Композиционный материал для замещения костных дефектов Российский патент 2019 года по МПК C12N5/775 

Изобретение относится к медицине, к области биотехнологии и может быть использовано с целью восполнения послеоперационных дефектов и переломах кости.

На сегодняшний день существует значительное количество материалов используемых для замещения костных дефектов как искусственного, так и животного происхождения.

Известен способ замещения костных дефектов путем помещения имплантата из пористого никелида титана или сплавов на его основе в зону костного дефекта, отличающийся тем, что перед введением имплантат обрабатывают гидроксилапатитом на глубину 10 мм при комнатной температуре, причем при установке имплантата в конгруэнтное костное ложе последнее обрабатывают гидроксиапатитом (Патент РФ №2066982 от 27.09.1996 г. ).

Из уровня техники известен способ замещения дефектов костей путем пластики с использованием аутогенного костно-хрящевого регенерата, выраженного с помощью деминерализованной костной аллоткани, отличающийся тем, что деминерализованную костную аллоткань подсаживают на фасцию или надкостницу, которые рассекают или перфорируют в нескольких местах соответственно зоне расположения деминерализованного трансплантата, выращенный аутогенный костно-хрящевой регенерат используют для замещения костных дефектов отдельно или же в комбинации с деминерализованными или недеминерализованными костными аллотрансплантатами (Патент РФ 2117453 от 20.08.2008).

К основным недостаткам указанных способов можно отнести использование остеокондуктивных синтетических или аллогенных остеонидуктивных материалов несоответствующих антигенной структурой индивидуальному организму. В настоящее время данный недостаток нивелируется использованием мезенхимальных стволовых клеток.

Выявлено, что мезенхимальные стволовые клетки обладают иммуномодулирующим эффектом, ингибируют пролиферацию Т-клеток и снижают вероятность возникновения и степень выраженности РТПХ при совместной трансплантации с гемопоэтическими стволовыми клетками. При этом они существенно ускоряют восстановление поврежденного гемопоэза. Полученные данные о том, что мезенхимальные стволовые клетки не содержат мембранных маркеров, характерных для гемопоэтических клеток, а также антигенов гистосовместимости позволяют рассматривать мезенхимальные стволовые клетки как кандидаты не только для аутологичной, но и для аллогенной клеточной терапии.

Результатом трансплантации больным мезенхимальных стволовых клеток костного мозга может быть восстановление популяции стромальных клеток в различных органах. Стромальные клетки являются источником важных цитокинов и ростовых факторов, которые способствуют активированию и нормализации иммунного ответа, сниженного в результате болезни, а также развитию регенеративных процессов в поврежденных тканях и органах.

Известен способ пролиферации мезенхимальных стволовых клеток человека, предназначенных для реконструкции костных и хрящевых сегментов, например, в травматологической хирургии. В соответствии с этим патентом образец костного мозга человека промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером. Клетки с ядрами подсчитывают с использованием красителя и в среде F12, включающей 10% сыворотки и 1 нг/мг FGF -2, высевают на дно культурального сосуда в количестве 5×106 клеток в виде нефракционированного костного мозга на 10 кв.см сосуда для культуры ткани. Через 48 часов эту среду удаляют, клетки промывают в физиологическом растворе с фосфатным буфером и выдерживают 24-48 часов в среде F12 без каких-либо добавок. Для поддержания остеохондрогенного потенциала в мезенхимальных стволовых клетках и способствования пролиферации клеток в среду добавляют определенную смесь факторов (Патент РФ 2272839 от 27.03.2006).

Известен способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, включающий выделение клеток и инкубирование в питательной среде, отличающийся тем, что выделение фибробластов осуществляют из биоптатов кожи человека путем ферментативной обработки в растворе DMEM/5% ЭБС/0,2% диспазы/0.1 мг/мл коллагеназы I типа при постоянном помешивании и пипетировании при температуре 37°С в течение 1,5 ч в стерильных условиях, полученную суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, осевшие клетки ресуспендируют в среде DMEM/10% ЭБС/100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона и высевают на чашки, затем фибробласты переводят на длительное культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента: DMEM/10%ССКП/100 ед/мл стрептомицина, 100 ед/мл фунгизона или в терапевтической среде AIM-V, перед введением пациентам клетки несколько раз отмывают в буфере Krebs-Ring, обрабатывают раствором 0,25% трипсина/0,02% ЭДТА для снятия клеток с подложки, добавляют 1 мл Krebs-Ringer, центрифугируют 5 мин при 200 g, супернатант сливают, клетки ресуспендируют в новой порции раствора Krebs-Ringer для введения пациентам (Патент РФ 2320720 от 27.03.2008).

Известен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека exvivo включает по меньшей мере два цикла культивирования ядросодержащих костномозговых клеток в ростовой среде до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток. В процессе каждого цикла высевают выделенные клетки в соответствующий культуральный сосуд, регулярно определяют рН ростовой среды и заменяют ростовую среду, рН которой менее 6,0 или более 8,0, на ростовую среду, рН которой лежит в пределах от 6,0 до 8,0, при этом регулярно элиминируют клетки, не относящиеся к популяции мезенхимальных стволовых клеток. Процесс культивирования в каждом цикле ведут до образования сплошного монослоя популяции МСК, который извлекают из культурального сосуда путем его обработки 0,03-0,1%-ным раствором трипсина, а перед и после указанной обработки МСК отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и следов трипсина соответственно. Изобретение позволяет за достаточно короткий период (приблизительно 40 суток) вырастить из 0,5-1,0 мл пунктата костного мозга эффективную терапевтическую дозу МСК (по меньшей мере 5*107-108) (Патент РФ 2323252 от 27.04.2008).

Задачей изобретения является обеспечение процесса регенерации костной ткани в послеоперационных дефектах или переломах.

Техническим результатом изобретения является восстановление архитектоники костной ткани путем стимулирования регенерации костной ткани композицией с индивидуальными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами.

Технический результат достигается за счет того, что композиционный материал для замещения костных дефектов состоит из смеси гранулированного остеопластического материала Bio oss, который после стерильного измельчения при температуре жидкого азота и трехкратного отмыва забуферным физиологическим раствором, подвергается циклической тепловой обработке в термостате при температуре от 70 до 90 градусов Цельсия, три раза по 90 минут и мезенхимальных стволовых клеток пациента имбибированные мезенхимальными стволовыми клетками, культивированными из прикрепленной десны пациента.

Выделение мезенхимальных стволовых клеток из слизистой оболочки десны обеспечивает индивидуализацию остеоиндукции замещения дефекта челюсти.

Использование в процессе остеокондуктивного остеопластического материала Bio-oss обеспечивает восстановление архитектоники челюсти осуществляя профилактику патологических переломов.

В предлагаемом композиционном материале, в отличие от известных ранее, применяется препарат Bio oss органического происхождения, в котором из базового вещества - гидроксиапатита вымыт ранее считавшийся незаменимым и наиболее активным компонентом бета три кальций фосфат.

Композиционный материал для замещения костных дефектов получают следующим образом:

У пациента под инфильтрационной анестезией хирургическим скальпелем осуществляется забор поверхностного слоя слизистой оболочки прикрепленной десны. Полученный фрагмент помещается в 0,05% раствор коллагеназы 2-го типа на 16 часов в термостат при +37°С, с дальнейшим проведением пипетирования осадка и добавления полной питательной среды, состоящей из DMEM/F12 (Invitrogen, США), содержащей 10%) телячью фетальную сыворотку («HyCloneDefined», HyClone, США), инсулин 0,4 мкМ, 0,25 мг/л гентамицина.

Культивирование мезенхимальных стволовых клеток (МСК) осуществляется в стандартных условиях в CO2-инкубаторе с концентрацией CO2 5%, атмосферного воздуха 95% и с повышенной влажностью. Замену культуральной среды на свежую осуществляется каждые 72 часа. Пассирование клеток осуществляли следующим образом: после образования субконфлюэнтного монослоя (80-90% площади культурального пластика) клетки однократно отмывают раствором Версена, затем снимают с помощью раствора Версена с 0,25% трипсином, центрифугируют при 350g, убирают надосадок, осадок ресуспендируют в полной питательной среде и разливали в новую культуральную посуду. Стандартизованную дифференцировку МСК КМ осуществляли в соответствии с протоколами STEMPRO® MSC SFM; StemPro® AdipogenesisDifferentiationKit; StemPro® ChondrogenesisDifferentiationKit; StemPro® OsteogenesisDifferentiationKit.

Иммунофенотипирование осуществляли на проточном цитофлуориметре Gallios (БекманКультер, США). Анализ проводили при помощи ПО AN43172 SoftwareVersion.

Далее гранулы остеопластического материала Bio-oss (Щвецария) были, стерильно измельчены при температуре жидкого азота, после чего их отмывали 3 раза в забуференном физиологическом растворе (PBS) следующим образом:

- гранулы были разложены в одинаковом количестве в стерильные пробирки объемом 2 мл в 4 повторах;

- в каждую пробирку вводили 2 мл PBS и встряхивали на лабораторном шейкере (shaker) 60 сек, после чего давали материалу осесть и супернатант удаляли отсасыванием.

В применяемом композиционном материале, для усиления адгезивных и пролиферативных свойств применяется материал Bio oss, который после стерильного измельчения при температуре жидкого азота и трехкратного отмыва забуферным физиологическим раствором, подвергается циклической тепловой обработке в термостате при температуре от 70 до 90 градусов Цельсия, три раза по 90 минут.

К отмытому материалу добавили 1 мл питательной среды и помещали на 24 часа в CO2-инкубатор, к не промытому материалу также добавили среду на 24 часа для проверки стерильности.

Для проведения скрининга остеопластических материалов при исследовании пролиферационной активности применяли перевиваемую линию фибробластов 3T3/NIH, которая входит в список рекомендованных ГОСТ Р ИСО 10993.5-99.

В результате серии экспериментов in vitro нами доказано что, отмыв всех прочих остеопластических материалов, ухудшают адгезивные и пролиферативные свойства.

Считая, что поверхность гранул с контролем (50 мкл суспензии Цитодекс №3) составляет 8 см², была рассчитана посевная концентрация клеток линии 3Т3, которая составила 30% от 100%) монослоя. Конечный объем среды после засева составил 1,5 мл на диаметр раневой поверхности 10 мм.

Изменение количества применяемого для лечения клеток в ту или другую сторону даже на 3 процента приводит к ингибирующему эффекту и останавливает как адгезию, так и рост и размножение клеток.

Пробирки с образцами материалов с клетками помещали в программируемый ротатор RM-1 (Elmi), скорость вращения 2 об/мин.

Культивирование продолжали в ротаторе, помещенном в термостат, в течение 96 часов при 37°С.

Следует отметить что в существующей лечебной практике дефекты с раневой поверхностью 5 мм и более полностью не восстанавливаются. В нашем случае при применении композиционного материала получено восстановление дефекта с раневой поверхностью диаметром 10 мм.

Полученная композиция готова к использованию.

Таким образом, благодаря полученному с учетом требований п.п. 1-4 композиционному материалу, впервые в мире удалось получить эффект полноценного (100%) заживления дефекта костной ткани челюсти диаметром более 5 мм и восстановление оптической плотности кости в срок на 3 месяца раньше по сравнению с естественным течением репаративного процесса (6 месяцев). В случае естественного репаративного процесса помимо длительных сроков заживления, заполнение дефекта осуществляется в объеме не более 70 процентов, что наряду с несостоятельностью костной ткани в месте дефекта является основной причиной осложнений при последующей имплантации (протезирования). Ниже приведены данные по плотности кости в единицах Хаунсфилда.

Срок 3 месяца, плотность кости при использовании композиционного материла с мезенхимальными стволовыми клетками из десны составляет (761.45. HU) по сравнению с контролем (566.23), в то время как плотность кости на 6 месяце составляет (851.21. HU). Сокращение сроков восстановления костной ткани крайне существенно, поскольку позволяет вдвое сократить срок перевода пациентов на полноценное питание и осуществить полноценное протезирование, в том числе установку дентальных имплантатов в восстановленную костную ткань.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиционному материалу для замещения костных дефектов, состоящему из смеси гранулированного остеопластического материала Bio-Oss и мезенхимальных стволовых клеток пациента, имбибированных мезенхимальными стволовыми клетками, культивированными из прикрепленной десны пациента. Изобретение позволяет эффективно осуществлять восстановление архитектоники костной ткани, а также осуществлять полноценное (100%) заживление дефекта костной ткани челюсти диаметром более 5 мм и восстановление оптической плотности кости в срок на 3 месяца раньше по сравнению с естественным течением репаративного процесса (6 месяцев).

Композиционный материал для замещения костных дефектов состоит из смеси гранулированного остеопластического материала Bio-Oss, который после стерильного измельчения при температуре жидкого азота и трехкратного отмыва забуферным физиологическим раствором подвергается циклической тепловой обработке в термостате при температуре от 70 до 90°С, три раза по 90 мин и мезенхимальных стволовых клеток пациента, имбибированных мезенхимальными стволовыми клетками, культивированными из прикрепленной десны пациента.