Способ количественного определения каталазы в молоке и других биологических жидкостях Советский патент 1978 года по МПК G01N33/02 C12D13/10 

(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТАЛАЗЫ В МОЛОКЕ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

руемую жидкость, содержащую пероксидазу и лейкокрас11ге/ ь, дополнительно вводят фермент или синергетические фермеиты, гакие как 1-алактозооксндазу или / -галактозидазу и г.покозооксидазу или /3-галактозидазу и галактозооксидазу, проду1|ируюи. перекись водорода иепосредствеиыо в анали3ируемую ж11 дкость.

1ейк()красиге,1ь окис.тяют перекисью водорода в ирису ствпн катализатора иероксндазы, и ио происходящей цветной реакции судят о количестве каталазы и о качественном составе анализируемого иродукта

Колнчествеииый аиалпз каталазыпроводят при помощи фильтровальной бумаги, на одиой стороне которой помещают пероксидазу и лейкокраситель, отделяя tt.x от фермента или синергетическпх ферментов, епособиых выделять перекись водорода.

При отс тствип в анализируемой жидкости каталазы раствор имеет темно-гол бой пли зеленый цвет, а в случае ее высокой концентрации - бледно-желтый цвет. Чувствительность определения обратно пропорциональна концентрации пероксидазы в реакциониой с.меси.

В с.тучае анализа молока, взятого от коров, зараженны.х мастито.м (степень заражения возрастаюц|ая), цветная реакция приводит к образованшо жидког-о иродукта, имеющего цвет от средне-голубого до слабо-желтого.

При определении каталазы одну молока перемешивают с одной каплей реакционного раствора, прпготовленного по с дному из еледующп.х составов, мг/ыл:

I./ -Галактозидаза0,1

Глюкозооксидаза или

галактозоокспдаза0,1

Пероксидаза0,1

о-Толидин0.2

II.Галактозооксидаза0,1 Пероксидаза ,0,1 о-Тол ид и н0,2

III.Гииоксантпи0,1 Пероксидаза1,0 о-Толидин0,2

IV.Перборат патрия или пероксид мочеиины1,0 Пероксидаза1,0 о-Тол иди н0,2

Одним пз этих составов пропитывают полоску фильтровальной бума|-н и высушивают, затем вносят в молоко, предназначенное для анализа на содержание в нем каталазы. При этом полоска фильтровальной бумаги абсорбирует определенное количество молока, соответствующее количеству реагентов, находящихся на бумаге. Используе.мая в указанных составах пероксидаз.а может и.меть соответствующую промыщленной степень чистоты. Глюкозооксидаза и галактозидаза должны быть приготовлены пригодными для анализа невысоких концентраций каталазы. Для обеспечения устойчивости реагентов оии

должны быть растворены в соответствующем буферно.м растворе с рН 7.

Пример . Испытательную ячейку разделяют на две секции, одну из которых закрывают полупроницаемой мембраной, при этом о па содержит 1 -10 V галактозооксидазы (в )асчете на лактозу, являющуюся субстратом). В открытую секцию исиытательной ячейки добавляют 0,5-1,0 мл жидкости, 0 подвергае.мой анализу на содержание каталазы. Испытательную бу.магу, содержащую пероксидазу и лейкокраситель, помещают в жидкость так, что расстояние от еамой близкой части испытательной бумаги до полупроницаемой .ме.мбраны составляет несколько миллиметров. Различная чуветвительность анализов на каталазу зависит от количества галактозооксидазы, объема пробы и расстояния, между фильтровальной бумагой и полупроницаемой .мембраной. Q При анализе молока на каталазу получают полуколичественные данные о концентрации последней в пределах примерно от 2 до 20 V/мл путем сравнения цвета на испытательной бу.маге с цветным эталоно.м. Интенсивное окрашивание наблюдают через несколько минут при условии отсутствия каталазы и более слабое - при высоких концентрациях каталазы.

Пример 2. Систему, в которой образуется перекись водорода, помещают в одпу секцию испытательной ячейки, а систему с образованием красителя - в другую секцию, обе системы разделяют иористым элементом, образующим разделяющее пространство (среду). Этот пористый элемент может абсорбировать жидкость, подвергаемую анализу на 5 каталазу, и обеспечивает диффузию через . себя перекиси водорода. Это разделяющее пространство может быть усилено полупроницаемой мембраной или нееколькими слоями иористой бумаги.

Эти две системы реагентов используют также в с.юнх геля..

Готовят два раствора при 4()С в 20-40 /о-иом желатине или другом гелеообразующем веществе.

Раствор 1: ггероксидаза (ЕС 1.11, 1.7, PZ 0,6) 0,5 мг/.мл; о-Толидии 0,5 мг/мл; Буферная соль, обладаю щая нейтральным водородным показателем рН 7, например фосфат. Раствор 2: галактозооксидаза (ЕС 1.1 3.9, около 20У/мг в расчете на лактозу, являющуюея субстратом и не

содержащую каталазу) 0,5- 5,0 мг/мл; буферная соль, как в растворе ).

Пример 3. Вместо системы двух ферментов, находящихся по обе стороны пористого элемента и помещенных в различные слои геля, используют два пористых эле.мента из бума|-и, при этом одна из систем адсорби. руется в другую на обе стороны или в раз.1пчные части третьего nopnoToio элемента, изготовлепного также из бумаги. Эти два

пористых элемента изолируют от внутреииеIo элемента ири помощи иолуироиицаемых м ем б рай.

Пример 4. Согласно примеру 2 i-отовят два раствора и помешают их в микрокаиеулы, которые затем размеилают в разлпчиых слоях по каждую сторопу иорисчого диффузионного слоя или смешивают с ииертиой диффузионной средой, например в()лoкнa н це, люлозы, получая при иеремешивании пористую структуру.

Предлагаемый способ ко.ч и честней оиределения каталазы в молоке и других биологических жидкостях по сравиению с известным обес 1ечивает упрощеиие процесса и иовыи1епие качества определения.

Чувствительность однофазной системы реагеитов достаточно высока для определения воспалительного процесса, ироисходящего в молочных железа.к, а также для идентифицирования стадии его развития. Однако она не обладает достаточной чувствительностью для надежного, определения заболевания на ранних стадиях (воспалительный процесс - субклинический мастит). Но эти стадии .могут б|)1ть идеитифпцированы фотометрически.ми методами, и в этом случае могут быть успешно использованы однофазные систе.мы реагентов.

Чувствительность аналитического метода может быть увеличена до необходимого уровня при использовании многофазной системы, когда реагенты, образ Ю1цие перекись водорода и краситель, разделяют физически некоторым |ространствам (или средой), через которое образующаяся перекись водорода может диффундировать, причем указанное пространство может содержать и анализируемое молоко. За время прохождения перекиси водорода из фазы реагентов, образующих перекись водорода, через разделяюп-1ее пространство и входа в фазу реагентов, образующих краситель, она иолностыо иди частично разлагает каталазу, нахо.чянуюся в молоке и проникшую или введеиную в указ 1П1ое ирост1)аиство. .

Формула изобретения

1.Сд1()соб ко,1пчествен1 ого онредел.ения каталазы ь .молоке и других биологических жидкостях путем введения peaiCHTOB пероксидазы, перекиси водорода, лейкокрасителя, окисления , ейкокрасите тя перекисью 15одорода в присутствии катализатора - пероксидазы, уста1 овлеиия оттенка цвета в результате происходящей цветной реакции, по которой судят о к().ичестве ката.1азы и о качествениом составе анализируемого продукта, отличающийся те.м, что, с целью уирощепия процесса и повьш ения качества определения, в анализируемую жидкость, содержащую пероксидазу и лейкокрасптель, дополнительно- вводят галактозооксидаз) или /5-галактозидазу и глюкозооксидазу или js-raлактозидазу и галактозооксидазу, продуцирующие перекись водорода иепосредственно в анализируемую жидкость.

2.Способ по п. 1. отличающийся тем, что анализ количествеиного определения каталазы проводят с иомощью фильтровальной бумаги, на которой находится пероксидаза и лейкокрасите,1ь, отделенные от фер.мента или синергетических ферментов, способных выделять перекись водорода.

Приоритет по пунктам; 16.02.73 по п. I: 19.07.73 по п. 2.

5

Источники информации, прииятые во вгшмаиие ири экспертизе:

1. «Z. physiol. Chem., 1962, 329, с. 40.