КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ АЛЛЕРГИИ ИЛИ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2024 года по МПК A61K35/15 A61K35/17 A61P37/08 C12N5/78 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к композициям и способам для лечения и предотвращения нарушений, вызванных поглощением аллергенов в организме человека или млекопитающего.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] В ходе фазы сенсибилизации аллергий, профессиональные антигенпредставляющие клетки фагоцитируют антигены (применительно к аллергиям, обозначенные как аллергены) и осуществляют перекрестное представление процессированных антигенов T_H2-лимфоцитам. Эти клетки отвечают на встречу с аллергеном посредством высвобождения интерлейкина 4 и взаимодействуют с B-лимфоцитами. Активированные B-клетки, совместно с IL-4, продуцируют иммуноглобулины типа E (IgE), нацеленные против аллергена. Секретированный IgE связывается специфическими для IgE рецепторами, присутствующими, например, на тучных клетках. Эти иммуноциты, таким образом, становятся сенсибилизированными к аллергену. Повторное воздействие приводит к связыванию аллергена с покрытыми IgE иммуноцитами, которое, после перекрестного связывания рецептора, вызывает активацию сенсибилизированных клеток. Активированные тучные клетки отвечают посредством обильного высвобождения иммуномедиаторов, таких как гистамин, цитокины и провоспалительные молекулы липидов, из внутриклеточных гранул. Высвобожденные медиаторы имеют плейотропные эффекты, включая вазодилатацию, секрецию слизи и стимуляцию нервов, которые приводят к зуду и покраснению. Эти симптомы могут являться местными или системными.

[0003] Тучные клетки преимущественно находятся в тканях, многократно противостоящих патогенным стимулам, таких как кожа, дыхательные пути и желудочно-кишечный тракт. Обычно, тучные клетки активируются посредством иммунологических сигналов, таких как рецепторы Fcγ, перекрестно связанные посредством комплексов антиген/IgE, белки системы комплемента или агонисты toll-подобного рецептора. Тучные клетки отвечают на активацию обильным высвобождением иммуномедиаторов. Тучные клетки лучше всего известны по их роли в зависимых от IgE аллергических реакциях, и нацеливание на функцию тучных клеток, такую как дегрануляция, может помогать в облегчении наиболее болезненных симптомов, ассоциированных с аллергическими реакциями.

[0004] Целью настоящего изобретения является предоставление способов и средств для предотвращения или лечения аллергических реакций, вызванных аллергенами, введенными в организм человека или млекопитающего.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей супернатант клеточной культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), для применения в лечении или предотвращении аллергии или аллергической реакции, вызванной введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, где PBMC подвергают ионизирующему облучению до или во время культивирования.

[0006] Неожиданно оказалось, что супернатант культуры PBMC можно использовать для лечения или предотвращения аллергий и аллергических реакций, вызванных пищевыми или ингаляционными аллергены, вводимыми человеку или млекопитающему. Кроме того, композицию по настоящему изобретению можно также использовать для лечения или предотвращения аллергий или аллергических реакций, вызванных системным введением по меньшей мере одного аллергена.

[0007] В течение длительного времени, виды терапии на основе стволовых клеток считали многообещающим инструментом для регенерации различных поврежденных тканей и органов. С этого времени, многочисленные работы подвергали сомнению эту концепцию посредством сообщений, что секретируемые факторы, а не сами клетки, проявляют наблюдаемый регенеративный эффект. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) представляют собой, в отличие от стволовых клеток, привлекательный и легко доступный источник клеточных секретомов с перенастраиваемыми признаками. Хотя иммуномодулирующие эффекты приписывали секретому предпочтительно γ-облученных PBMC (Aposec), является неожиданным, что для супернатантов культур PBMC показаны благоприятные эффекты, применительно к аллергическим реакциям и аллергии, в частности, для запускающих аллергенов.

[0008] Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения аллергии или аллергической реакции, вызванной поглощением по меньшей мере одного аллергена организмом человека или млекопитающего, включающему стадию введения композиции, как определено в настоящем описании.

[0009] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу определения пригодности композиции, как определено в настоящем описании, для применения в лечении или предотвращении аллергии или аллергических реакций, вызванных введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, включающему стадии

a) приведения по меньшей мере двух областей кожи млекопитающего в контакт с аллергеном,

b) введения композиции, как определено в любом из пунктов 1-17, по меньшей мере в одну из указанных областей кожи, где по меньшей мере одну из указанных областей кожи не подвергают обработке с использованием указанной композиции,

c) сравнения областей кожи, приведенных в контакт с аллергеном, с областями кожи, приведенными в контакт с аллергеном и указанной композицией,

d) идентификации различия между указанными областями и

e) определения того, является ли композиция пригодной для лечения или предотвращения указанного нарушения или заболевания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0010] На фиг. 1 показано, что MNCaposec предотвращает индуцированное соединением 48/80 и IgE/антителами против IgE высвобождение медиатора первичными тучными клетками человека. Дегрануляцию тучных клеток оценивали по высвобожденной бета-гексозаминидазе после стимуляции (A) соединением 48/80 и (B) IgE/антителами против IgE первичных тучных клеток человека. Звездочками обозначено p<0,05 для Aposec, по сравнению с контрольной средой (CellGro). Среда для тучных клеток обозначает среду, общеупотребительную для культивирования тучных клеток (DMEM без добавок).

[0011] На фиг. 2 показано, что секретом PBMC Aposec облегчает набухание уха при индуцированной DNFB гиперчувствительности. Толщину уха оценивали посредством измерений с помощью микрометра через 24 часа после повторной стимуляции DNFB. p<0,05 Aposec против контрольной среды.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0012] Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей супернатант культуры клеток PBMC, для применения в лечении или предотвращении аллергии или аллергической реакции, вызванной введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего.

[0013] Известно, что клетки, в частности, клетки млекопитающих, секретируют множество веществ в ходе культивирования в среде для культивирования клеток. Полученные таким образом кондиционированные культуральные среды можно использовать в лечении и/или предотвращении различных заболеваний и нарушений. Например, в WO 2010/070105 и WO 2010/079086 описаны кондиционированные культуральные среды («супернатанты»), которые получены посредством культивирования PBMC и которые можно использовать в лечении различных воспалительных состояний. Таким образом, «супернатант клеточной культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC)», в рамках изобретения, относится к любому супернатанту, который можно получать посредством культивирования PBMC in vitro в культуральной среде. После стадии культивирования PBMC удаляют из культуральной среды для получения по существу бесклеточного, предпочтительно, полностью бесклеточного, супернатанта. Супернатант культуры PBMC содержит, помимо компонентов культуральной среды, вещества, продуцированные и секретированные PBMC, и/или даже лизированные PBMC. «Супернатант» можно использовать взаимозаменяемо с кондиционированной культуральной средой, которую можно получать посредством культивирования PBMC.

[0014] Супернатант по настоящему изобретению можно получать посредством культивирования PBMC, которые подвергают ионизирующему облучению до или во время культивирования. Ионизирующее облучение предпочтительно представляет собой гамма-облучение.

[0015] «Аллергия или аллергическая реакция, вызванная введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего», в рамках изобретения, относится к любой неблагоприятной реакции, вызванной введением пищевого и/или ингаляционного аллергена в организм человека или млекопитающего. Пищевые аллергены обычно вводят перорально в организм человека или млекопитающего. Ингаляционные аллергены, как правило, вводят посредством ингаляции через нос или рот в легкое и дыхательные пути. Некоторые лекарственные средства, используемые для лечения организмов человека и млекопитающих, могут вызывать аллергические реакции при системном введении в такие организмы. Такие лекарственные средства можно вводить перорально, посредством ингаляции, парентерально или посредством любого другого способа введения в организмы человека или млекопитающих, приводящего к системному распределению лекарственного средства внутри таких организмов. Парентеральное введение лекарственного средства может включать внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и другие способы введения. Местное введение аллергена - лекарственного средства или любого другого аллергена на кожу не приводит к системному распространению и, таким образом, системному введению в организм человека или млекопитающего.

[0016] Аллергены, вызывающие аллергию или аллергические реакции при введении в организм человека или млекопитающего, включают пищевые аллергены, аллергены - лекарственные средства, ингаляционные аллергены (например, пыльцу, химические вещества) и все виды аллергенов, которые вводят/доставляют в организм человека или млекопитающего. Таким образом, типичные аллергические реакции, вызванные введением аллергенов в организм человека или млекопитающего, включают, среди прочего, насморк, затрудненное дыхание, тошноту, диарею, носовые кровотечения, проблемы с ушами, свистящее дыхание, кашель или даже анафилаксию, когда аллерген вводят, например, в кровоток.

[0017] «Аллерген», в рамках изобретения, относится к антигену, который является способным стимулировать реакцию гиперчувствительности в организме человека и/или млекопитающего посредством ответов иммуноглобулина E (IgE), как правило, приводящих к избыточному высвобождению гистамина из тучных клеток. Термин «аллерген» включает - если аллерген имеет биологическое происхождение и представляет собой белок или полипептид - также фрагменты таких природных аллергенов, когда для этих фрагментов показаны эффекты, сходные с природным аллергеном, применительно к высвобождению гистамина в организме человека или млекопитающего.

[0018] Термины «осуществление предотвращения» и «предотвращение», в рамках изобретения, относятся к предотвращению или ингибированию рецидива, начала и развития аллергии или ее симптома в организме человека и млекопитающего, происходящему в результате введения супернатанта в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления «осуществление предотвращения» и «предотвращение» относится к уменьшению риска развития аллергии против специфических аллергенов. Термин «осуществление предотвращения» охватывает способы не только для предотвращения возникновения аллергии, но также для ареста ее прогрессирования и уменьшения ее последствий после возникновения.

[0019] Термины «лечении» и «осуществление лечения», в рамках изобретения, относятся к уменьшению или ингибированию прогрессирования и длительности аллергии, уменьшению или облегчению тяжести аллергии и облегчению одного или нескольких ее симптомов. «Лечение» включает также улучшение и/или обращение симптомов аллергии или аллергических реакций. Термин «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим мерам. Например, индивидуумы, которые могут получать преимущество от лечения с использованием композиций и способов по настоящему изобретению, включают индивидуумов, уже имеющих аллергию, так же как индивидуумов, у которых надлежит предотвращать аллергию.

[0020] В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере один аллерген представляет собой биологический или химический аллерген.

[0021] Биологические аллергены включают аллергены, происходящие из биологической системы, подобной растениям, животным (например, насекомым, паукообразным) или микроорганизмам (например, плесени, бактериям). Такие аллергены представляют собой, в большинстве случаев, белки, полипептиды или пептиды. Биологические аллергены хорошо известны в данной области и описаны в различных базах данных, подобных http://www.allergen.org/ или http://www.allergome.org/.

[0022] В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, биологический аллерген выбран из группы, состоящей из аллергена животных, аллергена растений, аллергена плесени или аллергена бактерий.

[0023] Аллергены животных представляют собой аллергены, включающие одно или несколько соединений, обнаруженных у животных, включая как позвоночных, так и беспозвоночных. Аллергены позвоночных животных, которые могут присутствовать в смешанных композициях аллергенов, включают аллергены птиц, такие как аллергены яиц, например, овомукоид nGal d 1, овальбумин n Gal d 2, кональбумин nGal d 3, полный аллерген яичного белка и т.д.; аллергены млекопитающих, такие как аллергены молока, например, альфа-лактальбумин nBos d 4, бета-лактоглобулин nBos d 5, казеин nBos d 8, лактоферрин nBos d, полный аллерген молока и т.д.; аллергены рыбы, например, rCyp c 1, rGad c 1, полный аллерген трески, аллергены белой рыбы, аллергены красной рыбы и т.д. Аллергены беспозвоночных животных, которые могут присутствовать в смешанных композициях аллергенов, включают: аллергены ракообразных, такие как аллергены креветок, например, тропомиозин rPen a 1, полный аллерген креветок и т.д.; аллергены насекомых, например, аллерген яда укуса пчелы, аллерген яда укуса осы, аллерген яда укуса комара и т.д.; и т.п. Ингаляционные аллергены животных могут включать мех и перхоть кошек или собак, яйцевые капсулы тараканов и экскременты пылевого клеща.

[0024] Аллергены растений представляют собой аллергены, включающие одно или несколько соединений, обнаруженных в растениях. Представляющие интерес аллергены растений включают: аллергены пшеницы, например, омега-5-глиадин rTri a 19, полный аллерген пшеницы, глиадин пшеницы, rTri a 14 LTP и т.д.; аллергены киви, например, rAct d 8 PR-10, полный аллерген киви и т.д.; аллергены сельдерея, например, rApi g 1,01 PR-10, rPhl p 12, полный аллерген сельдерея, CCD MUXF3 из бромелиевых и т.д.; аллергены сои, например, rGly m 4 10 PR-10, полный аллерген сои, бета-конглицинин nGly m 5, глицинин nGly m 6 и т.д.; аллергены косточковых плодов, например, f419, f420, f421, f95, f242, o214 rPru p 1 PR-10, rPru p 3 LTP, первичный полный аллерген косточковых плодов, CCD MUXF3 из бромелиевых и т.д.; аллергены овса, например, аллергены компонентов овса, полный аллерген овса и т.д.; аллергены кунжута, например, аллергены компонентов кунжутного семени, полный аллерген кунжутного семени и т.д. Аллергены растений включают также ингаляционные аллергены, подобные аллергенам пыльцы. Такие аллергены могут включать аллергены пыльцы березы (например, Bet v 1), аллергены пыльцы травы (например, Phl p 1), аллергены плевела и тимофеевки.

[0025] Аллергены включают аллергены, выделенные из природных источников, или рекомбинантно или химически полученные аллергены.

[0026] В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, культура клеток PBMC содержит моноциты, T-клетки, B-клетки и/или клетки NK.

[0027] В соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, клетки PBMC культивируют в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из среды для роста клеток, предпочтительно, среды CellGro, более предпочтительно, среды Cellgro GMP DC, RPMI, DMEM, X-vivo и Ultraculture.

[0028] PBMC из культуры клеток PBMC подвергают ионизирующему облучению до или во время культивирования. В дополнение к этим индуцирующим стресс условиям, PBMC можно подвергать дополнительному стрессу. Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, PBMC подвергают воздействию одного или нескольких дополнительных индуцирующих стресс условий до или во время культивирования.

[0029] Термин «в индуцирующих стресс условиях», в рамках изобретения, относится к условиям культивирования, приводящим к получению подвергнутых стрессу клеток. Условия, вызывающие стресс клеток, включают, среди прочего, нагревание, химические средства, облучение, гипоксию, осмотическое давление и т.д.

[0030] Дополнительный стресс для клеток по настоящему изобретению приводит к дальнейшему увеличению экспрессии и секреции веществ, обеспечивающих преимущество для лечения воспалительных состояний кожи, в частности, состояний кожи, ассоциированных с ишемией.

[0031] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, индуцирующие стресс условия включают гипоксию, озон, нагревание (например, более чем на 2°C, предпочтительно, более чем на 5°C, более предпочтительно, более чем на 10°C выше, чем оптимальная температура культивирования PBMC, т.е. 37°C), облучение (например, УФ-облучение, гамма-облучение), химические средства, осмотическое давление (т.е., условия осмоса, повышенного по меньшей мере на 10%, по сравнению с осмотическими условиями, обычно возникающими в жидкости организма, в частности, в крови) или их комбинации.

[0032] Таким образом, в соответствии со следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, индуцирующее стресс условие выбрано из группы, состоящей из УФ-облучения, гипоксии, озона, нагревания, осмотического давления и сдвига pH.

[0033] В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, PMC подвергают ионизирующему облучению, предпочтительно, гамма-облучению, в дозе по меньшей мере 10 Гр (1000 рад), предпочтительно, по меньшей мере 20 Гр (2000 рад), более предпочтительно, по меньшей мере 40 Гр (4000 рад), более предпочтительно по меньшей мере 50 Гр (5000 рад).

[0034] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, PBMC культивируют в течение по меньшей мере 4 час, предпочтительно, в течение по меньшей мере 6 час, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 час, до выделения их супернатанта.

[0035] В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, композицию по настоящему изобретению вводят до, во время и/или после начала аллергических реакций и/или воздействия по меньшей мере одного аллергена.

[0036] Композицию по настоящему изобретению можно вводить на различных стадиях аллергической реакции или даже до возникновения реакции. В конкретном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, композицию можно вводить до подвергания организма человека или млекопитающего воздействию аллергена. Неожиданно оказалось, что композиция по настоящему изобретению является способной предотвращать поглощение аллергенов или их фрагментов антигенпредставляющими клетками. Таким образом, если такое поглощение можно предотвращать, аллерген или его фрагменты не будут представлены иммунной системе человека или млекопитающего.

[0037] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, культура клеток PCBMC содержит от 1×10⁵ до 1×10⁸ PBMC/мл, предпочтительно, от 1×10⁶ до 1×10⁷ PBMC/мл, более предпочтительно, от 2×10⁶ до 5×10⁶ PBMC/мл.

[0038] Оказалось, что композиция супернатанта, которую можно получать посредством культивирования PBMC, имеет обеспечивающие преимущества свойства, если культивируют конкретное количество PBMC на мл среды для культивирования клеток.

[0039] В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, 0,1-5 мл супернатанта/кг массы тела, предпочтительно, 0,3-3 мл/кг массы тела, более предпочтительно, 0,5-2 мл/кг массы тела, более предпочтительно, 0,8-1,2 мл/кг массы тела, вводят в организм человека или млекопитающего.

[0040] Композиция по настоящему изобретению содержит супернатант в количестве, достаточном для лечения или предотвращения аллергий и аллергических реакций. Объем супернатанта, вводимого на кг массы тела в организм человека или млекопитающего, как указано выше, относится непосредственно к супернатанту. Если объем является слишком большим для введения в организм человека или млекопитающего, этот объем можно уменьшать, например, посредством лиофилизации. Таким образом, объем композиции по настоящему изобретению, подлежащий введению, может быть ниже, чем указано для супернатанта. Специалисту в данной области известно, какие объемы можно вводить с использованием конкретного способа введения.

[0041] В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, композицию вводят посредством ингаляции, местно, перорально, подъязычно, буккально, подкожно или внутривенно.

[0042] Композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемые наполнители, такие как разбавители, стабилизаторы, носители и т.д. В зависимости от дозированной формы, препарат в соответствии с настоящим изобретением содержит соответствующие ингредиенты. Способы его получения хорошо известны специалисту в данной области.

[0043] Для увеличения срока хранения композиции в соответствии с настоящим изобретением, супернатант или даже полную композицию можно лиофилизировать. Способы лиофилизации таких препаратов хорошо известны специалисту в данной области.

[0044] Перед его использованием, лиофилизированный препарат можно приводить в контакт с водой или водным раствором, содержащим буферы, стабилизаторы, соли и т.д.

[0045] В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, млекопитающее представляет собой лошадь, собаку, кошку или верблюда.

[0046] Композицию по настоящему изобретению можно использовать для лечения любого вида млекопитающего. Однако, вышеупомянутые млекопитающие являются наиболее предпочтительными.

[0047] Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения аллергии или аллергической реакции, вызванной поглощением по меньшей мере одного аллергена организмом человека или млекопитающего, включающему стадию введения композиции, как определено выше.

[0048] Следующий аспект настоящего изобретения относится к способу определения пригодности композиции, как определено выше, для применения в лечении или предотвращении аллергии или аллергических реакций, вызванных поглощением по меньшей мере одного аллергена организмом человека или млекопитающего, включающему стадии

a) приведения по меньшей мере двух областей кожи млекопитающего в контакт с аллергеном,

b) введения композиции, как определено выше, по меньшей мере в одну из указанных областей кожи, где по меньшей мере одну из указанных областей кожи не подвергают обработке с использованием указанной композиции,

c) сравнения областей кожи, приведенных в контакт с аллергеном, с областями кожи, приведенными в контакт с аллергеном и указанной композицией,

d) идентификации различия между указанными областями и

e) определения того, является ли композиция пригодной для лечения или предотвращения указанного нарушения или заболевания.

[0049] Для тестирования того, можно ли использовать композицию по настоящему изобретению для лечения или предотвращения аллергии или аллергической реакции, вызванной введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, можно использовать анализ заживления царапины. Если композиция по настоящему изобретению является способной уменьшать аллергические реакции в участке царапины, по сравнению с необработанным участком царапины или участком царапины, обработанным используемой в качестве отрицательного контроля композицией, композицию по настоящему изобретению можно вводить в организм нуждающегося в этом человека или млекопитающего.

ПРИМЕРЫ

[0050] Пример 1: Нарушение дегрануляции тучных клеток посредством Aposec

[0051] Материалы и способы

[0052] Изготовление Aposec

[0053] Секретомы PBMC («Aposec») получали, как описано в Wagner T et al. (Sci Rep. 2018;8(1):18016). Кратко, PBMC получали посредством центрифугирования в градиенте плотности с использованием Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, USA) и доводили до концентрации 2,5×10⁷ клеток/мл. Затем клетки подвергали воздействию γ-облучения 60 Гр (6000 рад) Цезия 137 (IBL 437C, Isotopen Diagnostik CIS GmbH, Germany), и культивировали в не содержащей фенола красного среде CellGenix GMP DC (CellGenix GmbH, Germany) в течение 24±2 часов. Клетки и клеточный дебрис удаляли посредством центрифугирования, и супернатант пропускали через фильтр 0,2 мкм. Очистку от вирусов проводили с использованием метиленового синего посредством технологии Theraflex (MacoPharma, France) и посредством γ-облучения лиофилизированного порошка (25000 Гр (2500000 рад), Gammatro 1500, Mediscan, Austria), как описано ранее (Haider T et al. Exp Neurol. 2015;267:230-42). Стерильный лиофилизат криоконсервировали общепринятым способом при -80°C.

[0054] Выделение и поддержание in vitro первичных тучных клеток человека

[0055] Ткани кожи и подкожного жира, используемые для выделения тучных клеток, получали от пациентов, подвергаемых абдоминопластике. Подкожную ткань и сетчатый слой дермы удаляли, и оставшиеся ткани нарезали на мелкие фрагменты и подвергали ферментному расщеплению (2,4 ед./мл диспазы II из Bacillus polymyxa, Roche, Switzerland) при 4°C в течение ночи. После удаления эпидермиса, дермальные ткани расщепляли в коллагеназе I (Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA) при 37°C в течение 2 часов. CD117⁺ тучные клетки обогащали посредством технологии магнитной сортировки клеток (MACS System, Miltenyi Biotec, Germany), как предложено производителем. Для увеличения чистоты выделенных клеток, процедуру выделения повторяли еще один раз с использованием CD117⁺ клеток из первого цикла выделения. CD117+ тучные клетки культивировали в DMEM, дополненной 10% (об./об.) инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (обе из Gibco), 1% (об./об.) пенициллина/стрептомицина (Biochrom, Germany), и 100 нг/мл рекомбинантного фактора стволовых клеток человека (PeproTech, USA).

[0056] Индуцированная соединением 48/80 дегрануляция первичных тучных клеток человека

[0057] Первичные тучные клетки человека рассевали при плотности 50000-100000 на лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты в 50 мкл DMEM без цветного индикатора pH, дополненной сывороткой и SCF, как описано выше. Клетки предварительно обрабатывали с использованием 50 мкл Aposec или 50 мкл контрольной среды (CellGenix) в течение ночи. На следующие сутки, клетки осторожно промывали 100 мкл HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты; Thermo Fisher Scientific), и дегрануляцию индуцировали посредством добавления 100 мкл HEPES, содержащего 50 мкг/мл соединения 48/80 (Sigma Aldrich, USA). Для нестимулированного контроля, добавляли HEPES. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37°C при нормальном содержании CO₂ в окружающей среде. Пятьдесят мкл супернатанта отделяли и сохраняли, и клетки лизировали в 100 мкл 0,1% тритона X-100 (Sigma Aldrich).

[0058] Индуцированная IgE/антителами против IgE дегрануляция первичных тучных клеток человека

[0059] Первичные тучные клетки человека рассевали при плотности 50000-100000 на лунку в плоскодонные 96-луночные планшеты в 50 мкл DMEM без цветного индикатора pH, дополненной сывороткой и SCF, как описано выше. Клетки предварительно обрабатывали с использованием 50 мкл Aposec, 50 мкл контрольной среды (CellGenix) или 50 мкл DMEM (среды для тучных клеток) и дополнительно стимулировали с использованием 100 нг/мл IgE человека (миелома, Merck KGaA, Germany) в течение ночи. На следующие сутки, клетки осторожно промывали 100 мкл HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты; Thermo Fisher Scientific), и дегрануляцию индуцировали посредством добавления 100 мкл HEPES, содержащего 5 мкг/мл антитела против IgE (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., USA). Для нестимулированного контроля, добавляли HEPES. Клетки инкубировали в течение 1 часа при 37°C при нормальном содержании CO₂ в окружающей среде. Пятьдесят мкл супернатанта отделяли и сохраняли, и клетки лизировали в 100 мкл 0,1% тритона X-100 (Sigma Aldrich).

[0060] Реагенты для анализа бета-гексозаминидазы

[0061] Раствор субстрата для анализа бета-гексозаминидазы получали посредством растворения 8,9 г дигидрата гидрофосфата динатрия (Na₂HPO₄·2H₂O) и 650 мг п-нитро-N-ацетил-бета-D-глюкозамида в 400 мл дважды дистиллированной воды и доведения pH до 4,5 с использованием 0,4 M лимонной кислоты (все реагенты из Sigma Aldrich). Останавливающий раствор состоит из 15,02 г глицина в 900 мл дважды дистиллированной воды с pH, доведенным до 10,7 с использованием 3 M гидроксида натрия.

[0062] Анализ бета-гексозаминидазы

[0063] Пятьдесят мкл раствора субстрата добавляли к 50 мкл супернатантов и 50 мкл лизированных тритоном клеток, соответственно, и образцы инкубировали при 37°C при содержании CO₂ в окружающей среде в течение 90 минут. Добавляли семьдесят пять мкл останавливающего буфера, и оптическую плотность при 405 нм определяли посредством люминометра для считывания планшетов LUMIstar OPTIMA Reader (BMG LABTECH, Ortenberg, Germany) с использованием программного обеспечения FlUOstar OPTIMA (версии 1.20-0, BMG LABTECH).

[0064] Анализы данных и статистические анализы

[0065] Процент высвобожденной бета-гексозаминидазы рассчитывают с использованием следующей формулы:

[0066] Данные представлены как арифметические средние из технических повторов и стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводили посредством одностороннего t-теста, сравнивающего две группы Aposec против контрольной среды, где p<0,05 считали статистически значимым.

[0067] Результаты

[0068] Aposec прекращает вынужденную дегрануляцию тучных клеток

[0069] Для определения того, является ли Aposec способным предотвращать дегрануляцию тучных клеток, тучные клетки предварительно обрабатывали с использованием Aposec или контрольной среды и оценивали высвобождение бета-гексозаминидазы из первичных тучных клеток человека после стимуляции соединением 48/80 и IgE/антителами против IgE. Aposec заметно предотвращал индуцированное соединением 48/80, так же как IgE/антителами против IgE высвобождение медиатора, по сравнению с контрольной средой (27,9±3,6% и 27,3±1,1% высвобожденной β-гексаминидазы с использованием Aposec против 35,7±3,4% и 36,7±3,1% высвобожденного медиатора с использованием контрольной среды, после стимула соединением 48/80 и IgE/антителами против IgE, соответственно, в обоих случаях, p<0,05 для aposec против контроля) (Фигура 1). По сравнению с этим, для контрольной среды не показано эффекта на дегрануляцию тучных клеток, по сравнению со средой для тучных клеток [36,7±2,3 и 36,9±1,9 высвобожденного медиатора с использованием среды для тучных клеток после стимуляции соединением 48/80 и IgE/антителами против IgE, соответственно. p>0,05 для среды для тучных клеток против контрольной среды в (A) и (B)].

[0070] Заключение

[0071] Настоящие данные показывают, что Aposec эффективно предотвращает высвобождение медиатора первичными тучными клетками человека при стимуляции соединением 48/80 и IgE/антителами против IgE. В то время как высвобождение фермента уменьшалось на более чем 20% после химической стимуляции, высвобождение бета-гексозаминидазы после обработки IgE/антителами против IgE уменьшалось на более чем 25% с использованием Aposec, по сравнению с контрольной средой. В совокупности, эти данные позволяют предполагать применение Aposec для лечения опосредованных дегрануляцией тучных клеток аллергических реакций.

[0072] Пример 2: Облегчение симптомов аллергической гиперчувствительности посредством применения Aposec in vivo

[0073] Обоснование

[0074] На протяжении последних десятилетий, интенсивные исследования патологии аллергической гиперчувствительности вносили вклад в лучшее понимание иммунологических реакций. Тем не менее, комплексная и многоплановая этиология заболевания представляет главные препятствия для разработки эффективных новых терапевтических вмешательств, и варианты клинического лечения остаются ограниченными до настоящего времени. Поскольку сильные противовоспалительные эффекты Aposec описаны ранее, проверяли потенциал Aposec для облегчения связанных с аллергической гиперчувствительностью симптомов.

[0075] Материалы и способы

[0076] Модель на мышах

[0077] 1-фтор-2,4-динитробензол (DNFB, Sigma-Aldrich) служил в качестве аллергена для индукции воспалительных состояний у мышей C57BL/6. Двадцать мкл 0,25% (об./об.) DNFB в оливковом масле вводили на сутки 0 и 1. Уши ежесуточно обрабатывали с использованием Aposec, в то время как в контралатеральные уши вводили среду-носитель в течение 6 последовательных суток, начиная с суток 0.

[0078] Микрометрические измерения

[0079] Через двадцать четыре часа после повторной стимуляции DNFB, толщину уха оценивали с использованием электронного цифрового микрометра (0-25 мм, Marathon Management Inc, USA), измеряя толщину внешних двух третей уха. Измерения проводили в четырех повторах.

[0080] Статистический анализ

[0081] Данные статистически оценивали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc.). Односторонний, парный t-тест проводили для сравнения Aposec против контрольной среды. Значения p ниже 0,05 считали статистически значимыми. Данные представлены как арифметические средние из биологических повторов и стандартная ошибка среднего.

[0082] Результаты

[0083] Aposec смягчает индуцированное аллергеном набухание ткани

[0084] Индуцированную DNFB мышиную гиперчувствительность использовали в качестве модели для исследования противовоспалительных эффектов Aposec при аллергических реакциях in vivo. Обнаружили, что степень набухания уха, отражающая тяжесть иммунного ответа, заметно уменьшалась посредством Aposec, по сравнению с контрольной средой, через 24 часа после повторного воздействия DNFB (толщина обработанных носителем ушей 553,9±12,7 мкм против 472,4±47,3 мкм с использованием Aposec, p<0,05 для Aposec против контрольной среды. Наивные уши: толщина 355±12,7 мкм) (Фигура 2).

[0085] Заключение

[0086] Эти данные показывают, что введение Aposec эффективно предотвращало набухание ткани после повторного воздействия аллергена. Эти обнаружения показывают, что Aposec представляет собой многообещающего кандидата для лечения симптомов, связанных с аллергическими реакциями.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к применению супернатанта клеточной культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) для лечения или предотвращения аллергии или аллергической реакции и способу определения пригодности супернатанта клеточной культуры PBMC. Применение супернатанта клеточной культуры PBMC для лечения или предотвращения аллергии или аллергической реакции, вызванной введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, где культура клеток PCBMC содержит от 1×10⁵ до 1×10⁸ PBMC/мл, и PBMC подвергают ионизирующему облучению в дозе от 10 до 60 Гр до или во время культивирования. Способ определения пригодности супернатанта клеточной культуры PBMC для применения в лечении или предотвращении аллергии или аллергических реакций, вызванных введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, включающий стадии: a) приведения по меньшей мере двух областей кожи млекопитающего в контакт с аллергеном, b) введения супернатанта клеточной культуры PBMC по меньшей мере в одну из указанных областей кожи, где по меньшей мере одну из указанных областей кожи не подвергают обработке с использованием указанного супернатанта, c) сравнения областей кожи, приведенных в контакт с аллергеном, с областями кожи, приведенными в контакт с аллергеном и указанным супернатантом, d) идентификации различия между указанными областями и e) определения того, является ли супернатант пригодным для лечения или предотвращения указанной аллергии или аллергической реакции, где клеточная культура PBMC содержит от 1×10⁵ до 1×10⁸ PBMC/мл и PBMC подвергают ионизирующему облучению в дозе от 10 до 60 Гр до или во время культивирования. Вышеописанная группа изобретений позволяет предотвращать аллергию, вызванную пищевым, ингаляционным аллергеном или лекарственным средством. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Применение супернатанта клеточной культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) для лечения или предотвращения аллергии или аллергической реакции, вызванной введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, где культура клеток PCBMC содержит от 1×10⁵ до 1×10⁸ PBMC/мл, и PBMC подвергают ионизирующему облучению в дозе от 10 до 60 Гр до или во время культивирования.

2. Применение по п. 1, где по меньшей мере один аллерген представляет собой биологический или химический аллерген.

3. Применение по п. 2, где биологический аллерген выбран из группы, состоящей из аллергена животных, аллергена растений, аллергена плесени или аллергена бактерий.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где культура клеток PBMC содержит моноциты, T-клетки, B-клетки и/или клетки NK.

5. Применение по любому из пп. 1-4, где PBMC культивируют в среде для культивирования клеток, выбранной из группы, состоящей из среды для роста клеток, предпочтительно, среды CellGro, более предпочтительно, среды Cellgro GMP DC, RPMI, DMEM, X-vivo и Ultraculture.

6. Применение по любому из пп. 1-5, где PBMC культивируют в течение по меньшей мере 4 час, предпочтительно, в течение по меньшей мере 6 час, более предпочтительно, в течение по меньшей мере 12 час, до выделения их супернатанта.

7. Применение по любому из пп. 1-6, где композицию вводят до, во время и/или после начала аллергических реакций и/или воздействия по меньшей мере одного аллергена.

8. Применения по любому из пп. 1-7, где культура клеток PCBMC содержит от 1×10⁶ до 1×10⁷ PBMC/мл, предпочтительно, от 2×10⁶ до 5×10⁶ PBMC/мл.

9. Способ определения пригодности супернатанта клеточной культуры мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) для применения в лечении или предотвращении аллергии или аллергических реакций, вызванных введением по меньшей мере одного пищевого и/или ингаляционного аллергена или системным введением по меньшей мере одного лекарственного средства в организм человека или млекопитающего, включающий стадии

a) приведения по меньшей мере двух областей кожи млекопитающего в контакт с аллергеном,

b) введения супернатанта клеточной культуры PBMC по меньшей мере в одну из указанных областей кожи, где по меньшей мере одну из указанных областей кожи не подвергают обработке с использованием указанного супернатанта,

c) сравнения областей кожи, приведенных в контакт с аллергеном, с областями кожи, приведенными в контакт с аллергеном и указанным супернатантом,

d) идентификации различия между указанными областями и

e) определения того, является ли супернатант пригодным для лечения или предотвращения указанной аллергии или аллергической реакции, где клеточная культура PBMC содержит от 1×10⁵ до 1×10⁸ PBMC/мл и PBMC подвергают ионизирующему облучению в дозе от 10 до 60 Гр до или во время культивирования.