Композиционный материал и устройство для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/06 G01N27/06 G01N27/327 G01N33/493 H01M4/02 

[01] Область техники

[02] Группа изобретений относится к области биотехнологии, а именно к композиционным материалам для биосенсорных аналитических устройств (биосенсоров) и конструкциям указанных устройств, и может быть использована для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях, а именно образцах бродильных и ферментационных сред, а также жидких пищевых продуктах.

[03] Уровень техники

[04] В области биотехнологии и контроля качества продуктов питания широко распространены следующие методы для количественной оценки содержания крахмала: поляриметрический и титриметрический. Недостатками данных методов является необходимость пробоподготовки образцов для предварительного гидролиза крахмала в пробах. Существуют также качественные методы определения крахмала, основанные на реакции взаимодействия крахмала с йодом и появлении синего окрашивания. Они реализованы в коммерчески доступных тест-полосках и являются простыми и удобными в использовании, однако не позволяют проводить контроль содержания крахмала в жидких продуктах питания, где его использование разрешено в качестве загустителя, стабилизатора, эмульгатора или носителя в регламентируемых малых количествах.

[05] Известно устройство для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях, которое содержит стеклоуглеродный электрод, рабочая площадь поверхности которого покрыта наноматериалом - оксидом графена, ферментами - глюкозоокси-дазой и глюкоамилазой, иммобилизованных на дрожжевых клетках [Liu J. et al. Sensitive electrochemical sequential enzyme biosensor for glucose and starch based on glucoamylase-and glucose oxidase-controllably co-displayed yeast recombinant // Analytica Chimica Acta. -2022. - T. 1221. - C. 340173]. Устройство позволяет проводить определение крахмала в диапазоне от 50 до 3500 мг/дм³. Недостатком описанного устройства является невозможность определения содержания крахмала в образцах, содержащих менее 50 мг/дм³ крахмала.

[06] Ближайшим аналогом заявленной группы изобретений является композиция и устройство для количественного определения содержания крахмала в жидкостях, описанные в источнике [Lang Q. et al. Co-immobilization of glucoamylase and glucose oxidase for electrochemical sequential enzyme electrode for starch biosensor and biofuel cell // Biosensors and Bioelectronics. - 2014. - T. 51. - C. 158-163]. Данное устройство содержит стеклоуглеродный электрод, модифицированный наноматерналом в виде многостенн-ных углеродных нанотрубок и биоматериалом в виде смеси ферментов глюкозоокси-дазы и глюкоамилазы, иммобилизованных в полимерную матрицу, содержащую бычий сывороточный альбумин. Диапазон определяемых концентраций крахмала данным устройством составляет 0,005-0,7% (по массе) крахмала, что соответствует концентрации 50-7000 мг/дм³ при плотности раствора равной 1 г/дм³. Относительное стандартное отклонение серии восьми последовательных аналитических сигналов составляет 9%. Недостатком описанного устройства является невозможность количественной оценки содержания крахмала в образцах, содержащих небольшое количество крахмала.

[07] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлена заявленная группа изобретений является отсутствие простых и доступных количественных методов оценки содержания крахмала малых концентраций в жидкостях с применением устройств, обладающих высокими техническими характеристиками.

[08] Раскрытие сущности изобретения

[09] Техническим результатом группы изобретений является снижение нижней границы диапазона определяемых концентраций крахмала в жидкостях до 2 мг/дм³, а также уменьшение относительного стандартного отклонения серии проводимых измерений.

[010] Указанный технический результат достигается в композиционном материале для устройства для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях, содержащем полимерную матрицу на основе бычьего сывороточного альбумина, включения углеродных нанотрубок и включения смеси ферментов глюкозо оксид азы и глюкоамилазы, иммобилизованные в полимерную матрицу, где полимерная матрица содержит бычий сывороточный альбумин, ковалентно связанный с редокс-активным соединением в виде нейтрального красного, включения одностенных углеродных нанотрубок, при этом композиционный материал содержит компоненты в следующем соотношении, мас. %: включения одностенных углеродных нанотрубок 1,0-3,0, включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы - 1,5-3,0, полимерная матрица - остальное.

[011] В частном случае реализации заявленного композиционного материала:

[012] - композиционный материал получен путем смешивания бычьего сывороточного альбумина, калий-натриевого фосфатного буферного раствора, суспензии одностенных углеродных нанотрубок, насыщенного раствора нейтрального красного, смеси ферментов глюкозо оксид азы и глюкоамилазы и раствора глутарового альдегида.

[013] Указанный технический результат достигается также в устройстве для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях за счет того, что оно содержит рабочий электрод, поверхность которого покрыта композиционным материалом в соответствии с заявленным изобретением.

[014] В частном случае реализации заявленного устройства:

[015] - в качестве рабочего электрода использован графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.

[016] Зависимость аналитического сигнала биосенсоров на основе смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы от концентрации крахмала имеет типичный для ферментативных реакций вид, поэтому экспериментальные данные аппроксимируются уравнением гиперболы с двумя параметрами и интерпретируются в рамах классической кинетической модели Михаэлиса-Ментен. Верхняя граница определяемых концентраций ферментных биосенсоров определяется значением параметра, аналогичного константе Михаэлиса. Снижение нижней границы определяемых концентраций крахмала связано с заменой стеклоуглеродного электрода на графитовый печатный элекрод, модифицированный бычьим сывороточным альбумином, ковалентно связанным с нейтральным красным, который используется совместно с одностенными углеродными нанотрубками, взятыми в качестве нано матер нала. Совокупность указанных компонентов приводят к изменению микроокружения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы, что изменяет сродство ферментов к субстратам и приводит к более низкой концентрации субстрата, необходимой для достижения той же каталитической эффективности, что и у свободного фермента.

[017] Введение редокс-активного соединения в виде нейтрального красного непосредственно в структуру полимера (бычьего сывороточного альбумина), используемого для иммобилизации смеси указанных ферментов, приводит к усилению взаимодействия «фермент редокс-активное соединение», что обеспечивает быстрый медиа-торный перенос электронов с используемых ферментов на графитовый печатный электрод электрод, что способствуют снижению нижней границы определяемых концентраций крахмала и повышает стабильность биосенсора.

[018] Использование в качестве наноматериала одностенных углеродных нанотрубок приводит к формированию более развитой поверхности рабочего электрода в виду более высокого отношения площади поверхности к объему по сравнению с многостенными углеродными нанотрубками, что обеспечивает увеличение точек контакта между используемыми ферментами, медиатором нейтральным красным и графитовым печатным электродом, и, следовательно, уменьшение нижней границы диапазона определяемых содержаний крахмала.

[019] В частном случае реализации заявленного устройства замена стеклоуглеродного электрода на графитовый печатный электрод обеспечивает дополнительный технический результат в виде удобства модификации, возможности конструирования воспроизводимых одноразовых датчиков и тест-полосок, а также меньшим расходом реагентов и биоматериала ввиду более низкой площади рабочей поверхности электрода.

[020] Краткое описание чертежей

[021] Группа изобретений поясняется фигурами, где:

На фигуре 1 схематично показан общий вид заявленных композиционного материала и устройства,

На фигуре 2 показан общий вид заявленных композиционного материала и устройства в разрезе,

На фигуре 3 показана схема образования бычьего сывороточного альбумина, ковалентно связанного с медиатором нейтральным красным,

На фигуре 4 показан регистрируемый сигнал от заявленного устройства в виде зависимости силы тока (нА) от времени (с),

На фигуре 5 показана градуировочная зависимость заявленного устройства,

На фигуре 6 показан линейный участок градуировочной зависимости.

[022] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 - рабочий электрод,

2 - включения одностенных углеродных нанотрубок,

3 - включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы,

4 - полимерная матрица.

[023] Осуществление изобретения

[024] Заявленный композиционный материал содержит:

[025] - полимерную матрицу (4), включающую полимер в виде бычьего сывороточного альбумина, модифицированного редокс-активным соединением в виде нейтрального красного, преимущественно, в количестве 94,0-97,5 мас. %;

[026] - размещенные в указанной полимерной матрице включения наноматери-ала в виде одностенных углеродных нанотрубок (2) в количестве 1,0-3,0 мас. %

[027] - и иммобилизованные в указанную полимерную матрицу включения био-распознающего компонента в виде смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы

(3) в количестве 1,5-3,0 мас. %.

[028] Для формирования пространственной структуры полимерной матрицы (4) в виде гидрогеля используют бычий сывороточный альбумин в количестве 3,7-5,0 мас. % (предпочтительно 3,7 мас. %), калий-натрий фосфатный буферный раствор с рН 6-8, который также служит в целях регулирования рН смеси, в количестве 30,0-50,0 мас. %, медиатор в виде насыщенного раствора нейтрального красного в количестве 5,0-7,0 мас. %, а также бифункциональный сшивающий агент в виде раствора глутарового альдегида в количестве 7,5-9,5 мас. %.

[029] Заявленное устройство включает рабочий электрод (1), поверхность которого модифицирована (покрыта) описанным выше композиционным материалом, соответствующим заявленному изобретению. В качестве рабочего электрода (1), преимущественно, используют графитовый печатный электрод. Также может быть использован инертный металлический электрод.

[030] Ниже представлены примеры получения заявленной группы изобретений.

[031] Пример 1. В пробирке к 0,0035 г бычьего сывороточного альбумина добавляют 50 мкл калий-натрий фосфатного буферного раствора с рН 6-8, 10 мкл суспензии одностенных углеродных нанотрубок, 5 мкл насыщенного раствора медиатора нейтрального красного и смесь ферментов глюкозооксидазы (Т=2,5 Е/мкл, V=10 мкл) и глюкоамилазы (1 Е/мкл, V=10 мкл). Полученную смесь встряхивают в течение 2 минут. Затем к полученной смеси добавляют 7,5 мкл 25 мас. % раствора глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод. Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода и оставляют до полного высыхания. В результате получают композиционный материал со следующим соотношением компонентов: полимерная матрица (4) - 97,0 мас. %, включения одностенных углеродных нанотрубок (2) - 1,0 мас. % в пересчете на сухое вещество, включения фермента глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3) 2,0 мас. % в пересчете на сухое вещество.

[032] Пример 2. В пробирке к 0,005 г бычьего сывороточного альбумина добавляют 50 мкл калий-натрий фосфатного буферного раствора с рН 6-8, 10 мкл суспензии одностенных углеродных нанотрубок, 7 мкл насыщенного раствора медиатора нейтрального красного и смесь ферментов глюкозооксидазы (Т=2,5 Е/мкл, V=15 мкл) и глюкоамилазы (1 Е/мкл, V=15 мкл). Полученную смесь встряхивают в течение 2 минут.Затем к полученной смеси добавляют 9 мкл 25 мас. % равствора глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод. Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода и оставляют до полного высыхания. В результате получают композиционный материал со следующим соотношением компонентов: полимерная матрица (4) - 95,0 мас. %, включения одностенных углеродных нанотрубок (2) - 2,0 мас. % в пересчете на сухое вещество, включения фермента глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3) 3,0 мас. % в пересчете на сухое вещество.

[033] Пример 3. В пробирке к 0,003 г бычьего сывороточного альбумина добавляют 50 мкл калий-натрий фосфатного буферного раствора с рН 6-8, 30 мкл суспензии одностенных углеродных нанотрубок, 4 мкл насыщенного раствора медиатора нейтрального красного и смесь ферментов глюкозооксидазы (Т=2,5 Е/мкл, V=7,5 мкл) и глюкоамилазы (1 Е/мкл, V=7,5 мкл). Полученную смесь встряхивают в течение 2 минут. Затем к полученной смеси добавляют 7 мкл 25 мас. % равствора глутарового альдегида и встряхивают в течение не более 30 секунд перед нанесением на графитовый печатный электрод. Далее 3 мкл полученной смеси наносят на рабочую поверхность графитового печатного электрода и оставляют до полного высыхания. В результате получают композиционный материал со следующим соотношением компонентов: полимерная матрица (4) - 95,5 мас. %, включения одностенных углеродных нанотрубок (2) - 3,0 мас. % в пересчете на сухое вещество, включения фермента глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3) - 1,5 мас. % в пересчете на сухое вещество.

[034] Принцип работы заявленной группы изобретений заключается в следующем.

[035] Для измерений используют потенциостат, измерительную кювету объемом, к примеру, 5 мл, магнитную мешалку и портативный компьютер. Заявленное устройство помещают в измерительную кювету, добавляют натрий-калий фосфатный буферный раствор с рН 6-8, включают магнитную мешалку и регистрируют фоновый ток в измерительной кювете. Для регистрации результатов измерения можно использовать потенциостат CS150 (Contest, Китай), подключаемый к рабочему электроду и персональному компьютеру. Затем вводят анализируемую пробу жидкости. Измерения проводят при комнатной температуре и рабочем потенциале -550 мВ, что связано с окислительно-восстановительными свойствами редокс-активного соединения, используемого в композиции - нейтрального красного. После каждого измерения промывают измерительную кювету фосфатным буферным раствором с рН 6,8 в объеме, равном объему измерительной кюветы.

[036] Сигналом рабочего электрода (1) является зависимость силы тока (нА) от времени (с) (см. фиг. З). Далее рассчитывают амплитуду изменения силы тока после введения пробы в измерительную кювету (ответ биосенсора, Д1, нА). Содержание крахмала в пробе определяют с использованием предварительно построенной градуировочной зависимости, показанной на фиг. 4. Расчет проводят следующим образом: содержание крахмала в образце определяют с использованием уравнения, описывающего линейный участок градуировочной зависимости, показанной на фиг. 5 (у=10,65+1,03х, где х концентрация крахмала, мг/дм³, у - ответ биосенсора, нА). Примеры результатов расчета концентрации крахмала в жидкостях с помощью заявленной группы изобретений в соответствии с вышеприведенными примерами 1-3 приведены в таблице 1.

[037] Таблица 1. Результаты расчета концентрации крахмала в жидкостях с помощью заявленной группы изобретений

[038] Основные характеристики заявленного устройства для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях и устройства согласно ближайшему аналогу приведены в таблице 2.

[039] Таблица 2. Сравнительные характеристики устройств для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях

[040] Таким образом, заявленные композиционный материал и устройство для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях позволяют определить содержание крахмала низкой концентрации (от 2 мг/дм³) с более низким относительным стандартным отклонением серии восьми последовательных аналитических сигналов.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлен композиционный материал для устройства для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях, который содержит полимерную матрицу (4) на основе бычьего сывороточного альбумина, включения углеродных нанотрубок и включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), где полимерная матрица (4) содержит бычий сывороточный альбумин, ковалентно связанный с редокс-активным соединением в виде нейтрального красного, включения одностенных углеродных нанотрубок (2). Также раскрыто устройство для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях, которое содержит рабочий электрод (1), поверхность которого покрыта композиционным материалом в соответствии с заявленным изобретением. Изобретение может быть использовано для количественной оценки содержания крахмала в жидкостях, а именно образцах бродильных и ферментационных сред, а также жидких пищевых продуктах. При этом заявленное изобретение позволяет снизить нижнюю границу диапазона определяемых концентраций крахмала в жидкостях до 2 мг/дм³, а также уменьшить относительное отклонение серии проводимых измерений. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Композиционный материал в качестве покрытия устройства для количественной оценки содержания крахмала в жидких пищевых продуктах, бродильных и ферментационных средах, содержащий полимерную матрицу (4) на основе бычьего сывороточного альбумина, включения углеродных нанотрубок и включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), отличающийся тем, что полимерная матрица (4) содержит бычий сывороточный альбумин, ковалентно связанный с редокс-активным соединением в виде нейтрального красного, включения одностенных углеродных нанотрубок (2), при этом композиционный материал содержит компоненты в следующем соотношении, мас.%:

включения одностенных углеродных нанотрубок (2) 1,0-3,0 включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3) 1,5-3,0 полимерная матрица (4) остальное

2. Композиционный материал в качестве покрытия устройства для количественной оценки содержания крахмала в жидких пищевых продуктах, бродильных и ферментационных средах по п. 1, отличающийся тем, что композиционный материал получен путем смешивания бычьего сывороточного альбумина, калий-натриевого фосфатного буферного раствора, суспензии одностенных углеродных нанотрубок, насыщенного раствора нейтрального красного, смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы и раствора глутарового альдегида.

3. Устройство для количественной оценки содержания крахмала в жидких пищевых продуктах, бродильных и ферментационных средах, представляющее собой рабочий электрод (1), поверхность которого покрыта композиционным материалом, содержащим полимерную матрицу (4) на основе бычьего сывороточного альбумина, включения углеродных нанотрубок и включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3), иммобилизованные в полимерную матрицу (4), при этом полимерная матрица (4) содержит бычий сывороточный альбумин, ковалентно связанный с редокс-активным соединением в виде нейтрального красного, включения одностенных углеродных нанотрубок (2), а композиционный материал содержит компоненты в следующем соотношении, мас.%:

включения одностенных углеродных нанотрубок (2) 1,0-3,0 включения смеси ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы (3) 1,5-3,0 полимерная матрица (4) остальное

4. Устройство для количественной оценки содержания крахмала в жидких пищевых продуктах, бродильных и ферментационных средах по п. 3, отличающееся тем, что в качестве рабочего электрода (1) использован графитовый печатный электрод или инертный металлический электрод.