Способ ранней диагностики лимфогенных метастазов при меланоме кожи туловища и конечностей Российский патент 2024 года по МПК A61B5/107 G01T1/164 

Настоящее изобретение относится к медицине, к области онкологии, и может быть применено для ранней диагностики начала лимфогенного метастазирования меланомы кожи при отсутствии клинических признаков поражения регионарных лимфатических узлов.

Меланома кожи является наиболее агрессивной злокачественной опухолью кожи с высоким уровнем метастазирования и смертности [Rastrelli M., Tropea S., Rossi C.R., Alaibac M. Melanoma: epidemiology, risk factors, pathogenesis, diagnosis and classification. In Vivo. 2014 Nov-Dec;28(6):1005-11. PMID: 25398793.].

В течение последних 60 лет во всем мире заболеваемость меланомой стабильно растет. Прирост заболеваемости меланомой в зарубежных странах составляет до 5 – 7% в год [Melanoma and other skin cancers, 2015. Accessed January 10, 2018 http://www.cancernetwork.com/cancer-management/melanoma-and-other-skin-cancers], в России – до 2 – 3% [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, А.О. Шахзадовой Злокачественные новообразования в России в 2021 году (заболеваемость и смертность) – М.: МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, − 2022. − 252 с.].

В лечении меланомы кожи используется комплексное лечение, включающее различные методы – хирургические, лекарственные, лучевые [Министерство здравоохранения Российской Федерации. Клинические рекомендации. Меланома кожи и слизистых оболочек.]

В последнее время интенсивно развивается персонализированная медицина, требующая тщательной оценки морфологических и клинических особенностей опухоли перед назначением лечения. В связи с этим проводятся многочисленные исследования, позволяющие выявить дополнительные факторы риска прогрессирования заболевания [11. Garg, M., Couturier, DL., Nsengimana J. Tumour gene expression signature in primary melanoma predicts long-term outcomes. Nat Commun 12, 1137 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-21207-2 ; 12. Zager, J.S., Gastman, B.R., Leachman S. Performance of a prognostic 31-gene expression profile in an independent cohort of 523 cutaneous melanoma patients. BMC Cancer 18, 130 (2018).].

В основу изобретения положена задача создания способа ранней диагностики лимфогенных метастазов при меланоме кожи туловища и конечностей, который является доступным, относительно простым, не требующим дополнительных затрат и может быть использован в НИИ, онкологических диспансерах и лечебных учреждениях, занимающихся лечением меланомы кожи.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе ранней диагностики лимфогенных метастазов при меланоме кожи туловища и конечностей, включающем использование динамической лимфосцинтиграфии, до операции вокруг опухоли внутрикожно вводят радиофармпрепарат с размером частиц от 80 – 100 нм, затем выполняют динамическую лимфосцинтиграфию, затем определяют скорость распространения радиофармпрепарата от места введения до сигнального лимфатического узла (СЛУ), затем рассчитывают по формуле скорость распространения радиофармпрепарата: V= S/t, где S - расстояние от опухоли до сигнального лимфатического узла, t – время от появления радиофармпрепарата вокруг опухоли до появления его в сигнальном лимфатическом узле; о наличии метастатических изменений в сигнальных лимфатических узлах свидетельствует скорость распространения РФП при меланоме кожи туловища 20,66±4,34 мм/сек (p≤0,05), при меланоме кожи нижних конечностей 11,48±4,52 мм/сек (p≤0,05).

Отличительные признаки предлагаемого изобретения основаны на том, что скорость распространения радиофармпрепарата при первичной меланоме кожи при реактивных и метастатических изменениях в сигнальных лимфатических узлах при первичной меланоме кожи туловища и конечностей различается. Скорость распространения радиофармпрепарата (РФП) в случае меланомы кожи туловища при наличии реактивных изменений составляет 1,39±0,04 мм/сек (p≤0,05), при наличии метастатических изменений составляет 20,66±4,34 мм/сек (p≤0,05). Скорость распространения радиофармпрепарата в случае меланомы кожи нижних конечностей составляет при наличии реактивных изменений 4,14±0,16 мм/сек (p≤0,05), при наличии метастатических изменений – 11,48±4,52 мм/сек (p≤0,05). Отсутствие при гистологическом, цитологическом исследованиях признаков вторичного поражения сигнального лимфатического узла в случае высокой скорости распространения радиофармпрепарата делает необходимым дополнительные иммуноморфологические исследования (иммуногистохимическое, иммуноцитохимическое исследование), что позволяет увеличить выявляемость изолированных опухолевых клеток до 66,7% [Ершов В.А., Анисимова А.В., Вашкуров С.М., Воробьева С.П., Щелкова Н.Д., Зинькевич М.В., Манихас Г.М. Особенности поражения сигнальных лимфатических узлов при первичной меланоме кожи. Учёные записки Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова. 2019; 26(1):54-60. https://doi.org/10.24884/1607-4181-2019-26-1-54-60]

Таким образом, мы предлагаем использовать скорость распространения РФП как дополнительный признак раннего лимфогенного метастазирования при меланоме кожи.

Изобретение поясняется фиг.1, на которой приведено изображение одного из серии последовательных снимков, выполненных при проведении динамической лимфосцинтиграфии (описанный клинический пример). Визуализируются место введения РФП вокруг опухоли (1), пути распространения РФП (2), указаны сигнальные лимфатические узлы (3), измерено расстояние от места введения РФП до сигнальных лимфатических узлов в мм.

Нами проанализированы данные динамической лимфосцинтиграфии, морфологические (гистологические, иммунногистохимические, цитологические, иммунноцитохимические), клинические данные 30 пациентов с первичной меланомой кожи туловища и конечностей.

Среди пациентов было 18 женщин (60%) от 32 до 86 лет и 12 мужчин (40%) от 33 до 83 лет. Соотношение женщин и мужчин составило 1,5.

Распределение пациентов по локализации опухоли: у 18 пациентов (60%) опухоль располагалась на туловище, у 7 (23,3%) - на нижней конечности; у 5 (16,7%) на верхней конечности.

Все пациенты соответствовали следующим требованиям:

1. Наличие морфологически подтвержденной первичной меланомы кожи туловища и конечностей

2. Клинически негативные регионарные лимфатические узлы

3. Отсутствие диссеминации опухолевого процесса

4. Компенсированная сопутствующая патология

Диагноз выставлялся на основании анамнеза, клинических данных, данных дерматоскопии, данных инструментальных исследований.

При наличии изъязвления выполнялся соскоб-отпечаток с цитологическим исследованием препарата.

В случае сомнительного диагноза выполнялась тотальная биопсия опухоли под местной анестезией, в случае подтверждения диагноза меланомы – реиссечение послеоперационного рубца с реконструктивно-пластическим компонентом.

На амбулаторном этапе пациенты были обследованы; для оценки распространенности опухолевого процесса, исключения регионарных и отдаленных метастазов выполнялись рентгенография/компьютерная томография грудной полости, УЗИ/компьютерная томография брюшной полости, УЗИ периферических лимфатических узлов.

У всех пациентов до госпитализации при обследовании диагностирована локальная стадия заболевания, признаки метастатического поражения регионарных лимфатических узлов и отдаленных органов при физикальном и визуализационных исследованиях отсутствовали.

Всем больным выполнено широкое иссечение опухоли с биопсией сигнального лимфатического узла.

Для определения СЛУ применяли предоперационную лимфосцинтиграфию с использованием радиофармпрепарата"Технефит99mТс" (Tc99m-коллоид). В день операции после премедикации кетоналом (100 мг внутримышечно) в условиях радиоизотопной лаборатории перитуморально внутрикожно с помощью инсулиновых шприцев в 4 точки вводили от 0,5 до 1,0 мл приготовленного ex tempore препарата “Технефит99mTc” активностью 20-80 МБк. При наличии инфильтрации вокруг опухоли место пункции выбирали, отступая 10-15 мм от видимой границы инфильтрации.

Во всех случаях при проведении дооперационной лимфосцинтиграфии была зафиксирована миграция препарата из места инъекции в сигнальные лимфатические узлы. Лимфатические узлы расценивали как сигнальные если они были единственным узлом, накапливающим радиоколлоид или первым визуализированным узлом или узлом, связанным с опухолью «дорожкой» лимфатических сосудов.

Исследовали распространение РФП в режиме Limphatic Scan в четырех проекциях в положении пациента лежа. При эффективных дозах на все тело от 0,16 до 0,48 мЗв динамическая лимфосцинтиграфия проводилась с частотой фиксации 1 кадр в секунду. При анализе последовательности изображений отмечали время, прошедшее от инъекции РФП до визуализации его в лимфатическом сосуде либо в тканях вокруг места введения, после чего фиксировали время, прошедшее от момента визуализации РФП до появления его в СЛУ. Расстояние между местом инъекции РФП и СЛУ измеряли в миллиметрах. Скорость движения лимфы рассчитывали по формуле:

V= S/t, где S - расстояние от опухоли до СЛУ, t – время от появления РФП вокруг опухоли до появления его в СЛУ. Полученные значения выражали в миллиметрах в секунду (мм/сек).

Операции выполняли под общей и регионарной анестезией. Первым этапом производили широкое иссечение опухоли кожи с различными видами пластики. Биопсию сигнального лимфатического узла выполняли как второй этап операции от 1 до 6 часов после введения радиофармпрепарата. С помощью переносного гамма-датчика Gamma Finder II определяли направление тока лимфы и проекцию расположения СЛУ на коже, характеризуемую максимальной импульсацией. В этом месте параллельно току лимфы производили разрез кожи до 3 см длиной, под контролем гамма-датчика идентифицировался и выделялся лимфатический узел (узлы) с максимальным накоплением Tc99m-коллоида. После удаления СЛУ с помощью Gamma Finder II дополнительно исследовали вне операционного поля для подтверждения высокого накопления РФП. Также контролировали операционную рану для исключения других источников накопленной радиоактивности. Удаляли все обнаруженные “горячие” лимфатические узлы до снижения радиоактивности в проекции операционного поля не менее чем в 10 раз по сравнению с выявленной в СЛУ.

В условиях операционной производили аспирационную биопсию из интактных лимфатических узлов иглой 20G из 4-5 точек. Аспират помещали в консервирующий раствор и направляли для цитологического исследования. Первичную опухоль кожи и лимфатические узлы направляли для гистологического исследования.

Цитологические препараты готовили методом жидкостной цитологии, окрашивали азуром-эозином. Для гистологического исследования материал первичной опухоли, сигнальных и региональных лимфоузлов фиксировали в 10 % растворе формалина, обезвоживали в изопропиловых спиртах, заливали в парафиновые блоки, с помощью микротома готовили срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином.

Проводили иммунногистохимические и иммуноцитохимические исследования с использованием моноклональных антител к S100, Melan A, HMB45. Выявление исследуемых белков в 5 и более % опухолевых клеток в цитологических или гистологических препаратах считали положительной реакцией.

Было получено и проанализировано 50 сигнальных лимфатических узлов размерами от 3 до 20 мм.

Всего метастазы обнаружены у 5 пациентов. Метастатическое поражение СЛУ с формированием вторичной опухоли выявлено у 3 пациентов. При гистологическом исследовании вторичные опухоли верифицированы во всех трех случаях. В цитологических препаратах скопления опухолевых клеток обнаружены у двух из них. Кластеры клеток меланомы либо изолированные опухолевые клетки выявлены у двух пациентов при использовании иммуноморфологических методов, при иммуноцитохимическом исследовании – в обоих случаях, при иммуногистохимическом исследовании – в одном.

Анализируя данные динамической лимфосцинтиграфии, определили, что при локализации первичной опухоли на коже туловища скорость распространения РФП до СЛУ с реактивными изменениями составила 1,39±0,04 мм/сек (p≤0,05), до СЛУ с вторичными изменениями – 20,66±4,34 мм/сек (p≤0,05). РФП от меланомы кожи верхней конечности до СЛУ с реактивными изменениями распространялся со скоростью 0,52±0,07 мм/сек (p≤0,05). От меланомы кожи нижней конечности до СЛУ с реактивными изменениями РФП распространялся со скоростью 4,14±0,16 мм/сек (p≤0,05), до СЛУ с метастатическим поражением – 11,48±4,52 мм/сек (p≤0,05)

Таким образом, в случае наличия метастатических изменений в СЛУ были получены более высокие значения скорости распространения, что являлось верным даже у одного пациента с наличием двух путей лимфооттока от опухоли и метастатическим поражением одного регионарного коллектора.

Приводим клиническое наблюдение.

Пациентка Т., 85 лет.

Из анамнеза: опухоль кожи спины пациентка заметила в июне 2022 г., с января 2023 г. отмечается быстрый рост, изъязвление опухоли.

Обращение за медицинской помощью в апреле 2023 г.

Выполнено цитологическое исследование: клетки меланомы.

Обследована; клинически, инструментально данных за наличие вторичных изменений не выявлено.

03.05.2023 г. после перитуморального РФП введения выполнена динамическая лимфосцинтиграфия: поступление РФП в окружающие опухоль ткани визуализируется с первой секунды, РФП распространяется в направлении правой и левой подмышечных областей. Сигнальные лимфатические узлы визуализируются справа и слева: справа СЛУ визуализируется на расстоянии 210 мм от опухоли через 70 секунд, скорость распространения РФП составила 3 мм в секунду; слева СЛУ визуализируется на расстоянии 245 мм от опухоли через 15 секунд, скорость распространения РФП составила 16, 33 мм в секунду (см. фиг.1).

Выполнена операция: Широкое иссечение опухоли кожи спины + биопсия сигнальных лимфатических узлов (подмышечные справа и слева).

Гистологическое исследование: 1) смешанная эпителиоидная и веретеноклеточная меланома кожи с изъязвлением, малым содержанием пигмента и умеренным лимфоидным инфильтраттом. Толщина по Бреслоу 7,5 мм, IV стадия инвазивного роста по Кларку. 2 сигнальных лимфатических узла справа без признаков опухолевого поражения. 3 сигнальных лимфатических узла слева без признаков опухолевого поражения

Иммуноцитохимическое исследование: лимфатические узлы справа – клетки лимфатической ткани и их деструкутивные формы; лимфатические узлы слева – единичные клетки меланомы (ядерная экспрессия S100) на фоне клеток лимфатической ткани.

В опубликованных ранее исследованиях были получены данные о разной скорости лимфотока от верхних и нижних конечностей [Weissleder H, Weissleder R. Lymphedema: evaluation of qualitative and quantitative lymphoscintigraphy in 238 patients. Radiology. 1988 Jun;167(3):729-35. doi: 10.1148/radiology.167.3.3363131. PMID: 3363131.]; исследований, посвященных скорости лимфотока при меланоме кожи туловища, нам обнаружить не удалось.

Полученные нами данные о возможности использования параметров динамической лимфосцинтиграфии в качестве прогностического фактора при меланоме кожи подтверждают результаты других исследователей [Fujiwara, M., Suzuki, T., Kasuya, A., Shimauchi, T., Fukamizu, H., & Tokura, Y. (2018). Lymphatic transit rate as a predictive parameter for nodal metastasis in primary limb malignant melanoma. Journal of dermatological science, 90(1), 27–34].

Однако в этой работе:

а. не оцениваются пациенты с меланомой кожи туловища;

б. для выражения скорости лимфатического транзита японские ученые используют другой параметр – время сцинтиграфического насыщения, и другие единицы измерения – сантиметры в минуту, что является менее точным по нашему мнению.

В отечественной литературе аналогичных исследований мы не обнаружили.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для ранней диагностики лимфогенных метастазов при меланоме кожи туловища и конечностей. До операции вокруг опухоли внутрикожно вводят радиофармпрепарат с размером частиц от 80-100 нм. Выполняют динамическую лимфосцинтиграфию. Определяют скорость распространения радиофармпрепарата: V=S/t, где S - расстояние от опухоли до сигнального лимфатического узла, t – время от появления радиофармпрепарата вокруг опухоли до появления его в сигнальном лимфатическом узле. О наличии метастатических изменений в сигнальных лимфатических узлах свидетельствует скорость распространения РФП при меланоме кожи туловища 20,66±4,34 мм/с, при меланоме кожи нижних конечностей - 11,48±4,52 мм/с. Способ обеспечивает возможность ранней диагностики лимфогенных метастазов при меланоме кожи туловища и конечностей за счет определения скорости распространения радиофармпрепарата. 1 ил., 1 пр.

Способ ранней диагностики лимфогенных метастазов при меланоме кожи туловища и конечностей, включающий использование динамической лимфосцинтиграфии, отличающийся тем, что до операции вокруг опухоли внутрикожно вводят радиофармпрепарат с размером частиц от 80-100 нм, затем выполняют динамическую лимфосцинтиграфию, затем определяют скорость распространения радиофармпрепарата от места введения до сигнального лимфатического узла, затем рассчитывают по формуле скорость распространения радиофармпрепарата: V=S/t, где S - расстояние от опухоли до сигнального лимфатического узла, t – время от появления радиофармпрепарата вокруг опухоли до появления его в сигнальном лимфатическом узле; о наличии метастатических изменений в сигнальных лимфатических узлах свидетельствует скорость распространения РФП при меланоме кожи туловища 20,66±4,34 мм/с (p≤0,05), при меланоме кожи нижних конечностей 11,48±4,52 мм/с (p≤0,05).