ВАКЦИНА ПРОТИВ КРИПТОСПОРИДИОЗА Российский патент 2025 года по МПК A61K39/12 C07K14/44 C12P21/02 A61P33/02 

Настоящее изобретение относится к области паразитологических вакцин. Более конкретно, изобретение касается белка Cryptosporidium gp40, способов получения указанного белка, медицинского применения этого белка в качестве вакцины против криптоспоридиоза, вакцины, содержащей белок, и производства этой вакцины, а также способов защиты от криптоспоридиоза.

Cryptosporidia представляет собой паразитические простейшие, относящиеся к типу Apicomplexa. У млекопитающих они находятся в основном в кишечнике и вызывают криптоспоридиоз, который в основном характеризуется диареей, коликами, обезвоживанием, вторичными инфекциями и т. д. Симптомы могут варьироваться от легких у иммунокомпетентных людей или животных, отличных от человека, до тяжелых у хозяев, которые более уязвимы, например, молодые или с ослабленным иммунитетом. В медицине это заболевание наиболее заметно у детей, страдающих от недоедания, и у больных СПИД. В ветеринарии заболевание новорожденных жвачных животных: овец, коз, но особенно, телят, является серьезной проблемой как с точки зрения благополучия животных, так и по экономическим причинам. Основным возбудителем является Cryptosporidium parvum, который встречается как в зоонозном, так и в антропонозном генотипе. Многие другие виды Cryptosporidia, такие как патоген C. hominis человека, также вызывают криптоспоридиоз.

Паразитарная стадия, выделяемая инфицированными хозяевами, представляет собой ооцисты, которые очень заразны и устойчивы к условиям окружающей среды и ко многим дезинфицирующим средствам. Таким образом, инфекция может быстро распространяться через фекальный материал, например, при тесном контакте или фекальном загрязнении пищи или питьевой воды.

Несколько препаратов были одобрены для терапевтического лечения криптоспоридиоза: Нитазоксанид (тиазолид) показан для применения у иммунокомпетентных людей, и Halocure® (галофугинон, MSD Animal Health) можно использовать для новорожденных телят. В идеале также должна быть разработана эффективная вакцина, однако это оказалось очень трудным из-за сложного жизненного цикла паразита, а также из-за невозможности культивирования паразита in vitro. В результате в настоящее время нет зарегистрированных вакцин против криптоспоридиоза.

Причиной этого является не отсутствие попыток, поскольку с течением времени было протестировано большое количество экспериментальных вакцин против криптоспоридиоза, включая живые аттенуированные, убитые, лизатные и субъединичные вакцины. В качестве субъединичной вакцины были опробованы многие белки различных стадий развития паразита. См. обзор: Lemieux et al. (2018, Pathogens, vol. 7, DOI: 10.3390/pathogens7010002).

Одним из многих антигенов-кандидатов для субъединичной вакцины является гликопротеин муцинового типа массой 40 кДа из Cryptosporidia: gp40. Этот белок находится на поверхности подвижных стадий паразита и сильно гликозилирован.

Следует отметить, что название белка для Cryptosporidia вводит в заблуждение, и gp40 (или его кодирующий ген или продукт гена) также называют Cpgp40/15 (Cevallos et al., 2000, Inf. & Imm., vol. 68, p. 4108-4116); gp15/45/60 (Strong et al., 2000, Inf. & Imm., vol. 68, p. 4117-4134); или S60 (Winter et al., 2000, Funct. Integr. Genomics, vol. 1, p. 207-217). Родственным также является белок Cp17 (Priest et al., 2000, Mol. Biochem. Parasit., vol. 106, p. 261-271). Различия в указанной молекулярной массе отражают вариабельность последовательности и уровня гликозилирования. Следует также отметить, что антиген, названный «Cp15/60», представляет собой другой белок (Jenkins et al., 1993, Inf. and Imm., vol. 61, p. 2377-2382; GenBank acc.nr. U22892). То же самое относится к антигенам, названным «CP15» (GenBank № доступа L34568) или «cp41» (WO 01/040439).

Экспрессия gp40 в рекомбинантной системе экспрессии и использование для (пассивной) вакцинации предлагались в течение многих лет, например, в: WO 93/024649, WO 01/040248, WO 01/077293 и US 2002/0081312. Однако до сих пор нет функциональной вакцины.

Для новорожденных жвачных животных, которые обычно заражаются в очень раннем возрасте, активная вакцинация обеспечит защиту только через 3-4 недели, что на практике слишком поздно. Однако возможен удобный способ пассивной вакцинации против криптоспоридиоза путем молозивной передачи, например путем кормления молозивом теленка от вакцинированного крупного рогатого скота. Такая вакцинация новорожденных телят против неонатальной диареи, также известной как понос телят, путем молозивной передачи описана, например, в WO 01/045735 и WO 2011/056175. Кроме того, этот способ защиты будет соответствовать мерам, применяемым в настоящее время для других причин диареи новорожденных телят, таких как Escherichia coli, коронавирус крупного рогатого скота, ротавирус крупного рогатого скота и клостридии. Пассивная вакцинация людей путем кормления (антителами) молозива также была эффективной, см. Lemieux et al., 2018 (выше).

Таким образом, во многих публикациях описано выделение или экспрессия антигенов Cryptosporidium и их изучение в диагностике или исследованиях антигенности. Предлагается также использовать некоторые антигены для активной или пассивной вакцинации людей или животных. Однако, на сегодняшний день, ни одна коммерческая вакцина не была одобрена. Следовательно, существует потребность в вакцине против криптоспоридиоза, которая безопасна и эффективна.

Азиридины представляют собой органические химические соединения, содержащие азиридиновое кольцо. Эти соединения используются в медицине в качестве противораковых средств из-за их склонности повреждать нуклеиновые кислоты в результате реакции алкилирования, вызывая перекрестное связывание и разрывы цепей. В биотехнологии, это свойство азиридинов используется для инактивации микроорганизмов, таких как бактерии и вирусы.

Наряду с нуклеиновыми кислотами, азиридины могут взаимодействовать с белками путем алкилирования нуклеофильных участков аминокислот. Например, путем взаимодействия с серосодержащей боковой цепью, такой как сульфгидрильная или тиоэфирная группа; с азотсодержащей боковой цепью, такой как аминогруппа; или с кислородсодержащей боковой цепью, такой как гидроксильная группа.

Эти реакции могут происходить с одной или несколькими аминокислотами белка; но какие аминокислоты реагируют с азиридином и становятся алкилированными, не совсем понятно.

Широко используемым азиридином для инактивации вирусов является этиленимин (EI), в основном используемый в форме бинарного этиленимина (BEI). Обзор представлен в H. Bahnemann (1990, Vaccine, vol. 8, p. 299-303).

Хотя он является опасным химикатом, использование EI предпочтительнее традиционной инактивации вирусов формалином из-за его более предсказуемой, т.е. линейной, кинетики реакции. Кроме того, поскольку EI предпочтительно взаимодействует с нуклеиновыми кислотами, он менее вреден для иммуногенности белковых антигенов, чем формалин (Blackburn & Besselaar, 1991, J. of Virol. Methods, vol. 33, p. 367-374; Hulskotte et al., 1997, Vaccine, vol. 15, p. 1839-1845).

Есть несколько сообщений, в которых описано, что инкубация белкового антигена с химическим веществом увеличивает антигенность, однако это относится только к реакциям перекрестного сшивания белков, например, формалином и/или термообработкой (Grovit-Ferbas et al., 2000, J. of Virol., vol. 74, p. 5802-5809). Другие инкубации субъединичных белков с инактивирующим агентом описаны только для детоксикации бактериальных токсинов формалином. Для азиридинов, инкубация с субъединичным белком не описана, за исключением контекста использования для инактивации микроорганизмов. Инкубация с азиридином не описана для белка Cryptosporidium gp40.

В нескольких статьях описывается негативное влияние на иммуногенность от действия азиридинов на белки во время реакций инактивации, и рекомендуются меры предосторожности; Chen et al. (1999, J. of Exp. Med., vol. 189, p. 1757-1764) описывают потерю антигенности S-алкилированием цистеинов в белках. Для уменьшения такой реакционной способности, в WO 98/51660 описывается разработка полимеров EI, которые еще более специфичны для нуклеиновых кислот. Кроме того, в WO 98/45415 описывается инактивация с помощью EI при кислом уровне pH для уменьшения неблагоприятной реакции с вирусными белками.

Объектом настоящего изобретения является преодоление недостатка известного уровня техники и удовлетворение этой потребности в данной области путем предоставления вакцины против криптоспоридиоза, которая является безопасной и эффективной.

Когда изобретатели попытались разработать вакцину против криптоспоридиоза на основе рекомбинантного экспрессированного белка gp40, первоначальные результаты были многообещающими: gp40 можно было экспрессировать в E. coli, как описано в литературе, и его использовали со стандартными адъювантами для вакцинации беременных телок. После отела было получено молозиво, содержащее высокие уровни gp40-специфических антител. Когда телят кормили молозивом, они были защищены от болезней, вызванных тяжелой инфекционной иммунизации C. parvum. К сожалению, уровень рекомбинантной экспрессии был невысоким, и экспрессируемый белок gp40 обладал низкой иммуногенностью, поэтому необходимо было применять относительно высокие дозы антигена. В этих условиях, производство вакцины против криптоспоридиоза на основе рекомбинантного экспрессированного gp40 считалось нецелесообразным для коммерциализации.

Еще одна проблема заключалась в том, что белок gp40 оказался довольно реакционноспособным после вакцинации: при введении иммунологически эффективных доз gp40 крупному рогатому скоту в качестве стандартной эмульгированной вакцины общая безопасность была хорошей и не было никакого влияния на беременность, но возникали неприемлемые уровни местных реакций на вакцинацию, особенно при подкожном способе введения. Также эти местные реакции усилились после ревакцинации.

В то время как использование более низких доз антигена снизило местные побочные реакции на вакцинацию до приемлемого уровня, к сожалению, эти дозы не индуцировали достаточного уровня антител в молозиве, чтобы это могло обеспечить эффективную пассивную вакцинацию телят.

У изобретателей не было догадок, как преодолеть эти проблемы, чтобы разработать доступную, безопасную и эффективную вакцину против криптоспоридиоза.

Неожиданно было обнаружено, что объект изобретения может быть достигнут и, следовательно, один или более недостатков известного уровня техники могут быть преодолены путем инкубации белка gp40 с азиридином перед его применением в качестве вакцины. Было обнаружено, что эта инкубация значительно повышает иммуногенность gp40, что приводит к более высокому титру gp40-специфических антител в вакцинированном млекопитающем-мишени, и впоследствии также в молозиве, полученном от этой вакцинированной мишени; это по сравнению с иммунизацией тем же количеством gp40, который не инкубировали с азиридином.

Это открытие позволяет уменьшить антигенную массу gp40, используемого для вакцинации, в 10-20 раз по сравнению с gp40, который не инкубировали с азиридином, при этом все еще индуцируя достаточные уровни антител в молозиве для обеспечения эффективной пассивной иммунной защиты потомства против тяжелой инфекционной иммунизации Cryptosporidium. Помимо создания эффективной вакцины против криптоспоридиоза, возможно значительное снижение антигенной массы gp40 на дозу вакцины, что решает еще две проблемы: оно снижает уровень местных реакций, так что вакцинация эффективной дозой теперь безопасна. Кроме того, это делает вакцину против криптоспоридиоза на основе рекомбинантного экспрессированного gp40 экономически целесообразной.

Известно, что gp40-специфические антитела могут ингибировать инвазию паразитов Cryptosporidia в клетки-хозяева. Следовательно, при пассивной вакцинации против криптоспоридиоза, например, путем кормления молозивом вакцинированного млекопитающего, повышенный уровень антител в этом молозиве будет обеспечивать повышенный местный уровень антител в желудочно-кишечном тракте и обеспечивать защиту против инвазии паразитов.

Однако точно неизвестно, как и почему инкубация с азиридином повышает иммуногенность gp40.

Хотя авторы изобретения не хотят быть связанными какой-либо теорией или моделью, которые могли бы объяснить эти результаты, они ожидают, что химическое изменение белка gp40, вызванное инкубацией с азиридином, в частности алкилирование одной или нескольких аминокислот, приводит к другому ответу иммунной системы вакцинированного человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, по сравнению с иммунным ответом на gp40, который не был алкилирован азиридином. Наряду с наблюдаемым повышением уровня создаваемых анти-gp40 антител, вероятно, также имеется одно или несколько других изменений в создаваемом профиле антител, таких как авидность и/или специфичность создаваемых антител. Кроме того, может быть изменение типа или уровня активированного клеточного иммунного ответа.

Это вовсе не было очевидно из какого-либо описания известного уровня техники: во многих публикациях, сообщающих о повреждении иммуногенных эпитопов во время химической инактивации, положительное действие инкубации с азиридином на иммуногенность было совершенно неожиданным. Не говоря уже об увеличении иммуногенности такого масштаба. Кроме того, при инкубации gp40 с формалином, Triton X-100 или после гамма-облучения, подобный эффект не наблюдается.

Поэтому, в одном аспекте, изобретение относится к белку Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, отличающемуся тем, что белок gp40 и его часть содержат одну или более алкилированных аминокислот.

«Белок» представляет собой молекулярную цепь аминокислот, как определено в настоящем документе. Среди прочего: полипептид, пептид и олигопептид включены в определение белка. Белок может быть природного или синтетического происхождения, может быть нативным или зрелым белком, пре- или пробелком или частью белка.

Термин «Cryptosporidium» относится к роду паразитов, типу Apicomplexa и подклассу Coccidia. Эти микроорганизмы имеют характерные черты своего таксономического класса, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патологическое поведение. Известно большое количество видов паразитов Cryptosporidium. Они могут заразить широкий спектр животных, отличных от человека, а также людей.

Хорошо известным видом паразита Cryptosporidium является C. parvum, который встречается в двух генотипах: генотип I, который считается заразным только для человека, и генотип II, который является доказанным зоонозным агентом. Оба генотипа C. parvum вызывают криптоспоридиоз, особенно у уязвимых объектов. Ссылку на по характеристики и действие C. parvum в ветеринарии: "The Merck veterinary manual" (11th ed., 2016, ISBN-10: 9780911910612).

Как известно в данной области техники, классификация микроорганизма к конкретной таксономической группе основано на комбинации его признаков. Таким образом, изобретение также включает другие виды Cryptosporidium, которые относятся к этому роду. Точно так же, это относится к паразитам, которые каким-либо образом субклассифицируются, например, на подвиды, штаммы, изоляты, генотипы, варианты, подтипы или подгруппы, и подобные.

Кроме того, специалисту в области техники, к которой относится изобретение, будет очевидно, что, хотя конкретный паразит по изобретению в настоящее время может быть отнесен к такому виду или роду, однако это таксономическая классификация, которая может измениться со временем, поскольку новые результаты исследований могут привести к переклассификации в новую или другую таксономическую группу. Однако, поскольку это не меняет самого паразита или его антигенный репертуар, а только его научное название или классификацию, такие переклассифицированные паразиты остаются в объеме изобретения.

Образцы паразитов Cryptosporidium для использования в изобретении могут быть получены из различных источников, например, в виде полевого изолята от человека или животного, отличного от человека, в дикой природе или на ферме, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов. Кроме того, большая часть генетической информации о криптоспоридиях и gp40 доступна в цифровом виде в общедоступных базах данных последовательностей, таких как GenBank NCBL и EBI EMBL. Общедоступной базой данных, специализирующейся на последовательностях из Cryptosporidia, является CryptoDB, которая доступна онлайн по адресу: cryptodb.org.

Для изобретения, «gp40» представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или его гомолог. Та же последовательность представлена на фигуре 1 в однобуквенном коде IUPAC. Эта конкретная последовательность соответствует основной последовательности белка gp40, начиная с аминокислоты 31 и заканчивая 220 из GenBank, № доступа AAF78345.1 (Strong et al., 2000, выше). Эта запись GenBank представляет аминокислотную последовательность белка-предшественника 60 кДа из C. parvum, штамм Iowa, который является изолятом из крупного рогатого скота в США и имеет генотип II.

В природе, gp40 экспрессируется как гликопротеин-предшественник, при этом N-концевые 2/3 предшественника представляют собой gp40, и C-концевая 1/3 представляет собой gp15. Предшественник имеет N-концевую сигнальную последовательность и полисериновый участок (оба в части gp40), а также C-концевой GPI-якорь (в gp15). После расщепления предшественника, два белка взаимодействуют и прикрепляются к области апикальной поверхности мерозоитной и спорозоитной стадий Cryptosporidia, где они участвуют в прикреплении и инвазии клеток-хозяев. В природе, gp40 сильно гликозилирован, в основном с O-связанными структурами GalNac на аминокислотах треонин и серин.

Ген, кодирующий белок-предшественник gp40 из C. parvum, описан как номер гена: cgd6_1080 в базе данных CryptoDB (выше).

«Гомолог» полипротеина Cryptosporidium gp40 по настоящему изобретению представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 60% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 при сопоставлении с полной длиной SEQ ID NO: 1. Выравнивание последовательностей должно выполняться с использованием алгоритма «blastp» со стандартными параметрами из комплекта программного обеспечения для выравнивания NCBI BLAST™, доступного онлайн по адресу: blast.ncbi.nlm.nih.gov.

Этот разброс уровня идентичности последовательности необходим для охвата природного отклонения в аминокислотной последовательности белков Cryptosporidium gp40 по изобретению, которые, как хорошо известно, являются весьма гетерогенными (см. также Strong et al., 2000, выше). Например, даже среди белков gp40 из C. parvum, изолятов генотипа II, существует вариация до 23% в уровне идентичности аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 1. Это является результатом, с одной стороны, некоторых распределенных отклонений аминокислотной последовательности, и с другой, отклонений длины полисеринового тракта. Этот полисериновый тракт в Cryptosporidium gp40 может иметь от 6 до 25 последовательных серинов, хотя все они являются функциональными белками gp40. См., например, гомологи gp40 C. parvum генотипа II в GenBank с №№ доступа AOA32955.1 (6 серинов) и ACR78128.1 (25 серинов). При выравнивании с полной длиной SEQ ID NO: 1 с использованием программы blastp, они демонстрируют идентичность аминокислотной последовательности 77 и 96%, соответственно.

Дальнейшее изменение аминокислотной последовательности gp40 происходит в изолятах C. parvum генотипа I. Как описано в Таблице 1 из Strong et al. (2000, выше): идентичность аминокислот между белками-предшественниками gp15/45/60 из изолятов типа I и типа II может составлять всего 67%, при этом они все еще являются функциональными белками gp40.

На тему разнообразия Cryptosporidium gp40 parvum, см. также: Leav et al., 2002, Inf. and Imm., vol. 70, p. 3881-3890; и: Wu et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol., vol. 69, p. 4720-4726.

Еще один уровень вариабельности аминокислотной последовательности gp40 обусловлен гомологами gp40 близкородственных видов, таких как C. hominis, для которых идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 1 снижается примерно до 60%.

Однако все эти гомологичные белки gp40 можно использовать в настоящем изобретении.

Чтобы быть способным к алкилированию путем инкубации с азиридином по изобретению, гомолог Cryptosporidium gp40 содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту, выбранную из: цистеина, метионина, серина, треонина, тирозина, лизина, аргинина, валина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.

Термин «содержать» (а также такие вариации, такие как «содержащий», «содержит» и «содержащийся»), используемый в настоящем документе, предназначен для обозначения всех элементов и в любой возможной комбинации, возможной для изобретения, которые охватываются или включены в текстовый раздел, абзац, формулу изобретения и т. д., в которых используется этот термин, даже если такие элементы или комбинации не указаны явно; и не исключая любой из таких элементов или комбинаций.

Таким образом, любой такой текстовый раздел, абзац, формула изобретения и т. д. может также относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, в которых термин «содержащий» (или его варианты) заменен такими терминами, как «состоит из», «состоящий из», или «состоит по существу из».

«Алкилированная аминокислота» по изобретению представляет собой аминокислоту, в которой атом серы, азота или кислорода был алкилирован реакцией с азиридином так, что аминокислота приобрела дополнительную алкильную группу по сравнению с нативной структурной формулы аминокислоты. Алкилированные аминокислоты включают, например: аминокислоту цистеин, сульфгидрильная группа боковой цепи которой была алкилирована в алкилентиоэфир, или аминокислоту метионин, в которой тиоэфир боковой цепи был алкилирован в третичный тиоэфир; лизин или аргинин, в которых аминогруппа боковой цепи была алкилирована в алкиламиногруппу; или серин, треонин, тирозин, глутаминовая кислота или аспарагиновая кислота, в которых гидроксильная группа боковой цепи была алкилирована в простой алкиловый эфир.

Реакция алкилирования, происходящая при инкубации с азиридином, будет зависеть от доступности таких аминокислот для реакции. Например, когда два цистеина соединены серным мостиком, они в не восстанавливающих условиях не будут доступны для алкилирования. С другой стороны, аминокислоты, одна из групп которых в норме не реагирует, могут алкилироваться по амино- или карбоксигруппе, когда такая группа открыта, например, на N- или С-конце фрагмента белка. Например, когда белок gp40 или его часть инициируется валином, тогда открытая на N-конце аминогруппа этого валина может стать алкилированной в реакции с азиридином.

Как понятно специалисту в данной области техники, часть белка Cryptosporidium gp40, содержащая одну или более алкилированных аминокислот по изобретению, может в равной степени использоваться для индукции повышенных уровней gp40-специфических антител в иммунизированной мишени. Часть белка gp40 должна быть «иммуногенной частью» белка gp40 в том смысле, что она должна быть способна индуцировать gp40-специфичные антитела, которые можно использовать для защиты от криптоспоридиоза. Это обеспечивается, среди прочего, частью, содержащей одну или более алкилированных аминокислот, как описано в настоящем документе.

Специалист в данной области техники может легко определить, является ли часть белка gp40 или его гомолога такой иммуногенной частью, путем иммунизации мишени и тестирования образования gp40-специфических антител.

Для того, чтобы обеспечить иммуногенную эффективность по настоящему изобретению, иммуногенная часть белка Cryptosporidium gp40, содержащая одну или более алкилированных аминокислот, имеет, по меньшей мере, 50 последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1 и содержит, по меньшей мере, одну алкилированную аминокислоту, выбранную из: глутаминовой кислоты, соответствующей аминокислоте номер (а.к. №) 88 или 94 из SEQ ID NO: 1; и аспарагиновой кислоты, соответствующей а.к. № 129 из SEQ ID NO: 1.

Для изобретения, «соответствующая» в признаке «аминокислота, соответствующая аминокислоте номер» относится к аминокислоте, которая находится в сравнимом положении и/или в сравнимом контексте аминокислот, как в случае аминокислотной последовательности указанного идентификатора последовательности.

Каждый из белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению может быть модифицирован различными способами, хорошо известными в данной области техники. Примерами являются гликозилирование, липидирование или пегилирование. Также может быть добавлена дополнительная часть белка, такая как носитель, гаптен, сигнальная последовательность, якорная последовательность, маркер или метка. Любая из этих модификаций может быть полезна для экспрессии, обнаружения и/или очистки белка. Также такая модификация может быть полезной для адаптации или дальнейшего повышения иммуногенности.

Например, приведенные ниже примеры описывают применение белка Cryptosporidium gp40, содержащего одну или более алкилированных аминокислот, с С-концевой 6x-гистидиновой меткой. Хотя эта метка не влияет на иммуногенность, она позволяет очищать белок gp40 с помощью металло-аффинной хроматографии, например, когда белок находится в сборе рекомбинантной системы экспрессии.

Кодирующая последовательность N-конца белка gp40, использованная в экспериментах по вакцинации, описанных в примерах, удлинена частью нативной сигнальной последовательности, и кодирует N-концевой метионин для инициации его транскрипции. Это улучшило уровни экспрессии в системе экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, не индуцируя секрецию из клеток насекомого.

Аминокислотная последовательность белка Cryptosporidium gp40, используемого в примерах, представлена в SEQ ID NO: 3. Этот белок включает полную аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с указанными дополнительными N- и C-концевыми последовательностями: она экспрессируется из рекомбинантного гена, который предоставлен для His-метки, дополнительного метионина и частичной сигнальной последовательности. Кроме того, этот ген, кодирующий gp40 по изобретению, был кодон-оптимизирован в отношении предпочтительности кодонов гена полиэдрина AcMNPV бакуловируса. Кодирующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.

Алкилирование белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части азиридином обеспечивает повышенную иммуногенность белка его части. Термин «иммуногенность» хорошо известен в данной области техники и относится к способности соединения индуцировать защитный иммунный ответ у мишени. Индуцированный иммунный ответ может быть гуморального и/или клеточного типа, и защита может быть достигнута различными способами, как описано ниже. Иммуногенность в отношении вакцинации также называется «потенцией».

Повышение иммуногенности белка может быть легко определено специалистом в данной области техники путем проведения сравнительного эксперимента по иммунизации. Для изобретения это может означать сравнение иммунного ответа у животного, отличного от человека, иммунизированного белком Cryptosporidium gp40, содержащим одну или более алкилированных аминокислот по изобретению, с ответом животного, иммунизированного белком gp40, не содержащим одну или более алкилированных аминокислот, при этом все остальные параметры и условия по существу такие же. В соответствии с изобретением, повышенная иммуногенность будет приводить к более высокому количеству gp40-специфических антител, образующихся в сыворотке мишени белком Cryptosporidium gp40, содержащим одну или более алкилированных аминокислот, по сравнению с аналогичной дозой gp40, которая не содержат одну или более алкилированных аминокислот. Уровень и специфичность сывороточного ответа можно легко измерить с помощью любого подходящего серо-диагностического метода, такого как ELISA, IFT или AlphaLisa. Для оптимального сравнения эффекта изобретения, gp40, который не содержит одну или более алкилированных аминокислот, следует инкубировать с имитацией, т.е. инкубировать в тех же условиях, что и инкубация с азиридином, за исключением того, что азиридин не будет присутствовать.

Например, при однократной иммунизации крупного рогатого скота 10 мкг gp40, либо алкилированного, либо ложно обработанного, со стандартным масляным адъювантом, белок Cryptosporidium gp40, содержащий одну или более алкилированных аминокислот по изобретению, будет индуцировать титр gp40-специфического антитела, которое на 2-4 единицы Log2 выше при измерении в стандартном ELISA антитела с использованием покрытого gp40, по сравнению с титром, полученным gp40, который не содержит одну или более алкилированных аминокислот; это увеличение титра gp40-специфических антител до 16 раз является результатом алкилирования азиридином.

Для изобретения, gp40-специфические антитела представляют собой антитела, которые распознают и связываются с gp40 «специфическим» образом. В этой области техники, это означает, что связывание и распознавание коррелируют с концентрацией антитела и антигена. Следовательно, в случае специфического связывания разведение либо антигена, либо антитела должно демонстрировать постепенное снижение уровня связывания, который можно обнаружить в стандартном серологическом анализе.

Подробности вариантов осуществления и дополнительных аспектов изобретения будут описаны ниже.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 по изобретению, гомолог представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет аминокислотную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 60% с SEQ ID NO: 1, при сопоставлении с полноразмерной SEQ. ID NO: 1, как определено в настоящем документе.

Более предпочтительно, гомолог белка Cryptosporidium gp40 по изобретению имеет идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере, 62, 65, 67, 70, 72, 75, 77, 80, 82, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или даже, по меньшей мере, 99% идентичность аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 1 при сопоставлении с полноразмерной SEQ ID NO: 1, в указанном порядке предпочтения.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, алкилированная аминокислота представляет собой одну или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из: цистеина, метионина, серина, треонина, тирозина, лизина, аргинина, валина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.

Все эти аминокислоты являются хорошо известными химическими соединениями, не встроенным химическим веществом (L-изомером) которых являются: цистеин: регистрационный № CAS: 52-90-4; метионин: CAS №: 59-51-8; серин: CAS №: 56-45-1; треонин: CAS №: 80-68-2; тирозин: CAS №: 60-18-4; лизин: CAS №: 56-87-1; аргинин: CAS №: 74-79-3; валин: CAS №: 72-18-4; глутаминовая кислота: CAS №: 56-86-0; и аспарагиновая кислота: CAS №: 56-84-8.

Алкилирование сульфгидрильной группы боковой цепи цистеина дает цистеин, имеющий простой алкилентиоэфир, при этом алкиленаминогруппа заменяет атом водорода из сульфгидрильной группы.

Алкилирование тиоэфирной группы боковой цепи метионина дает метионин, имеющий третичный тиоэфир, при этом алкиленаминогруппа заменяет атом водорода из тиоэфирной группы.

Алкилирование аминогруппы боковой цепи аргинина или лизина дает аргинин или лизин, имеющий алкиленаминогруппу, присоединенную к боковой аминогруппе.

Алкилирование гидроксигруппы боковой цепи серина, треонина, тирозина, аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты дает серин, треонин, тирозин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту, к которым присоединен алкиленамино в виде алкилового эфира.

Алкилирование аминогруппы валина дает валин, имеющий алкиленамин, присоединенный к аминогруппе.

В предпочтительном варианте осуществления, алкиленамин, присоединенный реакцией с азиридином, представляет собой этилениминовую группу.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, алкилированная аминокислота алкилирована алкильной группой Формулы (2)

(2),

где R1 выбран из группы, состоящей из: H, алкила, алкилсульфонила, мезила, тозила, нозила, брозила, алкенила, алкинила, алкиларила, арилалкила и циклоалкила, где каждый из алкила, алкенила, алкинила, алкиларила, арилалкила и циклоалкила необязательно замещен заместителем, выбранным из группы, состоящей из: карбонила, гидроксила, алкила и галогеналкила. Предпочтительно, R1 выбран из группы, состоящей из H, ацетила и гидроксиэтила.

Каждый из R2' и R2'' независимо выбран из Н и алкила. Подходящим образом, R2' и R2'' каждый независимо выбран из H и C_1-6 алкила. Предпочтительно, каждый из R2' и R2'' независимо выбран из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила, изопропила, бутила и изобутила. Предпочтительно, по меньшей мере, один из R2' и R2” представляет собой Н. Предпочтительно, R2' и R2” представляет собой Н.

Каждый из R3' и R3'' независимо выбран из группы, состоящей из Н и алкила. Подходящим образом, R3' и R3'' каждый независимо выбран из H и C_1-6 алкила. Предпочтительно, каждый из R3' и R3'' независимо выбран из H, метила, этила, пропила, изопропила, бутила и изобутила. Предпочтительно, по меньшей мере, один из R3' и R3” представляет собой Н. Предпочтительно, R3' и R3” представляет собой Н.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, алкил имеет 1-20 атомов углерода, предпочтительно, 1-10 атомов углерода, более предпочтительно, 1-6 атомов углерода, и наиболее предпочтительно, 1-3 атома углерода. Предпочтительно, алкенил, алкинил и циклоалкил имеют 2-20 атомов углерода, предпочтительно, 2-10 атомов углерода, более предпочтительно, 2-6 атомов углерода и наиболее предпочтительно, 2-3 атома углерода. Соответственно, арил имеет 5-12 атомов углерода, предпочтительно, 5-10 атомов углерода, более предпочтительно, 6-10 атомов углерода.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, алкилированная аминокислота алкилирована алкильной группой Формулы (2), где

- R1 представляет собой Н;

- R2' представляет собой Н;

- R2' представляет собой этил;

- R1 представляет собой ацетил;

- R2' представляет собой метил;

- R1 представляет собой этанол;

- R2' изобутил;

- R2” представляет собой Н;

- R3' представляет собой Н; или

- R3” представляет собой Н.

В предпочтительном варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, алкильная группа Формулы (2) имеет одну из комбинаций заместителей из группы:

- R1 представляет собой Н, R2' представляет собой Н, R2” представляет собой Н, R3' представляет собой Н и R3” представляет собой Н;

- R1 представляет собой C(=O)CH3, R2' представляет собой H, R2" представляет собой H, R3' представляет собой H и R3" представляет собой H;

- R1 представляет собой Н, R2' представляет собой СН₂СН₃, R2” представляет собой Н, R3' представляет собой Н и R3” представляет собой Н;

- R1 представляет собой Н, R2' представляет собой СН₃, R2” представляет собой Н, R3' представляет собой Н и R3” представляет собой Н;

- R1 представляет собой CH₂CH₂OH, R2' представляет собой H, R2” представляет собой H, R3' представляет собой H и R3” представляет собой H; и

- R1 представляет собой H, R2' представляет собой C(CH₃)₃, R2" представляет собой H, R3' представляет собой H и R3" представляет собой H.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, алкилированная аминокислота представляет собой одну или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из валина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.

Как описано в примерах, дальнейшие анализы показали, что эти аминокислоты gp40 предпочтительно, алкилируются при инкубации с азиридином.

Как описано выше, белок Cryptosporidium gp40 по изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или ее гомолог. Следовательно, алкилированные аминокислоты, предпочтительно, содержат аминокислоты, соответствующие E88, E94 и D129 из SEQ ID NO: 1.

NB: E и D представляют собой коды аминокислот, соответственно, глутаминовой и аспарагиновой кислот в однобуквенном коде IUPAC. Таким образом: «Е88» относится к глутаминовой кислоте в положении а.к № 88 и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления, белок gp40 по изобретению содержит участок SEQ ID NO: 3, который включает SEQ ID NO: 1. Более предпочтительно, gp40 содержит а.к. № 19-207 SEQ ID NO: 3; а.к. № 15-207; 10-207; 5-207; 4-207; 3-207; 2-207; или даже 1-207 SEQ ID NO: 3, в указанном порядке предпочтения.

Как описано в примерах, одна форма белка gp40 по изобретению, обнаруженная после рекомбинантной экспрессии и инкубации с азиридином, содержит а.к. № 2-207 SEQ ID NO: 3. По-видимому, частичная сигнальная последовательность не была отщеплена, но был отщеплен N-концевой метионин, оставив валин в положении 2 (V2), экспонированным на N-конце gp40. Интересно, что валин также алкилировался при инкубации с азиридином.

Таким образом, в варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению и алкилированной аминокислоты, выбранной из валина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, валин представляет собой валин, соответствующий номеру аминокислоты (а.к. №) 2 из SEQ ID NO: 3; глутаминовая кислота представляет собой глутаминовую кислоту, соответствующую а.к. № 106 или а.к. № 112 из SEQ ID NO: 3; и/или аспарагиновая кислота представляет собой аспарагиновую кислоту, соответствующую а.к. № 147 из SEQ ID NO: 3.

В еще одном аспекте изобретение относится к композиции, содержащей белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, по изобретению.

Как описано, белок Cryptosporidium gp40 и его иммуногенная часть по изобретению, содержащие алкилированные аминокислоты, могут быть получены путем инкубации с азиридином, как описано в настоящем документе.

Следовательно, в следующем аспекте изобретения, белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть по изобретению можно получить путем инкубации композиции, содержащей белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, с азиридином.

Аналогичным образом и в следующем аспекте, изобретение относится к способу получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, где способ включает стадию инкубации композиции, содержащей белок Cryptosporidium gp40, или его иммуногенную часть, с азиридином.

NB: азиридины являются токсичными и мутагенными химическими веществами, которые необходимо хранить, обрабатывать и утилизировать безопасным и соответствующим образом. Азиридины можно нейтрализовать инкубацией с тиосульфатом, например с тиосульфатом натрия (Na₂S₂O₃).

Азиридиновое кольцо представляет собой трехчленный гетероцикл, состоящий из одной амино- и двух метиленовых групп. «Азиридин» представляет собой органическое химическое соединение, содержащее азиридиновое кольцо, и имеет структурную формулу (1):

(1).

R1 выбран из группы, состоящей из: H, алкила, алкилсульфонила, мезила, тозила, нозила, брозила, алкенила, алкинила, алкиларила, арилалкила и циклоалкила, где каждый из алкила, алкенила, алкинила, алкиларила, арилалкила и циклоалкила необязательно замещен заместителем, выбранным из группы, состоящей из карбонила, гидроксила, алкила и галогеналкила. Предпочтительно, R1 выбирают из группы, состоящей из H, ацетила и гидроксиэтила.

Каждый из R2' и R2'' независимо выбран из Н и алкила. Подходящим образом R2' и R2'' каждый независимо выбран из H и C_1-6 алкила. Предпочтительно, каждый из R2' и R2'' независимо выбран из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила, изопропила, бутила и изобутила. Предпочтительно, по меньшей мере, один из R2' и R2” представляет собой Н. Предпочтительно, R2' и R2” представляет собой Н.

Каждый из R3' и R3'' независимо выбран из группы, состоящей из Н и алкила. Подходящим образом R3' и R3'' каждый независимо выбран из H и C_1-6 алкила. Предпочтительно, каждый из R3' и R3'' независимо выбран из H, метила, этила, пропила, изопропила, бутила и изобутила. Предпочтительно, по меньшей мере, один из R3' и R3” представляет собой Н. Предпочтительно, R3' и R3” представляет собой Н.

Соответственно, алкил имеет 1-20 атомов углерода, предпочтительно, 1-10 атомов углерода, более предпочтительно, 1-6 атомов углерода, и наиболее предпочтительно, 1-3 атома углерода. Предпочтительно, алкенил, алкинил и циклоалкил имеют 2-20 атомов углерода, предпочтительно, 2-10 атомов углерода, более предпочтительно, 2-6 атомов углерода, и наиболее предпочтительно, 2-3 атома углерода. Соответственно, арил имеет 5-12 атомов углерода, предпочтительно, 5-10 атомов углерода, более предпочтительно, 6-10 атомов углерода.

Широко используемыми азиридинами для инактивации микроорганизмов являются этиленимин (R1=H) и 1-ацетилэтиленимин (R1=ацетил).

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, азиридин представляет собой азиридин Формулы (1), где R1 представляет собой H или представляет собой ацетил.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, азиридин представляет собой азиридин Формулы (1), где

- R1 представляет собой Н;

- R2' представляет собой Н;

- R2' представляет собой этил;

- R1 представляет собой ацетил;

- R2' представляет собой метил;

- R1 представляет собой этанол;

- R2' изобутил;

- R2” представляет собой Н;

- R3' представляет собой Н; или

- R3” представляет собой Н.

Азиридиновое кольцо очень реакционноспособно и может раскрыться в результате реакции одного из метиленов, например, с белком, что приводит к алкилированию сульфгидрильной группы. Аминокислоты цистеина легко алкилируются азиридином. При щелочном рН также тиоэфир метионина может быть алкилирован азиридином.

При алкилировании белка азиридином по изобретению, открытое кольцо азиридина становится присоединенным к одной или нескольким его аминокислотам в виде алкильной группы. Например, одну или более аминокислот алкилируют алкильной группой формулы (2), где в формуле (2) пунктирная линия представляет связь с аминокислотой.

(2)

R1 выбран из группы, состоящей из: H, алкила, алкилсульфонила, мезила, тозила, нозила, брозила, алкенила, алкинила, алкиларила, арилалкила и циклоалкила, где каждый из алкила, алкенила, алкинила, алкиларила, арилалкила и циклоалкила необязательно замещен заместителем, выбранным из группы, состоящей из карбонила, гидроксила, алкила и галогеналкила. Предпочтительно, R1 выбран из группы, состоящей из H, ацетила и гидроксиэтила.

Каждый из R2' и R2'' независимо выбран из Н и алкила. Подходящим образом, R2' и R2'' каждый независимо выбран из H и C_1-6 алкила. Предпочтительно, каждый из R2' и R2'' независимо выбран из группы, состоящей из H, метила, этила, пропила, изопропила, бутила и изобутила. Предпочтительно, по меньшей мере, один из R2' и R2” представляет собой Н. Предпочтительно, R2' и R2” представляет собой Н.

Каждый из R3' и R3'' независимо выбран из группы, состоящей из Н и алкила. Подходящим образом, R3' и R3'' каждый независимо выбран из H и C_1-6 алкила. Предпочтительно, каждый из R3' и R3'' независимо выбран из H, метила, этила, пропила, изопропила, бутила и изобутила. Предпочтительно, по меньшей мере, один из R3' и R3” представляет собой Н. Предпочтительно, R3' и R3” представляет собой Н.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, азиридин представляет собой азиридин Формулы (1), имеющий одну из комбинаций заместителей из группы:

- R1 представляет собой Н, R2' представляет собой Н, R2” представляет собой Н, R3' представляет собой Н и R3” представляет собой Н;

- R1 представляет собой C(=O)CH3, R2' представляет собой H, R2" представляет собой H, R3' представляет собой H и R3" представляет собой H;

- R1 представляет собой Н, R2' представляет собой СН₂СН₃, R2” представляет собой Н, R3' представляет собой Н и R3” представляет собой Н;

- R1 представляет собой Н, R2' представляет собой СН₃, R2” представляет собой Н, R3' представляет собой Н и R3” представляет собой Н;

- R1 представляет собой CH₂CH₂OH, R2' представляет собой H, R2” представляет собой H, R3' представляет собой H и R3” представляет собой H; и

- R1 представляет собой H, R2' представляет собой C(CH₃)₃, R2" представляет собой H, R3' представляет собой H и R3" представляет собой H.

В предпочтительном варианте осуществления азиридина по изобретению, применяется одно из условий, выбранных из:

- этиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 151-56-4,

- 2-этилэтиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 2549-67-9 ,

- 1-ацетилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 460-07-1,

- 2-метилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 75-55-8,

- 1-этиленимин-этанол предпочтительно, представляет собой CAS № 1072-52-2 и

- 2-изобутилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 3647-37-8.

Как описано, такая инкубация с азиридином приводит к алкилированию белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, особенно аминокислот, выбранных из: цистеина, метионина, серина, треонина, тирозина, лизина, аргинина, валина, глутаминовой кислоты, и аспарагиновой кислоты. Это алкилирование, в свою очередь, придает такому белку или его части повышенную иммуногенность.

Для белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также для способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, «инкубация» включает обычные процедуры, такие как объединение водных композиций, содержащих указанные компоненты, и их взаимодействие в течение определенного времени и при определенных условиях. Подходящими условиями для этой инкубации являются такие, которые приводят к обнаруживаемому увеличению иммуногенности белка gp40 или его части. Такую инкубацию с азиридином можно проводить при самых разных условиях и параметрах, все из которых хорошо известны специалисту в области техники изобретения и легко доступны для оптимизации и адаптации обычными способами, когда это необходимо.

Например, указанную инкубацию можно проводить в широком диапазоне температур. Предпочтительно, инкубацию с азиридином проводят при температуре выше нуля градусов Цельсия, более предпочтительно, от 1 до 55°С, от 5 до 50°С, от 10 до 40°С или даже от 15 до 40°С, в указанном порядке предпочтения.

Аналогично, инкубацию с азиридином можно проводить при широком диапазоне значений pH. Однако наиболее эффективной будет инкубация при не очень кислом значении рН, поскольку алкилирование аминокислот азиридином может быть менее эффективным при очень кислом уровне рН.

Поэтому в варианте осуществления указанного способа, инкубацию с азиридином проводят при рН выше 4, более предпочтительно, при рН выше 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7 или даже при рН выше 7,5, в указанном порядке предпочтения.

Верхний предел значения рН для инкубации с азиридином в способе легко определяется по отношению к другим параметрам инкубации. Предпочтительно, инкубацию с азиридином проводят при рН ниже 12, ниже 10 или даже ниже 9, в указанном порядке предпочтения.

Как понятно специалисту в данной области техники, поскольку азиридин расходуется во время реакции инкубации, его концентрацию можно с уверенностью указать только в начале инкубации.

Следовательно, в варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, концентрация азиридина в начале инкубации составляет, по меньшей мере, 0,1 мМ, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 30, 40 или даже, по меньшей мере, 50 миллимолей, в указанном порядке предпочтения.

Верхний предел концентрации азиридина может быть легко определен. В одном варианте осуществления, концентрация азиридина в начале инкубации составляет менее 1 М, менее 0,5 М или даже менее 0,1 М, в указанном порядке предпочтения.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, продолжительность инкубации композиции, содержащей белок или его фрагмент и азиридин, составляет, по меньшей мере, 10 минут, более предпочтительно, по меньшей мере, 20, 30, 40, 50, 60 минут, 1,5 часа, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 24 или даже, по меньшей мере, 36 часов в порядке предпочтения. В варианте осуществления, продолжительность составляет в течение ночи (т.е. 12-18 часов).

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого в соответствии с изобретением, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части в соответствии с изобретением, дополнительную стадию проводят после инкубации с азиридином, где эта стадия обеспечивает нейтрализацию любого оставшегося азиридина.

В предпочтительном варианте осуществления, стадию нейтрализации осуществляют путем добавления к смеси для инкубации, после реакции инкубации, соответствующего количества тиосульфата, и инкубации в течение соответствующего периода времени для завершения нейтрализации. Например: нейтрализация добавлением от 10 до 100 мМ тиосульфата натрия и инкубация от 15 до 90 минут при температуре от 15 до 30°C.

На практике, количество тиосульфата, используемого для нейтрализации, будет небольшой передозировкой. Это служит гарантией: когда после реакции нейтрализации остается некоторое количество тиосульфата, можно быть уверенным, что весь азиридин израсходован.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, азиридин выбран из: этиленимина (R1=H), 2-этилэтиленимина (R2'=этил), 1-ацетилэтиленимина (R1=ацетил), 2-метилэтиленимина (R2'=метил), 1-этилениминэтанола (R1=этанол) и 2-изобутилэтиленимина (R2'=изобутил).

В предпочтительном варианте осуществления азиридина по изобретению, применяется одно из условий, выбранных из:

- этиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 151-56-4,

- 2-этилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 2549-67-9,

- 1-ацетилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 460-07-1,

- 2-метилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 75-55-8,

- 1-этиленимин-этанол предпочтительно, представляет собой CAS № 1072-52-2, и

- 2-изобутилэтиленимин предпочтительно, представляет собой CAS № 3647-37-8.

Поскольку азиридин является достаточно опасным химическим веществом, его предпочтительно использовать для инкубации по изобретению в разбавленной форме.

Для этиленимина, это удобным образом может быть достигнуто применением так называемого «бинарного этиленимина» (BEI). BEI представляет собой продукт реакции циклизации бромэтиламингидробромида (BEA) в щелочных условиях и при умеренном нагревании, например, примерно до 37°C. Щелочные условия могут быть удобно обеспечены добавлением, например, гидроксида натрия. Все это хорошо известно в данной области техники, см., например, Bahnemann 1990 (выше).

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, азиридин представляет собой этиленимин или представляет собой бинарный этиленимин.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого в соответствии с изобретением, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части в соответствии с изобретением, дополнительную стадию проводят перед инкубацией с азиридином, и на ней получают BEI.

Затем соответствующее количество полученного BEI используют в качестве азиридина для инкубации с композицией, содержащей белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть.

Предпочтительно, BEI получают в результате реакции BEA с гидроксидом.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, белок gp40, или его иммуногенная часть происходит от C. parvum; более предпочтительно, из C. parvum генотипа II.

Для изобретения, «из C. parvum» означает, что аминокислотная последовательность белка gp40 или его части основана на белке gp40 из видов C. parvum либо непосредственно путем выделения белка или кодирующей нуклеиновой кислоты; либо косвенно, например, на основе информации о последовательности такого белка gp40 C. parvum.

Белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенная часть по изобретению, таким образом, предпочтительно, представляет собой выделенный белок, что означает, что он не находится в своем естественном контексте в или на живом паразите Cryptosporidium.

Композицию, содержащую белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, для применения в инкубации с азиридином по изобретению, можно получить различными способами, среди которых находится выделение паразитов Cryptosporidium, полученных из живого инфицированного организма-хозяина. Также белок или его часть можно получить в бесклеточной системе транскрипции.

Однако наиболее удобным и масштабируемым до уровней промышленного производства является получение белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, для применения в изобретении, путем экспрессии in vitro с использованием рекомбинантной системы экспрессии. Такая система экспрессии может использовать систему клеточной культуры прокариотических или эукариотических клеток, которые были генетически модифицированы для экспрессии желаемого белка. Альтернативно, клетки могут быть хозяином для рекомбинантного микроорганизма, такого как вирус, который индуцирует клетки для экспрессии желаемого белка. Примерами рекомбинантных систем экспрессии являются: генетически модифицированные клетки яичника китайского хомяка (CHO), бактерии, такие как E. coli, виды Bacillus или Staphylococcus carnosus; или виды дрожжей, например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastores. Примеры применения рекомбинантного вируса для экспрессии из клетки-хозяина включают: системы бакуловирус-клетка насекомого или аденовирус-клетка млекопитающих.

Следовательно, в варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, дополнительная стадия осуществляется для получения композиции, содержащей белок gp40 или его часть, посредством рекомбинантной системы экспрессии; предпочтительно, посредством системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого.

Система экспрессии бакуловирус-клетка насекомого хорошо известна с 1980-х годов, обзор см. в Chambers et al., 2018, Curr. Protoc. Protein Sci., vol. 91, p. 5.4.1-5.4.6.

Более предпочтительным является продуцирование экспрессионной системой бакуловирус-клетка насекомого белка Cryptosporidium gp40 путем экспрессии последовательности рекомбинантной ДНК SEQ ID NO: 2 в качестве гетерологичной вставки для рекомбинантного бакуловируса.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, где композиция включает белок gp40 или его часть (до инкубации с азиридином), полученный с помощью системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, указанную композицию собирают из культуры клеток насекомого, например, в виде целой культуры или в виде части такой культуры, например, супернатанта или дебриса после центрифугирования культуры клеток насекомых, или фильтрата или ретентата после фильтрации.

Более предпочтительно, композиция, содержащая белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, представляет собой супернатант или фильтрат культуры системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого. Супернатант может быть получен после отстаивания культуры под действием силы тяжести, например, выдерживая в течение ночи или центрифугированием; фильтрат представляет собой то, что проходит через фильтр при фильтрации.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, где композиция включает белок gp40 или его часть, полученный посредством рекомбинантной системы экспрессии, после получения и сбора указанной композиции из системы экспрессии и перед инкубацией с азиридином проводят дополнительную стадию, где стадия включает очистку указанной композиции. Предпочтительно, очистка осуществляется посредством колоночной хроматографии. Более предпочтительно, белок gp40 или его часть содержит метку, облегчающую очистку указанной композиции с помощью колоночной хроматографии, такую как гистидиновая метка для металло-аффинной хроматографии.

Так как инкубация с азиридином также является эффективным средством для химической инактивации микроорганизма, получение алкилированного белка или его алкилированной иммуногенной части по изобретению можно удобно комбинировать с инактивацией микроорганизма, например вируса или бактерии.

Следовательно, в варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, композиция, содержащая белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, также содержит микроорганизм. Микроорганизм может, например, представлять собой паразита C. parvum, инактивированного азиридином; хотя это инактивирует паразита, оно также вызывает алкилирование белка gp40. Предпочтительно, микроорганизм представляет собой вирус или бактерию, например такие, которые используются в рекомбинантной системе экспрессии.

Условия для инактивации многих микроорганизмов с использованием азиридина хорошо известны в данной области техники. Любая желаемая адаптация или оптимизация могут быть легко выполнены обычными способами.

В варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, а также способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, применяют одно или несколько условий, выбранных из группы, состоящей из:

- инкубацию с азиридином проводят при температуре выше нуля градусов Цельсия, более предпочтительно, от 1 до 55°С, от 5 до 50°С, от 10 до 40°С или даже от 15 до 40°С, в указанном порядке предпочтения;

- инкубацию с азиридином проводят при рН выше 4, более предпочтительно, при рН выше 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7 или даже при рН выше 7,5 в указанном порядке предпочтения;

- инкубацию с азиридином проводят при рН ниже 12, ниже 10 или даже ниже 9, в указанном порядке предпочтения;

- концентрация азиридина в начале инкубации составляет, по меньшей мере, 0,1 мМ, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,2, 0,3, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 20, 30, 40 или даже, по меньшей мере, 50 миллимолей, в указанном порядке предпочтения;

- концентрация азиридина в начале инкубации ниже 1 моля, ниже 0,5 моля или даже ниже 0,1 моля, в указанном порядке предпочтения;

- продолжительность инкубации композиции, содержащей белок или его фрагмент и азиридин, составляет, по меньшей мере, 10 минут, более предпочтительно, по меньшей мере, 20, 30, 40, 50, 60 минут, 1,5 часа, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 24 или даже, по меньшей мере, 36 часов, в указанном порядке предпочтения; в варианте осуществления, продолжительность составляет ночь (т.е. 12-18 часов);

- после инкубации с азиридином проводят дополнительную стадию, которая обеспечивает нейтрализацию любого оставшегося азиридина; в предпочтительном варианте осуществления, нейтрализацию осуществляют путем добавления к инкубационной смеси соответствующего количества тиосульфата;

- азиридин выбран из: этиленимина, 2-этилэтиленимина, 1-ацетилэтиленимина, 2-метилэтиленимина, 1-этилениминэтанола и 2-изобутилэтиленимина;

- для азиридина применяется одно из условий, выбранных из:

○ этиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 151-56-4,

○ 2-этилэтиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 2549-67-9,

○ 1-ацетилэтиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 460-07-1,

○ 2-метилэтиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 75-55-8,

○ 1-этилениминэтанол, предпочтительно, представляет собой CAS № 1072-52-2, и

○ 2-изобутилэтиленимин, предпочтительно, представляет собой CAS № 3647-37-8;

- азиридин представляет собой этиленимин или бинарный этиленимин;

- перед инкубацией с азиридином проводят дополнительную стадию, на которой получают BEI; затем соответствующее количество полученного BEI используют в качестве азиридина для инкубации с композицией, содержащей белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть; предпочтительно, BEI получают в результате реакции BEA с гидроксидом;

- белок gp40 или его иммуногенная часть получен из C. parvum; более предпочтительно, из C. parvum генотипа II;

- проводят дополнительную стадию для получения композиции, содержащей белок или его часть, которую необходимо инкубировать с азиридином на более поздней стадии способа, посредством рекомбинантной системы экспрессии; предпочтительно, посредством системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого; более предпочтительно, стадия представляет собой получение, посредством системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, белка Cryptosporidium gp40 путем экспрессии последовательности рекомбинантной ДНК SEQ ID NO: 2 в виде гетерологичной вставки;

- композицию, содержащую белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, которую получают посредством системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, собирают из культуры клеток насекомого, например, в виде всей культуры, или в виде супернатанта или дебриса осадка после центрифугирования культуры клеток насекомых, в виде фильтрата или ретентата;

- композиция, содержащая белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, представляет собой супернатант или фильтрат культуры системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого;

- дополнительную стадию проводят после получения и сбора композиции, содержащей белок или его часть, с помощью рекомбинантной системы экспрессии, где стадия включает очистку указанной композиции; предпочтительно, очистку колоночной хроматографией; более предпочтительно, белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенная часть содержит метку, облегчающую очистку указанной композиции колоночной хроматографией, такую как гистидиновая метка для металло-аффинной хроматографии; и

- композиция, содержащая белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, также содержит микроорганизм; предпочтительно, микроорганизм представляет собой вирус или бактерию.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части, получаемого по изобретению, применяют один или более или все признаки, выбранные из:

- азиридин представляет собой этиленимин или представляет собой бинарный этиленимин,

- Cryptosporidium gp40 получен от Cryptosporidium parvum,

- композиция, содержащая белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, представляет собой супернатант или фильтрат из культуры системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, и

- указанный супернатант или фильтрат очищают колоночной хроматографией.

Аналогичным образом, в предпочтительном варианте осуществления способа получения белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, применяют один или более или все признаки, выбранные из:

- азиридин представляет собой этиленимин или представляет собой бинарный этиленимин,

- Cryptosporidium gp40 получен из Cryptosporidium parvum,

- композиция, содержащая белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть, представляет собой супернатант или фильтрат из культуры системы экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, и

- указанный супернатант или фильтрат очищают колоночной хроматографией.

Как описано, изобретение представляет иммуноген для безопасной и эффективной вакцины против криптоспоридиоза. Cryptosporidium gp40 или его иммуногенная часть по изобретению, содержащие одну или более алкилированных аминокислот, особенно полезны в этом отношении, поскольку они обладают повышенной иммуногенностью.

Следовательно, в другом аспекте, изобретение относится к белку Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, или к тому, что может быть получено по изобретению, или к тому, что может быть получено способом по изобретению, для использования в вакцине для защиты человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, от криптоспоридиоза.

Аналогичным образом, в другом аспекте, изобретение относится к применению белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, или получаемого по изобретению, или получаемого способом по изобретению, для производства вакцины для защиты человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, от криптоспоридиоза.

Хорошо известно, что «вакцина» представляет собой композицию, содержащую иммуноген и фармацевтически приемлемый носитель. Иммуноген вызывает иммунологический ответ у вакцинированной мишени, где ответ эффективен для защиты от заболевания или от инфекции или ее последствий. Защита касается снижения нагрузки или сокращения продолжительности репликации патогена, против которого направлена вакцинация. В свою очередь это приводит к снижению у вакцинированных мишеней количества, интенсивности или тяжести поражений, сопутствующих симптомов и клинических признаков заболевания, вызванного возбудителем.

Определение эффективности вакцины по изобретению находится в пределах квалификации практикующего врача и может быть выполнено, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации или путем проверки появления клинических симптомов или смертности после инфекционной иммунизации, например, путем мониторинга признаков заболевания у мишеней, клинических оценок, серологических параметров или путем повторного выделения контрольного патогена и сравнения этих результатов с ответом на контрольную вакцинацию, наблюдаемым у ложно вакцинированных животных. В данной области техники известно множество способов измерения и характеризации соответствующих патогенов, их симптомов и заболеваний.

Белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенная часть по изобретению для применения в вакцине по изобретению, а также их применение для изготовления вакцины по изобретению, эффективны для защиты от «криптоспоридиоза». Этот термин относится к совокупности симптомов, вызванных заражением восприимчивой мишени паразитом Cryptosporidium. В основном такие симптомы касаются диареи, но некоторые виды паразита могут вызывать и респираторное заболевание. Симптомы ветеринарного криптоспоридиоза описаны в "The Merck veterinary manual" (выше).

Для изобретения, «защита ... от криптоспоридиоза» касается снижения тяжести и/или продолжительности диареи, вызванной паразитом Cryptosporidium. Вакцина по изобретению эффективна в этом отношении, как показано в разделе «Примеры».

Защита создается в самой вакцинированной мишени. Кроме того, при иммунизации млекопитающего-мишени, защита может быть обеспечена косвенно, путем молозивного переноса. Это касается сбора молока у вакцинированного беременного млекопитающего примерно во время родов и кормления этим молоком (или антителами, полученными из него) человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека.

Результатом этой защиты является восстановление общего состояния здоровья (пассивно) вакцинированных мишеней. В ветеринарии защита от криптоспоридиоза приводит к повышению экономических показателей у (пассивно) вакцинированных животных, что отражается в одном или нескольких параметрах: снижение смертности, лучший среднесуточный привес, улучшенная конверсия корма, улучшенный удой, улучшенная репродуктивность и/или снижение затрат на здравоохранение.

В дополнение к уменьшению симптомов заболевания, особенно диареи, защита касается снижения вероятности заражения паразитами Cryptosporidium за счет уменьшения выделения ооцист вакцинированными мишенями в окружающую среду стада или популяции, а также внутри географической площади. Следовательно, защита изобретения также приводит к снижению распространенности паразитов Cryptosporidium.

В предпочтительном варианте осуществления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, для применения в вакцине по изобретению, а также для применения для изготовления вакцины по изобретению, вакцина предназначена для защиты жвачных животных; более предпочтительно, для защиты новорожденного крупного рогатого скота путем молозивного переноса.

Для изобретения, «жвачное животное» относится к любому жвачному животному, имеющему отношение к ветеринарии или коммерческому животноводству. Предпочтительно, оно относится к коровам, козам, овцам или оленям. Более предпочтительными являются крупный рогатый скот, козы и овцы. Наиболее предпочтительным жвачным животным является крупный рогатый скот.

«Крупный рогатый скот» по изобретению представляет собой крупный рогатый скот европейскую корову (Bos taurus), крупный рогатый скот зебу (Bos indicus), буйвола, бизона, яка или зубра. Крупный рогатый скот может быть любого типа: молочный или мясной, или родительское поголовье для молочного или мясного типа.

Для достижения защиты от криптоспоридиоза, как описано, белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть по изобретению, содержащий одну или более алкилированных аминокислот, составляют и вводят в виде вакцины.

Следовательно, в следующем аспекте, изобретение относится к вакцине против криптоспоридиоза для человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, где указанная вакцина содержит белок Cryptosporidium gp40 или его иммуногенную часть по изобретению, или может быть получена по изобретению, или может быть получена способом по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.

«Фармацевтически приемлемый носитель» помогает в производстве, введении и/или консервации вакцины, не вызывая (тяжелых) побочных эффектов. Такой носитель может представлять собой водный раствор, например воду, буфер или культуральную среду.

Предпочтительным фармацевтически приемлемым носителем для вакцины по изобретению является среда для культивирования клеток насекомых, или буфер, такой как солевой раствор, PBS или 50 мМ HEPES.

Кроме того, фармацевтически приемлемый носитель может содержать дополнительные добавки и эксципиенты, такие как наполнитель, стабилизатор, консервант или адъювант. Подробности и примеры хорошо известны, например, они описаны в таких справочниках, как: “Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincott, USA, ISBN: 683306472), и: “Veterinary vaccinology” (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

Кроме того, вакцина по изобретению может содержать адъювант. В особенности для субъединичных вакцин это дополнительно усиливает иммунный ответ мишени против субъединичного антигена.

Следовательно, в варианте осуществления, вакцина по изобретению отличается тем, что она содержит адъювант.

«Адъювант» представляет собой хорошо известный ингредиент вакцины, который неспецифическим образом стимулирует иммунный ответ мишени. В данной области техники известно множество различных адъювантов. Примерами адъювантов являются: полный или неполный адъювант Фрейнда, витамин Е или альфа-токоферол, неионные блок-полимеры и полиамины, такие как сульфат декстрана, Carbopol™, пиран, сапонин, такой как Quil A™ или Q-vac™. Сапонин и компоненты вакцины могут быть объединены в ISCOM™.

Кроме того, пептиды, такие как мурамилдипептиды, диметилглицин, тафтсин, часто используют в качестве адъювантов, и минеральное масло, например, Bayol™, Drakeol™, Klearol™ или Marcol™, Montanide™ или легкое минеральное (парафиновое) масло; не минеральные масла, такие как сквален, сквалан; растительные масла или их производные, например этилолеат. Также можно успешно использовать комбинированные продукты, такие как ISA™ (Seppic) или DiluvacForte™ и Xsolve™ (оба от MSD Animal Health). Еще одной опцией является использование адъюванта SVEA (содержащего сквалан и ацетат витамина Е), как описано в WO 2018/115435.

Справочник по адъювантам, их применению и действию: “Vaccine adjuvants” (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O’Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).

В варианте осуществления вакцины по изобретению, адъювант представляет собой один или более адъювантов, выбранных из соли алюминия и масла. Масло представляет собой минеральное масло или не минеральное масло; предпочтительно, масло представляет собой минеральное масло. Соль алюминия, предпочтительно, представляет собой гидроксид алюминия.

В качестве адъюванта на основе минерального масла в ветеринарных вакцинах широко используется светлое (или белое) жидкое парафиновое масло, такое как Drakeol® 6VR (Penreco), Marcol® 52 (Exxon Mobile) и Klearol® (Sonneborn). Альтернативой является предварительно смешанная смесь минерального масла/эмульгатора, такая как линейка Montanide® от Seppic, France.

Обычными адъювантами, не относящимися к минеральному маслу, являются сквален и сквалан (масло печени акулы), этилолеат и токоферол (витамин Е). Масляная фаза может содержать эксципиенты, такие как эмульгатор и стабилизаторы.

Обычными эмульгаторами для вакцин являются сорбитанмоноолеат (Span® 80) и полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат (полисорбат 80 или Tween® 80). Обычными стабилизаторами эмульсии являются бензиловый спирт и триэтаноламин.

Широко используемой солью алюминия является гидроксид алюминия, например, Alhydrogel™ (Brenntag Biosector), Rehydragel™ (Reheis) и Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical).

Вакцина с масляным адъювантом может быть составлена в виде эмульсии водной и масляной фаз; предпочтительно, эмульсия относится к типу, выбранному из: вода-в-масле (в/м), масло-в-воде (м/в), вода-в-масле-в-воде (в/м/в) и двойная масляная эмульсия (м/в/м).

Более предпочтительной является вакцина по изобретению, в которой адъювантом является масло, и которая составлена в виде эмульсии вода-в-масле.

Таким образом, в варианте осуществления вакцины по изобретению, вакцина составлена в виде эмульсии вода-в-масле.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению, содержащей адъювант, адъювант включает масло; предпочтительно, масло представляет собой легкое парафиновое масло.

Более предпочтительно, адъювант также содержит соль алюминия; соль алюминия предпочтительно, представляет собой гидроксид алюминия.

В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению, указанная вакцина предназначена для вакцинации беременных млекопитающих. Предпочтительно, беременным млекопитающим является жвачное животное, более предпочтительно, крупный рогатый скот.

Это позволит собирать молозиво от указанного млекопитающего примерно во время родов, и это молозиво затем может быть использовано для обеспечения пассивной защиты от криптоспоридиоза человека или животного, отличного от человека, путем кормления этим молозивом или содержащимися в нем антителами.

Вакцину по изобретению можно вводить человеку-мишени или мишени, отличной от человека, различными путями.

В одном варианте осуществления, вакцину по изобретению вводят парентеральным путем, т.е. через кожу, например: внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подслизисто или подкожно. Предпочтительным путем введения является внутрикожный, внутримышечный или подкожный путь.

Объем на дозу вакцины по изобретению может быть выбран в соответствии с характеристиками конкретной применяемой вакцины, характеристиками мишени и предполагаемым путем применения. Парентеральные инъекции обычно осуществляют в дозе 0,01-10 мл/мишень. Для взрослого представителя крупного рогатого скота, предпочтительный объем на дозу составляет 0,5 мл при подкожном введении и 1-2 мл при в/м введении.

Преимущество алкилирования азиридином по изобретению заключается в том, что в дозе вакцины необходимо использовать меньшее количество белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, по сравнению с белком gp40 или его частью, который не содержит одну или более алкилированных аминокислот, при этом обеспечивая хороший уровень защиты. Выбор количества белка gp40 или его части на дозу может быть сделан специалистом в данной области техники на основе характеристик вакцины и мишени.

Следовательно, в варианте осуществления, вакцина по изобретению содержит от 0,01 до 50 мкг белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу вакцины. Предпочтительно, вакцина содержит от 0,05 до 20 мкг, от 0,1 до 10 или даже от 0,1 до 5 мкг белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу, в указанном порядке предпочтения.

Наиболее предпочтительно, вакцина содержит 0,5-2 мкг белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу для взрослой особи крупного рогатого скота.

В варианте вакцины по изобретению, где вакцина предназначена для вакцинации крупного рогатого скота, вакцина содержит менее 10 мкг белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу. Предпочтительно, вакцина по изобретению, предназначенная для крупного рогатого скота, содержит менее 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или даже менее 2 мкг белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, на дозу.

Наиболее предпочтительно, вакцина содержит 1 мкг белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу для взрослой особи крупного рогатого скота.

Количество белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу можно проанализировать в готовой вакцинной эмульсии. Это можно сделать с помощью стандартных биохимических лабораторных процедур, например, путем разрушения эмульсии и тестирования водной фазы с помощью SDS-PAGE. Затем количество белка определяют путем сравнения с известным количеством эталонного белка, например альбумина. См., например: The Protein Protocols Handbook, 2nd edition, September 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Chapter 29, p. 237-242.

Предпочтительно, количество белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению определяют с помощью ELISA антигенной массы, как это описано ниже. Альтернативно, количественное определение белка может быть выполнено с использованием жидкостной хроматографии, такой как ВЭЖХ, или с помощью масс-спектрометрии.

Предпочтительно, количество белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению на дозу определяют в водной фазе вакцины по изобретению перед смешиванием с солью алюминия и/или перед эмульгированием с масляной фазой.

Схема введения вакцины по изобретению выбирают исходя из предполагаемого типа защиты: вакцинация для обеспечения активной защиты самой вакцинируемой мишени или вакцинация для образования молозива для пассивной вакцинации.

Активная вакцинация мишени может мобилизовать гуморальный и клеточный иммунный ответ, и может быть рассчитана в удобное время. Ее можно проводить независимо от возраста, веса, пола, иммунологического статуса и других параметров вакцинируемой мишени. Активная вакцинация может быть проведена в виде разовой дозы, за которой может последовать, например, ревакцинация примерно через две недели с последующими ежегодными ревакцинациями.

Однако пассивная вакцинация посредством молозивного переноса почти исключительно опосредована антителами. Поэтому вакцинацию для образования такого молозива необходимо приурочить к предполагаемой дате родов, чтобы получить высокие уровни gp40-специфических антител в молозиве. Для разных видов млекопитающих известна продолжительность их беременности, поэтому можно выбрать и оптимизировать сроки этой вакцинации. Для выработки молозива у коров, беременную корову предпочтительно, двукратно вакцинируют вакциной по изобретению: ревакцинация в период 1-4 недель до ожидаемого отела, и первичная вакцинация за 1-12 недель до ревакцинации. Предпочтительно: ревакцинацию проводят за 2-4 недели до ожидаемого отела, и первичную вакцинацию, за 2-6 недель до ревакцинации. Если корова уже получила первичную и ревакцинацию во время предыдущей беременности, может быть достаточно сделать только одну вакцинацию для последующих беременностей в период 1-12 недель до ожидаемого отела; желательно за 2-8 недель до ожидаемого отела.

Предпочтительно, чтобы способ, время и объем введения вакцины по изобретению были интегрированы в существующие схемы вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться человеку-мишени или животному-мишени, чтобы уменьшить стресс для мишени и для снижения трудозатрат. Эти другие вакцины можно вводить одновременно, параллельно или последовательно, и способом, совместимым с их лицензированным использованием.

В предпочтительном варианте осуществления, вакцину по изобретению вводят беременной самке крупного рогатого скота, и вводят в комбинации с другими вакцинами, предназначенными для защиты новорожденных телят от неонатальной диареи путем молозивного переноса. Примерами таких других вакцин являются: Guardian® (Merck Animal Health) эмульсия В/М, содержащая адъювант минерального масла, которую вводят подкожно; и: Rotavec® Corona (MSD Animal Health), эмульсия В/М, которая содержит в качестве адъюванта и минеральное масло, и соль алюминия, и вводится внутримышечно. Предпочтительным методом комбинирования является так называемое «ассоциированное не смешанное» использование.

В зависимости от животного-мишени, предполагаемого заболевания, пути введения и т. д. может потребоваться адаптация элементов вакцины по изобретению или ее введения. Это находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники и, как правило, включает тонкую настройку эффективности вакцины. Этого можно добиться адаптацией, например, дозы вакцины, количества, частоты введения, способа введения, эксципиентов и т. д.

Само собой разумеется, что смешивание других соединений, таких как стабилизаторы, носители, адъюванты, разбавители, эмульсии и подобные, с вакцинами по изобретению также входит в объем изобретения. Такие добавки описаны в известных справочниках, таких как: «Remington» и «Veterinary Vaccinology» (оба выше).

Для вакцины по настоящему изобретению может оказаться полезным создание дополнительных комбинаций с дополнительными иммуноактивными компонентами. Это может служить для усиления уже имеющейся иммунной защиты или для распространения ее на другие патогены.

Следовательно, в одном варианте осуществления, вакцина по изобретению содержит, по меньшей мере, один дополнительный иммуноактивный компонент.

Такой «дополнительный иммуноактивный компонент» может представлять собой антиген, иммуностимулирующее вещество, адъювант или иммуномодулятор, цитокин, другую вакцину или любую их комбинацию. Это дает преимущества с точки зрения стоимости, эффективности и целевого качества жизни. Альтернативно, вакцина по изобретению сама может быть добавлена к другой вакцине.

Общие методы и соображения, применимые к производству вакцин в соответствии с общеизвестными стандартами фармацевтического производства, описаны, например, в правительственных директивах и постановлениях (Фармакопея, 9CFR) и в известных справочниках (“Veterinary vaccinology” и “Remington”, оба выше). Обычно такие вакцины готовят стерильными и готовят с использованием эксципиентов фармацевтического сорта качества.

Такие препараты будут включать микробиологические тесты на стерильность и отсутствие посторонних агентов; и могут включать исследования in vivo или in vitro для подтверждения эффективности и безопасности. После завершения тестирования на качество, количество, стерильность, безопасность и эффективность, вакцина может быть выпущена в продажу. Все это хорошо известно специалисту в данной области техники.

Следовательно, в следующем аспекте, изобретение относится к способу изготовления вакцины по изобретению, где способ включает стадию составления белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, или в том виде, в котором он может быть получен по изобретению, или, в котором он может быть получен способом по изобретению, в вакцину.

Такое составление может включать простое смешивание белка gp40 или его иммуногенной части с фармацевтически приемлемым носителем. Также оно может включать смешивание с адъювантом, как описано, включая эмульгирование, и/или смешивание, по меньшей мере, с одним дополнительным иммуноактивным компонентом.

Вариант вакцины против криптоспоридиоза по изобретению представляет собой молозиво, которое вырабатывается беременным млекопитающим, иммунизированным вакциной по изобретению. Это молозиво очень эффективно для пассивной вакцинации человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, против криптоспоридиоза. Молозиво можно скармливать или поить мишень, и оно обеспечивает кишечную, слизистую и/или системную иммунную защиту от криптоспоридиоза. Альтернативно, можно вводить антитела, полученные из такого молозива.

Молозиво может быть получено путем вакцинации беременных млекопитающих перед родами вакциной по изобретению.

Следовательно, в следующем аспекте, изобретение относится к способу получения молозива, включающему антитела против белка Cryptosporidium gp40 или его иммуногенной части по изобретению, или получаемые по изобретению, или получаемые способом по изобретению, где способ, включающий стадии:

а. вакцинации беременного млекопитающего, по меньшей мере, один раз вакциной по изобретению, и

b. сбор молозива из молочных желез указанного млекопитающего.

Как известно, «молозиво» представляет собой это молоко, выделяемое молочными железами млекопитающего в период, предшествующий родам.

Предпочтительно, молозиво по изобретению представляет собой молоко, выделяемое в период от 1 дня до 4 дней после родов; более предпочтительно, от 1 часа до 72 часов после родов.

Более предпочтительно, молозиво по изобретению выделяется жвачным животным; еще более предпочтительно, крупным рогатым скотом, как определено в настоящем документе. Еще более предпочтительно, молозиво по изобретению собирают у указанного крупного рогатого скота при первом, втором, третьем и четвертом доениях после отела.

В варианте осуществления способа получения молозива по изобретению, мишенью является жвачное животное; предпочтительно, мишенью является крупный рогатый скот, как определено в настоящем документе.

Молозиво по изобретению содержит антитела против белка Cryptosporidium gp40 или против его иммуногенной части по изобретению, где антитела имеют более высокую концентрацию и/или отличаются по авидности или специфичности по сравнению с антителами в молозиве млекопитающего, вакцинированного белком gp40 или его частью, не содержащим одну или более алкилированных аминокислот.

Вакцинацию беременных млекопитающих предпочтительно проводят в соответствии со схемой вакцинации, описанной в настоящем документе.

Сбор молозива предпочтительно, осуществляется в период от 1 дня до родов до 4 дней после родов, более предпочтительно, начиная со дня родов и в течение, по меньшей мере, 3 дней, как описано в настоящем документе.

В следующем аспекте изобретение относится к молозиву, полученному способом получения молозива по изобретению, для использования для защиты человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, от криптоспоридиоза.

В предпочтительном варианте молозива для применения по изобретению, защита достигается путем кормления мишени молозивом или антителами, полученными из молозива.

Как описано, изобретение относится как к активной, так и к пассивной схемам вакцинации против криптоспоридиоза.

В следующем аспекте изобретение, относится к способу защиты человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, от криптоспоридиоза, где указанный способ включает введение указанной мишени, по меньшей мере, однократной вакцины по изобретению.

В другом аспекте, изобретение относится к способу защиты человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, от криптоспоридиоза, где указанный способ включает кормление молозивом, полученным способом по изобретению, или молозивом по изобретению, указанной мишени.

Способ защиты с использованием молозива по изобретению также относится к пассивной вакцинации мишени с использованием препарата gp40-специфических антител, которые были очищены из молозива, получаемого способом по изобретению, или из молозива по изобретению.

Когда метод пассивной защиты относится к крупному рогатому скоту, можно провести дальнейшее различие между различными методами животноводства, применяемыми к крупному рогатому скоту для различных целей: телят молочного скота обычно отбирают у матерей в день рождения, поэтому этим телятам вакцинация путем введения молозива проводится путем активного сбора молозива и скармливания его телятам в течение первой недели их жизни. Предпочтительно, молочные телята будут получать молозиво по изобретению в течение, по меньшей мере, 3 дней, более предпочтительно, по меньшей мере, 4 или даже, по меньшей мере, 5 дней, в указанном порядке предпочтения. Первую дозу молозива следует дать телятам в течение 8 часов после рождения, предпочтительно, в течение 6, или даже в течение 4 часов после рождения.

Кормление молозивом может производиться один или два раза в день; предпочтительно, кормление осуществляется один раз в день.

У мясного скота, из-за меньшего объема производимого молока, концентрация антител в молозиве выше, чем у молочного скота. Также телят мясного скота после рождения обычно оставляют с матерями. В этом случае кормление молозивом для способа защиты по изобретению осуществляют, позволяя телятам глотать молозиво при сосании. Предпочтительно, мясным телятам дают сосать молозиво от коровы, вакцинированной, как описано в настоящем документе, в течение, по меньшей мере, 3 дней, более предпочтительно, по меньшей мере, 4 или даже, по меньшей мере, 5 дней в указанном порядке предпочтения. Доступ телят к молозиву должен быть обеспечен в течение 8 часов после рождения, предпочтительно, в течение 6 или даже в течение 4 часов после рождения.

В варианте осуществления обоих способов защиты по изобретению, мишенью является жвачное животное; предпочтительно, мишенью является крупный рогатый скот, как определено в настоящем документе.

Изобретение далее будет описано с помощью следующих неограничивающих примеров.

Примеры

Пример 1: Производство вакцины против криптоспоридиоза

1.2. Рекомбинантная белковая конструкция

Рекомбинантный белок gp40 для использования в исследованиях вакцинации конструируют, исходя из основной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, которая получена из C. parvum, штамм Iowa, генотип II. Эту последовательность дополняют С-концевой 6х гистидиновой меткой, чтобы обеспечить очистку с помощью колоночной хроматографии Никля.

Известно, что для белка Cryptosporidium gp40, расщепление N-концевой сигнальной последовательности отличается в системе экспрессии, где расщепление происходит на аминокислоте № 20; по сравнению с нативным белком gp40, который начинается с аминокислоты № 31, см. O’Connor et al. (2007, Mol. Bioch. Parasit., vol. 152, p. 149-158). Для изобретения, N-концевая сигнальная последовательность gp40 частично восстановлена с использованием аминокислот 14-30 из записи GenBank AAF78345.1.

Кроме того, для инициации транскрипции добавляют N-концевой метионин. Эта сборка может быть эффективно экспрессирована в рекомбинантной системе экспрессии бакуловирус-клетка насекомого, хотя она не допускает секреции или гликозилирования. Следовательно, экспрессия является цитоплазматической, и gp40 можно собрать из супернатанта культуры в конце периода культивирования, когда лизировано большинство клеток насекомых.

Точная аминокислотная последовательность белка Cryptosporidium gp40, используемого в экспериментах по вакцинации, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 3. Она экспрессирована из рекомбинантной ДНК, которая является кодон-оптимизированной на основе предпочтения кодонов гена бакуловирусного полиэдрина AcMNPV; использованная рек. последовательность ДНК представляет собой последовательность SEQ ID NO: 2. Этот рекомбинантный ген встроен в виде фрагмента BamH1-EcoR1 в бакуловирусный трансфер-вектор на основе плазмиды pVL1393, который управляет экспрессией из полиэдринового промотора. Стабильно трансфицированный рекомбинантный бакуловирус создают путем гомологичной рекомбинации с линеаризованной геномной ДНК AcMNPV с использованием стандартных процедур. Рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий His-меченный рекомбинантный белок Cryptosporidium gp40 (rgp40His), выделяют, очищают от бляшек и амплифицируют.

Экспрессию Rgp40His подтверждают с помощью SDS-Page супернатанта культуры клеток насекомых, который показывает экспрессированный белок в виде полосы примерно 32 кДа. Дальнейшие тесты проводят с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресцентного анализа с использованием поликлональной анти-gp40 антисыворотки крупного рогатого скота и анти-His моноклонального антитела. Рекомбинантный бакуловирус закладывают в качестве исходного вакцинного вируса после нескольких тестов на генетическую корректность и стабильность, и стерильность.

1.2. Экспрессирование и сбор

Rgp40His получают из клеток насекомых Sf9, инфицированных затравкой рекомбинантного бакуловируса. Клетки культивируют в коммерческой среде для культивирования клеток насекомых, не содержащей животных соединений SF900II™. Культивирование в мелком масштабе 0,5-2 литра проводят в лабораториях; крупномасштабные производственные циклы до 500 л культуры проводят на предпроизводственных мощностях. В целом, применяют следующую схему: чистые клетки Sf9 получают в культурах увеличивающегося объема. После получения достаточного количества чистых клеток, клетки концентрируют и повторно высевают в свежую среду в количестве 1,6×10⁶ клеток/мл. Их инфицируют с m.o.i. 0,002 и инкубируют в течение 5 дней при 28°С. В конце культивирования, супернатант собирают; в мелком масштабе центрифугированием, в крупном масштабе ректификацией глубокой фильтрацией. При экспрессии в мелком масштабе, рекомбинантный бакуловирус затем инактивируют инкубацией с 0,1% Triton® X-100 в течение 1 часа при комнатной температуре с последующим гамма-облучением в коммерческой компании. При крупномасштабном производстве, всю последующую обработку проводят в установке ограниченного использования и с использованием закрытых подключений, и большую часть рекомбинантного бакуловируса выделяют с помощью различных стадий фильтрации и очистки. Затем весь оставшийся вирус уничтожают во время обработки азиридином.

Для очистки, собранный rgp40His загружают в колонку Ni-Sepharose. Затем колонку промывают и элюируют rgp40His с использованием имидазола. Затем имидазол удаляют диафильтрацией против 50 мМ буфера HEPES при рН 7,5. Затем rgp40His стерильно фильтруют через 0,2 мкм мембранные фильтры и инкубируют с азиридином. BEI получают путем объединения равных объемов 1,09 М ВЕА и 1,91 М NaOH. Это дает исходный раствор 545 мМ BEI. Затем BEI добавляют к композиции, содержащей rgp40His, до 33 мМ. Смесь с BEI инкубируют при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем добавляют тиосульфат натрия в концентрации 33 мМ. Его инкубируют в течение часа при комнатной температуре и измеряют значение рН 7,1.

Для сравнительных экспериментов, Cryptosporidium gp40, который не содержит одну или более алкилированных аминокислот, получают таким же образом, за исключением того, что вместо азиридина добавляют буфер для ложной инкубации.

1.3. Определение антигенной массы

Количество белка rgp40His первоначально измеряют с помощью SDS-PAGE в диапазоне разведений известных количеств эталонного белка. Затем с помощью денситометрии окрашенных гелей количественно определяют полосы. Позже этот тест меняют на более точный: ELISA конкурентной антигенной массы, который полностью проверен на специфичность, надежность, линейность и точность. Коротко, ELISA антигенной массы выполняют следующим образом: лунки планшета для микротитрования покрывают очищенным rgp40His (не алкилированным) в количестве 50 нг/лунку, в течение ночи в буфере для покрытия и при 4°C. На следующий день планшет промывают, затем покрывают казеинсодержащим буфером в течение 1 часа при 37°С, и затем снова промывают. На отдельных планшетах для микротитрования, тестируемый образец rgp40His с неизвестной концентрацией серийно разводят в буфере для ELISA (содержащем 0,05% полисорбата 80) и добавляют фиксированное количество анти-gp40 моноклонального антитела мыши. Его предварительно инкубируют в течение 1 часа при 37°C, затем эту смесь переносят на планшеты с покрытием и инкубируют в течение 1 часа при 37°C в буфере для ELISA. Затем планшеты промывают, и количество моноклонального антитела gp40, которое связалось с планшетом, определяют путем инкубации с пероксидаза-конъюгированным анти-мышиным IgG козы в буфере для ELISA в течение 1 часа при 37°C. Пероксидазу визуализируют ферментативным превращением тетраметилбензидина в течение 15 минут при комнатной температуре, которую останавливают с помощью серной кислоты. Оптическую плотность желтого цвета в каждой лунке измеряют при 450 нм. Количество конъюгата пероксидазы обратно пропорционально количеству антигена в тестируемом образце. Данные обрабатывают программным обеспечением с использованием алгоритма Logit-Log, по меньшей мере, для 3 точек выборки из серии разведений. Также образцы измеряют, по меньшей мере, в двух повторах, и в ходе тестирования берут соответствующие положительные и отрицательные контроли. Затем рассчитывают значение антигенной массы gp40 в тестируемом образце в микрограммах/мл на основе значений стандартизированного эталонного образца.

1.4. Составление в вакцину

Затем rgp40His, очищенный на колонке и инкубированный с азиридином или ложно инкубированный, составляют в виде эмульсионной вакцины для дальнейшего применения путем комбинирования с подходящими адъювантами и эмульгирования с использованием хорошо известных способов и материалов. Коротко: rgp40His помещают в стерильный солевой раствор (0,85% масс./об. хлорида натрия) до необходимой концентрации. Параллельно, масляную фазу получают из ISA™ 70 VG (Seppic, France) стерильной фильтрацией. Обе фазы объединяют и эмульгируют с помощью гомогенизатора Silverson™ или Dispax™ в эмульсию вода-в-масле. Постепенное повышение температуры во время гомогенизации контролируют и поддерживают на уровне ниже 50°С. Полученную эмульсию хранят при 4°С до розлива в подходящие контейнеры. Заполненный продукт перед выпуском подвергают множеству тестов на стабильность и стерильность.

В зависимости от предполагаемого географического рынка или комбинации с другими антигенами, также получают партии эмульсии, которые включают дополнительный адъювант, в частности гидроксид алюминия. В этом случае: водный препарат rgp40His сначала объединяют со стерилизованной нагреванием суспензией 3% масс./об. Alhydrogel® (Brenntag) в солевом растворе и оставляют для абсорбции алюминием на 30-60 минут при комнатной температуре при перемешивании. Затем эту смесь антигена и алюминия эмульгируют с масляной фазой, как описано выше.

Продолжаются испытания на долговременную стабильность 1- и 2-летнего срока годности при 4°C. Показательны, однако, результаты промежуточных и ускоренных тестов на стабильность: в течение 15 месяцев при 4°С и в течение 3 недель при 30 или 37°С. Качество эмульсии остается хорошим на всем протяжении, и среднее изменение обнаруженной антигенной массы находится в пределах 10% от исходного состава. Это хороший показатель долговременной стабильности в условиях охлаждения.

Пример 2: Настройки испытаний вакцинация-контрольное заражение

В течение ряда лет проводят несколько испытаний на экспериментальных животных для разработки и оптимизации модели эффективных испытаний вакцинация-контрольное заражение, чтобы можно было оценить эффективность различных композиций, которые тестируют в качестве вакцин против криптоспоридиоза. Следующая настройка оказалась наиболее показательной для эффективности in vivo:

Вакцины получают, как описано выше: белок криптоспоридиоза gp40 экспрессируют в системе экспрессии бакуловирус-клетки насекомых и собирают в конце культивирования, очищают (или нет) металло-аффинной хроматографией и инкубируют (или нет) с азиридином. Затем белок был составляют с адъювантом, либо с маслом, либо с маслом и солью алюминия, и эмульгируют в виде эмульсии В/М.

2.

2.1 Модель на животных

Для исследований пассивной вакцинации, животные-мишени представляют собой здоровых молочных коров голштино-фризского типа в возрасте примерно одного года, выбранных как из телок, так и из повторнородящих коров. Коровы находятся в последнем триместре беременности, и их сыворотку проверяют на наличие только фоновых уровней gp40-специфических антител. Коров лечат на ферме, где они живут, поэтому акклиматизация не требуется. Корм и воду предоставляют в соответствии со стандартной практикой содержания крупного рогатого скота. Животных маркируют уникальным идентификационным номером с помощью ушной бирки.

2.2. Вакцинации

Вводят вакцины, содержащие 10 мг rgp40His/дозу, либо обработанные азиридином, либо ложно обработанные, эмульгированные в виде В/М с минеральным маслом, в объеме 2 мл, и вводимые внутримышечно в шею. Сроки следующие: ревакцинация за 3 недели до предполагаемой даты отела и первичная вакцинация за 6 недель до ревакцинации. Коров также вакцинируют вакциной Rotavec® Corona за 4 недели до предполагаемой даты отела, чтобы предотвратить диарею новорожденных у телят от патогенов, отличных от C. parvum. Образцы сыворотки берут в определенные моменты времени и тестируют с помощью ELISA на антитела.

После отела собирают молозиво при первой, второй и третьей дойке; в среднем за одно доение коровы получают 4-5 литров молозива. Молозиво объединяют для каждой тестируемой группы вакцинации, для каждой временной точки доения и разделяют на аликвоты в банки емкостью 250 мл перед пастеризацией с использованием водяной бани в течение 30-45 минут при 56°C. Затем аликвоты разделяют и хранят замороженными до использования. Размораживание контролируют с помощью водяной бани с температурой 43°C или горячей водопроводной воды, регулярно проверяя температуру воды. Молозиво согревают руками (т.е. приблизительно 40°C) при подаче телятам.

Новорожденных телят собирают при отеле, размещают отдельно и кормят 3-литровым болюсом анти-gp40 молозива от одной из вакцинированных групп в течение 4 часов после рождения. Затем телятам вводят контрольную дозу живых ооцист C. parvum через 2 часа после первого кормления.

Размер группы составляет 5-10 телят, и во все эксперименты включают незащищенную группа контрольного заражения, которая получает имитацию молозива. Обнаруживают, что использование незащищенных не зараженных индикаторов неинформативно, и в более поздних экспериментах его не учитывают. Телята, включенные в исследования, при рождении имеют массу тела, по меньшей мере, 30 кг.

Телят содержат в изолированном помещении, в одиночных боксах. Контакт между телятами не допускают. Смотрители меняют перчатки и обувь перед обработкой каждого животного.

Каждый отдельный загон для животных состоит из двух отсеков. Один содержит древесную стружку, и другой состоялит из металлической сетки над горизонтальной пластиной с гладкой поверхностью над каналом для сбора отходов. Телят содержат на древесных опилках в течение первых трех дней жизни. В конце третьего дня, телят переводят во второй отсек. Пластина с гладкой поверхностью дает возможность оценить консистенцию фекалий, чтобы провести оценку диареи. Эту пластину очищают после каждой временной точки подсчета, чтобы провести следующую оценку фекального материала, который получен между каждой временной точкой подсчета.

Телят кормят два раза в день; корм, состоящий из молозива (первое кормление) или молозива и заменителя молока, начиная со второго кормления, дают ежедневно в соответствии со спецификациями производителя после того, как первой подачи молозива теленку.

2.3. Контрольные заражения

Инокулят для контрольного заражения готовят свежим перед введением, используя 1×10⁶ живых ооцист C. parvum, штамм Iowa/теленка. Его дают телятам перорально в 50 мл заменителя молока. Впоследствии телята получают два раза в день молозиво (gp40- или контрольную вакцину) в заменителе молока: 0,25-0,5 литра молозива на 2-2,5 литра молока в день в течение нескольких дней.

Эта контрольная доза выбрана так, чтобы вызвать повторяющуюся и постоянную диарею, которая была тяжелой (но временной) во всех незащищенных группах контрольного заражения.

Живые ооцисты приобретают в свежем виде у компании Waterborne Inc., New Orleans, USA. Ооцисты свежевыпавшие, не старше 2 месяцев до начала эксперимента на животных. Жизнеспособность паразита методом эксцистирования (критерий тестирования 50-100%), плюс инфекционность клеточного слоя НСТ-8 оказались достаточными как до начала, так и в конце эксперимента.

После контрольного заражения за телятами наблюдают в течение 14 дней, при этом диарея обычно развивается между 4 и 11 днями, с пиком тяжести на 5-10 день. Уровни антител измеряют в молозиве и в сыворотке телят в 1 день перед кормлением и на 3 день кормления.

2.4. Оценка эффектов

Несколько способов тестируют с течением времени для наилучшего количественного определения и оценки влияния вакцинации на контрольное заражение. Первоначально используют только бычков, и фекалии всех телят собирают в пакеты для анализа количества и консистенции. Данные оказалось неточными, так как больные телята ложатся, и материал теряется. Наиболее клинически значимым оказалась запись два раза в день ряда наблюдаемых параметров оценки, в частности: общего состояния здоровья, обезвоживания, внешнего вида сзади и оценки диареи. Используемые параметры оценки диареи основаны на шкале Wisconsin-Madison, как описано в S. McGuirk, 2008 (Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., vol. 24, p. 139-153). Параметры, использованные для наблюдений, представлены в таблице 1. Обладая некоторым опытом, лица, ухаживающие за животными, смогли единообразно определить баллы.

Когда диарея становится заметной, применяют тест на Cryptosporidia в фекалиях, который проводят с использованием коммерческого набора для тестирования: BIO K 306™ - Rainbow Calf Scours (Bio-X Diagnostics, Belgium), который использует жидкостную хроматографию на специальных тест-полосках.

Подсчет ооцист в образцах фекалий проводят для определения уменьшения выпадения. Подсчет ооцист проводят следующим образом: из собранных фекалий отбирают образец объемом 50 мл и хранят при 2-8°C до использования. Образец серийно разводят, и образец помещают на предметное стекло для микроскопической диагностики и сушат на воздухе в течение 1 часа. Предметные стекла окрашивают в соответствии с способом Циля-Нильсена (кислотоустойчивый), и окрашенные в красный цвет ооцисты подсчитывают с помощью световой микроскопии. Результаты показывают как количество ооцист на грамм фекалий.

Таблица 1: Параметры наблюдения для оценки признаков криптоспоридиоза у телят

Оценка Общее состояние здоровья Обезвоживание Внешний вид сзади Оценка диареи 0 Обычный:
Теленок бдительный, голодный и наблюдает за смотрителями. Он может растянуться, когда встанет. Теленок ест с жадностью, часто подергивая хвостом во время еды. Не обезвоженный: (глаза нормальные, кожа упругая (шерсть гладкая). Чистый зад, хвост и ноги. Обычная:
фекалии сохраняют форму. Фекалии могут быть пастообразными, но не текут по наклонной поверхности. 1 Слегка подавлен:
Теленок встает и пьет без уговоров, но и не жадно. Теленок проявляет некоторое внимание к смотрителям. Возможно:
сомнительные глаза, тусклая/глазурованная шерсть. Хвост и зад грязные с небольшим количеством липких фекалий или сухих фекальных масс. Незначительная:
в форме лужицы, а не лепешки. Достаточное содержание воды, чтобы медленно течь по или вниз наклонной поверхности. 2 Умеренная депрессия:
Теленка нужно уговаривать пить, иначе он не съест все молоко. Он мало обращает внимания на смотрителя, пока его не коснутся. Умеренно:
глаза слишком глубокие, или тусклая/потускневшая шерсть. Хвост и зад очень грязные но не мокрые, сохнущие. Умеренная:
фекалии с достаточным содержанием воды, чтобы легко течь по или вниз наклонной поверхности, оставляя прилипший материал. 3 Тяжелая депрессия:
Теленка нужно уговаривать встать, может с трудом вставать или стоять, не обращает внимания на смотрителей при прикосновении, может отказываться от еды, отсутствует сосательный рефлекс. Сильное:
глаза лежат очень глубоко, а шерсть тусклая/потускневшая. Хвост, спина и ноги грязные и мокрые от водянистого поноса. Тяжелая:
часть или все фекалии очень водянистые. Фекалии могут стекать, оставляя мало или совсем не оставляя следов на гладкой наклонной поверхности (у теленка могут быть очень водянистые фекалии, за которыми следует некоторое количество твердого вещества, и при этом может наблюдаться тяжелая диарея). 4 Мертвый или умирающий:
Теленок не реагирует или почти не реагирует на раздражители, лежит на боку. -- -- --

Пример 3: Результаты экспериментов по вакцинации-контрольному заражению

3.

3.1. Рекомбинантная экспрессия gp40:

Было обнаружено, что система экспрессии бакуловирус-клетка насекомого с примененными оптимизациями: частичной сигнальной последовательностью и адаптацией использования кодонов, дает больше белка, чем ранее использовавшаяся система экспрессии E. coli. Однако при вакцинации неочищенным gp40, полученным из культур клеток насекомых, т.е. только центрифугированным и инактивированным Тритоном Х-100 и гамма-облучением, иммуногенность стандартной дозы 20 мкг была не такой хорошей, как для аналогичной дозы аналогично инактивированного и очищенного на колонке gp40. Поэтому в качестве стандарта используют слитые конструкции His-метка и очистку на колонке Nickle.

3.2. Состав вакцины

Используемые адъюванты масло и масло+алюминий индуцируют эффективные титры антител у беременных коров, и затем и в их молозиве. Однако для крупного рогатого скота, который ранее не был вакцинирован gp40, однократной вакцинации было недостаточно, и для индукции уровней антител в молозиве, которые защищают от тяжелой инфекции, как применяется в этих испытаниях, требуется схема вакцинации примирование/стимулирование. Обычно наивный крупный рогатый скот имеет титры антисыворотки gp40-специфических антител 9-12 Log2 в ELISA на антитела. Поэтому титр до 10 Log2 считается фоновым уровнем. После вакцинации в дозе 10 микрограммов очищенного gp40, который не содержит одну или более алкилированных аминокислот, в эмульсионной В/М вакцине, этот титр увеличивается до 12-13 Log2 после первичной вакцинации и до 15-17 Log2 после ревакцинации.

От этих коров собирают молозиво, содержащее gp40-специфические антитела с титрами около 20 Log2. Следовательно, дозы вакцины 10 мкг rgp40His, которые не были инкубированы и очищены с азиридином, используют в экспериментах по примированию/стимулированию. При применении в сочетании с вакциной Rotavec Corona никакого влияния на эффективность вакцинации против ротавируса, коронавируса или кишечной палочки вакциной gp40 не обнаруживают, см. также фигуру 2. Делают вывод, что эти вакцины можно эффективно комбинировать.

Нет никакой разницы в кормлении молозивом один или два раза в день, поэтому в дальнейшем применяют один раз в день. Также было обнаружено, что кормления молозивом в течение 5 дней достаточно.

3.3. Тестирование Rainbow scour

Все животные, получившие контрольный инокулят и имеющие диарею 2 или 3 балла, дали положительный результат в тесте на присутствие Cryptosporidium.

3.4. Побочные реакции

В то время как вакцинация крупного рогатого скота эмульгированными вакцинами rgp40His в целом является безопасной, т.е. не наблюдаются системные эффекты или влияние на беременность, они вызывают местные реакции в месте вакцинации: они являются пальпируемыми, и при вскрытии обнаружены признаки воспаления. Оказалось, что это связано с наличием белка gp40, поскольку вакцина в аналогичной эмульсии, вакцина Rotavec Corona, не вызывает таких местных реакций.

Единственным способом уменьшить эти реакции является снижение дозы gp40, однако это было возможно только при сохранении эффективности при использовании белка Cryptosporidium gp40, содержащего одну или более алкилированных аминокислот по изобретению.

Пример 4: Эффект инкубации с азиридином в экспериментах по вакцинации-контрольному заражению

4.

4.1. Влияние на титры антител

В эксперименте по вакцинации групп по 5 беременных голов крупного рогатого скота в каждой, как описано выше в примере 3, коровы получают две дозы 10 мкг rgp40His в эмульсии W/O с адъюватным маслом+алюминием. gp40 очищают на колонке и либо инкубируют с азиридином, либо нет. Отрицательным контролем служит группа, получающая только вакцину Rotavec Corona, имеющую тот же состав. Другая группа получает как вакцину gp40, не содержащую одну или более алкилированных аминокислот, так и вакцину Rotavec Corona. Титры сывороточных антител измеряют еженедельно и определяют с помощью ELISA на антитела. Титры на уровне 10 Log2 или ниже устанавливают равными 10 и считают фоновыми. Профили сероконверсии с течением времени для всех вакцин gp40 являются схожими. Только вакцина Rotavec Corona не индуцирует антитела против gp40. Результаты титра для комбинированной вакцины показывают, что нет интерференции между двумя типами вакцин.

При содержании того же количества антигена gp40, вакцина, содержащая белок Cryptosporidium gp40, содержащий одну или более алкилированных аминокислот, индуцирует титры антител у крупного рогатого скота, которые значительно выше, чем для не алкилированной вакцины gp40: на 3-4 Log2 выше после первичной вакцинации, и на 2 Log2 выше после ревакцинации; это представлено на фигуре 2. Обнаружено, что полученные титры молозива после вакцинации алкилированным gp40 являются очень высокими, 24 Log2.

4.2. Влияние на выпадение

Влияние на выпадение ооцист телятами после контрольного заражения в результате пассивной вакцинации было умеренным, но значительным. Обычно обнаруживают 10-кратное снижение общего количества ооцист на 100 грамм фекалий между 4 и 14 днями: с 10⁹ ооцист у не вакцинированных зараженных телят до 10⁸ у вакцинированных телят. Однако, поскольку количество фекалий также значительно снижено в результате более короткой продолжительности диареи, найденной у телят: 2 дня у телят, вакцинированных gp40, обработанных BEI, по сравнению с 6 днями у не вакцинированных телят. Таким образом, общее снижение выделения ооцист путем вакцинации, безусловно, имеет значение.

4.3. Влияние на безопасность

Белок gp40 в сочетании с адъювантом на основе минерального масла оказался весьма реакционноспособным; это было наиболее очевидно при подкожной вакцинации и при применении схемы вакцинации примирование/стимулирование. Этот эффект не усиливается при инкубации белка gp40 с азиридином.

Вакцина, имеющая дозу 10 мкг gp40 (алкилированного или нет), с адъювантом минерального масла и вводящаяся в качестве первичной и ревакцинации взрослых коров голштинской породы подкожным путем, вызывает опухоль в месте прививки до 10 см в диаметре и до 2 см толщиной. Однако, кроме того, что вакцинированные коровы выглядят тяжелыми, они не проявляют никаких признаков дискомфорта от этой местной реакции: не наблюдается лихорадка, и отсутствует какое-либо влияние на аппетит или на стельность.

Тем не менее, было решено, что такой отек, даже бессимптомный и временный, нежелателен.

К счастью, описанное в настоящем документе изобретение позволяет снизить дозу белка gp40 до безопасного уровня при сохранении хорошей иммунологической эффективности: при адаптации количества белка на дозу до 1 мкг алкилированного белка gp40, отек после двух доз, введенных подкожно, обычно составляет менее 5 см в диаметре и 1 см в высоту, в основном всего 2 см в диаметре. Это считается приемлемым. Важно отметить, что такое снижение количества белка в 10 раз влияет на эффективность вакцинации, поскольку в молозиве можно было получить все еще достаточно высокие титры антител к gp40.

4.4. Влияние на диарею

В эксперименте с контрольным вакцинированием, тяжесть диареи оценивают на основе параметров, представленных в таблице 1, последний столбец. Результаты для двух наиболее релевантных групп телят представлены на фигуре 3. Эти телята получают молозиво от матерей, либо вакцинированных вакциной gp40, обработанной BEI, либо не обработанной вакциной gp40. Заражение проводят в первый день, после первого болюса молозива, как описано. Определяют среднюю ежедневную оценку диареи на группу, и строят график для 14-дневного эксперимента.

Как ясно видно из фигуры 3, тяжесть диареи намного ниже и намного короче в группе, получавшей молозиво от коров, вакцинированных BEI-gp40. Разница впечатляет и имеет большое значение: в группе вакцины rgp40His+BEI значительная диарея (оценка выше 1,0) наблюдается только в течение 2 дней (в дни 7 и 8). Однако в группе, получавшей вакцину rgp40His (gp40, ложно обработанный азиридином), наблюдается выраженная диарея в течение 6 дней (в дни 6-11). При этом диарея в группе, получавшей вакцину rgp40His+BEI, также является намного менее серьезной: максимальная оценка составила 1,2 по сравнению с максимальной оценкой 2,8 в группе получавшей имитацию BEI вакцины.

В заключение:

Найдена действительно эффективная вакцина против криптоспоридиоза, которая способна значительно снизить как тяжесть, так и продолжительность диареи, вызванной тяжелым заражением паразитами Cryptosporidium.

Также высокоэффективной оказалась модель пассивной вакцинации новорожденных телят скармливанием молозива от вакцинированных матерей.

Пример 5: Продолжающиеся исследования

5.

5.1. Определение дозы

В продолжающихся исследованиях по определению доз тестируют дозы вакцины 0,1-0,2-0,5-1 - 2,5 и 5 мкг алкилированного белка gp40 по изобретению.

Первоначальные результаты показывают, что 1 мкг алкилированного белка gp40 на дозу в режиме вакцинации примирование/стимулирование индуцирует достаточный уровень gp40-специфических антител у беременных коров. На данный момент, доза 1 мкг с адъювантом на основе минерального масла, введенная дважды подкожно, индуцирует титр 19 единиц Log2 по ELISA через 2 недели после первичной вакцинации, который снижается до 18 через 4 недели п/в, когда проводят ревакцинацию. Затем ревакцинация снова увеличивает титр до 22 через 6 недель п/в, который немного снижается до титра 21 Log2 через 8 недель после первичной вакцинации. При отеле, уровень антител в молозиве на 1-2 Log2 выше, чем уровень Ab в сыворотке.

Учитывая, что титра молозива 17-18 Log2 будет достаточно для защиты телят, оптимальный протокол вакцинации направлен на достижение титра 15-16 Log2 у вакцинированной коровы-матери. Следовательно, даже доза вакцины 0,5 мкг алкилированного белка gp40 по изобретению будет достаточной для достижения таких уровней титра у матери при режиме вакцинации примирование/стимулирование.

Альтернативно, исследуют возможность достижения такого уровня защитного титра в молозиве путем однократной вакцинации беременных жвачных животных с использованием 0,5 или 1 мкг алкилированного белка gp40 на дозу.

Пример 6: Масс-спектрометрический анализ

Чтобы определить, какие аминокислоты были алкилированы при инкубации с азиридином, проводят анализы ЖХ-МС/МС BEI-инкубированного и не инкубированного rgp40His. Белок переваривают параллельно различными ферментами, при этом обнаруженные пептиды анализируют на наличие аддукта 42 Да, что соответствует алкилированию молекулой этиленимина.

6.1 Материалы и способы

6.1.1 Тестируемые образцы белка

Используют две партии rgp40His, имеющие различную начальную концентрацию белка: партия 01K с 4,1 мг/мл и партия 12G с 1,0 мг/мл по BCA. Обе эти партии инкубировали с BEI, как описано. В качестве контроля используют партию белка rgp40His, не инкубированную с азиридином; партия 2DJ, 0,62 мг/мл, и эту партию подвергают нанофильтрации для удаления любого остаточного бакуловируса.

6.1.2 Анализ интактной массы gp40

Количество белка определяют с помощью BCA (Pierce) с использованием протокола производителя. Приблизительно 6-8 мкг образца rgp40His анализируют с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ-МС) с использованием Agilent 1290 LC и Agilent 6545 QTOF MS. Картридж для обессоливания MassPrep™ Online (Waters) используют при скорости потока 0,4 мл/мин при 60°C. Буфер А для ЖХ состоит из 0,1% об./об. муравьиной кислоты в воде, и буфер В состоит из 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Градиент составляет от 5% до 80% буфера B в течение 5 минут и поддерживается на уровне 80% буфера B в течение 1 минуты. Уравновешивание происходит при 5% буфера B с общим временем прогона 8 мин. Элюент колонки электрораспыляют на МС с использованием источника ESI Dual AJS (обычно при 4 кВ). Сканирование МС регистрируют между 100 и 3200 m/z при частоте 1 спектр/сек.

6.1.3 Картирование пептида gp40

Картирование пептида rgp40His проводят переваром с ферментами: трипсин, химотрипсин или GluC (Staphylococcus aureus Protease V8) при соотношении фермент:белок 1:50, инкубируя в течение часа. Затем снова добавляют фермент в том же соотношении и продолжают перевар в течение ночи. Очистку проб проводят с помощью картриджей с сорбентом Sep-Pak™ tC18, 1 см³, 50 мг (Waters). Смеси пептидов элюируют 0,1% об./об. муравьиной кислоты в 90% ацетонитриле. Растворитель выпаривают в Speedvac™ при комнатной температуре. Смеси образцов пептидов восстанавливают в 0,1% муравьиной кислоте.

Приблизительно 30 мкг ферментативного гидролизата анализируют с помощью ЖХ-МС, как описано. Смеси пептидов разделяют с помощью Agilent AdvanceBio™ Peptide Map, C18, 1,2×150 мм, 2,7 мкм, при 0,4 мл/мин при 60°C. Буферы для ЖХ А и В такие, как описано. Используемый градиент представляет собой 2%-45% буфер В в течение 110 минут, затем 45%-95% буфер В в течение 5 минут и поддерживают на уровне 95% буфера В в течение 10 минут. Уравновешивание проводят с использованием 2% буфера В, общая продолжительность анализа составляет 145 мин. Элюент колонки распыляют электрораспылением на МС с использованием источника ESI Dual AJS (обычно при 4 кВ). Сканирование МС регистрируют в диапазоне частот от 100 до 1700 m/z при 4 спектрах/сек. Сканирование МС/МС регистрируют в диапазоне от 150 до 3200 m/z при 2 спектрах/сек. Для МС/МС отбирают максимум 5 ионов-предшественников на цикл при пороге численности 10000 импульсов. Ионы-предшественники исключают после 5 повторов по 1 мин. Ширину выделения устанавливают среднюю (4 а.е.м.).

6.1.4 Анализ данных МС

Интактные анализы

Пики ЖХ, содержащие белковые фрагменты, подвергают деконволюции с использованием программного обеспечения MassHunter™ Qualitative Analysis B.07.00. Алгоритм деконволюции представляет собой «максимальную энтропию»; диапазон масс 16000-23000 дальтон, диапазон m/z 800-2000. Исходное вычитание включено, и исходный коэффициент установлен как 7,00. Аддукт установлен на «протон», и ширина изотопа на «автоматическая».

Картирование пептида

Файлы данных МС/МС QTOF Agilent преобразовывают в файлы MFG с помощью программного обеспечения MassHunter. Для каждого файла данных создают список соединений с использованием функции «Поиск соединений с помощью автоматической МС/МС». Активируют «Извлечение МС/МС» с извлечением средних спектров МС/МС для всех энергий столкновений. В противном случае, применяют настройки по умолчанию. Список соединений экспортируют в MGF с активированным «Вычислением деизотопа», «Модель изотопа» устанавливают на пептид, и «Ограниченное назначенное состояние заряда» устанавливают максимум на 7. Файлы MFG исследуют против рекомбинантного белка Cryptosporidium parvum gp40с последовательностью SEQ ID NO: 3 базы данных в Mascot™. Ограничение фермента не установлено.

Этиленимин (43,04 Да, C₂H₅N) выбирают как вариабельную модификацию для всех аминокислот. Допуск МС устанавливают на 25 ч./млн., и допуск МС/МС на 0,1 Да. Заряд пептида устанавливают на 2+, 3+ и 4+.

Файлы MGF также подвергают поиску в базе данных белков клеток-хозяев (Sf9, Spodoptera frugiperda, Uniprot 201909127, с 26506 записями) с использованием параметров, идентичных описанным выше.

6.2 Результаты

В gp40, инкубированном с BEI, примерно четверть белка не содержит EI аддукт, одна четверть содержит один аддукт, и остальные содержат два или несколько аддуктов, частота которых быстро снижается.

Анализ интактной массы не выявил признаков гликозилирования или других посттрансляционных модификаций. Кроме того, для белков клетки-хозяина Sf9 не было обнаружено значительных совпадений с базой данных.

Для анализа белковых фрагментов применяют способ множественного перевара с использованием перевара трипсином, химотрипсином или GluC. Вместе они создают полный набор перекрывающихся пептидов с хорошим охватом последовательностей и очень надежным назначением EI аддуктов. 4 лучших сайта модификаций подвергают дополнительному ручному анализу.

Результаты PepMap показывают полное покрытие последовательности gp40, но ограниченное покрытие последовательности хвоста His-метки. Однако очень маловероятно, что аддукты EI расположены на гистидинах. Охват различных пептидных фрагментов представлен в таблице 2.

В таблице 2 результат 1 (*) для общего количества EI алкилированных пептидов в образце нативного белка является ложноположительной оценкой.

Таблица 2: Результаты картирования пептидов

Протестированная партия белка gp40 ID пептидов Уникальные сайты EI модификации Доминантный сайт EI модификации трипсин химотрипсин GluC Всего EI алкилированных 01К-BEI 201 64 134 50 31 4 12G-BEI 317 223 135 117 62 4 2DJ (нативный) 207 156 83 1* 0 0

Анализ PepMap позволяет идентифицировать EI аддукты для конкретных сайтов. Идентификацию сайтов EI модификации можно выполнить с помощью автоматического поиска в базе данных, поскольку заранее известны аддукты, которые необходимо обнаружить: каждый EI аддукт увеличивает размер на 42 Да, но разрешение применяемых способов имеет точность ±1 Да, поэтому анализируют увеличение веса на 41-43 Да. Селекцию против нескольких EI аддуктов по одной аминокислоте проводят с помощью программного обеспечения для МС анализа.

Из объединенных данных обеих партий, инкубированных с азиридином, аминокислоты gp40: 2V, 106E, 112E и 147D (пронумерованные как в SEQ ID NO: 3) оказались доминирующими сайтами алкилирования. Результаты представлены на фигуре 4. Обнаружено, что некоторые другие аминокислоты также алкилируются, хотя и с (значительно) меньшей частотой: цистеин, метионин, серин, треонин, тирозин, лизин и аргинин. Таким образом, интересно, что аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (E) оказались доминирующими сайтами модификации с меньшей частотой для других аминокислот.

Белок Cryptosporidium gp40, используемый в этих тестах, представляет собой рекомбинантно экспрессированный gp40-His с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3. Однако доминирующим белком, обнаруженным во всех образцах, является rgp40His без инициирующего метионина, который имеет основную молекулярную массу 20,9 кДа. Отсутствующий N-концевой метионин открывает валин в положении 2 для алкилирования.

Пример 7: Испытания вакцинации-контрольного заражения с применением низкодозированных вакцин

Как указано выше в примере 5, проводят эксперименты по определению дозы с использованием вакцин по изобретению с очень низкими дозами BEI-gp40. Беременных телок активно вакцинируют, и телят пассивно вакцинируют и заражают. Настройки и производительность в основном такие же, как описано выше. В частности, эксперименты проводят следующим образом: сначала гипериммунное молозиво получают путем вакцинации беременных телок и сбора их молозива от первого и второго доения. Количество алкилированного белка gp40, используемого на дозу для животного, составляет: 0,4 или 1,5 мкг. Вакцины составляют в виде эмульсии вода-в-масле, как описано выше, с использованием масла (ISA 70) + алюминия (Alhydrogel) в качестве адъювантов. Вакцину вводят подкожно в качестве первичной и ревакцинации за 7 недель и за 3 недели до предполагаемой даты отела, соответственно. Образцы сыворотки и молозива тестируют на специфический ответ IgG антитела против gp40 с использованием ELISA, как описано выше.

Затем новорожденных телят кормят этим молозивом в течение 5 дней, и затем заражают паразитами C. parvum. После контрольного заражения проводят оценку диареи и другие клинические оценки и регистрируют как оценку состояния здоровья в соответствии со шкалой Wisconsin-Madison, как описано в McGuirk (выше).

7.1 Получение гипериммунных сывороток с использованием низкодозированных вакцин

Используют стельных телок (голштино-фризские коровы) в двух группах: группа 1: 11 животных вакцинируют двукратно подкожно адъювантной BEI-rgp40his-субъединичной вакциной с 1,5 мкг gp40 на дозу для животного в объеме 2 мл/дозу. Вакцинацию проводят примерно за семь и три недели до предполагаемой даты отела. Во 2 группе, двенадцать животных остаются не вакцинированными для получения контрольного молозива. Всех животных также вакцинируют вакциной Rotavac® Corona (MSD AH) в соответствии с инструкциями производителя.

Образцы крови берут непосредственно перед каждой вакцинацией (в один и тот же день) и через 1 неделю после второй вакцинации у каждого животного из группы 1 и однократно у животных из группы 2 за неделю до вакцинации вакциной Rotavec® Corona.

Результаты серологии вакцинированных коров представлены в таблице 3 в виде среднего титра анти-gp40 ELISA на группу с их стандартными отклонениями.

Таблица 3: Титры анти-gp40 IgG (Log2) сыворотки коровы

Группа доза gp40 день 0 (1 вакцинация) 4 н п/в 1 1 н п/в 2 Сред. СО Сред. СО Сред. СО 1 1,5 10.2 1,2 16,8 2.2 17,5 1,3 2 -- 9,9 0,9 -- -- -- --

В начале исследования, средние титры антител IgG к gp40 сопоставимы для обеих групп и находятся на фоновом уровне.

Как видно из таблицы 3, результаты показывают заметное повышение титров сывороточных IgG против gp40 в группе 1 после первой и второй вакцинации. Однако оба титра указывают на то, что будут генерироваться защитные уровни антител в молозиве.

После родов от каждой коровы собирают первые две дойки и сохраняют для последующего использования в эксперименте по пассивной вакцинации/контрольному заражению. Первую дойку проводят в течение 6 часов после отела, и вторую дойку проводят в течение 20 часов после отела. В среднем, за одну дойку от одной коровы собирают около 5 литров молозива. Результаты ELISA на IgG в молозиве представлены в таблице 4 как средние значения по группам с их стандартными отклонениями.

Таблица 4: Титры анти-gp40 IgG (2Log) в молозиве

Группа Дойка Сред. СО 1 1 21,4 1,6 2 20,1 1,2 2 1 13,8 1,5 2 11,6 1,8

Титры молозива показывают, что защитные уровни анти-gp40 антител молозива вырабатываются в молозиве вакцинированной группы, и они значительно выше, чем титр в молозиве не вакцинированных контрольных животных (значение p <0,001).

7.2 Пассивное испытание вакцинации-контрольного заражения с использованием гипериммунного молозива

В последующем эксперименте, гипериммунное молозиво, полученное, как описано в разделе 7.1 выше, используют для пассивной вакцинации новорожденных телят. Это позволяет протестировать защиту, обеспечиваемую этим молозивом, против контрольного заражения паразитами C. parvum после кормления молозивом в течение 5 дней. Используют группы из восьми новорожденных телят; поскольку телята родились в разные дни, они проходят график испытаний с разными датами начала. Телята принадлежат голштино-фризской породе, весят, по меньшей мере, 34 кг, возраст не более 4 часов на момент начала эксперимента и не получают молозиво до начала эксперимента.

Все телята получают 3 литра молозива в течение 4 часов после рождения и комбинацию молозива и заменителя молока один раз в день в течение пяти дней подряд (группы 1 и 2). Всем телятам перорально вводят 10⁴ ооцист C. parvum через 2-4 часа после первого кормления молозивом. Консистенцию фекалий и показатели здоровья каждого теленка оценивают два раза в день в течение четырнадцати дней.

Разделение на группы следующее:

1. n=8, молозиво от коров, вакцинированных 1,5 мкг BEI-gp40, в течение 5 дней

2. n=8, молозиво от не вакцинированных коров, в течение 5 дней

Образцы крови берут у телят в начале эксперимента и на третий день, чтобы подтвердить поглощение ими анти-gp40 антител.

После контрольного заражения в течение 14 дней проводят ежедневные проверки здоровья каждого теленка для определения показателей здоровья в соответствии с приведенной выше таблицей 1, включая оценку консистенции фекалий два раза в день (утром и днем).

Фекальный материал от каждого животного, у которого в любой момент времени оценка диареи составляет 2 или 3, один раз в день проверяют на наличие C. parvum или других кишечных патогенов с использованием коммерческого теста Rainbow Calf Scours 4™ (BIO-K 288), пока хотя бы один тест не будет подтвержден положительным на C. parvum.

Результаты серологических исследований показывают следующие титры IgG в сыворотке против gp40: в первый день все титры находятся на исходном уровне 8,8 Log2. На третий день кормления молозивом, средние титры в сыворотке крови телят составляют: группа 1: 20,6 ± 0,4, группа 2: 10,9 ± 0,7.

Оценки теста Rainbow показывают, что вся диарея вызвана инфекцией C. parvum. У большинства телят из группы 1 (молозиво от коров, вакцинированных 1,5 мкг BEI-gp40, в течение 5 дней) обнаружены C. parvum в фекалиях на 8 день п/к, и у большинства телят из группы 2 (молозиво от не вакцинированных коров, в течение 5 дней) через 6 дней п/к.

Результаты оценок состояния здоровья представлены на фигуре 5. Эти оценки включают оценки консистенции фекалий и определены, как указано в Таблице 1 выше, в соответствии со шкалой Wisconsin-Madison (см. выше). Как видно, телята, получавшие молозиво от коров, вакцинированных gp40, значительно лучше способны справляться с тяжелым заражением паразитами C. parvum, поскольку они не заболевали так, как телята, получавшие молозиво без анти-gp40-антител.

7.3 Заключение

Можно сделать вывод, что даже дозы алкилированного белка gp40, составляющие 1,5 мкг на дозу вакцины для животных, могут индуцировать уровни анти-gp40 антител в молозиве, которые могут пассивно эффективно защищать от тяжелой инфекции C. parvum.

Обозначения на чертежах

Фигура 1

Аминокислотная последовательность белка Cryptosporidium gp40 по настоящему изобретению в однобуквенном коде IUPAC соответствует SEQ ID NO: 1.

Фигура 2

Графическое представление измеренных титров gp40-специфических антител в сыворотке вакцинированного крупного рогатого скота в единицах Log2 ELISA. Подробности даны в примерах 3 и 4.

Тестируемые группы:

rgp40His=вакцина белка Cryptosporidium gp40, который не был алкилирован;

rgp40His+BEI=вакцина белка Cryptosporidium gp40, содержащая одну или более азиридин-алкилированных аминокислот по изобретению;

Вакцина RC=вакцина Rotavec Corona

rgp40His+RC=группа двойной вакцинации, получившая и вакцину Rotavec Corona, и вакцину белка Cryptosporidium gp40, который не был алкилирован.

Фигура 3

Результаты эксперимента по вакцинации телят в отношении тяжести диареи.

Горизонтальная ось представляет дни после контрольного заражения.

Вертикальная ось представляет среднесуточный показатель диареи для группы, получающей вакцину rgp40His, и группы, получающей вакцину rgp40His+BEI.

Детали эксперимента описаны в примерах 3 и 4.

Фигура 4

Результаты масс-спектрометрического анализа белка Cryptosporidium gp40, инкубированного с азиридином. На графике по горизонтальной оси показана аминокислотная последовательность gp40 (представленная в SEQ ID NO: 3 в настоящем документе), и по вертикальной оси показано количество раз, когда было обнаружено, что конкретная аминокислота из gp40 алкилируется при инкубации с азиридином. Детали эксперимента описаны в примере 6.

Фигура 5

Результаты оценки здоровья в эксперименте по вакцинации с использованием очень низкой дозы белка gp40 для получения гипериммунного молозива. По горизонтальной оси показаны дни после заражения. Вертикальная ось показывает оценку состояния здоровья по шкале Wisconsin-Madison. Подробности описаны в Примере 7.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Intervet International BV

<120> ВАКЦИНА ПРОТИВ КРИПТОСПОРИДИОЗА

<130> 24911

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 183

<212> БЕЛОК

<213> Cryptosporidium parvum

<400> 1

Asp Val Pro Val Glu Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Val Ala Pro Ala Asn Lys

20 25 30

Ala Arg Thr Gly Glu Asp Ala Glu Gly Ser Gln Asp Ser Ser Gly Thr

35 40 45

Glu Ala Ser Gly Ser Gln Gly Ser Glu Glu Glu Gly Ser Glu Asp Asp

50 55 60

Gly Gln Thr Ser Ala Ala Ser Gln Pro Thr Thr Pro Ala Gln Ser Glu

65 70 75 80

Gly Ala Thr Thr Glu Thr Ile Glu Ala Thr Pro Lys Glu Glu Cys Gly

85 90 95

Thr Ser Phe Val Met Trp Phe Gly Glu Gly Thr Pro Ala Ala Thr Leu

100 105 110

Lys Cys Gly Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile Lys Asp Gln Thr

115 120 125

Asp Pro Ala Pro Arg Tyr Ile Ser Gly Glu Val Thr Ser Val Thr Phe

130 135 140

Glu Lys Ser Asp Asn Thr Val Lys Ile Lys Val Asn Gly Gln Asp Phe

145 150 155 160

Ser Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Ser Pro Thr Glu Asn Gly Gly Ser

165 170 175

Ala Gly Gln Ala Ser Ser Arg

180

<210> 2

<211> 621

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кодон-оптимизированный C. parvum gp40 ген и 3' His меткой

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(621)

<400> 2

atg gtg tct gct gtg ttc agc gct ccg gca gtc ccc cta cgc gga acc

48

Met Val Ser Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val Pro Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

ctc aag gat gtt cct gtc gaa ggt tca tct tcc tca tcg tca tcc tct

96

Leu Lys Asp Val Pro Val Glu Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

20 25 30

tcc tct tcg agc tca tct agc agc tca act agc acc gtt gca ccc gcc

144

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Val Ala Pro Ala

35 40 45

aac aaa gca cgt acc gga gaa gac gca gag ggt agc caa gac tca agc

192

Asn Lys Ala Arg Thr Gly Glu Asp Ala Glu Gly Ser Gln Asp Ser Ser

50 55 60

ggc acg gaa gca tct ggt tca caa gga tct gag gaa gag ggt agc gag

240

Gly Thr Glu Ala Ser Gly Ser Gln Gly Ser Glu Glu Glu Gly Ser Glu

65 70 75 80

gat gac ggt caa acc tct gca gcc tcc cag ccc act acc ccc gca caa

288

Asp Asp Gly Gln Thr Ser Ala Ala Ser Gln Pro Thr Thr Pro Ala Gln

85 90 95

tca gag ggc gca act acc gag acg att gaa gcc acc ccc aag gag gaa

336

Ser Glu Gly Ala Thr Thr Glu Thr Ile Glu Ala Thr Pro Lys Glu Glu

100 105 110

tgt gga acc agc ttc gtc atg tgg ttc ggt gaa gga act ccc gcg gca

384

Cys Gly Thr Ser Phe Val Met Trp Phe Gly Glu Gly Thr Pro Ala Ala

115 120 125

acc tta aaa tgc ggc gca tac acc atc gtg tac gct ccc atc aag gac

432

Thr Leu Lys Cys Gly Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile Lys Asp

130 135 140

cag acc gat ccc gct ccc cgt tac att tcc ggc gaa gtt acc tct gtg

480

Gln Thr Asp Pro Ala Pro Arg Tyr Ile Ser Gly Glu Val Thr Ser Val

145 150 155 160

acc ttc gag aaa tca gac aac acc gtg aag att aag gtg aac ggt caa

528

Thr Phe Glu Lys Ser Asp Asn Thr Val Lys Ile Lys Val Asn Gly Gln

165 170 175

gat ttc agc acc ctt agc gca aat tca tcg tct ccg acc gaa aat ggt

576

Asp Phe Ser Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Ser Pro Thr Glu Asn Gly

180 185 190

gga agc gca ggt caa gct tct tca agg cac cat cac cat cat cac

621

Gly Ser Ala Gly Gln Ala Ser Ser Arg His His His His His His

195 200 205

<210> 3

<211> 207

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Met Val Ser Ala Val Phe Ser Ala Pro Ala Val Pro Leu Arg Gly Thr

1 5 10 15

Leu Lys Asp Val Pro Val Glu Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Val Ala Pro Ala

35 40 45

Asn Lys Ala Arg Thr Gly Glu Asp Ala Glu Gly Ser Gln Asp Ser Ser

50 55 60

Gly Thr Glu Ala Ser Gly Ser Gln Gly Ser Glu Glu Glu Gly Ser Glu

65 70 75 80

Asp Asp Gly Gln Thr Ser Ala Ala Ser Gln Pro Thr Thr Pro Ala Gln

85 90 95

Ser Glu Gly Ala Thr Thr Glu Thr Ile Glu Ala Thr Pro Lys Glu Glu

100 105 110

Cys Gly Thr Ser Phe Val Met Trp Phe Gly Glu Gly Thr Pro Ala Ala

115 120 125

Thr Leu Lys Cys Gly Ala Tyr Thr Ile Val Tyr Ala Pro Ile Lys Asp

130 135 140

Gln Thr Asp Pro Ala Pro Arg Tyr Ile Ser Gly Glu Val Thr Ser Val

145 150 155 160

Thr Phe Glu Lys Ser Asp Asn Thr Val Lys Ile Lys Val Asn Gly Gln

165 170 175

Asp Phe Ser Thr Leu Ser Ala Asn Ser Ser Ser Pro Thr Glu Asn Gly

180 185 190

Gly Ser Ala Gly Gln Ala Ser Ser Arg His His His His His His

195 200 205

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к белку Cryptosporidium gp40 для иммунизации против криптоспоридиоза. Указанный белок gp40 содержит одну или более алкилированных аминокислот, причем этот белок Cryptosporidium gp40 получен путем инкубации композиции, содержащей белок Cryptosporidium gp40, с бинарным этиленимином. Кроме того, изобретение также относится к применению указанного белка в вакцине для защиты против криптоспоридиоза, а также к вакцине против криптоспоридиоза и способу получения такой вакцины. Настоящее изобретение обеспечивает повышение иммуногенности gp40, что приводит к более высокому титру gp40-специфических антител в вакцинированном млекопитающем-мишени. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Белок Cryptosporidium gp40 для иммунизации против криптоспоридиоза, отличающийся тем, что белок gp40 содержит одну или более алкилированных аминокислот, причем этот белок Cryptosporidium gp40 получен путем инкубации композиции, содержащей белок Cryptosporidium gp40, с бинарным этиленимином.

2. Белок Cryptosporidium gp40 по п. 1, причем Cryptosporidium gp40 происходит от Cryptosporidium parvum.

3. Применение белка Cryptosporidium gp40 по п. 1 или 2 в вакцине для защиты человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, против криптоспоридиоза.

4. Вакцина против криптоспоридиоза для человека-мишени или животного-мишени, отличного от человека, причем указанная вакцина содержит белок Cryptosporidium gp40 по п. 1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.

5. Вакцина по п. 4, отличающаяся тем, что вакцина содержит адъювант.

6. Вакцина по п. 4 или 5, отличающаяся тем, что вакцина содержит по меньшей мере один дополнительный иммуноактивный компонент.

7. Способ получения вакцины по любому из пп. 4-6, включающий стадию составления белка Cryptosporidium gp40 по п. 1 или 2 в вакцину.