательно, для успешной герниопластики необходимы средства, вызывающие фибриногенез и образование мостиковой ткани, что позволяет закрыть дефект мягких тканей, но не вызывает образование спаек.

Таким образом, задача, решаемая с помощью настоящего изобретения, состоит в получении биоразлагаемой матрицы, обеспечивающей быстрое, безопасное и стабильное закрытие дефекта мягкой ткани, в частности, грыжевого дефекта, при одновременном уменьшении спайкообразования. В то же время указанная матрица должна быть простой и недорогостоящей в производстве и обеспечивать возможность ее применение в традиционных открытых и лапароскопических хирургических методах.

Указанную проблему решают с помощью матрицы согласно пункту 1 формулы изобретения. Предпочтительные варианты реализации являются предметом зависимых пунктов формулы изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением предложена биоразлагаемая матрица для предотвращения образования послеоперационных спаек при хирургическом восстановлении мягких тканей, в частности, в результате абдоминальной хирургической операции в теле млекопитающего. Более конкретно, матрица согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходит для покрытия участков брюшины или брюшной стенки, которые были повреждены во время абдоминальной хирургической операции или из-за грыжи.

В настоящей заявке термин «матрица» относится к трехмерной опоре, например, сетке или каркасу, с губкообразной структурой, подходящей для заселения клетками. В частности, матрица согласно настоящему изобретению имеет губкообразную структуру с взаимосвязанными порами разных размеров. В этом смысле указанная матрица служит в качестве трехмерной основы, которая может быть заселена клетками или тканью. Такое заселение может происходить in vitro или in vivo. Кроме того, применительно к трансплантациям указанная матрица служит для определения местоположения трансплантата, а также в качестве метки-заполнителя для ткани, которая постепенно формируется in vivo.

Выражение «биоразлагаемый» относится к материалу, который может превращаться в метаболизируемые продукты в живых организмах (или жидкостях организма или культурах клеток, полученных из живых организмов). Биологически разлагаемые материалы включают, например, полимеры, которые являются биорассасываемыми и/или биоразрушаемыми. «Биоразрушаемый» означает способность растворяться или суспендироваться в биологических жидкостях. Биорассасываемый означает способность поглощаться клетками, тканями или жидкостями живого организма.

В соответствии с настоящим изобретением предложенная матрица содержит пористый верхний слой, выполненный из первого биосовместимого полимерного материала, содержащего полимолочную кислоту (в общем случае сокращенно обозначаемую «PLA») в качестве основного компонента и необязательно по меньшей мере один дополнительный полимер, выбранный из группы, включающей полигликолевую кислоту (в общем случае сокращенно обозначаемую «PGA»), поли(гликолевую кислоту-молочную кислоту), (в общем случае сокращенно обозначаемую «PLGA») и их смеси. Таким образом, термин «основной компонент» означает, что содержание PLA в первом полимерном материале выше, чем содержание любого дополнительного полимера, который может присутствовать в первом полимерном материале.

Предложенная матрица дополнительно включает пористый нижний слой, выполненный из второго биосовместимого полимерного материала, содержащего в качестве основного компонента по меньшей мере один полимер, выбранный из группы, включающей полимолочную кислоту [PLA], полигликолевую кислоту [PGA], поли(гликолевую кислоту-молочную кислоту) [PLGA] и их смеси, при этом содержание полимолочной кислоты в первом полимерном материале выше, чем во втором полимерном материале. Таким образом, термин «их смеси» также включает сополимеры названных полимеров.

В качестве «биосовместимых полимеров» полимеры должны быть биологически переносимыми и не вызывать отторжения при введении в живой организм. В случае настоящего изобретения биосовместимые полимеры также включают полимеры, которые хозяин распознает как чужеродные, но отторжение которых может быть подавлено путем применения соответствующей иммуносупрессии.

Оба слоя матрицы получают в виде пористых каркасов, имеющих губкообразную структуру с взаимосвязанными порами разных размеров. В этом отношении термин «пористый» относится к структуре, содержащей поры, то есть полости или пустые участки. Такие поры могут иметь круглую форму и/или угловую форму в 2-мерном сечении и/или наклонную форму, если смотреть в трех измерениях. Форму пор также можно охарактеризовать расширением с тем, чтобы ее можно было сравнивать с формой нервных клеток. Хотя в целом термин «поры» также относится к полостям, образованным филаментами, окружающими пустые участки, поры в рамках значения согласно настоящему изобретению представляют собой полости, образованные в губкообразной структуре. Такие полости, тем самым, ограничены стенками, как в природных губках или кораллах. По меньшей мере, некоторые из пор или полостей связаны друг с другом, что означает, что стенки пор между двумя соседними порами могут содержать отверстия, образующие соединение между указанными соседними порами. В этом состоит отличие от трикотажной сетчатой структуры. Таким образом, по меньшей мере некоторые из пор соединены между собой, так что они разделяют пространство с образованием соединенной по текучей среде межклеточной сети. Таким образом, клетки могут распространяться по матричной структуре. В этом отношении следует отметить, что поры, образованные внутри верхнего слоя, и поры в нижнем слое, могут структурно отличаться друг от друга, например, в отношении их формы, размера и/или взаимосвязанности.

Один из ключевых элементов настоящего изобретения состоит в том, что оба слоя являются биоразлагаемыми и имеют форму пористых каркасов, при этом верхний слой является гидрофильным и имеет краевой угол смачивания менее 75°, предпочтительно менее 60°, а нижний слой является гидрофобным и имеет краевой угол смачивания более 90°.

Термин «угол смачивания», применяемый в контексте настоящей заявки, относится к углу смачивания воды на поверхности, то есть к углу, образованному на границе раздела, где вода соприкасается с поверхностью. Таким образом, «вода», применяемая для измерения угла смачивания, относится к чистой воде, в частности, к воде сверхвысокой чистоты. В частности, измерение угла смачивания осуществляют методом лежащей капли (например, с помощью устройства типа EasyDrop DSA20E, GmbH), используя размер капли 0,3 или 0,1 мкл. В общем случае, углы смачивания рассчитывают путем подгонки функции кругового сегмента к контуру капли, помещенной на поверхность (метод «подгонки круга»).

Термин «гидрофильный» или «гидрофильность», применяемый в контексте настоящего изобретения, относится к краевому углу смачивания площади поверхности на матрице, составляющему менее 75°.

С другой стороны, термин «гидрофобный» или гидрофобность следует понимать как субстрат, имеющий площадь поверхности с краевым углом смачивания более 90°. Что касается гидрофобного нижнего слоя матрицы согласно настоящему изобретению, он предпочтительно имеет краевой угол смачивания более 120°. Гидрофобные свойства обычно являются проблемой синтетических полимеров, таких как PLA; PGA и PLGA, и их часто усиливают посредством многих способов последующей обработки, таких как обработка УФ-излучением.

Примечательно, что верхний слой матрицы согласно настоящему изобретению является гидрофильным, несмотря на то, что он содержит перечисленные выше в основном гидрофобные биоразлагаемые синтетические полимеры. Гидрофильные свойства являются важными для облегчения проникновения и адгезии клеток.

Было обнаружено, что благодаря первому полимерному материалу, содержащему PLA в качестве основного компонента, гидрофильные свойства верхнего слоя можно улучшить путем применения некоторых способов последующей обработки, в частности, стадии плазменной обработки при низкой температуре и низком давлении, которая будет более подробно описана ниже. При этом термин «плазма» в общем случае относится к возбужденному и содержащему радикалы газу, то есть к электропроводящему технологическому газу, включающему электроны и ионы. Плазму обычно генерируют с помощью электродов в вакуумной камере (так называемый «способ высокочастотной плазмы»), но ее также можно получить посредством емкостных или индуктивных методов или микроволнового излучения. Более подробная информация по этому поводу также приведена ниже в экспериментальном разделе.

Матрица согласно настоящему изобретению обеспечивает множество полезных эффектов: с одной стороны было обнаружено, что гидрофильные свойства верхнего слоя матрицы способствуют прорастанию ткани, например, перитонеальных клеток, гладкомышечных клеток и фибробласт, из прилегающей ткани в рану, которую необходимо закрыть, например, грыжу, и обеспечивают равномерное распределение клеток на верхнем слое и по всему верхнему слою. Кроме того, пористая природа верхнего слоя предоставляет клеткам среду, стимулирующую рост, что способствует формированию ткани внеклеточного матрикса и различных типов коллагеновых волокон и, тем самым, образованию рубцовой бляшки, закрывающей дефект ткани. Во-первых, растущая рубцовая бляшка создаст прочную связь между разрушаемой (и, следовательно, временной) матрицей и краями дефекта ткани. В случае грыжи рубцовая бляшка формируется по всей матрице, что позволяет закрыть щель в брюшной стенке. Со временем, по мере продолжения деградации матрицы вновь образованная рубцовая ткань будет постепенно принимать на себя необходимую опорную функцию путем создания дополнительного рубцевания, предотвращая, тем самым, повторное открытие раны или образование рецидивной грыжи.

С другой стороны, было обнаружено, что гидрофобные свойства нижнего слоя матрицы эффективно препятствуют прикреплению большинства типов клеток, в частности, воспалительных белков или гидрофильных жидкостей, к нижней поверхности матрицы, что предотвращает нежелательное спайкообразование в тканях. В частности, при исследовании при проведении пластики абдоминальной грыжи гидрофобные свойства нижнего слоя матрицы согласно настоящему изобретению успешно предотвращали инфильтрацию перитонеальной или другой физиологической жидкости в матрицу и минимизировали нежелательное образование спаек в тканях между пластикой грыжи и внутрибрюшными структурами, в частности, тонкой кишки.

Таким образом, матрица согласно настоящему изобретению обеспечивает временное закрытие дефекта мягких тканей, например, абдоминальной грыжи, и имеет следующие преимущества:

- С одной стороны, пористый гидрофильный верхний слой, обращенный к грыже, способствует прорастанию и пролиферации клеток, таких как мышечные клетки и фибробласты, которые образуют новую рубцовую ткань, принимающую на себя постоянно уменьшающуюся опорную функцию матрицы. В конце концов, после полной деградации матрицы (то есть, когда полимерные компоненты матрицы рассосались), в теле пациента не останется постоянного инородного материала.

- С другой стороны, гидрофобные свойства нижнего слоя матрицы предотвращают прикрепление фибрина или дебриса воспалительных клеток к матрице с внутрибрюшинной стороны (то есть со стороны матрицы, обращенной от грыжи в сторону брюшной полости), так что удается избежать появления воспаления и роста спаечной ткани между матрицей или вновь образованной рубцовой бляшкой и подлежащими тканями брюшной полости.

Хотя матрица согласно настоящему изобретению особенно полезна при герниопластике, ее можно применять для облегчения процесса заживления после хирургического вмешательства в целом. Например, при проведении операции на брюшной полости и наличии внутрибрюшного воспаления важно обеспечить барьер между воспаленной внутрибрюшной тканью и лежащими выше тканями, которые были разрезаны для получения доступа к области хирургического вмешательства, независимо от размера раны, например, даже если при малоинвазивном подходе сделан только небольшой разрез. Таким образом, гидрофобный слой может обеспечивать указанный барьер, а гидрофильный слой может способствовать процессу заживления хирургических ран.

Еще одно преимущество матрицы согласно настоящему изобретению состоит в том, что оба слоя являются пористыми, что обеспечивает возможность применения фармакологически активных веществ, таких как эпидермальный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, трансформирующий фактор роста бета, фактор ангиогенеза, антибиотики, противогрибковые средства, спермицидные средства, гормоны, ферменты и/или ингибиторы ферментов, введенных в указанные слои, предпочтительно в верхний слой, для доставки перечисленных веществ к месту ранения и положительного воздействия на рост клеток, таких как коллаген типов IV и V, фибронектин, ламинин, гиалуроновая кислота и протеогликаны, в области верхнего слоя и рядом с ним.

Для облегчения прикрепления и роста клеток по всему верхнему слою предпочтительно, чтобы вся каркасная структура верхнего слоя имела гидрофильную поверхность, то есть поверхность, краевой угол смачивания которой составляет менее 75°. Такие гидрофильные свойства были достигнуты путем плазменной обработки матрицы при температуре ниже 50°С и предпочтительно при низком давлении в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 бар, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 1,0 мбар.

Как было показано, поскольку повышение гидрофильности коррелирует с улучшенным прикреплением и пролиферацией клеток, краевой угол смачивания верхнего слоя матрицы предпочтительно составляет менее 60°, более предпочтительно менее 45° и даже более предпочтительно менее 25°. Наиболее предпочтительно, когда краевой угол смачивания гидрофильной поверхности верхнего слоя матрицы составляет от 0° до 10°, что означает, что такой верхний слой является «супергидрофильным».

Верхний и нижний слой могут быть выполнены в виде одной целостной структуры, т.е. в которой два слоя изготовлены как единое целое или прочно соединены друг с другом в нескольких местах. Альтернативно, два слоя также могут быть выполнены в виде двух отдельных структур, которые отделены друг от друга. Одним из примеров может быть структура, в которой как верхний слой, так и нижний слой имеют листообразную форму и просто свободно уложены друг на друга.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации составы материалов двух слоев отличаются друг от друга. Различие может состоять в типе полимера и/или в содержании конкретного полимера в полимерном материале. Например, оба слоя могут состоять из полимеров одного типа, но с разными соотношениями полимеров. Альтернативно, верхний слой и нижний слой могут отличаться в отношении типа полимеров, присутствующих в полимерном материале.

Согласно одному из предпочтительных вариантов реализации первый полимерный материал верхнего слоя состоит по меньшей мере на 70% из PL. (Примечательно, что термин «PLA» включает все хиральные формы PLA, то есть PLLA, PDLA и их смеси (сополимеры)). Это означает, что верхний слой может быть полностью сформирован из PLA или может состоять из 70% или более PLA и 30% или менее по меньшей мере одного дополнительного другого полимера, например, PLG. При наличие по меньшей мере одного дополнительного полимера PLA и другой полимер(ы) могут образовывать сополимер, или верхний слой может быть выполнен в виде двух отдельных компонентов, например, базовой структуры PLA с покрытием из другого полимера(ов). Было обнаружено, что PLA обладает хорошей прочностью на разрыв и высоким модулем упругости. Кроме того, было обнаружено, что PLA является полезным в отношении обеспечения и поддержания гидрофильных свойств. Более конкретно, было обнаружено, что для пористых структур, изготовленных из материала с высоким содержанием PLA, например, если первый полимер состоит по меньшей мере из 70% PLA, гидрофильность поверхности можно не только значительно повысить посредством плазменной обработки, как описано в настоящем документе, но указанная гидрофильность также может сохраняться в течение длительного времени. Фактически, гидрофильность также можно поддерживать после стерилизации матрицы пероксидом водорода (как будет дополнительно описано ниже). Благодаря гидрофильным свойствам верхний слой облегчает прикрепление клеток к матрице и их врастание в нее.

Однако чистая PLA имеет недостаток, состоящий в том, что она менее стабильна, то есть менее устойчива к деформации, чем, например, PGA. Тем не менее, поскольку нижний слой можно использовать для придания матрице дополнительной стабильности, верхний слой также может по существу состоять из PLA. Конкретным примером предпочтительного материала PLA является поли(L-лактид), который можно приобрести в компании Sigma Corporation (каталожный номер PLLA Р1566), с молекулярной массой от 85000 до 160000 Да. Подходящей альтернативой является PLLA от компании Durect Corporation (каталожный номер Lactel® (Лактель) В6002-2).

Как уже упоминалось, полимерный материал верхнего слоя может быть основан на PLA, но в комбинации с одним или более другим полимером(ами) для повышения стабильности верхнего слоя. Одним из предпочтительных дополнительных полимеров является PGA. Сополимеры PLA и PGA, так называемый «сополимер лактида и гликолевой кислоты» (сокращенно PLGA или PLG), можно приобрести при различных соотношениях PLA/PGA со строго определенными физическими свойствами. За счет изменения соотношения сополимеров PLA и PGA различные сополимеры PLGA обеспечивают широкий спектр эластичности и переменные скорости деградации, составляющие от нескольких дней до нескольких лет.

Согласно предпочтительному варианту реализации второй полимерный материал нижнего слоя матрицы предпочтительно состоит из поли(гликолевой кислоты-молочной кислоты) [PLGA]. В общем случае, чем выше доля PGA в композиции PLGA, тем выше стабильность полимера. Кроме того, чем выше содержание PGA во втором полимерном материале, тем выше гидрофобность нижнего слоя даже после плазменной обработки, используемой для увеличения гидрофильности верхнего слоя. Опять-таки, нижний слой обычно придает матрице дополнительную стабильность, тогда как верхний слой обеспечивает гидрофильную, благоприятную для клеток среду, увеличивающую выживаемость и скорость пролиферации клеток на верхнем слое и внутри него. По существу, второй полимерный материал нижнего слоя в общем случае будет иметь более высокое содержание PGA, чем первый полимерный материал верхнего слоя (поскольку первый полимерный материал верхнего слоя имеет более высокое содержание PLA, чем второй полимерный материал нижнего слоя).

Согласно одному из вариантов реализации оба слоя состоят из PLGA, но с разными соотношениями PLA и PGA. Предпочтительным полимерным материалом для верхнего слоя является смесь 85:15 поли(L-молочной кислоты) (PLLA) и PGA, то есть полимерная смесь с содержанием молочной кислоты (PLA) примерно 85 мол. % и содержанием гликолевой кислоты (PGA) примерно 15 мол. %. Такую смесь 85:15 можно приобрести, например, в компании Evonik Industries AG (Эссен, Германия) или в компании Durect (Купертино, Калифорния, США) под торговой маркой RESOMER® (Резомер) RG 858 или LACTEL® (Лактель) Absorbable Polymers. Сополимер D,L-лактида и гликолида в нижнем слое может представлять собой 50:50 смесь PLLA и PLG, например, RESOMER® (Резомер) RG 502. Другими предпочтительными полимерными смесями для верхнего и/или нижнего слоя являются сополимер D,L-лактида и гликолида 65:35, например, RESOMER® (Резомер) RG 653; сополимер D,L-лактида и гликолида 75:25, например, RESOMER® (Резомер) RG 752; сополимер D,L-лактида и гликолида (всегда выбирают таким образом, чтобы содержание PLA в первом полимерном материале было выше, чем содержание PLA во втором полимерном материале).

Способы получения пористых сеток из перечисленных выше синтетических полимеров хорошо известны в данной области техники. Одной из возможностей является применение технологии выщелачивания соли, описанной, например, в ЕР 2256155.

Предпочтительно, чтобы верхний слой содержал или по меньшей мере был частично покрыт по меньшей мере одним природным полимером, выбранным из группы, состоящей из коллагена, желатина, ламинина, фибриногена, альбумина, хитина, хитозана, агарозы, альгината гиалуроновой кислоты и их смесей, при этом коллаген является предпочтительным. Природный полимер придает верхнему слою дополнительную стабильность, гидрофильность и способствует пролиферации клеток. Пористый каркас верхнего слоя предпочтительно покрывают природным полимером или наносят покрытие из природного полимера таким образом, чтобы лежащая ниже пористая структура верхнего слоя не изменялась при нанесении покрытия. Более конкретно, предпочтительно, чтобы природный полимер покрывал поверхность губкообразной структуры без образования дополнительных трехмерных структур в порах губкообразной структуры верхнего слоя. Это гарантирует, что указанное покрытие не оказывает отрицательного воздействия на способность клеток проникать и распространяться в верхнем слое матрицы.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации второй полимерный материал нижнего слоя по существу состоит из PLGA или PGA, и первый полимерный материал верхнего слоя матрицы по существу состоит только из PLA (которая может быть покрыта природным полимером, выбранным из полимеров, перечисленных в предыдущем абзаце). Из упомянутых природных полимеров наиболее предпочтительным является коллаген. Это связано с тем, что коллаген представляет собой биомолекулу внеклеточного матрикса (ЕСМ) и является основным компонентом кожи и кости. Благодаря своей нановолоконной архитектуре он особенно эффективен с точки зрения стимулирования клеточной адгезии, роста и дифференцированной функции в культурах ткани. Однако также было обнаружено, что присутствие коллагена в первом полимерном материале особенно усиливает гидрофильные свойства верхнего слоя матрицы.

Примечательно, что термин «коллаген», применяемый в контексте настоящего изобретения, включает коллагены природного происхождения и синтетически полученные коллагены, а также вещества, полученные из коллагена, такие как желатин, представляющий собой гидролизованную форму коллагена. Кроме того, термин «коллаген» также включает все типы коллагена. Например, природный полимер может включать только один конкретный тип коллагена, например, I тип, или может состоять из смеси разных типов коллагена, например, смеси коллагена I типа и коллагена IV типа. В последнем случае предпочтение отдается смеси, содержащей белки в примерно процентах по массе. Коллаген I типа является наиболее предпочтительным, поскольку он представляет собой один из основных компонентов естественных кровеносных сосудов и обеспечивает вторичную структуру с участками прикрепления клеток, а также прочность на разрыв. Кроме того, он является одним из основных компонентов естественных кровеносных сосудов и обеспечивает естественное место прикрепления клеток, участвующих в процессе заживления ран. И последнее, но не менее важное: как было показано, продукт разложения коллагена I-III типа также вызывает хемотаксическое слияние человеческих фибробластов, что особенно полезно для предполагаемого применения матрицы согласно настоящему изобретению при хирургическом восстановлении мягких тканей.

Согласно предпочтительному варианту реализации по меньшей мере один слой из верхнего слоя и нижнего слоя, предпочтительно оба слоя, имеет/имеют плоскую листообразную форму и является/являются упруго деформируемым(и), что позволяет его/их складывать или сворачивать. В частности, предпочтительно, чтобы вся матрица была упруго деформируемой, чтобы ее можно было складывать или сворачивать, и при этом она могла возвращаться к своей исходной форме. Это позволяет вводить матрицу, например, через троакар при лапароскопической процедуре, что обеспечивает IPOM введение матрицы.

В общем случае, толщина каждого слоя предпочтительно составляет по меньшей мере от 0,1 мм до 20 мм, более предпочтительно от примерно 1 мм до примерно 10 мм, даже более предпочтительно от примерно 1 мм до примерно 3 мм. Само собой разумеется, что два указанных слоя также могут иметь разную толщину.

При получении в листообразной форме внешняя форма (если смотреть сверху или в продольном сечении) матрицы может быть любого вида, например, прямоугольной, квадратной, круглой, овальной и т.д., при этом указанную матрицу также можно разрезать для соответствия форме дефекта мягких тканей, который должен быть устранен. Внешняя форма поперечного сечения предпочтительно является круглой или овальной для избежания любых острых краев.

Кроме того, предпочтительно, чтобы пористость верхнего и нижнего слоя - и предпочтительно всей матрицы - составляла по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%. Такая пористость гарантирует, что питательные вещества могут диффундировать через матрицу, создавая благоприятную для клеток среду в гидрофильном верхнем слое, что способствует пролиферации и развитию клеток. Кроме того, пористая структура позволяет включать в матрицу, в частности, в верхний слой, факторы роста или другие молекулы, стимулирующие рост клеток.

Что касается времени деградации матрицы в теле, что обычно происходит в результате биоабсорбции ее компонентов, предпочтительно, чтобы верхний слой имел более высокую скорость деградации, чем нижний слой. В частности, время деградации верхнего слоя в теле предпочтительно неразрывно связано с образованием рубцовой ткани, которая надежно закрывает дефект мягкой ткани при деградации матрицы. В частности, при герниопластике крайне предпочтительно, чтобы нижний слой все еще обеспечивал дополнительную опору ко времени полного разрушения верхнего слоя, поскольку это предотвращает повторное открытие бывшей грыжи до тех пор, пока рубцовая бляшка, которая образуется поверх и внутри разрушающегося верхнего слоя, не станет достаточно прочной, чтобы выдерживать давление в брюшной полости. Кроме того, гидрофобность нижнего слоя помогает создать физический барьер между формирующейся рубцовой тканью и подлежащими органами брюшной полости. Следовательно, в течение первых нескольких месяцев, когда рост таких клеток является наиболее значительным, происходит эффективное предотвращение образования спаек между новой рубцовой тканью и внутрибрюшными органами за счет гидрофобных свойств нижнего слоя. К тому времени, когда формирование стабильной рубцовой бляшки, покрывающей бывшую грыжу, будет завершено, нижний слой будет продолжать деградировать, так что в общем случае через от 12 до 24 месяцев после имплантации матрицы в теле не останется инородного материала.

Согласно предпочтительному варианту реализации общее время деградации предложенной матрицы в живом организме составляет менее 24 месяцев, при этом предпочтительное время деградации верхнего слоя составляет менее 6 месяцев, предпочтительно менее 4 месяцев, и предпочтительное время деградации нижнего слоя составляет не менее 4 месяцев, предпочтительно от 4 до 24 месяцев. Таким образом, нижний слой будет обеспечивать дополнительную опорную функцию в течение первых от 4 до 12 месяцев. В общем случае, через 24 месяца нижний слой также будет более или менее полностью разрушен.

Согласно конкретному варианту реализации предпочтительно, чтобы время деградации верхнего слоя в живом организме составляло от 1 до 4 месяцев, предпочтительно примерно 3 месяца. С другой стороны, в случае нижнего слоя предпочтительно, чтобы время деградации в живом организме составляло от 6 до 12 месяцев.

Еще одно преимущество предлагаемой в настоящем изобретении матрицы состоит в том, что она позволяет включать в матрицу, в частности, в верхний слой, вещества, которые впоследствии доставляются к дефекту мягкой ткани. Предпочтительными веществами являются коллаген типов IV и V, фибронектин, ламинин, гиалуроновая кислота и протеогликаны. Аналогичным образом, в матрицу можно ввести фармакологически активные вещества, такие как факторы роста, антибиотики, противогрибковые средства, спермицидные средства, гормоны, ферменты и/или ингибиторы ферментов.

Для облегчения образования рубцовой ткани в области верхнего слоя и вокруг него, предпочтительно, чтобы верхний слой дополнительно содержал факторы роста. Факторы роста обычно действуют как сигнальные молекулы между клетками и часто способствуют дифференцировке и созреванию клеток. Например, эпидермальный фактор роста (EGF) усиливает остеогенную дифференцировку, тогда как факторы роста фибробластов (FGF) и факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) стимулируют дифференцировку кровеносных сосудов (ангиогенез). С учетом применения матрицы для восстановления мягких тканей верхний слой предпочтительно содержит по меньшей мере один фактор роста, выбранный из группы, состоящей из интерлейкинов, кислотного фактора роста фибробластов, основного фактора роста фибробластов (b-FGF), эпидермального фактора роста, инсулиноподобного фактора роста, белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста, фактора роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующего фактора роста альфа, трансформирующего фактора роста бета, VEGF и фактора роста гепатоцитов (HGF). Такие факторы роста являются важными для регулирования пролиферации и дифференцировки клеток, синтеза белка и ремоделирования ЕСМ (внеклеточного матрикса). В частности, было показано, что b-FGF, PDGF, VEGF и HGF увеличивают грануляцию, эпителизацию и образование капилляров за счет секреции ангиогенных цитокинов. Также было доказано, что они ингибируют миграцию нейтрофилов и макрофагов к месту ранения путем секреции факторов, подавляющих миграцию и супрессию как IL-1α, так и IL-1β, и выделяют противовоспалительные факторы, предотвращающие апоптоз и улучшающие заживление раны.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации верхний слой содержит факторы роста, добавленные в матрицу, в частности, в верхний слой, в форме секретома, полученного из мезенхимальных клеток плаценты. Было обнаружено, что коммерчески доступный секретом, полученный из (или по меньшей мере содержащий) стволовых клеток из желе Уортона (Wharton Jelly Stem Cell) (CM-hWAO), культивированных в условиях гипоксии, является особенно эффективным в отношении стимуляции прикрепления клеток к верхнему слою матрицы и их прорастания в него. Такой секретом стволовых клеток можно приобрести, например, в Институте стволовых клеток и рака (РТ. Kalbe Farma Tbk.).

Для получения матрицы можно использовать способ, включающий следующие стадии:

a) получение первой смеси I, состоящей из частиц соли и растворенного первого полимерного материала, содержащего полимолочную кислоту [PLA] в качестве основного компонента и необязательно по меньшей мере один дополнительный полимер, выбранный из группы, состоящей из полигликолевой кислоты [PGA], поли(гликолевой кислоты-молочной кислоты) [PLGA] и их смесей;

b) нанесение первой смеси I на поверхность с образованием первого слоя;

c) получение второй смеси II, состоящей из частиц соли и растворенного второго полимерного материала, содержащего в качестве основного компонента по меньшей мере один полимер, выбранный из группы, состоящей из PGA, PLA, PLGA и их смесей, при этом содержание PLA в первом полимерном материале выше, чем во втором полимерном материале;

г) нанесение слоя второй смеси II, полученной на стадии с), поверх первого слоя;

е) сушку полученной структуры с получением двухслойной биоразлагаемой матрицы, содержащей верхний слой из первого полимерного материала и нижний слой из второго полимерного материала; и

е) плазменную обработку матрицы с применением плазмы окисленного газа при температуре ниже 50°С.

Было обнаружено, что плазменная обработка усиливает гидрофильные свойства поверхности верхнего слоя, не оказывая отрицательного воздействия на стабильность или структурную целостность матрицы. С другой стороны, было обнаружено, что плазменная обработка структур PGA не увеличивает гидрофильность. Вследствие более высокого содержания PLA в верхнем слое по сравнению с нижним слоем плазменная обработка была особенно эффективной в отношении усиления, а также поддержания, гидрофильных свойств верхнего слоя, но она не увеличивает или увеличивает только в небольшой степени гидрофильность нижнего слоя.

Плазму ионизированного газа, применяемую для плазменной обработки, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из гелия, аргона, азота, неона, силана, водорода, кислорода и их смесей. Предпочтительными газами для обработки являются водород, кислород и азот, в частности, кислород.

Более конкретно, плазменная обработка предпочтительно включает низкотемпературную плазменную обработку при низком давлении, при которой несущая сетка подвергается воздействию плазмы ионизированного газа при i) температуре ниже 50°, предпочтительно ниже 40°С, ii) в течение по меньшей мере 2 минут, более предпочтительно от 5 до 20 минут, и iii) при давлении в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 бар, предпочтительно при давлении в диапазоне от 0,1 до 1,0 мбар.

Таким образом, термин «плазма» в общем случае относится к возбужденному и содержащему радикалы газу, то есть к электропроводящему технологическому газу, включающему электроны и ионы. Плазму обычно генерируют с помощью электродов в вакуумной камере (так называемый «способ высокочастотной плазмы»), но ее также можно получить посредством емкостных или индуктивных методов или микроволнового излучения.

Вместо перечисленных стадий а) - е) матрицу согласно настоящему изобретению также можно изготовить с применением 3D-печати, электроспиннинга и других известных в данной области техники способов изготовления полимерных каркасов.

Предложенный способ может дополнительно включать стадию, на которой пористый каркас верхнего слоя, сформированного из первого полимерного материала, покрывают природным полимером, выбранным из группы, состоящей из коллагена, желатина, ламинина, фибриногена, альбумина, хитина, хитозана, агарозы, альгината гиалуроновой кислоты и их смесей, предпочтительно коллагена. Такую стадию, при наличии, предпочтительно осуществляют перед стадией f) плазменной обработки.

С учетом ее последующего применения в качестве имплантата предложенную в настоящем изобретении матрицу далее (т.е. после стадии f)) предпочтительно стерилизуют. С этой целью предпочтительно использовать специальный способ стерилизации, который был разработан для этой цели. Такой способ стерилизации позволяет стерилизовать ткани, чувствительные к нагреванию и/или УФ-излучению, в частности, полимерные каркасы, и поэтому не ограничен конкретной матрицей, описанной выше, но применим для всех видов (чувствительных к нагреванию) изделий, которые необходимо стерилизовать.

В настоящее время не подлежит никакому сомнению, что стерилизация необходима практически для любого устройства и изделия, которое используют в медицинской сфере, например, инструментов, всех видов имплантатов и любых вспомогательных хирургических средств. Теоретически существует множество способов стерилизации, но не все они применимы ко всем субстратам. Металлические субстраты, такие как, например, металлический инструмент или имплантат, можно подвергнуть тепловой стерилизации с применением пара. Такой способ обычно осуществляют в паровом стерилизаторе (также называемом автоклавом), используя пар, температура которого обычно выше 120°С, под давлением. Однако тепловая стерилизация не подходит, если стерилизуемое изделие чувствительно к нагреванию. Кроме того, применение пара не подходит для компонентов, которые подвержены биоразлажению и, следовательно, в определенной степени растворимы в воде. Поэтому биоразлагаемые полимерные субстраты, содержащие термочувствительный природный полимер, такой как, например, коллаген, не может быть стерилизован горячим паром без нарушения молекулярной структуры такого субстрата.

Альтернативно, субстрат можно подвергнуть стерилизации газообразным этиленоксидом или плазменной стерилизации. Однако в том, что касается использования этиленоксида, указанный способ имеет другой недостаток, состоящий в необходимости применения относительно строгих мер безопасности из-за высокой токсичности стерилизующего средства.

Дополнительные способы стерилизации включают радиационную стерилизацию, в частности, стерилизацию гамма-излучением или стерилизацию рентгеновскими лучами. С другой стороны, основной недостаток таких способов заключается в том, что гидрофильные поверхностные свойства субстрата (в данном случае верхнего слоя) обычно теряются или по меньшей мере существенно ухудшаются вследствие стерилизационной обработки.

Таким образом, для стерилизации двухслойной матрицы в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше, требуется способ, позволяющий избежать применения тепла, то есть температуры выше 50°С, для сохранения трехмерной полимерной структуры матрицы. Кроме того, указанный способ должен обеспечивать сохранение высокой гидрофильности верхнего слоя во время и после процедуры стерилизации.

Принимая во внимание вышеизложенное, дополнительной задачей настоящего изобретения было также обеспечение простого способа, позволяющего тщательно стерилизовать матрицу без ухудшения гидрофильности верхнего слоя.

Было обнаружено, что приведенная ниже процедура удовлетворяет всем указанным требованиям и поэтому особенно хорошо подходит для стерилизации чувствительных субстратов, таких как двухслойная матрица согласно настоящему изобретению. Предложенная процедура включает стадии

I. получения двухслойной матрицы, как описано в настоящей заявке, и

II. воздействия на матрицу среды, содержащей пероксид водорода, при температуре ниже 50°С, предпочтительно ниже 40°С; при пониженном давлении от 10^-6 до 10^-2 бар; и в течение по меньшей мере 2 минут.

Неожиданное обнаружение, что такая низкотемпературная стерилизация пероксидом водорода позволяет обеспечить стерильное и гидрофильное биоразлагаемое изделие, открывает возможность применения простого процесса стерилизации чувствительных материалов без отрицательного воздействия на их структурную целостность и гидрофильные свойства. В качестве дополнительного преимущества, новый способ стерилизации является очень простым и эффективным, поскольку не требует трудоемких подготовительных стадий.

Среду, содержащую пероксид водорода, можно получить либо путем обработки плазмой Н₂О₂, либо путем размещения стерилизуемого субстрата в вакуумную камеру вместе с источником (обычно жидкого) пероксида водорода. Плазменная обработка предпочтительно включает плазменную обработку при низком давлении, при которой матрицу подвергают воздействию плазмы ионизированного газа при давлении в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 бар, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 20,0 мбар, и при температуре ниже 50°С, предпочтительно ниже 40°С, в течение по меньшей мере 2 минут. Альтернативно, матрицу можно поместить внутри вакуумной камеры, и при применении давления, достаточно низкого для испарения пероксида водорода, пероксид водорода испаряется, при этом создается атмосфера, содержащая пероксид водорода. Особенно предпочтительные (отрицательные) давления составляют от 0,1 до 20,0 мбар, например, от 6 до 12 мбар.

Время стерилизации сильно зависит от давления внутри камеры, температуры обработки и концентрации раствора Н₂О₂. Раствор Н₂О₂ предпочтительно содержит Н₂О₂ в количестве примерно 30% по объему или менее. Предпочтительное время обработки составляет по меньшей мере несколько минут, например, от 2 до 30 минут, альтернативно по меньшей мере один час. При применении «более высокого» давления, в частности, выше или примерно 10 мбар, и/или низких температур, например, ниже 40°С, или концентрации Н₂О₂ ниже 30%, например, от 20 до 25%, предпочтительным является время обработки, составляющее несколько часов, например, от 10 до 12 часов.

Как упоминалось ранее, двухслойная матрица согласно настоящему изобретению является особенно полезной для предотвращения образования внутрибрюшных спаек, например, в области герниопластики, и для предотвращения образования рецидивной грыжи. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению предложенной в настоящем изобретении двухслойной матрицы при хирургическом восстановлении мягких тканей, в частности, при хирургической операции на органах брюшной полости, например, при герниопластике. В частности, при применении для герниопластики способ согласно настоящему изобретению включает стадии:

i. получения биоразлагаемой матрицы, имеющей гидрофильный верхний слой и гидрофобный нижний слой, как описано в приведенных выше разделах;

ii. разрезания кожи и тканей брюшной полости пациента для получения доступа к грыже в брюшной стенке;

iii. размещения матрицы либо над дефектом, например, над брюшной стенкой, или альтернативно под мышечным слоем брюшной стенки (методка sublay) или в виде внутрибрюшинной накладной сетки (IPOM) ниже брюшины;

iv. закрытия разреза.

При необходимости, матрицу можно дополнительно прикрепить к мышцам брюшной полости для предотвращения перемещения.

Предпочтительные варианты реализации в отношении структуры матрицы и ее размещения в теле пациента при герниопластике дополнительно проиллюстрированы с помощью прилагаемой фигуры, при этом

на фиг. 1 показано схематичное изображение разреза, проходящего через дефект мягкой ткани, в частности, грыжи, устраненной с помощью матрицы в соответствии с настоящим изобретением.

На схематическом изображении на фиг. 1 показан дефект (щель) 10 в мышечной ткани 12, который был перекрыт с помощью матрицы 14 согласно настоящему изобретению. В частности, показана биоразлагаемая матрица согласно настоящему изобретению, имеющая пористый гидрофильный верхний слой 16 и пористый гидрофобный нижний слой 18. Гидрофильный верхний слой 16 состоит из полимолочной кислоты [PLA] и необязательно коллагена. Указанный верхний слой имеет краевой угол смачивания менее 10° и, таким образом, является супергидрофильным. Нижний слой 18 матрицы состоит из поли(гликолевой кислоты-молочной кислоты) [PLGA], например, Resomer® (Резомер) RG 503 Н от компании Sigma Aldrich с содержанием лактида : гликолида 50:50, и имеет краевой угол смачивания более 90°. Таким образом, указанный нижний слой является гидрофобным. Два слоя соединены друг с другом вдоль общей поверхности 20 раздела и образуют единое двухслойное матричное устройство 14. Гидрофильные свойства верхнего слоя обеспечивают посредством плазменной обработки матрицы с применением плазмы газообразного кислорода при температуре ниже 40°С и давлении в диапазоне от 0,1 до 1,0 мбар. Было показано, что такая плазменная обработка позволяет получить верхний слой с высоким содержанием PLA, обладающий гидрофильными свойствами, тогда как гидрофобные свойства нижнего слоя PLGA существенно не изменяются при плазменной обработке.

При хирургической пластике грыжи через кожу 22 пациента и ткани 12 брюшной полости делают разрез для получения доступа к грыже 10 в брюшной стенке. Затем матрицу 14 помещают либо над дефектом, например, брюшной стенкой (пластика паховой грыжи по Лихтенштейну) или альтернативно под мышечным слоем брюшной стенки (метод sublay) или, как в случае, показанном на рис. 1, в виде IPOM (внутрибрюшинной накладной сетки) ниже брюшины 24. Нижний слой 18 будет обращен к внутрибрюшным органам, в частности, к тонкой кишке 26, а верхний слой будет обращен к грыже 10. При желании матрицу 14 можно дополнительно прикрепить к мышцам брюшной полости 12 и/или брюшине 24 для предотвращения перемещения. (Перед размещением матрицы дефект в брюшной стенке также можно закрыть с помощью швов. Далее матрицу помещают выше или ниже устраненного дефекта для стабилизации шовного материала и облегчения процесса заживления.) Затем разрез закрывают с помощью швов 28 путем закрытия лежащей выше кожи 22.

В общем случае, после имплантации происходят следующие процессы:

В качестве разлагаемой структуры предложенная матрица создает временную опорную структуру для клеток, которые могут мигрировать в матрицу, в частности, в верхний слой матрицы, из прилегающих тканей и пролифелировать. Гидрофильные свойства верхнего слоя, обращенного к грыже, способствуют врастанию и пролиферации клеток, таких как мышечные клетки и фибробласты, которые образуют новую рубцовую ткань, принимающую на себя постоянно уменьшающуюся опорную функцию матрицы. С другой стороны, гидрофобные свойства нижнего слоя оказывают противоположное действие: указанный слой предотвращает прикрепление клеток, таких как, помимо прочего, воспалительные клетки, фибрин или клеточный дебрис, к матрице с внутрибрюшинной стороны, то есть со стороны матрицы, обращенной от грыжи в сторону брюшной полости, так что удается избежать появления воспаления и роста спаечной ткани между матрицей или вновь образованной рубцовой бляшкой и подлежащими тканями брюшной полости.

Верхний слой имеет более высокую скорость деградации, чем нижний слой. Деградация верхнего слоя занимает примерно от 3 до 6 месяцев и неразрывно связана с образованием рубцовой ткани, которая надежно соединяет края бывшей грыжи с брюшной стенкой. К тому времени, когда верхний слой полностью разрушится, нижний слой все еще продолжает обеспечивать дополнительную опору против давления в брюшной полости, а также обеспечивает физический барьер между вновь образованной рубцовой тканью и подлежащими органами брюшной полости. Следовательно, в то время, когда рост клеток является наиболее значительным, происходит эффективное предотвращение образования спаек между рубцовой тканью и внутрибрюшными органами за счет гидрофобных свойств нижнего слоя. Кроме того, при наличии внутрибрюшного воспаления, указанный физический барьер также отделяет воспаленные ткани от хирургической раны. Через примерно 12 месяцев, после завершения формирования стабильной рубцовой бляшки, покрывающей бывшую грыжу, нижний слой, как правило, также будет по существу полностью разрушен, и в теле не останется инородного материала.

Матрицу можно просто наложить на дефект или для предотвращения смещения матрицы дополнительно закрепить на месте с помощью швов или других мер.

В течение нескольких дней и недель после введения матрицы клетки из прилегающих тканей, в частности, гладкомышечные клетки и фибробласты, будут продолжать пролиферировать и формировать рубцовую ткань, которая прочно закрывает грыжу. К тому времени, когда оба слоя матрицы полностью разрушатся, указанная рубцовая ткань надежно закроет грыжу.

Для доказательства описанных выше эффектов предложенная в настоящем изобретении матрица была исследована in vivo путем имплантирования в крыс. В частности, экспериментальная грыжа брюшной стенки у крысы была устранена с помощью двухслойной матрицы в соответствии с настоящим изобретением. В таком эксперименте матрицу помещали ниже брюшины, как показано на рис. 1. Для фиксации имплантированной матрицы на месте перед закрытием кожи посредством швов указанную матрицу прикрепляли к мышечной ткани с помощью нескольких швов. После шести недель заживления место имплантации повторно открывали. Было обнаружено, что между матрицей и подлежащей тонкой кишкой не образовывалось никаких спаек. С другой стороны, в области, которая не была покрыта матрицей, наблюдалось образование спаечной перетяжки от края печени до брюшной стенки. Таким образом, эксперимент in vivo подтвердил, что матрица согласно настоящему изобретению успешно предотвращает образование послеоперационных спаек.

В следующих разделах будут подробно описаны конкретные примеры способов получения матрицы согласно настоящему изобретению.

Экспериментальные данные

Получение матрицы

Твердые частицы хлорида натрия (NaCl) измельчали с помощью ступки и пестика перед просеиванием с получением частиц NaCl размером от 355 до 425 мкм. 9 г частиц NaCl помещали в центрифужную пробирку и высушивали в эксикаторе. Затем частицы NaCl помещали в алюминиевый лоток и выливали на частицы NaCl раствор PLLA, приготовленный из 1 г гранул PLLA (лактид 100 от Durect Lactel® (Дюрект Лактель)) в 5 мл хлороформа. Раствор PLLA смешивали с частицами NaCl и затем смесь равномерно распределяли в алюминиевом лотке с получением плоского слоя PLLA.

Дополнительная последующая обработка коллагеном

Некоторые матрицы также обеспечивали коллагеновым покрытием, нанесенным на слой PLLA (который впоследствии образует верхний слой). С этой целью полученный слой PLLA высушивали и отделяли от алюминиевого лотка. Затем раствор коллагена (раствор коллагена I типа; Wako) выливали в чашку Петри. Концентрацию раствора коллагена выбирали в диапазоне от 0,1 до 5,0 (масс./об.)%, предпочтительно 1% (масс./об.). Перед помещением в другую чашку Петри слой PLLA погружали в раствор коллагена и замораживали в низкотемпературной морозильной камере при -80 °С в течение нескольких часов перед сублимационной сушкой (также известной как лиофилизация) под вакуумом <5 мбар (при температуре от -50°С до -80°С) в течение по меньшей мере 24 часов.

Для формирования гидрофобного слоя PLGA (который позже образует нижний слой) 9,0 г частиц NaCl помещали во второй алюминиевый лоток и получали раствор PLGA из 1 г гранул PLGA (лактид 25; гликолид 75 от Durect Lactel® (Дюрект Лактель)) в 5 мл хлороформа. Раствор PLGA смешивали с частицами NaCl. Затем смесь PLGA/NaCl выливали поверх слоя PLLA (с коллагеновым покрытием или без него), полученного в первом алюминиевом лотке, и равномерно распределяли с получением матрицы со слоем PLGA поверх слоя PLLA.

Матрицу PLLA/PLGA-NaCl отделяли от алюминиевого лотка и высушивали в вакуумной камере при -0,1 МПа в течение от 3 до 4 дней.

Полученные высушенные матрицы PLLA/PLGA-NaCl помещали в химический стакан, погружали в ddH₂O (дважды деионизированную воду) и выдерживали в линейной встряхивающей бане при 25°С (комнатная температура) при 60 об/мин в течение 48 часов для выщелачивания/вымывания частиц NaCl. Воду в химическом стакане меняли каждые 1-2 часа. Двухслойные матрицы PLLA/PLGA вынимали из химического стакана и высушивали в вытяжном шкафу в течение ночи.

Полученные матрицы содержали поры диаметром от 355 до 425 мкм.

Было обнаружено, что слой PLGA также можно получить первым, а слой PLLA на второй стадии.

Обработка плазмой О₂

Матрицы, либо с верхним слоем, покрытым коллагеном, либо без него, дополнительно подвергали плазменной обработке с применением плазмы ионизированного газа, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из гелия, аргона, азота, неона, силана, водорода, кислорода и их смесей. Предпочтительно использовать плазменную обработку с применением плазмы ионизированного газообразного кислорода.

Плазменную обработку проводили с применением устройства для плазменной обработки от компании Diener (Diener electronics; Plasma-Surface-Technology; Эбхаузен, Германия) в вакуумной камере в течение времени от 5 до 20 минут, предпочтительно от 8 до 15 минут. Были заданы следующие параметры обработки: давление в вакуумной камере: 0,40 мбар; мощность: 35 Вт; расход газообразного кислорода: 5 см³/мин (минимальный) - 60 см³/мин (максимальный.

Было обнаружено, что плазменная обработка значительно увеличивает гидрофильные свойства верхнего слоя PLLA, независимо от наличия коллагенового покрытия, но не слоя PLGA. Последний оставался гидрофобным.

Стерилизация

Далее матрицы с коллагеновым покрытием на верхнем слое или без него стерилизовали, помещая их в среду, содержащую Н₂О₂, при температуре ниже 40°С. Среду, содержащую Н₂О₂, создавали внутри вакуумной камеры, путем помещения матрицы в камеру вместе с открытой колбой или чашкой, содержащей раствор Н₂О₂, и последующего вакуумирования камеры для испарения Н₂О₂. Раствор Н₂О₂ содержал Н₂О₂ в количестве 30% по объему или менее. Время обработки сильно зависело от давления в камере и концентрации раствора Н₂О₂. Давление внутри камеры было таково, что происходило испарение пероксида водорода. Предпочтительные (отрицательные) давления составляли от 10^-2 до 10^-6 бар, предпочтительно от 0,1 до 20,0 мбар, например, 9 мбар. Предпочтительное время обработки составляло по меньшей мере две минуты, например, от 2 до 30 минут. Однако, в частности, при давлении выше 1 мбар, например, примерно 10 мбар, и/или при более низкой температуре (например, ниже 35°С) и/или при низкой концентрации пероксида водорода (например, ниже 30 об. %), время обработки предпочтительно было больше одного часа, например, от 8 до 10 часов.

Измерения статического краевого угла смачивания, метод лежащей капли

Измерения краевого угла смачивания проводили для определения степени гидрофильности или гидрофобности. Как правило, краевые углы верхнего и нижнего слоев матрицы определяли путем измерения статического угла смачивания посредством метода лежачей капли с применением ультрачистой воды (EasyDrop DSA20E, GmbH). Размер капель для измерения угла смачивания был установлен равным 0,1 мкл. Углы смачивания рассчитывали путем подгонки функции кругового сегмента к контуру капли, помещенной на поверхность (метод подгонки круга).

Группа изобретений относится к биоразлагаемой матрице (14) для предотвращения образования послеоперационных спаек в теле млекопитающего, содержащей верхний слой (16), выполненный из первого биосовместимого полимерного материала, содержащего полимолочную кислоту в качестве основного компонента; и нижний слой (18), выполненный из второго биосовместимого полимерного материала, содержащего в качестве основного компонента поли(гликолевую кислоту-молочную кислоту); при этом содержание полимолочной кислоты в первом полимерном материале выше, чем во втором полимерном материале; оба слоя (16, 18) сформированы в виде пористых каркасов, содержащих губкообразную структуру с взаимосвязанными порами разных размеров, верхний слой (16) является гидрофильным и имеет краевой угол смачивания менее 75° и нижний слой (18) является гидрофобным и имеет краевой угол смачивания более 90°, и также относится к способу получения матрицы путем a) получения первой смеси I частиц соли и растворенного первого полимерного материала, содержащего полимолочную кислоту в качестве основного компонента; b) нанесения первой смеси I на поверхность с образованием первого слоя; c) получения второй смеси II частиц соли и растворенного второго полимерного материала, содержащего поли(гликолевую кислоту-молочную кислоту) в качестве основного компонента, при этом содержание полимолочной кислоты в первом полимерном материале выше, чем во втором полимерном материале; d) нанесения слоя второй смеси II, полученной на стадии c), поверх первого слоя, полученного на стадии b); e) сушки полученной структуры с получением двухслойной биоразлагаемой матрицы (14) с нижним слоем (18) из второго полимерного материала и верхним слоем (16) из первого полимерного материала; и f) плазменной обработки матрицы (14) с применением плазмы окисленного газа при температуре ниже 50 °С. Группа изобретений обеспечивает закрытие грыжи без спайкообразования. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Биоразлагаемая матрица (14) для предотвращения образования послеоперационных спаек в теле млекопитающего, содержащая

верхний слой (16), выполненный из первого биосовместимого полимерного материала, содержащего полимолочную кислоту в качестве основного компонента; и

нижний слой (18), выполненный из второго биосовместимого полимерного материала, содержащего в качестве основного компонента поли(гликолевую кислоту-молочную кислоту);

при этом содержание полимолочной кислоты в первом полимерном материале выше, чем во втором полимерном материале;

оба слоя (16, 18) сформированы в виде пористых каркасов, содержащих губкообразную структуру с взаимосвязанными порами разных размеров,

верхний слой (16) является гидрофильным и имеет краевой угол смачивания менее 75° и

нижний слой (18) является гидрофобным и имеет краевой угол смачивания более 90°.

2. Матрица по п. 1, в которой первый биосовместимый полимерный материал содержит по меньшей мере один дополнительный полимер, выбранный из группы, состоящей из полигликолевой кислоты, поли(гликолевой кислоты-молочной кислоты) и их смесей.

3. Матрица по одному из пп. 1, 2, в которой верхний слой (16) имеет краевой угол смачивания менее 60°, предпочтительно менее 45°, более предпочтительно менее 25°, еще более предпочтительно менее 15°, наиболее предпочтительно в диапазоне от 0° до 10°.

4. Матрица по одному из пп. 1-3, в которой два указанных слоя (16, 18) либо сформированы как единое целое, либо прочно соединены друг с другом вдоль общей поверхности (20) раздела.

5. Матрица по одному из пп. 1-3, в которой два слоя (16, 18) выполнены в виде двух отдельных структур, которые отделены друг от друга.

6. Матрица по одному из пп. 1-5, в которой первый полимерный материал состоит по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80% из полимолочной кислоты или по существу состоит из полимолочной кислоты.

7. Матрица по одному из пп. 1-6, в которой по меньшей мере один, предпочтительно каждый из двух слоев (16, 18) имеет плоскую листообразную форму и является упругодеформируемым, что позволяет его складывать или сворачивать.

8. Матрица по одному из пп. 1-7, в которой верхний слой (16) содержит или покрыт по меньшей мере одним природным полимером, выбранным из группы, состоящей из коллагена, желатина, ламинина, фибриногена, альбумина, хитина, хитозана, агарозы, альгината гиалуроновой кислоты и их смесей, при этом коллаген является предпочтительным.

9. Матрица по одному из пп. 1-8, где послеоперационные спайки образуются после восстановления мягких тканей в результате абдоминальной хирургической операции.

10. Способ получения матрицы по пп. 1-9 путем

a) получения первой смеси I частиц соли и растворенного первого полимерного материала, содержащего полимолочную кислоту в качестве основного компонента;

b) нанесения первой смеси I на поверхность с образованием первого слоя;

c) получения второй смеси II частиц соли и растворенного второго полимерного материала, содержащего поли(гликолевую кислоту-молочную кислоту) в качестве основного компонента,

при этом содержание полимолочной кислоты в первом полимерном материале выше, чем во втором полимерном материале;

d) нанесения слоя второй смеси II, полученной на стадии c), поверх первого слоя, полученного на стадии b);

e) сушки полученной структуры с получением двухслойной биоразлагаемой матрицы (14) с нижним слоем (18) из второго полимерного материала и верхним слоем (16) из первого полимерного материала; и

f) плазменной обработки матрицы (14) с применением плазмы окисленного газа при температуре ниже 50 °С.

11. Способ по п. 10, в котором первый биосовместимый полимерный материал содержит по меньшей мере один дополнительный полимер, выбранный из группы, состоящей из полигликолевой кислоты, поли(гликолевой кислоты-молочной кислоты) и их смесей.

12. Способ по одному из пп. 10, 11, в котором первый полимерный материал состоит по меньшей мере на 70% из полимолочной кислоты.

13. Способ по одному из пп. 10-12, в котором плазменную обработку проводят в течение от 2 до 30 мин, предпочтительно от 5 до 20 мин, и при давлении в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 бар, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 1,0 мбар.

14. Способ по одному из пп. 10-13, дополнительно включающий стадию покрытия верхнего слоя (16) матрицы (14), полученной на стадии e), природным полимером, выбранным из группы, состоящей из коллагена, желатина, ламинина, фибриногена, альбумина, хитина, хитозана, агарозы, альгината гиалуроновой кислоты и их смесей, предпочтительно коллагена.

15. Способ по одному из пп. 10-14, дополнительно включающий стадию g) стерилизации полученной матрицы (14) путем ее обработки пероксидом водорода при температуре ниже 50 °C.

16. Способ по п. 15, в котором обработку пероксидом водорода на стадии g) проводят путем воздействия на матрицу (14) плазмы H₂O₂ или атмосферы, содержащей H₂O₂, при пониженном давлении, предпочтительно в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 бар, более предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 20,0 мбар, и в течение по меньшей мере 2 мин, предпочтительно от 2 до 30 мин или альтернативно в течение нескольких часов.