Способ определения качества молока с помощью тест-полоски Российский патент 2024 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к области анализа качества молока и молочных продуктов с помощью оптических средств, а именно тест-полосок, с которыми анализируемое вещество вступает в химическую реакцию, путем наблюдения за изменением цвета аналитической зоны, и может быть использовано в пищевой промышленности.

Известно, что перекись водорода широко используется в молочной промышленности в качестве консерванта и антимикробного агента. Однако ее избыточные концентрации могут оказывать токсичное действие на слизистую кишечника потребителей. Кроме того, образование перекиси водорода свидетельствует о развитии патогенных микроорганизмов в продукте.

В свою очередь, крахмал нередко применяется для фальсификации молока и молочных продуктов, поскольку повышает вязкость и создает видимость более высокого содержания сухих веществ. При этом чрезмерное потребление крахмала опасно для больных диабетом. При избыточном потреблении крахмала высвобождаемая энергия может не использоваться в основном обмене и физической активности и приводить к ожирению. В некоторых случаях избыток крахмала может не усваиваться и вызывать диарею.

Как известно, лактоза является основным углеводом, характерным для молока. В молоке здоровых коров её содержание составляет 4,1-5,0% по массе. Уровень лактозы служит важным показателем для контроля качества молока и низколактозных молочных продуктов. Кроме того, отклонение концентрации лактозы от референсных значений может свидетельствовать о проблемах со здоровьем коров.

Таким образом, точное определение концентраций перекиси водорода, крахмала и лактозы имеет принципиальное значение для обеспечения надлежащего качества и безопасности молока и молочных продуктов. Количественный контроль указанных параметров необходим для эффективного мониторинга технологического процесса, выявления фальсификации и микробиологической порчи молока.

Известен качественный способ определения перекиси водорода в образцах молока согласно ГОСТ 24067-80 «Молоко. Метод определения перекиси водорода». Указанный способ характеризуется тем, что сначала готовят раствор серной кислоты в соотношении кислота:вода = 1:3. Также готовят раствор йодистого калия - для этого 3 г крахмала растворяют в 20 см³ воды, затем приливают в колбу к 80 см³ кипящей воды. После охлаждения добавляют растворенный в воде йодистый калий. Для проведения анализа берут 1 см³ молока, добавляют 2 капли раствора серной кислоты и 0,2 см³ приготовленного крахмального раствора йодистого калия. По изменению цвета пробирки с образцом определяют наличие перекиси водорода в исследуемом молоке. К недостаткам способа относится то, что процесс включает приготовление большого количества реагентов, работу с опасной серной кислотой, требует высокой квалификации работников лаборатории и дает только качественную оценку.

Известна технология определения крахмала в молоке йодометрическим способом, описанная в ГОСТ Р 54759-2011 «Продукты переработки молока. Методы определения массовой доли крахмала». Согласно указанной инструкции при подозрении на фальсификацию молока готовят пробу и подвергают ее кислотному гидролизу путем добавления соляной кислоты и кипячения. Затем проводят нейтрализацию щелочью и фильтрование для очистки раствора. Далее осаждают белки при помощи специальных реактивов и снова фильтруют раствор. К полученному фильтрату прибавляют реактив Фелинга и кипятят для гидролиза крахмала с дальнейшим образованием оксида меди (I). Выпавший осадок Cu₂O титруют раствором йода, что позволяет определить содержание восстановившейся меди, соответствующее количеству крахмала. Проводят контрольное титрование для сравнения. Наконец, по таблице находят массовую долю крахмала в исходной пробе молока. Недостатками данного способа считаются использование различных реактивов и их предварительная подготовка, применение специальной посуды и оборудования.

Таким образом, недостатками перечисленных методов являются: сложность исполнения, поскольку требуется квалифицированный персонал; использование сложного дорогостоящего лабораторного оборудования; трудоемкость метода; длительность исполнения (около 2,5 - 3 часов для определения перекиси водорода, около 8 часов для определения крахмала); необходимость использования большого количества реактивов (не менее 4 для определения перекиси водорода, 11 для определения крахмала).

Существуют различные аналитические методы, которые можно использовать для обнаружения лактозы в молочных продуктах.

Ферментативные методы основаны на гидролизе лактозы ферментом β-галактозидазой и последующем определении образовавшейся глюкозы, галактозы или перекиси водорода и обладают высокой специфичностью и чувствительностью. Известен способ определения лактозы в присутствии других сахаров, который описывается в ГОСТ 34304-2017 «Молоко и молочные продукты. Метод определения лактозы и галактозы», представляющий собой метод спектрофотометрического определения массовой доли лактозы с использованием ферментов. В кювету №1 добавляют 0,20 см³ раствора β-никотинамидадениндинуклеотида, 0,02 см³ суспензии фермента β-галактозидазы, буферный раствор и 2,00 см³ воды. Проводят инкубацию, затем измеряют оптическую плотность. Далее добавляют 0,02 см³ суспензии β-галактозодегидрогеназы, инкубируют и измеряют оптическую плотность. В кювету №2 вносят 0,20 см³ β-никотинамидадениндинуклеотида, 0,1 см³ фильтрата, 1,00 см³ буфера и 1,90 см³ воды. Инкубируют, измеряют оптическую плотность. Затем добавляют 0,02 см3 β-галактозодегидрогеназы, инкубируют и измеряют оптическую плотность. В кювету №3 вносят 0,20 см³ β-никотинамидадениндинуклеотида, 0,1 см³ фильтрата, инкубируют, добавляют 1,00 см³ буфера и 1,90 см³ воды. Измеряют оптическую плотность, затем добавляют 0,02 см³ β-галактозодегидрогеназы, инкубируют и периодически измеряют оптическую плотность. По полученным данным проводят расчеты массовой доли лактозы по формулам. К недостаткам данного метода относят использование и приготовление большого количества реагентов, предварительную стадию пробоподготовки молока и работу с дополнительным оборудованием.

Кроме того, существуют следующие методы определения лактозы: ИК-спектроскопия (ГОСТ 32255-2013 «Инструментальный экспресс-метод определения физико-химических показателей идентификации с применением инфракрасного анализатора»); ЯМР-спектроскопия; криоскопия; УЗ-спектроскопия; хроматографические методы (ВЭЖХ, ГХ, ТСХ); колориметрические методы; поляриметрия (ГОСТ Р 54667-2011 «Молоко и продукты переработки молока. Методы определения массовой доли сахаров»).

Таким образом, перечисленные выше методы требуют дорогостоящего лабораторного оборудования (ИК-, ЯМР- и УЗ-спектроскопия, хроматография) и большого расхода реактивов (ферментативный, поляриметрический и колориметрический), а также высокой квалификации персонала для подготовки и проведения анализа. Поэтому многие из них могут быть использованы только в качестве арбитражных методов.

В наиболее близком и принятом в качестве прототипа способе определения показателей качества молока и фальсифицирующих его веществ, используются тестовые полоски Milk Security [Milk security tests // Lactoscan. URL: https://lactoscan.com/milk-security-tests-(50,1,1) (дата обращения: 27.09.2023)]. Данный способ позволяет выявить пероксид водорода и мальтодекстрин (продукт гидролиза крахмала) в молоке. Способ определения включает следующие шаги: опустить аналитическую зону тест-полоски в пробу молока на 3 секунды; вынуть тест-полоску и полностью удалить все молоко с нее, слегка постучав по краю ёмкости тест-полоской; сравнить цвет тест-полоски с цветовой шкалой на этикетке. К недостаткам данного метода относят низкую разрешающую способность (цветовая шкала с тремя цветовыми полями, соответствующими диапазонам концентраций для пероксида водорода: 0,0075% - 0,015%, 0,015% - 0,025% и более 0,025%; и для мальтодекстрина: 0,02% - 0,06%, 0,06% - 0,2% и более 0,2%), т. е. возможность только полуколичественного определения анализируемых веществ, узкий диапазон концентраций, а также использование дорогостоящего фермента и неустойчивого к внешнему воздействию хромогена в системе при определении пероксида водорода.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка способа определения качества молока с помощью колориметрических тестовых полосок на основе диоксида титана, обладающего пероксидазноподобной активностью, характеризующихся высокими чувствительностью и разрешающей способностью, возможностью количественного определения анализируемых веществ в широком диапазоне концентраций, а также в котором отсутствует пробоподготовка молока.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является возможность более точной оценки качества и безопасности молочной продукции с установлением в молоке концентрации фальсифицирующих веществ (пероксида водорода и крахмала), а также лактозы. Тест-полоски позволяют определить наличие перечисленных анализируемых веществ в следующих широких диапазонах концентраций: пероксида водорода от 0,005% до 0,5%, крахмала от 0,025% до 2,0% и лактозы от 0,005% до 2,5%. За счет разбавления образцов молока водой можно покрыть весь необходимый диапазон концентраций анализируемого вещества в молоке. Описываемый в данном патенте способ отличается большей разрешающей способностью метода: не менее 5 цветовых полей для визуального определения концентрации каждого анализируемого вещества и осуществляется без использования фермента пероксидазы и нестабильного при хранении хромогена.

Указанный технический результат достигается тем, что способ определения качества молока с помощью тест-полоски, включающий регистрацию изменения цвета аналитической зоны и оценку концентрации анализируемого вещества по эталонной цветовой шкале, отличается тем, что в качестве основного реагента аналитической зоны используют золь диоксида титана с рН 4,5, полученный золь-гель методом с применением кислотной пептизации и последующей диализной очисткой в течение 36 часов, с дальнейшим добавлением глицерина к золю диоксида титана в объемном соотношении 1 к 14, позволяющий количественно определять перекись водорода в молоке, при этом аналитическую зону получают нанесением основного реагента в количестве 50 мкл на область тест-полоски площадью 20 мм².

Для количественного определения крахмала в молоке к основному реагенту аналитической зоны добавляют фермент глюкоамилазу Aspergillus Niger, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 150 Ед/мл, и фермент глюкозооксидазу Aspergillus Niger, приготовленный в водном растворе глицерина с концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 150 Ед/мл, в объемном соотношении глюкоамилаза : глюкозооксидаза : основной реагент = 1:1:8.

Для количественного определения лактозы в молоке к основному реагенту аналитической зоны добавляют фермент β-галактозидазу Kluyveromyces lactis, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 200 Ед/мл, и фермент глюкозооксидазу Aspergillus Niger, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 150 Ед/мл, в объемном соотношении β-галактозидаза : глюкозооксидаза : основной реагент = 1:1:4.

Дополнительно регистрацию оптического отклика с аналитической зоны осуществляют спектрофотометрически с помощью приставки диффузного отражения спектрофотометра Agilent Cary 60.

Таким образом, использование тестовых полосок на основе золя диоксида титана позволяет проводить чувствительный и селективный анализ молока без комплексной пробоподготовки в широком диапазоне концентраций анализируемых веществ.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг. 1 приведён внешний вид тестовой полоски с геометрическими размерами: длина 70 мм, ширина 11 мм, радиус аналитической зоны 5 мм.

На фиг. 2 показана принципиальная схема определения анализируемых веществ с помощью тестовой полоски. Изначально на аналитическую зону наносят молоко, содержащее предполагаемое анализируемое вещество. После высушивания регистрируют оптический отклик либо визуально по цветовой эталонной шкале, либо с помощью спектроскопии диффузного отражения (в данном случае приведен график для пероксида водорода). В соответствии с калибровочной кривой, построенной по спектрам, определяют концентрацию вещества.

Осуществление изобретения

Пример 1.

Способ определения концентрации пероксида водорода в молоке с помощью тестовой полоски.

В качестве анализирующего реагента выбирают диоксид титана как вещество, способное реагировать с пероксидом водорода с образованием желтого пероксотитанового комплекса. Для синтеза золя диоксида титана концентрированную HNO₃ (0,7 мл) добавляют к деионизированной воде (100 мл) и перемешивают при 900 об/мин при t=80°C с обратным холодильником. Смесь изопропоксида титана концентрацией 97% и изопропанола концентрацией 99,8% (в объемном соотношении 4:3) объемом 28 мл добавляют к приготовленному раствору HNO₃ со скоростью 5 мл/мин. Смесь перемешивают с обратным холодильником в течение 1 ч при t=80°C. Затем смесь герметично закрывают и перемешивают (900 об/мин) при комнатной температуре в течение 5-7 дней, пока размер частиц не становится постоянным [Yakovlev A.V., Milichko V.A., Vinogradov V.V., Vinogradov A.V. Inkjet color printing by interference nanostructures / Yakovlev A.V., Milichko V.A., Vinogradov V.V., Vinogradov A.V. // ACS nano. - 2016. - № 22. - С. 3078-3086.]. После синтеза золь подвергают диализу против деионизированной воды до рН 4,5, который является биосовместимым для ферментов.

Подготавливают бумажную основу для тестовой полоски размером 11х70 мм, напечатав предварительно на принтере черными чернилами квадрат с помещенным в центре белым кругом для аналитической зоны диаметром 5 мм (Фиг. 1).

Золь TiO₂ после диализа смешивают с глицерином для достижения концентрации глицерина в золе 8 масс.%. Смесь наносят в количестве 50 мкл на область тест-полоски площадью 20 мм². Затем, тест-полоску с нанесенным основным реагентом подвергают сушке при комнатной температуре в течение 2 часов.

Для определения концентрации пероксида водорода наносят 50 мкл молока (пастеризованного жирностью 3,2 % (Тёма, Петмол, Санкт-Петербург, Россия)), предположительно содержащего аналит, на аналитическую зону тестовой полоски, далее оставляют в течение 30 секунд, затем оценивают окрашивание аналитической зоны с помощью визуальной оценки или путем регистрации спектров отражения.

В качестве более точного метода регистрации аналитического сигнала применяют метод спектроскопии диффузного отражения. Для регистрации спектров отражения используют приставку Video Barellino к спектрофотометру Agilent Cary 60. Спектры отражения регистрируют в диапазоне длин волн от 350 до 600 нм (Фиг. 2).

Приготавливая растворы различных концентраций перекиси водорода и регистрируя спектры отражения, получают градуировочную зависимость оптической плотности от концентрации в диапазоне от 0,005 масс.% до 0,5 масс.%. В качестве контрольного образца используют аналитическую зону до нанесения молока. Затем, по градуировочному графику оценивают концентрацию анализируемого вещества в пробе.

Пример 2.

Способ определения концентрации крахмала в молоке с помощью тестовой полоски.

Суть предлагаемого способа для определения крахмала состоит в использовании комбинации двух ферментов (глюкоамилазы и глюкозооксидазы - для распознавания крахмала, с образованием пероксида водорода в ходе второй ферментативной реакции) и диоксида титана в качестве матрицы, выполняющей функцию пероксидазы и хромогена.

Золь диоксида титана синтезируют согласно примеру 1. Бумажную основу для тестовой полоски подготавливают согласно примеру 1.

Глюкозооксидазу растворяют в 10 масс.% водном растворе глицерина до достижения конечной активности фермента 150 Eд/мл и конечной концентрации глицерина 8%. Глюкоамилазу готовят в 10 масс.% водном растворе глицерина для достижения конечной активности 150 Eд/мл и конечной концентрации глицерина 8%.

Тест-полоску на крахмал готовят путем смешивания глюкоамилазы (50 мкл, 150 Ед/мл), глюкозооксидазы (50 мкл, 150 Ед/мл) и TiO₂ после диализа (400 мкл) в объемном соотношении 1:1:8. Полученную смесь наносят в объеме 50 мкл на область тест-полоски площадью 20 мм² и сушат при комнатной температуре в течение 2 часов.

Для определения концентрации крахмала наносят 50 мкл молока (пастеризованного жирностью 3,2 % (Тёма, Петмол, Санкт-Петербург, Россия), предположительно содержащего аналит, на аналитическую зону, далее оставляют в течение 25 мин, а затем оценивают окрашивание аналитической зоны с помощью визуальной оценки или путем регистрации спектров отражения.

Регистрация спектров отражения проводится аналогично методике, указанной в примере 1.

Приготавливая растворы различных концентраций крахмала в молоке и регистрируя спектры отражения, получают градуировочную зависимость оптической плотности от концентрации в диапазоне от 0,025 масс.% до 2,0 масс.%. В качестве контрольного образца используют аналитическую зону до нанесения молока. Затем, по градуировочному графику оценивают концентрацию анализируемого вещества в пробе.

Пример 3.

Способ определения концентрации лактозы в молоке с помощью тестовой полоски.

Аналогично тестовой полоске на крахмал, тестовая полоска на лактозу содержит два фермента, где вместо глюкоамилазы используется β-галактозидаза.

Золь диоксида титана готовят согласно примеру 1. Бумажную основу для тестовой полоски подготавливают согласно примеру 1. Раствор фермента глюкозооксидазы получают согласно примеру 2.

Фермент β-галактозидазу готовят в 10 масс.% водном растворе глицерина для достижения конечной активности 200 Eд/мл и конечной концентрации глицерина 8 масс.%.

Тест-полоску на лактозу готовят путем смешивания β-галактозидазы (100 мкл, 200 Ед/мл), глюкозооксидазы (100 мкл, 150 Ед/мл) и TiO₂ после диализа (400 мкл) в объемном соотношении 1:1:4. Полученную смесь наносят в объеме 50 мкл на бумажную подложку и сушат при комнатной температуре в течение 2 часов.

Для определения концентрации лактозы наносят 50 мкл молока (пастеризованного жирностью 3,2 % (Тёма, Петмол, Санкт-Петербург, Россия), содержащего аналит, на аналитическую зону. Пробу молока объемом 50 мкл наносят на аналитическую зону тестовой полоски, далее оставляют в течение 25 мин, а затем оценивают окрашивание аналитической зоны с помощью визуальной оценки или путем регистрации спектров отражения.

Регистрация спектров отражения проводится аналогично методике, указанной в примере 1.

Приготавливая растворы различных концентраций лактозы и регистрируя спектры отражения, получают градуировочные зависимости оптической плотности от концентрации в диапазоне от 0,005 масс.% до 2,5 масс.%. В качестве контрольного образца используют аналитическую зону до нанесения молока. Затем, по градуировочному графику оценивают концентрацию анализируемого вещества в пробе.

Таким образом, способ позволяет оперативно (не более 25 мин) с высокими точностью, селективностью и воспроизводимостью и низким пределом обнаружения определять содержание пероксида водорода, крахмала и лактозы при анализе качества молока на предприятиях. Все реакции происходят в малых количествах непосредственно на тест-полоске без предварительной пробоподготовки, что способствует экономии реагентов. В отличие от прототипа изобретение предоставляет возможность количественного определения анализируемых веществ, позволяет повысить верхний предел обнаружения перекиси водорода с 0,025% до 0,5% и осуществляется без использования фермента пероксидазы и нестабильного при хранении хромогена.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к анализу качества молока и молочных продуктов с помощью оптических средств. Способ определения качества молока с помощью тест-полоски включает регистрацию изменения цвета трех аналитических зон и оценку концентрации анализируемого вещества по эталонным цветовым шкалам. В качестве основного реагента первой аналитической зоны для количественного определения перекиси водорода в молоке используют золь диоксида титана с рН 4,5, который получают золь-гель методом с применением кислотной пептизации и последующей диализной очисткой в течение 36 часов, с дальнейшим добавлением глицерина к золю диоксида титана в объемном соотношении 1 к 14. Для количественного определения крахмала в молоке по второй аналитической зоне к золю диоксида титана добавляют ферменты глюкоамилазу и глюкозооксидазу, а для количественного определения лактозы по третьей аналитической зоне к золю добавляют ферменты β-галактозидазу и глюкозооксидазу. Аналитические зоны получают нанесением соответствующего реагента в количестве 50 мкл на области тест-полоски площадью 20 мм². Способ с использованием тестовых полосок на основе золя диоксида титана обладает улучшенными аналитическими характеристиками по сравнению с ранее известными тест-полосками и позволяет проводить оперативную оценку качества и безопасности молока и молочной продукции с установлением более точной концентрации пероксида водорода, крахмала и лактозы. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

1. Способ определения качества молока с помощью тест-полоски, включающий регистрацию изменения цвета аналитических зон и оценку концентрации анализируемых веществ по эталонным цветовым шкалам, отличающийся тем, что в качестве реагента первой аналитической зоны на определение перекиси водорода в молоке используют золь диоксида титана с рН 4,5, полученный золь-гель методом с применением кислотной пептизации и последующей диализной очисткой в течение 36 часов, с дальнейшим добавлением глицерина к золю диоксида титана в объемном соотношении 1 к 14; в качестве реагента второй аналитической зоны на определение крахмала в молоке используют реагент первой аналитической зоны и добавляют фермент глюкоамилазу Aspergillus Niger, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 150 Ед/мл, и фермент глюкозооксидазу Aspergillus Niger, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 150 Ед/мл, в объемном соотношении глюкоамилаза : глюкозооксидаза : реагент 1-й зоны = 1:1:8; а в качестве реагента третьей аналитической зоны на определение лактозы в молоке используют реагент первой аналитической зоны и добавляют фермент β-галактозидазу Kluyveromyces lactis, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 200 Ед/мл, и фермент глюкозооксидазу Aspergillus Niger, приготовленный в водном растворе глицерина концентрацией 10 масс.% до достижения итоговых концентрации глицерина 8 масс.% и активности фермента 150 Ед/мл, в объемном соотношении β-галактозидаза : глюкозооксидаза : реагент 1-й зоны = 1:1:4, при этом все три аналитические зоны получают нанесением соответствующего реагента в количестве 50 мкл на области тест-полоски площадью 20 мм².

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрацию оптического отклика с аналитической зоны осуществляют спектрофотометрически с помощью приставки диффузного отражения к спектрофотометру Agilent Cary 60.