Средство, обладающее противосудорожной активностью Российский патент 2024 года по МПК A61K36/714 A61K31/439 A61P25/08 

Изобретение относится к медицине, к клинической фармакологии и может быть использовано в качестве противосудорожного средства.

Эпилепсия - это хроническое неврологическое заболевание, характеризующееся спонтанными рецидивирующими припадками, обусловленными аномальной активностью нейронов головного мозга [1, 2]. Судорожные приступы являются результатом чрезмерных электрических импульсов нейронов, возникающих из-за нарушения баланса между возбуждением и торможением в головном мозге, связанного со сложными нейромедиаторными процессами с участием глутаматергической, холинергической и ГАМКергической систем [3, 4].

Согласно данным ВОЗ эпилепсией в мире страдает более 1% всего населения, это порядка 75 миллионов человек. Распространенность эпилепсии в России составляет 3,4 на 1000 населения, т.е. более 2,5 миллионов человек, из которых более 800 тысяч дети и подростки. Ежегодно эпилепсия выявляется у 40-70 человек на 100000 населения и лишь у 70-75% пациентов заболевание контролируется современными противоэпилептическими препаратами [5]. Зачастую эпилепсия приводит к инвалидизации или существенному снижению качества жизни [6].

Основные лекарственные средства для лечения эпилепсии - антиконвульсанты. Некоторые препараты этой группы широко используют в мире по незарегистрированным показаниям, в т. ч. при шизофрении, больших депрессивных расстройствах, тревожных и тревожно-фобических расстройствах, посттравматическом синдроме, пограничных расстройствах личности, нарушениях пищевого поведения, токсикомании и других, преимущественно хронических заболеваниях. Таким образом, противосудорожные препараты получает значительное число людей на протяжении длительного времени, а иногда и пожизненно [7]. В настоящее время наиболее широко применяемыми антиконвульсантами являются вальпроаты, фенитоин, карбамазепин [8]. Однако они обладают большим количеством побочных эффектов, таких как когнитивные и психомоторные нарушения, гематотоксичность, нейротоксичность и тератогенность [9], что делает актуальным поиск новых средств, проявляющих выраженную противосудорожную активностью с большой продолжительностью действия, эффективных при разных видах эпилепсии, но не вызывающих серьезных побочных эффектов. Препараты растительного происхождения, имея ряд известных конкурентных преимуществ при терапии хронических и/или пожизненных патологий, являются перспективными кандидатами для решения данной проблемы [5, 10]. Несомненный интерес представляют дитерпеновые алкалоиды, выделенные из растений семейства Ranunculaceae, которые обладают выраженным фармакологическим действием в отношении ЦНС и в том числе противосудорожной активностью [11].

Экспериментальные исследования выявили высокую антиноцицептивную [12] и антидепрессантную [13] активность у дитерпенового алкалоида N-окись 12-эпинапеллина, выделенного из надземной части Aconitum baicalense. Учитывая низкую токсичность N-окись 12-эпинапеллина, который относится к 4 классу малотоксичных веществ [14] алкалоид является перспективной молекулой для создания на ее основе эффективного фармакологического препарата.

Наиболее близким по техническому результату (базовым) противосудорожным средством является карбамазепин, который выбран нами в качестве препарата сравнения. Карбамазепин широко применяется при лечении различных форм эпилепсии, но также как и другие синтетические противосудорожные препараты оказывает ряд побочных эффектов [8].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих выраженной противосудорожной активностью, при этом лишенных побочных эффектов и в силу своей относительной безопасности используемых в том числе в педиатрической практике. Поставленная задача достигается применением N-окись12-эпинапеллина в качестве средства, обладающего противосудорожной активностью.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве средства, обладающего противосудорожной активностью, N-окись12-эпинапеллина.

Пример 1: Надземная часть аконита байкальского (Aconitum baicalense), собранная в период цветения, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до рН 9-10 и последовательно экстрагировали сначала эфиром, затем хлороформом. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90→50%). Эфирорастворимую фракцию подвергли дробной экстракции буферными растворами с увеличивающимися значениями рН. Эфирный раствор, оставшийся после экстракции наиболее щелочным буфером, упаривали досуха и хроматографировали на окиси алюминия в системе гексан-метанол до элюции N-окись 12-эпинапеллина, происходящей после выхода напеллина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации.

Дитерпеновый алкалоид атизинового ряда N-окись 12-эпинапеллина (C₂₂H₃₃NO₄) является вторичным метаболитом растений семейства Ranunculaceae, рода Aconitum [15, 16] и представляет собой гетероциклическое азотсодержащее органическое соединение. Согласно классификация на основе биогенных предшественников (прекурсоров) N-окись 12-эпинапеллина относится к псевдоалкалоидам, поскольку образуется не из аминокислот, но также как все алкалоиды содержит в гетероциклическом кольце атом азота [17].

Эксперименты были выполнены на 46 аутбредных мышах-самцах CDI (7-8 недель, масса 25 г) первой категории конвенциональных, полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (сертификат здоровья животных, ветеринарное удостоверение 270 № 0008633). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены Биоэтическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол IACUC №191112021 от 21.12.2021) и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [18]; Приказу МЗ РФ от 1 августа 2016 N 199н.

Каждому животному внутри группы присваивали индивидуальный номер от 1 до 10, помечаемый с помощью меток фукорцином. Мышей распределяли на группы рандомизированно, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения в пределах одного пола более чем на ±10%. Данные (масса и номер) отобранных животных ранжировали в порядке убывания веса, используя для этого компьютерную программу Excel, имеющую команду SORT.

Статистическая обработка полученных результатов проведена методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения Statistica 6.0. Для всех данных подсчитаны среднее значение (X) и стандартная ошибка среднего (m), которые вместе со значением n (количество вариант в группе) представлены в итоговой таблице. Различие сравниваемых величин считали достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (Р<0,05). Нормальность распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический критерий U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Для выявления достоверности различий качественных показателей использовали критерий углового преобразования Фишера.

Пример 2. Противосудорожное действие N-окись 12-эпинапеллина исследовали на модели первично-генерализованных судорог, вызванных МЭШ, моделирующим так называемые «большие» (Grandmal) судорожные припадки [8]. МЭШ является консолидированной моделью и широко используется при скрининге противосудорожных средств [19]. Он основан на применении электрических разрядов в течение короткого периода времени, что приводит к деполяризации натриевых каналов, повышает возбудимость нейронов и как следствие вызывает развитие судорог [5, 20]. Карбамазепин, выбранный в качестве препарата сравнения, блокирует потенциал-зависимые Na⁺-каналы обладает потенциалом предотвращать распространение электрического разряда по нейронам и тем самым ослабляет МЭШ-индуцированные тонические судороги, уменьшая продолжительность приступов и повышая порог появления новых кризов [8]. Электросудорожный припадок создавали с использованием сертифицированной установки «RodentShockerRS», type 221 (Harvard Apparatus, GmbH, Германия): животные через специальные электроды получали электрические стимулы (режим: 250 V, 150 mA, длительность 0,2 с). Регистрировали следующие показатели: клонические судороги и их продолжительность, тоническую экстензию задних и передних конечностей с продолжительностью и гибель животных. Противосудорожный эффект оценивали по способности уменьшать продолжительность судорог, предотвращать гибель животных и по балльной шкале: 0 баллов - нет судорожных реакций, 1 балл - клонические судороги без потери рефлекса переворачивания, 2 балла - клонические судороги с потерей рефлекса переворачивания, 3 балла - тонические судороги, 4 балла - тонические судороги заканчивающиеся гибелью животного. N-окись 12-эпинапеллина в дозах 12,5, 25 и 50 мкг/кг вводили per os в течение 5 дней и последний раз за 1 час до проведения МЭШ. Препарат сравнения карбамазепин (таблетки, АО «АЛИУМ», Россия) растворяли в дистиллированной воде и вводили в дозе 100 мг/кг в аналогичном режиме. Эффективность соединений оценивалась по уменьшению выраженности судорожных реакций (баллы) и их продолжительности, увеличению количества животных без тонических судорог и доли выживших (%) после МЭШ относительно контрольной группы.

Исследование противосудорожной активности N-окись 12-эпинапеллина в тесте МЭШ показало, что курсовое введение дитерпенового алкалоида во всех изучаемых дозах в разной степени защищало животных от судорожной реакции, вызванной током. Применение N-окись 12-эпинапеллина в дозе 50 мкг/кг достоверно уменьшало тяжесть судорожных проявлений, выражаемых в балльной шкале в 1,2 раза по сравнению с контролем и на 33,3% сокращало количества животных с тонической экстензией. В дозе 25 мкг/кг алкалоид был более эффективен достоверно снижая выраженность судорог в 1,4 раза до 2,3 баллов, защищая животных от развития тонической экстензии конечностей на 44,4% относительно контроля. Максимальный эффект наблюдался при использовании N-окись 12-эпинапеллина в минимальной дозе. Так, дитерпеновый алкалоид N-окись 12-эпинапеллина в дозе 12,5 мкг/кг снижал выраженность судорожных проявлений в 1,7 раза до 1,9 баллов, защищая животных от развития тонической экстензии конечностей, и полностью предотвращая гибель животных (100% выживших), не уступая по эффективности карбамазепину. Кроме того, под действием N-окись 12-эпинапеллина в дозах 12,5, 25 и 50 мкг/кг наблюдалось значительное снижение продолжительность тонических судорог в 3,2, 2,6 и 2,5 раза соответственно (табл. 1).

Таблица 1 - Противосудорожная активность при курсовом введении N-окись 12-эпинапеллина, выделенного из надземной части Aconitum baicalense в тесте МЭШ у аутбредных мышей-самцов CDI

Группа, доза, количество животных (n) Продолжительность судорог, с (X±m) Баллы (X±m) Животные с тоническими судорогами, % Выжившие, % Клонические Тонические 1. Контроль, вода (n=10) 4,4±1,8 17,7±0,8 3,3±0,2 100,0 70 2. Карбамазепин, 100 мг/кг (n=9) 4,7±0,5 0,0±0,0
1-2 p<0,001 1,2±0,2
1-2 p<0,001 0,0
1-2 p<0,01 100
1-2 p<0,01 3. N-окись 12-эпинапеллина, 12,5 мкг/кг (n=9) 3,9±1,3 5,6±2,8
1-3 p<0,001 1,9±0,3
1-3 p<0,001 33,3
1-3 p<0,01 100
1-3 p<0,01 4. N-окись 12-эпинапеллина, 25 мкг/кг (n=9) 4,1±1,4 6,7±2,3
1-4 p<0,001 2,3±0,3
1-4 p<0,02 55,6
1-4 p<0,01 89 5. N-окись 12-эпинапеллина, 50 мкг/кг (n=9) 4,6±2,4 7,2±2,0
1-5 p<0,001 2,7±0,3
1-5 p<0,05 66,7
1-5 p<0,01 89 Примечание: перед уровнем значимости р указаны номера сравниваемых групп.

Таким образом, в результате скринингового исследования в тесте максимального электрошока выявлена противосудорожная активность дитерпенового алкалоида N-окись 12-эпинапеллина в дозах 12,5, 25 и 50 мкг/кг. Наиболее выраженный эффект, сопоставимый с активность эталонного препарата карбамазепина был выявлен в группе, получавшей алкалоид в дозе 12,5 мкг/кг. Вероятно, противосудорожная активность N-окись 12-эпинапеллина связана с влиянием на Na⁺-каналы, поскольку для некоторых дитерпеновых алкалоидов установлена взаимодействие с этой мишенью [11].

Список используемой литературы:

1. Falco-Walter, J.J. The new definition and classification of seizures and epilepsy / J.J. Falco-Walter, I.E. Scheffer, R.S. Fisher // Epilepsy Research. - 2018. - Vol. 139. - P. 73-79.

2. Lowenstein, D.H. Edging toward breakthroughs in epilepsy diagnostics and care. Nature Reviews / D.H. Lowenstein // Neurology. - 2015. - Vol. 11. - P. 616-617.

3. Patel, D.C. Neuronglia interactions in the pathophysiology of epilepsy. / D.C. Patel, B.P. Tewari, L. Chaunsali, H. Sontheimer // Nature Reviews Neuroscience. - 2019. - Vol. 20. - Is. 5. - P. 282-297.

4. Werner, F.M. Classical neurotransmitters and neuropeptides involved in generalized epilepsy in a multi-neurotransmitter system: how to improve the antiepileptic effect? / F.M. Werner, R. Coveñas // Epilepsy & Behavior. - 2017. - Vol. 71. - P. 124-129.

5. da Guedes, E. Anticonvulsant Activity of trans-Anethole in Mice / E. da Guedes, L.R. Ribeiro, C.A. Carneiro et al. // Biomed. Res. Int. - 2022. - Vol. 2022. - P. 9902905.

6. Муфазалова, Н.А. Противоэпилептические препараты: учебное пособие / Н.А. Муфазалова, Л.А. Валеева, Л.Ф. Муфазалова, К.В. Батракова. - Уфа: ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, 2021. - 111 с.

7. Ушакова, А.В. Влияние противосудорожных препаратов на когнитивные и поведенческие функции / А.В. Ушкалова, Е.А. Ушкалова // Фарматека. - 2009. - № 7. - С. 13-18.

8. Воронина, Т.А. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ / Т.А. Воронина, Л.Н. Неробкова «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть. 1. - М.: Гриф и К, 2013. - С. 235-250.

9. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2021. - 1216 с.

10. Bezverkhniaia, E.A. Screening Study for Anticonvulsive Activity of Lipophilic Fractions from Empetrum nigrum L. / E.A. Bezverkhniaia, T.N. Povet’eva, T.V. Kadyrova et al. // Research Results in Pharmacology. - 2020. - Vol. 6. - Is. 3. - P. 67-73.

11. Salehi, A. Neuropharmacological Potential of Diterpenoid Alkaloids / A. Salehi, M. Ghanadian, B. Zolfaghari // Pharmaceuticals. - 2023. - Vol. 16. - P. 747.

12. Нестерова, Ю.В. Анальгетическая активность дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского / Ю.В. Нестерова, Т.Н. Поветьева, Н.И. Суслов и др. // Бюл. экспер. биол. - 2014. - Т. 157. - №4. - С. 488-492.

13. Нестерова, Ю.В. Антидепрессантная активность дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского / Ю.В. Нестерова, Т.Н. Поветьева, Н.И. Суслов и др. // Бюл. экспер. биол. - 2011. - Т. 151. - № 4. - С. 406-409.

14. Dzhakhangirov, F.N. Diterpenoid alkaloidsas a new class of antiarrhythmic agents. Structure-activity relationship / F.N. Dzhakhangirov, M.N. Sultankhodzhaev, B. Tashkhodzhaev et al. // Chemistry of Natural Compounds. - 1997. - Vol. 33. - N. 2. - P. 190-202.

15. Жапова, Ц. Исследование химического состава растения Aconitum baicalense: автореф. дисс. канд. хим. наук: 02.00.03. / Жапова Цымжит - Иркутск, 1995. - 19 с.

16. Yin, T. Chemistry and biological activities of hetisine-type diterpenoid alkaloids / T. Yin, H. Zhang, W. Zhang, Z. Jiang // RSC Adv. - 2021. - Vol 11. - P. 36023-36033.

17. Swamy, M.K. Plant-derived bioactives: chemistry and mode of action / M.K. Swamy. - New York: Springer, 2020. - P. 1-589.

18. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях (пер. с англ.). - СПб., 2012. - 48 с.

19. Bahr, T.A. The effects of various essential oils on epilepsy and acute seizure: a systematic review / T.A. Bahr, D. Rodriguez, C. Beaumont, K. Allred // Evidence-based Complement Altern Med. - 2019. - Vol. 2019. - P. 1-14.

20. Oliva, M. Sodium channels and the neurobiology of epilepsy / M. Oliva, S.F. Berkovic, S. Petrou // Epilepsia. - 2012. - Vol. 53. - Is. 11. - P. 1849-1859.

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической фармакологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции заболеваний ЦНС. Описано применение дитерпенового алкалоида N-окись 12-эпинапеллина в качестве средства, обладающего противосудорожной активностью. Изобретение позволяет расширить арсенал средств растительного происхождения, обладающих выраженной противосудорожной активностью и при этом лишенных побочного эффекта. 1 табл., 2 пр.

Применение дитерпенового алкалоида N-окись 12-эпинапеллина в качестве средства, обладающего противосудорожной активностью.