СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУР ФИБРОБЛАСТОПОДОБНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ/СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ ПОЛНОСЛОЙНОЙ НЕСОСТОЯТЕЛЬНОСТИ СТЕНКИ ПИЩЕВОДА И ЗОНЫ ПИЩЕВОДНО-КИШЕЧНОГО АНАСТОМОЗА Российский патент 2024 года по МПК A61K35/28 A61B17/00 C12N5/00 A61K35/12 

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, может быть рассмотрено в общей хирургии, экспериментальной медицине, возможно клиническое применение при точечной несостоятельности стенки пищевода, несостоятельности швов пищеводно-кишечного анастомоза после хирургического или комбинированного лечения рака желудка с переходом на нижнюю треть пищевода, кардиоэзофагеального рака.

Развитие несостоятельности пищеводно-кишечного анастомоза остается одним из опасных осложнений после хирургического вмешательства, составляет 7%, а послеоперационная летальность может достигать от 3% до 19%.

В арсенале врача имеется широкий спектр различных вариантов обследования и лечения послеоперационных хирургических осложнений, которые направлены не только на своевременную диагностику и предотвращение торпидной манифестации, но снижению риска разобщения реконструкции, обеспечивая тем самым, достойное качество жизни. Помимо стандартно проводимой антибактериальной терапии, эндоскопическое вмешательство, такое как, клипирование или стентирование зоны несостоятельности, а также применение вакуумной активной системы аспирации, допустимы у ограниченной группы пациентов в отсутствии системной воспалительной реакции и развития разлитой эмпиемы плевры (Liang Zhao, Gefei Zhao, Jiagen Li, et al. Calcification of arteries supplying the gastric tube increases the risk of anastomotic leakage after esophagectomy with cervical anastomosis. J Thoracic Disease. 2016; 8(12): 3551-3562. https://doi.org/10.21037/jtd.2016.12.62). С недавнего времени применение торакоскопической санации в сочетании с вакуумной активной системой аспирации позволяет не только контролировать гнойно-воспалительный процесс в заднем средостении, но и локально, со стороны самого дефекта (Mehmet Bilgin, Yigit Akcali, Fahri Oguzkaya Benefits of early aggressive management of empyema thoracis. J Surgery. 2006; 76(3): 120-122. https://doi.org/10.1111/j.1445-2197.2006.03666.x; Shadi Lalezari, Christine J Lee, Anna A Borovikova, et al. Deconstructing negative pressure wound therapy. J International Wound. 2017; 14(4): 649-657 https://doi.org/10.1111/iwj.12658).

В последнее десятилетие для герметизации швов анастомоза применяют соединительные биосовместимые антимикробные элементы (СБАЭ), которые представляют собой пленку из коллагена, эфиров целлюлозы, поливинилпирролидона и других биополимеров (Файзуллин А.Л., Шехтер А. Б., Истранов Л. П., и др. 2020; 11(1): 61 https://doi.org/10.47093/2218-7332.2020.11.1.59-70). Благодаря локальному применению соединительных элементов, в зоне дефекта создается антимикробная среда, время действия которой, определяется временем рассасывания пленки с антибиотиком или антисептиком.

Известен способ полимеризации in situ для формирования конструкционных носителей (RU 2486907 C2), которые могут быть сформированы с приданием необходимой формы согласно дефекту, способствуют развитию ткани путем стимулирования восстановления нативных клеток, и потенциально могут быть имплантированы с помощью минимальной инвазивной инъекции и использованы с целью достижения герметизации. Способ предполагает местное нанесение реагента на поврежденную ткань, тем самым способствуя закрытию дефекта.

Недостатком способа можно отнести отсутствие временной оценки процесса заготовки, отсутствие формата использования в практической медицине на клинических примерах.

Известен способ программируемой стимуляции репаративной регенерации в зоне шовной полосы анастомозов полых органов желудочно-кишечного тракта (RU2421225), где на 2 сутки послеоперационного периода пациентам перорально вводят 5-оксиметилурацил в виде драже массой 1,5 г в определенном соотношении: 5-оксиметилурацил 0,5 г, 5% спирто-ацетоновый раствор ацетилфталилцеллюлозы - 3 слоя, раствор низкомолекулярного полиэтилена в гексане 10% - 1-3 слоя, медицинский клей «Сульфакрилат» - 1-3 слоя.

Несмотря на высокую адгезивность растворов, которые обеспечивают высокую клеевую основу, недостатком является присутствие временной деструкции и отсутствие конкретных условий их применения.

Самыми близкими являются следующие способы (прототипы):

- способ герметизации швов толстокишечного анастомоза (RU 94042070) с применением антимикробных элементов типа ЭСБАДХ (элемент соединительный биосовместимый антимикробный с дискосидином и хиноксидином), спирта и цианкрылатного клея, отличающийся тем, что производят резекцию кишки с удалением пораженной части, обрабатывают просвет кишки раствором хлоргексидина, а затем формируют анастомоз, причем соединительный элемент предварительно замачивают в 0,9% растворе хлорида натрия, в последующем линию швов анастомоза обрабатывают спиртом, а извлеченный из раствора соединительный элемент накладывают с применением цианкрылатного клея на линию швов анастомоза и размещают последний в прессокральном пространстве, ушивая при этом тазовую брюшину;

- способ антибактериальной защиты анастомоза при резекциях кишечника (RU2184545 C2) путем использования антибиотика цефамизина и фиксатора, отличающийся тем, что после наложения швов область анастомоза предварительно обрабатывают 1% водным раствором метиленового синего, после чего наносят раствор цефамезина.

Недостатком способа (RU 94042070) является отсутствие плотного контакта пленки с линией швов, что требует более «агрессивной» клеевой основы и средства для его растворения.

К недостатку можно отнести профилактический подход, который не гарантирует несостоятельность в послеоперационном периоде, интраоперационное использование антибиотика в отсутствии соответствия с микробиологическими данными конкретного пациента.

Задачей изобретения является разработка способа заживления полнослойной несостоятельности стенки пищевода и зоны пищеводно-кишечного анастомоза, который позволит ускорить процесс местной репарации и формирования грануляционной ткани, в частности в гнойных условиях, тем самым, частично или полностью заменив раневой дефект.

Техническим решением является то, что также как и в известном способе проводят введение готового раствора из клеточных культур для заживления дефекта стенки пищевода или анастомоза.

Особенностью заявляемого способа является то, что пробирку с костным мозгом донора инкубируют при комнатной температуре 2 часа, после отстаивания эритроцитов супернатант аккуратно отбирают пастеровской пипеткой, а выделенные клетки отмывают в среде RPMI-1640, центрифугируют при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в ростовой среде RPMI-1640, содержащей пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 ЕД/мл, амфотерицин 100 нг/мл, L-глютамин 2 мМ и 15% эмбриональной телячьей сыворотки, культивируют в СО²-инкубаторе в газовой среде: 5% углекислого газа и 95% воздуха при температуре 37°С, смену кондиционной среды проводят через каждые 3 суток, при достижении сливного конфлюентного монослоя, клетки пересевают с использованием 0,25% раствора трипсина, непосредственно перед введением в зону пищеводно-кишечного анастомоза клетки в количестве 8х107 вносят в стерильный раствор кондиционной среды культуры ФМССК, после чего готовый раствор в объеме 50 мл с фибробластоподобными мезенхимальными стромальными/стволовыми клетками при помощи эндоскопического спрей-катетера местно орошают в область свищевого хода и краев дефекта.

Изобретение поясняется подробным описанием, клиническими примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 – Эндоскопическая картина очищения краев дефекта от фибрина с эпителизацией и сокращением краев несостоятельности стенки пищевода пациентки З., после комбинированного лечения по поводу местнораспространенного рака желудка: а) до лечения – точечный дефект с фибрином; б) после лечения – смыкание полости до нитевидной.

Фиг. 2 – Эндоскопическая картина эпителизации дна ранее определяемого полуциркулярного дефекта пищеводно-кишечного анастомоза пациента М., после комбинированного лечения по поводу местнораспространенного кардиооэзофагеального рака: а) до лечения – дефект анастомоза на 1/3 и сообщение с плевральной полостью; б) края дефекта гиремированы, с подрытыми, изъявленными краями; в) после лечения – очищение краев и формирование слепо заканчивающегося кармана.

Способ осуществляют следующим образом.

При получении культур фибробластоподобных мезенхимальных стромальных/стволовых клеток (ФМССК) использовали донорский костный мозг, полученный посредством аспирационной пункции гребня подвздошной кости или рукоятки грудины.

Получение ФМСКК.

Пробирку с костным мозгом донора инкубируют при комнатной температуре 2 часа, после отстаивания эритроцитов супернатант аккуратно отбирают пастеровской пипеткой, а выделенные клетки отмывают в среде RPMI-1640, центрифугировают при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в ростовой среде. В качестве ростовой среды служит среда RPMI-1640, содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 15% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводится в СО₂–инкубаторе при температуре 37°С (в газовой среде: 5% углекислого газа и 95% воздух), в культуральных флаконах. Смена кондиционной среды каждые 3 суток. При достижении сливного конфлюентного монослоя, клетки пересевают с использованием 0,25% раствора трипсина.

Непосредственно перед введением клетки в количестве 8х10⁷ вносили в стерильный раствор кондиционной среды культуры ФМССК.

Готовый раствор с фибробластами при помощи эндоскопического спрей-катетера местно орошают в область свищевого хода и краев дефекта, далее устанавливают вакуумную аспирационную систему (ВАК) в область несостоятельности.

Клинический пример № 1.

Пациентка З., 66 лет, обратилась в наш центр по поводу рака тела желудка.

На первом этапе проведено 4 курса предоперационной полихимиотерапии по схеме FLOT в октябре 2022 г. Через 1,5 месяца вторым этапом выполнена гастрэктомия с формированием высокого трансхиатального пищеводного анастомоза на петле тощей кишки. На 8-е сутки послеоперационного периода при эзофагоеюноскопии выявлен дефект по левой боковой стенке анастомоза до 3 мм (Фиг.1 а). Через 48 часов произведена видеоторакоскопия, где был визуализирован дефект в зоне анастомоза с поступлением жёлчи. Выполнено дренирование зоны несостоятельности и плевральной полости, установлена ВАК система, замена которой происходила каждые 3-4 дня под контролем эндоскопии. Контроль заживления дефекта проводился на этапах программной смены мелкопористой губки, где после двух сеансов отмечено значительное сокращение свища и появление краевой эпителизации.

После контрольной эндоскопической ревизии зоны дефекта на этапе замены губки полость свища локально орошали раствором культур фибробластоподобных мезенхимальных стромальных/стволовых клеток (ФМССК) – 50 мл, которую изготовили следующим образом.

Пробирку с костным мозгом донора инкубировали при комнатной температуре 2 часа, после отстаивания эритроцитов супернатант аккуратно отбирали, а выделенные клетки отмывали в среде RPMI-1640, данный состав центрифугировали при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды использовали RPMI-1640, содержащая пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 15% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводили в СО₂–инкубаторе при температуре 37°С (в газовой среде: 5% углекислого газа и 95% воздух), в культуральных флаконах. Смена кондиционной среды проводили каждые 3 суток. При достижении сливного конфлюентного монослоя, клетки пересеивали с использованием 0,25% раствора трипсина.

Непосредственно перед введением клетки в количестве 8х10⁷ вносили в стерильный раствор кондиционной среды культуры ФМССК. Завершающим этапом в зону дефекта устанавливали новую губку.

При эндоскопическом контроле полное заживление свищевого хода с момента его диагностики зафиксировано на 30 сутки (Фиг.1 б).

Клинический пример № 2.

Пациент М., 52 года, обратился в Центр с кардиоэзофагеальным раком.

На первом этапе проведено 8 курсов химиотерапии по схеме FOLFIRINOX. Через месяц пациенту выполнена расширенная гастрэктомия с резекцией нижнегрудного отдела пищевода комбинированным торакоабдоминальным доступом слева с реконструкцией участком тощей кишки.

На 8-е сутки при эндоскопическом контроле был визуализирован дефект пищеводно-кишечного анастомоза на половину окружности анастомоза, сообщающийся с левой плевральной полостью (Фиг. 2 а, б). На дно раны установили ВАК систему с использованием мелкопористой губки. Одновременно выполнили торакоскопическую санацию левой плевральной полости с дренированием и формированием еюностомы для питания. На протяжении 2 месяцев пациенту проводили программную смену губки в сочетании со скарификацией краев дефекта и использованием эндоскопической щетки, а также производили локальное введение раствора культур фибробластоподобных мезенхимальных стромальных/стволовых клеток (ФМССК) в объеме 50 мл, изготовленный по вышеуказанной схеме.

На 75 сутки с момента диагностики осложнения – удалось добиться полного закрытия дефекта (Фиг.2 в).

Предложенный способ прост в использовании, позволяет улучшить непосредственные результаты послеоперационного течения, ликвидировать грозное гнойное осложнение, предотвращая тем, самым применение более агрессивного хирургического подхода, вплоть до разобщения ранее сформированной реконструкции.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу заживления полнослойной несостоятельности стенки пищевода и зоны пищеводно-кишечного анастомоза, и может быть рассмотрено в общей хирургии, экспериментальной медицине, при точечной несостоятельности стенки пищевода, несостоятельности швов пищеводно-кишечного анастомоза после хирургического или комбинированного лечения рака желудка с переходом на нижнюю треть пищевода, кардиоэзофагеального рака. Для заживления дефекта стенки пищевода или анастомоза производят локальное введение раствора культур фибробластоподобных мезенхимальных стромальных/стволовых клеток (ФМССК) в объеме 50 мл. Предложенный способ прост в использовании, позволяет улучшить непосредственные результаты послеоперационного течения, ликвидировать грозное гнойное осложнение, предотвращая тем самым применение более агрессивного хирургического подхода, вплоть до разобщения ранее сформированной реконструкции. 2 ил., 2 пр.

Способ заживления полнослойной несостоятельности стенки пищевода и зоны пищеводно-кишечного анастомоза, включающий введение готового раствора из клеточных культур фибробластоподобных мезенхимальных стромальных/стволовых клеток (ФМССК) для заживления дефекта стенки пищевода или анастомоза, отличающийся тем, что пробирку с костным мозгом донора инкубируют при комнатной температуре 2 часа, после отстаивания эритроцитов супернатант аккуратно отбирают пастеровской пипеткой, а выделенные клетки отмывают в среде RPMI-1640, центрифугируют при 1000 оборотов в минуту в течение 10 минут, осадок ресуспендируют в ростовой среде RPMI-1640, содержащей пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 ЕД/мл, амфотерицин 100 нг/мл, L-глютамин 2 мМ и 15% эмбриональной телячьей сыворотки, культивируют в СО₂-инкубаторе в газовой среде: 5% углекислого газа и 95% воздуха при температуре 370°С, смену кондиционной среды проводят через каждые 3 суток, при достижении сливного конфлюентного монослоя клетки пересевают с использованием 0,25% раствора трипсина, непосредственно перед введением в зону пищеводно-кишечного анастомоза клетки в количестве 8х107 вносят в стерильный раствор кондиционной среды культуры ФМССК, после чего готовый раствор в объеме 50 мл с фибробластоподобными мезенхимальными стромальными/стволовыми клетками при помощи эндоскопического спрей-катетера местно орошают в область свищевого хода и краев дефекта.