Способ диагностики тяжести ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления целостности геномных ДНК Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области биомедицины и заключается в определении качественных и количественных характеристик циркулирующей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в крови обследуемых, а именно в оценке кодирующих участков внеклеточной ДНК.

Сердечно-сосудистые заболевания до сих пор являются основной причиной смертности или инвалидизации населения во многих странах, в том числе и в России. К данной группе заболеваний относят болезни сосудов головного мозга, являющиеся наиболее частыми причинами нарушения функционирования головного мозга и проявляющиеся в виде ишемии головного мозга. При ишемии снижается кровоснабжение тканей головного мозга, что приводит к гипоксии и гипогликемии. В результате клетки испытывают дефицит в энергетических ресурсах, что проявляется в развитии окислительного стресса.

При ишемическом инсульте, как при частном проявлении ишемически-гипоксических поражений центральной нервной системы (ЦНС), большой вклад в патогенез заболевания вносит окислительный стресс. Образовавшиеся свободные радикалы способны повреждать геномную ДНК еще не погибших клеток, что впоследствии ведет к нарушению их функционирования и увеличению зоны поражения головного мозга.

При ишемическом инсульте выделяют активное и пассивное повреждение ДНК. Активное опосредовано активностью эндонуклеазами апоптоза и вносит большой вклад в фрагментацию ДНК после ишемии. Пассивное повреждение опосредовано активность активных форм кислорода (АФК) [Li P. Mechanistic insight into DNA damage and repair in ischemic stroke: exploiting the base excision repair pathway as a model of neuroprotection / P. Li, X. Hu, Y. Gan, Y. Gao, W. Liang, J. Chen. - DOI 10.1089/ars.2010.3451 - Text: online // Antioxidants & redox signaling. - 2011. - №14 (10). - P. 1905-1918. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3078503/ (date of request: 09.03.2022)].

После прекращения кровотока формируется некротическая зона, т.е. область погибших клеток, продукты распада которых поступают в кровоток из-за нарушения целостности гематоэнцефалического барьера. Среди подобных продуктов обнаруживается внеклеточная или циркулирующая ДНК, которую рассматривают как прогностический маркер ишемического инсульта [de Miranda F.S. Properties and Application of Cell-Free DNA as a Clinical Biomarker / F.S. de Miranda, V.G. Barauna, L. Dos Santos, G. Costa, P.F. Vassallo, L.C.G. Campos. - DOI 10.3390/ijms22179110. - Text: online// International journal of molecular sciences. - 2021. - №22 (17). - p. 9110. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8431421/ (date of request: 23.03.2023)]. Вокруг некротического очага формируется область пенумбры - область, в которой клетки структурно не были повреждены, однако их функционирование нарушено. Исход внезапно нарушенного кровоснабжения определяется оказанием своевременного лечения, а также проведением точной диагностики. При этом лечение направлено на сохранение зоны пенумбры до того, как сформируется конечный объем острого ИИ, т.е. в течение «терапевтического окна» - 3-6 часов.

В настоящее время в научной литературе появляется все больше информации о внеклеточной ДНК как о биомаркере повреждений, по содержанию которого возможно проводить диагностику состояния пациента [Fathima N. Role of cell-free DNA for predicting incidence and outcome of patients with ischemic stroke // N. Fathima, S. Manorenj, S.K. Vishwakarma, A.A. Khan. - DOI: https://dx.doi.Org/10.5316/wjn.v8.i1.1. - Text: online / World J Neurol. - 2022. - №8 (1). - P. 1-9. - URL: https://www.wjgnet.com/2218-6212/full/v8/i1/1.htm (date of request: 20.11.2022)].

Определена зависимость между концентрацией циркулирующих в плазме крови ДНК и тяжестью инсульта, что может быть использовано для распределения больных по группам тяжести заболевания. Измерение ядерной ДНК может быть использовано в мониторинге состояния пациентов, в разработке схем поэтапного обследования и в прогнозировании исхода заболевания [Rainer Т.Н. Prognostic use of circulating plasma nucleic acid concentrations in patients with acute stroke // Т.H. Rainer, L.K. Wong, W. Lam, E. Yuen, N.Y. Lam, C. Metreweli, Y.M. Lo. - DOI 10.1373/49.4.562. - Text: online / Clinical chemistry. - 2003. - №49 (4). - P. 562-569. - URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12651807/ (date of request: 09.11.2022)].

Исследования последних лет показывают, что через 3 часа после ИИ в кровотоке обнаруживается внеклеточная ДНК в диапазоне концентраций от 32,4 нг/мл до 48 нг/мл, и со временем концентрация увеличивается [Vasilyeva I. Differential Dynamics of the Levels of Low Molecular Weight DNA Fragments in the Plasma of Patients With Ischemic and Hemorrhagic Strokes // V. Bespalov, A. Baranova, I. Voznyuk, D. Baranenko. - DOI 10.32598/bcn.11.6.1639.1. - Text: online / Basic and clinical neuroscience. - 2020. - №11 (6). - P. 805-810. https://doi.Org/10.32598/bcn.11.6.1639.l (date of request: 13.10.2022)].

Показано, что при ишемическом инсульте происходит изменение фрагментации ДНК. У больных длина фрагментов ДНК составляет 300-400 п.н. с пиком в 350 п.н., в то время как у здоровых - 75-250 п.н. (с пиком в 170 п.н.). При этом смысловая нагрузка выявляемых фрагментов ДНК также различается. У людей, перенесших инсульт, внеклеточная ДНК характеризуется наличием ALU-фрагментов, CpG-регионов и экзонов в отличие от внеклеточной ДНК здоровой группы [Cui X. The Length and Distribution of Plasma Cell-Free DNA Fragments in Stroke Patients / X. Cui, S. Du, H. Liu, J. Liu, Q. Wu, Q. Huo, Y. Qi, X. Qin, Y. Yang, W. Li. - DOI 10.1155/2020/9054196. - Text: online // BioMed research international. - 2020. - №9054196. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7017581/ (date of request: 15.10.2021)].

На основе представленной информации видно, что анализ целостности и поиск определенных областей геномной ДНК может выступать маркером патологических процессов.

При хронических заболеваниях происходит увеличение клеточной гибели, что приводит к увеличению концентрации внеклеточной ДНК в кровотоке пациентов.

Известен подход определения содержания GC-богатой последовательности генома (GC-ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови как способ определения уровня гибели клеток при беременности. Способ заключается в определении содержания GC-богатой последовательности генома (GC-ДНК) в составе циркулирующей внеклеточной ДНК плазмы периферической крови. Содержание GC-богатой последовательности генома - фрагмента транскрибируемой области рибосомного повтора человека - в составе выделенной внеклеточной ДНК определяют методом нерадиоактивной количественной гибридизации и, если определенное содержание повтора повышено более чем в 2 раза по сравнению с его содержанием в геномной ДНК, делают вывод о наличии в организме хронического процесса, который сопровождается увеличенной гибелью клеток (RU 2625503, МПК G01N 33/49, G01N 33/50, опубл. 14.07.2017).

Недостатками данного метода служит использование трудоемких и дорогостоящих методов исследования.

Известен способ неинвазивной диагностики колоректального рака, основанный на установлении целостности ДНК методом ГЩР-анализа. Для оценки целостности геномной ДНК и установления наличия рака проводят амплификацию двух длинных фрагментов ДНК (800 п.н. и 2340 п.н.), содержащих кодирующие участки генов ТР53 и MLH1 Данный подход основан на том, что при колотеральном раке клетки наряду с нормальными в кал поступают опухолевые клетки с измененной геномной ДНК и из-за нарушения механизмов апоптоза ДНК опухолевых клеток стабильна и имеет высокую молекулярную массу (RU 2586775, МПК G01N 33/574, C12Q 1/68, опубл. 10.06.2016).

Недостатками данного способа является применение ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации, поскольку это значительно увеличивает время проведения диагностики.

Ранняя диагностика и прогнозирование ишемического инсульта остается серьезной проблемой в клинических условиях. В настоящее время основой для диагностики ИИ являются клиническая картина и компьютерная и магнитно-резонансная томография (МРТ). Однако данные методы не позволяют отслеживать патогенез ИИ в реальном времени на молекулярном уровне. В связи с этим молекулярные компоненты, высвобождаемые клетками в кровоток, становятся важным инструментом для разработки более качественной диагностики и выбора лучшего подхода лечения. Для пациентов с предположительным диагнозом «ишемический инсульт» проводят ряд лабораторных тестов (общий анализ крови, общий анализ мочи), которые позволяют контролировать состояние пациента и своевременно выявлять появление осложнений [Научный центр неврологии: клинические рекомендации: шемический инсульт и транзиторная ишемическая атака у взрослых.: сайт.- Москва, 2021 - URL: https://neurology.ru/ (дата обращения: 09.04.2023) - Текст: электронный; Fathima N. Role of cell-free DNA for predicting incidence and outcome of patients with ischemic stroke // N. Fathima, S. Manorenj, S.K. Vishwakarma, A.A. Khan. - DOI: https://dx.doi.Org/10.5316/wjn.v8.i1.1. - Text: online / World J Neurol. -2022. - №8 (1). - P. 1-9. - URL: https://www.wjgnet.com/2218-6212/full/v8/i1/1l.htm (date of request: 20.11.2022)].

Для улучшения и повышения точности диагностики и мониторинга пациентов с ишемическим инсультом в настоящее время разрабатываются панели биомаркеров. Среди белковых биомаркеров выделяют: натрийуретические пептиды, глиальный фибриллярный кислый белок, S100b, нейронспецифическая енолаза, основной белок миелина, интерлейкин-6, матриксная металлопротеиназа (ММР-9), D-димер и фибриноген. Биомаркеры ишемического инсульта могут быть полезны в распознавании этиологии инсульта, определения размеров некротической зоны и зоны пенумбры [Fathima N. Role of cell-free DNA for predicting incidence and outcome of patients with ischemic stroke // N. Fathima, S. Manorenj, S.K. Vishwakarma, A.A. Khan. - DOI: https://dx.doi.org/10.5316/wjn.v8.iLl. -Text: online / World J Neurol. - 2022. - №8 (1). - P. 1-9. - URL: https://www.wjgnet.eom/2218-6212/full/v8/i1/1.htm (date of request: 20.11.2022)].

В качестве прототипа был взят способ дифференциальной диагностики геморрагического и ишемического типов инсультов. Способ дифференциальной диагностики геморрагического и ишемического типов инсультов в остром периоде включается в себя определение количества низкомолекулярной фракции ДНК, сравнивая в течение суток электрофореграммы, полученные из плазмы крови больных, со стандартами известной концентрации, и при выявлении количества 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через 3 ч после начала острого инсульта диагностируют геморрагический тип инсульта, при обнаружении 80-87 нг/мл низкомолекулярной ДНК через сутки после начала острого инсульта -диагностируют ишемический тип инсульта (RU 2503002, МПК GOIN 33/487, опубл. 27.12.2013).

Среди недостатков данного способа можно выделить следующие: данная разработка не позволяет проводить диагностику ишемического инсульта в первые часы развития заболевания, а также наличие ограничений в концентрации измеряемых низкомолекулярных ДНК. Произведя замер через сутки после начала острого инсульта, а также обнаружив определенное количество низкомолекулярной ДНК (80-87 нг/мл) диагностируют ишемический инсульт.

Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности и ускорении диагностики тяжести ишемического инсульта за счет определения наличия кодирующих последовательностей высокоэкспрессивных генов белков клеток тканей головного мозга в плазме крови, сравнивая их количество с нормой с первых часов и в течение суток после начала заболевания.

Сущность изобретения заключается в том, что способ диагностики тяжести ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления целостности геномных ДНК включает забор крови в пробирки, центрифугирование пробирок с кровью, выделение ДНК, проведение ПЦР с помощью набора реагентов, включающего ПЦР-буфер, Taq-ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ в концентрациях 0,12 мМ и MgCl₂ в концентрации 3 мМ, бидистиллированную воду, 4 пары олигонуклеотидных праймеров, 4 флуоресцентных зонда, отрицательный и положительный контрольный образец, определяется количество анализируемых фрагментов экзома, включающих ген GFAP, ген енолазы и ген β-субъединицы глобина. При этом количество анализируемых фрагментов экзонов генов, циркулирующих в плазме крови у пациентов с диагнозом ишемический инсульт в диапазоне от 20 нг/мл до 96 нг/мл и отсутствие выраженной динамики их роста в течение суток свидетельствует о легкой форме ишемического инсульта, 96 нг/мл и более на фоне выраженной динамики роста свидетельствует о прогрессирующем увеличении очага поражения головного мозга и развитии тяжелой формы ишемического инсульта.

Мультиплексный ПЦР проводится с помощью набора реагентов включащий ПЦР-буфер, высокопроцессивную Taq-ДНК-полимеразу со специфическими моноклональными антителами, смесь дезоксинуклеоизидтрифосфатов, ионы магния, деонизированную воду, положительный контроль. В качестве положительного контроля используется готовый препарат ДНК, выделенной из культуры клеток человека.

В комплект реагентов для амплификации включены: 3 пары праймеров (прямой и обратный) и ДНК-зондов, а именно: прямой и обратный праймеры на ген β-субъединщы глобина человека F: 5'-GTG САС CTG ACT ССТ GAG GAG А-3', R: 5'-ССТ TGA ТАС САА ССТ GCC CAG-3' и ДНК-зонд 5'-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG(BHQ-1)-3'; прямой и обратный праймеры на ген GFAP (glial fibrilliary acidic protein) F: 5'-TCA TAA AGC CCT CGC АТС CC-3', R: 5'-ACC АТС АТС ТСС ССТ GAG GA-3' и ДНК-зонд 5'-(R6G)GCG AGC AGA GCC AGA GCA GG(BHQ-1)-3'; прямой и обратные праймеры на ген енолазы (ENO2) F: 5'- ACG TGA ТС A ATG GTG GCT CT-3',R: 5'-ТСТ CCA GGA TAT TGG GGG СА-3' и ДНК-зонд:5'-(ROX)TGG САА САА GCT GGC CAT GCA(BHQ-2)-3'. Для оценки степени фрагментированности ДНК был синтезирован дополнительные праймеры и ДНК-зонд на ген енолазы, амплифицирующий участок в 107 п.н.: F: 5'- GAG AGC ТТТ CGG GAT GCC АТ-3', R: 5'-ССТ ТСА ТСС ССС АСА TTG GT-3', ДНК-зонд 5'-(Су5) GCG ACT AGG TGC AGA GGT СТА CCA(BHQ-2)-3'. Концентрация каждого праймера равна 100 пкмоль/мкл.

Разработанный способ основан на применении разработанных и синтезированных олигонуклеотидных праймерах и зондов специфичных к генам, кодирующим нейроспецифические белки, использующиеся в качестве биомаркеров повреждения нервной ткани.

Способ диагностики тяжести ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления целостности геномных ДНК осуществляется следующим образом.

У обследуемых производят забор периферической крови в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА или специальные пробирки для лучшего сохранения целостности плазмы и циркулирующей ДНК. Далее проводят центрифугирование пробирок с кровью при 1400 g (угол наклона ротора 45°) в течение 10 минут. Плазму отбирают по 200-300 мкл в пробирки Эппендорф и проводят выделение ДНК. После получения ДНК проводят ПЦР.

В состав ПЦР-набора входят следующие компоненты: реакционная смесь (500 мкл), ПЦР-буфер, Taq-ДНК-полимераза (1000 мкл), дезоксинуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ в концентрациях 0,12 мМ MgCl₂, деионизированная вода, 4 пары олигонуклеотидных праймеров, 4 флуоресцентных зонда, отрицательный контрольный образец (водный раствор, обработанный нуклеазами, 200 мкл), положительный контрольный образец (очищенный препарат геномной ДНК, выделенной из культуры клеток). Последовательность праймеров и ДНК зондов на кодирующие участки высокоэкспрессивных генов клеток тканей головного мозга. Параметры программы циклов ПЦР в режиме реального времени: начальная денатурация - 95°С, 3 минуты, 1 цикл; денатурация 95°С, 15 секунд, 35 циклов; отжиг праймеров 55°С, 20 секунд, 35 циклов; элонгация 72°С, 30 секунд, 35 циклов.

На основе полученных данных ПЦР устанавливается диагноз: количество анализируемых фрагментов экзонов генов, циркулирующих в плазме крови у пациентов с диагнозом ишемический инсульт в диапазоне от 20 нг/мл до 96 нг/мл и отсутствие выраженной динамики их роста в течение суток свидетельствует о легкой форме ишемического инсульта, 96 нг/мл и более на фоне выраженной динамики роста свидетельствует о прогрессирующем увеличении очага поражения головного мозга и развитии тяжелой формы ишемического инсульта. Количество анализируемых фрагментов экзонов генов, циркулирующих в плазме крови, менее 20 нг/мл свидетельствует о том, что у пациента не наблюдается ишемический инсульт.

Таким образом, с помощью заявленного способа можно диагностировать тяжесть ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления целостности геномных ДНК, сравнивая их количество с нормой с первых часов и в течение суток после начала заболевания.

Пример 1. Донор В., 53 года, относительно здоровый. В ходе исследования, проводимого по заявленному способу, наличие фрагментов экзонов генов не выявлено. Это свидетельствует о том, что у пациента нет ишемического инсульта.

Пример 2. Больной Б., 62 года, основной клинический диагноз: транзиторная ишемическая атака в вертебробазилярном бассейне с полным регрессом неврологической симптоматики в течение 24 часов (легкая форма острого нарушения мозгового кровообращения). Обратился в поликлинику с жалобами на нечеткость речи, онемение в левой руке, головокружение и был направлен неврологом в дежурную больницу. В ходе исследования, проводимого по заявленному способу, была выявлена концентрация фрагментов экзонов генов 47,7 нг/мл. Это свидетельствует о легкой форме ишемического инсульта.

Пример 3. Больной Р., 81 год, основной клинический диагноз: ишемический (кардиоэмболический) инсульт в бассейне левой задней мозговой артерии с правосторонним гемипарезом, гемианопсией справа, дизартрией (тяжелая форма). Жалобы при поступлении на слабость в правых конечностях, асимметрию лица. В ходе исследования, проводимого по заявленному способу, была выявлена концентрация фрагментов экзонов генов 165,1 нг/мл, что свидетельствует о прогрессирующем увеличении очага поражения головного мозга и развитии тяжелой формы ишемического инсульта.

По сравнению с известным решением заявленное изобретение позволяет повысить эффективность и ускорить диагностику тяжести ишемического инсульта за счет определения наличия кодирующих последовательностей высокоэкспрессивных генов белков клеток тканей головного мозга в плазме крови, сравнивая их количество с нормой с первых часов и в течение суток после начала заболевания.

Изобретение создано за счет средств Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (соглашение №17079/2021 от 09.11.21).

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2024-07-02"

softwareVersion="2.3.0" softwareName="WIPO Sequence"

fileName="Пат.xml" dtdVersion="V1_3">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023127176/10(060296)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-24</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference> 10 ИЗ-2017 100,181</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">Панькина Кира

Юрьевна</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Kira Pankina</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ диагностики тяжести

ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления

целостности геномных ДНК</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgcacctgactcctgaggaga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccttgataccaacctgcccag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggtgaacgtggatgaagttggtgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcataaagccctcgcatccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q12">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accatcatctcccctgagga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q14">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgagcagagccagagcagg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q16">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgtgatcaatggtggctct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q18">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tctccaggatattgggggca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q20">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tggcaacaagctggccatgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q22">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gagagctttcgggatgccat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="11">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q24">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccttcatcccccacattggt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="12">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q26">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgactaggtgcagaggtctacca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан способ диагностики тяжести ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления целостности геномных ДНК, включающий забор крови в пробирки, центрифугирование пробирок с кровью, выделение ДНК, проведение ПЦР с помощью набора реагентов, включающего ПЦР-буфер, Taq-ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ в концентрациях 0,12 мМ и MgCl₂ в концентрации 3 мМ, деионизированную воду, 4 пары олигонуклеотидных праймеров и 4 флуоресцентных зонда. Технический результат заявленного способа заключается в повышении эффективности и ускорении диагностики тяжести ишемического инсульта за счет определения наличия кодирующих последовательностей высокоэкспрессивных генов белков клеток тканей головного мозга в плазме крови, сравнивая их количество с нормой с первых часов и в течение суток после начала заболевания. 3 пр.

Способ диагностики тяжести ишемически-гипоксических поражений ЦНС на основе установления целостности геномных ДНК, включающий забор крови в пробирки, центрифугирование пробирок с кровью, выделение ДНК, проведение ПЦР с помощью набора реагентов, включающего ПЦР-буфер, Taq-ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ в концентрациях 0,12 мМ и MgCl₂ в концентрации 3 мМ, деионизированную воду, 4 пары олигонуклеотидных праймеров и 4 флуоресцентных зонда, а именно:

прямой и обратный праймеры на ген β-субъединицы глобина человека F: 5'-GTG САС CTG ACT ССТ GAG GAG А-3', R: 5'-ССТ TGA ТАС САА ССТ GCC CAG-3' и ДНК-зонд 5'-(FAM)AAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GG(BHQ-1)-3';

прямой и обратный праймеры на ген GFAP (glial fibrilliary acidic protein) F: 5'-TCA TAA AGC CCT CGC АТС CC-3', R: 5'-ACC АТС АТС ТСС ССТ GAG GA-3' и ДНК-зонд 5'-(R6G)GCG AGC AGA GCC AGA GCA GG(BHQ-1)-3';

прямой и обратные праймеры на ген енолазы (ENO2) F: 5'- ACG TGA ТС A ATG GTG GCT CT-3', R: 5'-ТСТ CCA GGA TAT TGG GGG СА-3' и ДНК-зонд 5'-(ROX)TGG САА САА GCT GGC CAT GCA(BHQ-2)-3';

прямой и обратные праймеры для оценки степени фрагментированности ДНК на ген енолазы, амплифицирующий участок в 107 п.н. F: 5'- GAG AGC ТТТ CGG GAT GCC АТ-3', R: 5'-ССТ ТСА ТСС ССС АСА TTG GT-3', ДНК-зонд 5'-(Су5) GCG ACT AGG TGC AGA GGT СТА CCA(BHQ-2)-3',

отрицательный и положительный контрольный образец, определяется количество анализируемых фрагментов экзома, включающих ген GFAP, ген енолазы и ген β-субъединицы глобина, при этом количество анализируемых фрагментов экзонов генов, циркулирующих в плазме крови у пациентов с диагнозом ишемический инсульт, в диапазоне от 20 нг/мл до 96 нг/мл и отсутствие выраженной динамики их роста в течение суток свидетельствует о легкой форме ишемического инсульта, 96 нг/мл и более на фоне выраженной динамики роста свидетельствует о прогрессирующем увеличении очага поражения головного мозга и развитии тяжелой формы ишемического инсульта.