Способ редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9 Российский патент 2024 года по МПК C12N15/63 C12N9/22 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно, к созданию способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

АЧС - это трансграничная особо опасная инфекционная болезнь характеризующаяся лихорадкой, геморрагическим диатезом и высокой летальностью (до 100%) для домашних свиней и диких кабанов. АЧС может протекать сверхостро, остро, подостро, хронически и бессимптомно. Основными путями распространения и передачи вируса являются контакт инфицированных и здоровых животных и влияние антропогенного фактора (транспортировка инфицированных свиней, продукции свиноводства, скармливание необеззараженных пищевых отходов, ятрогенная передача), при этом в ряде стран юго-восточной Африки, Италии (о. Сардиния) и других резервуаром и вектором передачи вируса являются также выступают аргасовые клещи рода Ornithodoros, в особенности О. moubata и О. erraticus [1].

Вирус АЧС является единственным представителем рода Asfivirus, семейства Asfarviridae [2]. Первый случай регистрации АЧС на территории бывшего СССР отмечен в 1977 г. в Одесской области Украинской ССР у домашних свиней. Современная глобальная эпизоотия АЧС началась в марте 2007 г. на территории Грузии, вызванная вирусом АЧС II генотипа. Позже, множество эпизоотических очагов официально нотифицированы в Армении, Южной и Северной Осетии, Абхазии и в ноябре 2007 г. - в Чеченской Республике (Российская Федерация). В дальнейшем вирус АЧС распространился в центральную часть РФ, затем в страны Европы и Дальнего Востока, а к настоящему времени (сентябрь 2023 г.) неблагополучие по АЧС также наблюдается практически во всех странах Юго-Восточной Азии [3, 4, 5, 6, 7].

Возбудитель АЧС представляет собой крупный оболочечный ДНК-содержащий вирус, вирион которого имеет размер 200-215 нм и содержат не менее 28 структурных белков. Геном вируса включает от 170 до 193 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.), состоит из консервативного центрального участка размером около 125 т.п.н. и вариабельных конечных участков, а также кодирует 160-189 открытых рамок считывания. В настоящее время в реакции задержки гемадсорбции идентифицировано 9 сероиммунотипов и на основе вариабельности С-конца гена B646L, кодирующего капсидный белок vp72, 24 генотипа. В мировой практике на основе консервативности гена данного белка проводится дифференциация изолятов вируса АЧС внутри генотипа на основе анализа высоко вариабельных генов B602L (CVR), кодирующего неструктурный шаперон, участвующий в сборке капсидных белков E183L и CP204L, кодирующих структурные белки vp54 и vp30, соответственно [8, 9, 10].

Методы лабораторной диагностики АЧС делятся на две группы: к первой (методы прямого обнаружения) относятся методы выделения вируса, выявления его антигенов и/или геномной ДНК, а вторая (методы косвенного обнаружения) включает методы направленные на обнаружения в организме животных специфических антител. Лабораторная диагностика АЧС направлена одновременно на выделение вируса в пермиссивных первичных культурах клеток (например, лейкоциты свиней, макрофаги костного мозга или селезенки свиней), выявление антигена в мазках или срезах тканей с помощью реакции иммунной флюоресценции (РИФ) и выявление геномной ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в различных вариациях. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) представляет собой высокочувствительный, специфичный и быстрый метод обнаружения генома вируса АЧС. Этот метод особенно ценен, если выделение живого вируса и выявление антигена в тканях невозможны. При сомнительных результатах ПЦР-РВ проводят пассаж в культуре лейкоцитов свиньи исследуемого биоматериала и повторяют описанные выше процедуры [11, 12, 13].

В связи с недостаточной изученностью генов вирулентности и отсутствием данных о процессах формировании гуморального иммунитета при АЧС в настоящее время в широкой практике отсутствуют эффективные и безопасные вакцины против данной болезни. Рядом научных групп получены лишь экспериментальные образцы препаратов, которые пока не нашли массового применения. В связи с этим одним из основных способов борьбы с АЧС остается оперативное уничтожение всего восприимчивого поголовья как в эпизоотическом очаге, так и вокруг него. Все это влечет за собой значительные экономические потери, торговые ограничения и тормозит развитие отрасли свиноводства.

Выбор подходов для разработки живой вакцины, способной защищать животных без наличия клинических признаков инфекции и длительной виремии после иммунизации, является актуальным. Для реализации данной глобальной задачи требуется создавать/получать вакцинные генно-инженерные штаммы вируса АЧС, которые включают в себя редактированные локусы вирулентности. Задача данного исследования заключается в разработке способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET 1.2 и фермента Cas9. Данные гены особенно важны, поскольку ответственны за экспрессию факторов вирулентности возбудителя африканской чумы свиней.

Техническая проблема заключается в отсутствии эффективного способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L. Решение данной проблемы достигнуто благодаря разработке способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9. Благодаря технологии, применение которой предполагает данный способ, удастся создать генетически модифицированный штамм, позволяющий достигать титр вируса более 6,75 lg ГАДЕ₅₀/см³, не являющийся патогенным и дающий возможность на его основе разрабатывать диагностические тест-системы, а также в перспективе вакцинные препараты.

Технический результат заключается в возможности редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET 1.2 и фермента Cas9.

Представленный способ предполагает применение системы редактирования CRISPR, которая позволяет проводить генетические манипуляции выбранных (необходимых исследователю) локусов с целью изменения нуклеотидной последовательности генома вируса, а следовательно, и его свойств (направленной аттенуации). Данный подход является одним из инновационных в генетическом редактировании, с помощью которого могут быть изменены геномы живых организмов [14].

CRISPR - семейство последовательностей ДНК, обнаруженных в геномах прокариот.CRISPR-последовательности получены из фрагментов ДНК бактериофагов, которые ранее инфицировали прокариот. Они используются для обнаружения и уничтожения ДНК подобных бактериофагов во время последующих инфекций. Эти последовательности играют ключевую роль в противовирусной системе защиты прокариот и обеспечивают форму приобретенного иммунитета. Имеющиеся данные показывают, что CRISPR обнаружены примерно в 50% секвенированных геномах бактерий.

Cas9 - представляет собой фермент, который использует последовательности CRISPR в качестве матрицы для распознавания и расщепления специфических цепей ДНК, комплементарных последовательности CRISPR. Ферменты Cas9 вместе с последовательностями CRISPR составляют основу технологии, известной как CRISPR Cas9, которая может использоваться для редактирования генов организмов. Данный процесс редактирования имеет широкий спектр применения, включая прикладное ветеринарное направление, в частности, создание генно-инженерных вакцинных штаммов вирусов заболеваний сельскохозяйственных и мелких домашних животных [15].

Изучена система CRISPR из Streptococcus pyogenes, которая основана на функциях белка Cas9. Эндонуклеаза Cas9 представляет собой четырехкомпонентную систему, которая включает две небольшие молекулы: crRNA и трансактивирующую CRISPR РНК (tracrRNA). Дженнифер Даудна и Эммануэль Шарпантье синтезировали эндонуклеазу Cas9 с более управляемой двухкомпонентной системой путем слияния двух молекул РНК в «однонаправленную РНК», которая в сочетании с Cas9 могла находить и разрезать ДНК-мишень, определенную как направляющая РНК. Манипулируя нуклеотидной последовательностью такой РНК, искусственную систему Cas9 можно запрограммировать так, чтобы она нацеливалась на любую последовательность ДНК для внесения двуцепочечного разрыва [14, 15].

В 2020 г. Фэн Чжана и Джорджа Черча с соавторами впервые опубликовали описание редактирования генома в культурах клеток человека с использованием технологии CRISPR Cas9. В 2019-2021 гг. данный метод применялся для внесения геномных изменений различных организмов, в частности, пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), плодовых мушек (Drosophila melanogaster), муравьев (Harpegnathos saltator и Ooceraea biroi), комаров (Aedes aegypti), нематод (Caenorhabditis elegans), растений, мышей (Mus musculus domesticus), обезьян и даже человеческих эмбрионов [14, 15].

Сущность технологии редактирования CRISPR Cas9 заключается в том, что доставляя нуклеазу Cas9 в комплексе с синтетической направляющей РНК (gRNA) в клетку, геном клетки можно разрезать в нужном исследователю месте, что позволяет удалять существующие гены и/или добавлять новые in vivo [14].

Возможность и преимущества использования стрептококковой системы CRISPR Cas9 заключается в том, что для реакции требуется два компонента: «указывающая путь» молекула РНК - РНК-гид (guideRNA, gRNA), комплементарная целевому гену, и фермент Cas9, расщепляющий этот ген. Гены этих двух компонентов помещаются в плазмиду и доставляются в клетку, где проводится их экспрессия. Данная методика позволяет доставить для этого процесса сразу несколько РНК-гидов, комплементарных разным генам-мишеням, в результате чего нуклеаза Cas9 будет способна разрезать их все [15].

Фермент Cas9 разрезает обе цепи геномной ДНК в месте, с которым связывается РНК-гид. РНК-гид (размером примерно в 80 нуклеотидов) состоит из 5'-концевой последовательности - «спейсер» (размер в 20 нуклеотидов), комплементарной нужному участку ДНК, и «шпильки» для правильной ориентации комплекса. Дизайн РНК-гида должен учитывать один момент, связанный с выбором комплементарной цели. «Целевой» участок геномной ДНК, который будет разрезаться, может быть любым, но за ним должны следовать два цитозиновых нуклеотида, т.к. считается, что РНК-гид лучше связывается с ДНК на том участке, где комплементарная цепь этой ДНК содержит консенсус 5'-NGG-3'. Данный участок получил название «прилегающий к протоспейсеру мотив» (protospacer adjacent motif, РАМ) [14, 15, 16].

Преимуществами технологии CRISPR Cas9 является то, что данный метод позволяет редактировать геномы in vivo довольно точно и дешево. Его можно использовать при создании новых лекарств, сельскохозяйственных продуктов и генетически модифицированных организмов, включая вирусы, а также как средство борьбы с патогенами и вредителями.

Следует отметить, что редактирование генома стало возможным с использованием различных методов еще с 1980-х годов, но при этом используемые методы были неэффективными и непрактичными для реализации в больших масштабах. С открытием технологии CRISPR и молекулы нуклеазы Cas9 эффективное и высокоселективное редактирование стало реальностью. Данная нуклеаза облегчает целенаправленную модификацию генома, обеспечивая надежность создания целевого разрыва в определенном месте, обозначенном нитями crRNA и tracrRNA [15]. Общая схема изменения последовательности ДНК с использованием системы CRISPR Cas9 представлена на фиг.1.

Относительно недавно система CRISPR Cas9 успешно применена к ДНК-содержащим вирусам, таким как вирус осповакцины (VACV), полиомавирус человека 2 типа (JCPyV), аденовирус птиц IV типа (FAdV-4), вирус болезни Ауески, вирус болезни Марека [14, 15]. Так, для вируса болезни Ауески штамма «HNX» проводили модификацию генов ТК, gE путем внесения делеции, а для штамма «BarthaK61» в гены ЕРО, UL50 добавляли новые нуклеотидные последовательности. С помощью технологии CRISPR Cas9 некоторыми исследователями получены генетически модифицированные ДНК-содержащие вирусы. Так, к 2022 г. уже созданы некоторые генно-инженерные штаммы, например, получили штамм вируса болезни Марека на основе делеций в области генов UL6/UL19/UL27/UL30/UL49/ICP4/UL25 штамма RB-1B GFP. Также вырезанию нуклеотидов с помощью предложенной методики подвергали «поздний» ген полиомавируса человека II типа. Данная технология использовалась для модификации генов ОРС42/43 (1966DEL) штамма «KR5» аденовируса птиц IV типа посредством делеции [14, 15].

В настоящее время существуют различные штаммы вируса АЧС, в том числе генно-модифицированные, однако не все они могут быть использованы в процессах создания средств диагностики, в т.ч. для DIVA-стратегии, и перспективных средств специфической профилактики болезни.

Одним из новых перспективных методов получения безопасных аттенуированных вакцин является делеция специфических генов ДНК вируса АЧС, кодирующих белки, отвечающих за свойство вирулентности. В то же время, значительные трудности представляют неизученные функции многих белков. Например, делеция гена KI69R, кодирующего тимидинкиназу, приводила к потере вирулентности у изолята «Malawi Lil-20/1» (генотип VIII), но при этом сохраняла вирулентность у штамма «Georgia 2007/1» (генотип II), что, по-видимому, объясняется компенсаторными мутациями в других участках генома. При иммунизации штаммом «Georgia 2007/1» с делецией гена 9GL, кодирующего фосфорилазу, наблюдается более высокий уровень защиты при сочетанной делеции гена UK (DP96R). Однако при совместной делеции генов MGF 360/505, кодирующих ингибиторы интерферона I типа, и 9GL защитного эффекта при иммунизации не наступает [17, 18, 19, 20, 21, 22].

Для свиней, иммунизированных рекомбинантным штаммом «BA71ACD2» с делецией гена EP402R (CD2v), при использовании контрольного изолята «RSA/11/2017» протекция составила 83,3%, а при использовании изолята «КепОб.Вш» только 50% [23].

Делеция гена DP148R изолята «Benin 97/1» (генотип I) приводила к потере вирулентности вируса АЧС. В этом случае при интраназальном заражении защита от контрольного заражения составляла 83,3%) [24].

Работа по искусственному редактированию (делеция) генов MGF505-1R, MGF505-2R, MGF505-3R, MGF360-12L, MGF360-13L, MGF360-14L, EP402R, 9GL, DP148R, кодирующих различные белки, привели к получению модифицированного варианта «HLJ/18-7GD» вируса АЧС, при использовании которого после внутримышечной инокуляции свиньям, животные оставались клинически здоровыми в течение 3-х недель наблюдения. При заражении свиней вирулентным изолятом «HLJ/18» (генотип II) у животных, иммунизированных в дозе 10³ ГАДЕ₅₀/гол штаммом HLJ/18-7GD, наблюдалась лихорадка в течение 3-9 дней с максимальным подъемом температуры до 42,0°С, однако у свиней, иммунизированных в дозе 10⁵ ГАДЕ₅₀/гол штаммом HLJ/18-7GD, незначительный подъем температуры до 40,7°С регистрировался только в течение первых суток. При этом следует отметить, что данный экспериментальный штамм проявляет удовлетворительные репродукционные свойства в культуре клеток [25].

Актуальным является разработка способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9 для создания в будущем генно-модифицированного штамма вируса АЧС и перспективных средств специфической профилактики заболевания на его основе.

Прототипным способом является классический процесс редактирования генома вируса АЧС с помощью стандартных эндонуклеаз [2], однако данный способ не позволяет с высокой точностью проводить геномное редактирование, а также является достаточно дорогим и трудоемким в исполнении.

Настоящее изобретение позволяет учесть недостатки прототипного способа геномного редактирования вируса АЧС. Разработка данного способа позволит повысить эффективность и точность процесса редактирования ДНК вируса АЧС, снизить стоимость и трудоемкость проведения процесса.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Общая схема изменения последовательности ДНК с использованием системы CRISPR Cas9.

Фиг. 2 - Выравнивание последовательности гидов gR1 и gR2 после их секвенирования по Сэнгеру. Примечание: в черной рамке выделены последовательности, комплементарные для генов MGF 110_4L-6L.

Фиг.3 - Схема клонирования по методу Гибсона при разработке способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Фиг. 4 - Схема сконструированной плазмиды (shuttle) методом Гибсона. Примечание: черным цветом обозначена большая круглая последовательность плазмиды pJET, красным цветом - L-arm, синим цветом - R-arm.

Фиг. 5 - Электрофоретическое разделение фрагментов ПЦР при анализе генома модельного образца, применяемого при разработке способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Примечание: лунка №1 - молекулярный маркер 1 кб, от 10000 п. н. до 250 п. н., лунка №2 - вирус АЧС с делецией в генах MGF 110_4-6L, лунки №3 и 4 - вирус АЧС без делеции в генах MGF 110_4-6L.

На первом этапе работы по разработке способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9, необходимо разработать две плазмидные конструкции, которые в дальнейшем требуется совместно применять для редактирования генома вируса АЧС.

Первая конструкция - плазмида-гид (gRNA), которую получают на основе вектора U6. Она содержит комплементарный фрагмент гена вируса АЧС, в который, в свою очередь, фермент Cas9 вносит рестрикционные модификации. Конструкция gRNA включает в себя 20 п. н., комплементарных по отношению к участку генома вируса АЧС с генами MGF 110 4L-6L. Данный фрагмент находится в позициях 8724-10107 п. н. генома вируса АЧС, что подтверждено на основе анализа референтного штамма «Georgia 2007/1» вируса АЧС (номер в GenBank #FR682468.2).

Вторая конструкция - кассета, или челночная плазмида (shuttle plasmid), которую получают на основе плазмиды pJET1.2. Она содержит два фрагмента генома вируса АЧС - Left-arm (L-arm) и Right-arm (R-arm), которые фланкируют гены MGF 110 4L-6L для их делеции.

Для получения данных генных конструкций разработан ряд пар олигонуклеотидных праймеров, которые подобраны для актуальных участков генов вируса АЧС, представленных выше. Созданные праймеры получены в соответствии с рядом общепринятых правил и требований с учетом значений термодинамических показателей, и им присвоены следующие наименования в зависимости от анализируемого участка генома: A4C_gR1_R, A4C_gR2_R, A4C_gR1_F, A4C_gR2_F. Данные прямые и обратные праймеры созданы для клонирования РНК-гида в плазмиды.

После клонирования 20 п. н. в вектор U6 и получения двух гид проведен процесс трансформации созданной модифицированной плазмиды в E.coli (штамм «JM-109») с целью амплификации нуклеотидных участков для использования на втором этапе работы. Для осуществления данного процесса проведено размораживание на льду компетентных клеток Е. coli. К 100 мкл суспензии данных клеток добавляют 30 мкл раствора плазмиды и инкубируют на льду в течение 20-30 минут. Ставят «Heat-shock» при температуре 42°С в течение 35 секунд и смесь охлаждают на льду в течение 3 минут. Добавляют 400 мкл питательной среды LB, инкубируют при температуре 37°С в течение часа. Проводят центрифугирование при 2000 об/мин в течение минуты, удаляют супернатант.Осадок клеток ресуспендируют в 100 мкл среды LB, наносят на агар LB с ампициллином и инкубируют при температуре 37°С в течение ночи. Отдельные клоны выбирают для выделения плазмиды (гиды) с использованием коммерческого набор Midi-prep plasmid extraction kit (Евроген, Москва). Подтверждают правильность последовательности по Сэнгеру, анализируя выравнивания нуклеотидов.

На следующем этапе работы проводят клонирования двух участков L-arm и R-arm в плазмиду pJET 1.2 с помощью метода Гибсона [26] для получения кассет (Shuttle). Следует отметить, что для осуществления данного процесса требуется амплифицировать участки L-arm и R-arm из генома вируса АЧС с помощью ПЦР. Для этого разрабатывают дизайн олигонуклеотидных праймеров, предназначенных именно для поставленной задачи. В результате реакции получают готовую сконструированную плазмиду. Амплифицированную последовательность анализируют и подтверждают ее дизайн с помощью секвенирования методом Сэнгера с использованием стандартных праймеров М-13, специфичных для плазмиды pJET.

Следующий важнейший этап работы предполагает проведение редактирования генома вируса АЧС. Изначально проводят трансфекцию клеточной линии африканской зеленой мартышки (Chlorocebus aethiops) Vero плазмидами кассет (Shuttle) и гидов gR1 и gR2, плазмидой для экспрессии белка Cas9 без NLS (Nuclear localization signal - используется для экспрессии белков в ядро). Данная процедура необходима для получения всех компонентов реакции с целью редактирования по технологии CRISPR Cas9. Непосредственно для проведения трансфекции используют перевиваемую культуру клеток Vero-76 (в 12 луночных культуральных планшетах), все представленные выше плазмиды и набор Lipofectamine 3000 (производитель «Invitrogen»). На всех этапах работы четко следуют инструкции производителя используемых наборов и оборудования.

Монослойную клеточную линию Vero-76 заражают адаптированным к данной культуре клеток в течение 10 последовательных пассажей вирусом АЧС. Инкубирование проводят при температуре 37±0,1°С в течение 7 суток. После этого культуральный планшет подвергают замораживанию при температуре минус 20±1°С и затем через 20 мин инкубируют при температуре 37±1°С в течение 2 ч. Используют каждую лунку 96-луночного планшета для заражения и титрования (n=5). После чего добавляют в каждую лунку 20%-ю суспензию эритроцитов свиньи для обнаружения вируса АЧС по степени гемадсорбции.

Следующий этап работы направлен на селекцию созданного штамма вируса АЧС с делецией в генах MGF 110_4L-6L. Для этого разрабатывают дизайн олигонуклеотидных праймеров Deletion-Fwd1 и Deletion-Rvs1, специфичных для данного фрагмента генома. Суть применения данных олигонуклеотидов заключается в том, что они позволяют проводить амплификацию трех фрагментов генома вируса АЧС размерами 1698 п. н., 1110 п. н. и 456 п. н. в присутствии генов MGF 110_4L-6L. При отсутствии этих генов разработанные праймеры амплифицируют только один фрагмент размером 410 п. н. Обнаружение одного фрагмента является маркером генетически модифицированного вируса, а трех фрагментов - исходного родительского штамма.

Модифицированный вариант вируса АЧС (мутант) после проведения селекции подвергают пассированию в клеточной линии Vero-76 в 96-луночном планшете с проведением титрования по конечной точки (n=5) для клонирования чистого варианта (с делецией).

На следующем этапе исследования проводят репродукцию клонированного мутанта в первичной культуре клеток селезенки свиньи. Из полученной вируссодержащей суспензии выделяют геном вируса АЧС с помощью фенол-хлороформной экстракции в модификации Mazloum et al. (2019) [17] и проводят полногеномное секвенирование на секвенаторе MGI-С50. Оценивают результаты секвенирования, подтверждением наличия делеции генов MGF 110_4L-6L, а также делецию в ДНК вируса АЧС в правом вариабельном регионе.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Создание двух плазмидных конструкций для разработки способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET 1.2 и фермента Cas9.

На первом этапе разработки способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9 создали две плазмидные конструкции, которые в дальнейшем совместно требовалось применять для редактирования генома вируса АЧС.

Первая конструкция - плазмида-гид (gRNA), которую получали на основе плазмиды U6. Она содержала комплементарный фрагмент гена вируса АЧС, в который, в свою очередь, фермент Cas9 вносит рестрикционные модификации. Конструкция gRNA содержит 20 п. н., комплементарные по отношению к участку генома вируса АЧС с генами MGF 110_4L-6L. Данный фрагмент находится в позициях 8724-10107 н.о. в геноме вируса АЧС.

Вторая конструкция - кассета, или челночная плазмида (Shuttle plasmid), которую конструировали на основе плазмиды pJET1.2. Она содержит два фрагмента генома вируса АЧС - Left-arm (L-arm) и Right-arm (R-arm), они фланкируют гены MGF 110_4L-6L для их делеции.

Для получения конструкций был разработан ряд пар олигонуклеотидных праймеров, которые подбирали для актуальных участков генов вируса АЧС, представленных выше. Созданные праймеры получили в соответствии с рядом общепринятых правил и требований, с учетом значений термодинамических показателей, и им присвоили следующие наименования в зависимости от анализируемого участка генома: A4C_gR1_R, A4C_gR2_R, A4C_gR1_F, A4C_gR2_F. Дизайн олигонуклеотидов отражен в таблице 1. Данные прямые и обратные праймеры были созданы для клонирования РНК-гида в плазмиды.

После клонирования 20 п. н. в вектор U6 и получения двух гид осуществили процесс трансформации созданной модифицированной плазмиды в E.coli (штамм «JM-109») с целью амплификации гиды (клона) для использования на втором этапе работы.

Для этого к 100 мкл компетентных клеток добавляли 30 мкл плазмиды и инкубировали на льду в течение 20-30 минут. Проводили «Heat-shock» при температуре 42°С в течение 35 секунд и смесь охлаждали на льду в течение 3 минут. Добавляли 400 мкл питательной среды LB, инкубировали на шейкере (250 об/мин) при температуре 37°С в течение часа. Центрифугировали при 2000 об/мин в течение минуты и удаляли супернатант. Осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл среды LB, наносили на агар LB с ампициллином (при концентрации 100 мкг/мл) и инкубировали при температуре 37°С в течение ночи. Отдельные клоны выбирали для выделения плазмиды с использованием коммерческого набор Midi-prep plasmid extraction kit («Евроген», Москва). Подтверждали правильность последовательности по Сэнгеру, анализируя выравнивания, которые отражены на фиг.2. Таким образом, созданы две плазмидные конструкции для разработки способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Пример 2. Клонирование двух участков L-arm и R-arm в плазмиду pJET 1.2 с помощью метода Гибсона для получения кассет (shuttle) и разработки способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET 1.2 и фермента Cas9.

Проводили клонирование двух участков L-arm и R-arm в плазмиду pJET1.2 с помощью метода Гибсона для получения кассет (shuttle) (основные позиции отражены на фиг.3, 4). Следует отметить, что для осуществления данного процесса требовалось амплифицировать участки L-arm и R-arm из генома вируса АЧС с помощью ПЦР. Для этого разрабатывали дизайн праймеров, предназначенных именно для поставленной задачи. Дизайн данных олигонуклеотидов отражен в таблице 2 (большими буквами выделены последовательности праймеров, специфичных для генома вируса АЧС, а маленькими буквами - комплементарные последовательности с плазмидой pJET1.2). Размер созданных праймеров составлял по 40 п. н. В результате процесса получали готовую сконструированную плазмиду, карта которой обозначена на фиг.4, где представлены большая круглая последовательность плазмиды pJET, L- и R-arm. Как видно из фиг.4, в результате клонирования создавали вектор, содержащий два фрагмента генома вируса АЧС фланкирующих генов MGF_110-4L-6L для проведения их делеции. Полученную последовательность подтверждали с помощью секвенирования методом Сэнгера с использованием стандартных праймеров М-13, специфичных для плазмиды pJET. Таким образом, проведено клонирование двух участков L-arm и R-arm в плазмиду pJET 1.2 с помощью метода Гибсона для получения кассет (shuttle) и разработки способа редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Пример 3. Редактирование генома вируса АЧС в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Для редактирование генома вируса АЧС в области генов MGF 1104L-6L изначально проводили трансфекцию клеточной линии Vero-76 плазмидами кассет (shuttle), гидов gR1 и gR2, а также плазмидой для экспрессии белка Cas9 без NLS. Данная процедура необходима для получения всех компонентов с целью редактирования по технологии CRISPR Cas9. Непосредственно для проведения процедуры трансфекции применяли перевиваемую культуру клеток Vero-76 (в 12 луночных планшетах), все представленные выше плазмиды и набор Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Во время работы четко следовали инструкции производителя набора.

Монослойную клеточную линию Vero-76 заражали вирусом АЧС, который был адаптирован к культуре клеток в течение 10 последовательных пассажей. Инкубирование проводили при температуре 37±1°С в течение 7 суток. После этого этапа культуральный планшет подвергали замораживанию при температуре минус 20±1°С и затем 20 мин инкубировали при температуре 37±1°С в течение 2 ч и использовали каждую лунку 96-луночного планшета для заражения и титрования (n=5). Далее добавляли в каждую лунку 20% суспензию эритроцитов свиньи для обнаружения вируса АЧС по степени гемадсорбции. Таким образом, проведено редактирование генома вируса АЧС в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Пример 4. Селекция и репродукция мутанта вируса А ЧС при разработке способа редактирования генома вируса АЧС в области генов MGF 1104L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Данный этап работы был направлен на селекцию созданного штамма вируса АЧС, который содержит делеции в генах MGF 110 4L-6L. Для этого разрабатывали дизайн олигонуклеотидных праймеров Deletion-Fwd1 и Deletion-Rvs1, специфичных для данного фрагмента генома (табл.3). Суть применения данных олигонуклеотидов заключалась в том, что они дали возможность проводить амплификацию трех фрагментов генома вируса АЧС размером1698 п. н., 1110 п. н. и 456 п. н. в присутствии генов MGF 110_4L-6L. При отсутствии генов MGF 110_4L-6L разработанные праймеры позволяли амплифицировать только один фрагмент размером 410 п. н., что представлено на фиг.5.

На фиг.5 видно, что в лунке №1 - молекулярный маркер 1 кб, от 10000 п. н. до 250 п. н., в лунке №2 - вирус АЧС с делецией в генах MGF 110_4L-6L, в лунках №3 и 4 - вирус АЧС без делеции в генах MGF 110_4L-6L.

Штамм вируса АЧС с одним ПЦР-продуктом (мутант) после проведения селекции пассировали в клеточной линии Vero-76 в 96-луночном планшете с проведением титрования по конечной точки (n=5) для клонирования чистого варианта (с делецией) и отделения от исходного родительского штамма.

На следующем этапе проводили репродукцию отобранного штамма вируса АЧС в первичной культуре клеток селезенки свиньи (табл.4). В таблице 4 представлены репродукционные свойства мутанта вируса АЧС, изученные в первичной культуре клеток селезенки свиней (СС). Выявлено, что при дозе заражения 0,005 ГАДЕ₅₀/кл. титр инфекционной активности вируса АЧС в среднем за 5 пассажей составил 6,75±0,52 lg ГАДЕ₅₀/КЛ. (n=3, р<0,05), что выше по сравнению с прототипом более, чем на 1,00 lg ГАДЕ₅₀/КЛ.

Из полученной вируссодержащей суспензии выделяли ДНК вируса АЧС с помощью фенол-хлороформной экстракции в модификации Mazloum et al. (2019) [17] и осуществляли полногеномное секвенирование на секвенаторе MGI-C50. Оценили результаты секвенирования, подтвердили наличие делеции генов MGF 110_4L-6L, а также делецию в геноме вируса АЧС в правом вариабельном регионе, которая была еще до редактирования.

Таким образом, проведены селекция и репродукция мутанта вируса АЧС с использованием способа редактирования генома вируса АЧС в области генов MGF 110 4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Таким образом, разработан и апробирован способ редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Способ редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9»:

1. EFSA AHAW Panel. African swine fever. EFSA J. 13, 4163 (2015).

2. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018.-Ch. 2.8.

3. Sanchez-Vizcaino JM, Mur L, Gomez-Villamandos JC, Carrasco L. An Update on the Epidemiology and Pathology of African Swine Fever. J. Сотр. Pathol. 2015;152:9-21.

4. Cortinas Abrahantes, J. et al. Epidemiological analyses on African swine fever in the Baltic countries and Poland. EFSA J. 15, (2017).

5. World Organisation for Animal Health (OIE). African swine fever in Hungary. Immediate notification ref OIE: 26484, 23.04.2018 (2018). Available at http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=26484 (Accessed 11thOctober 2018).

6. Zhou, X. et al Emergence of African Swine Fever in China, 2018. Transbound. Emerg. Dis. 0-1 10.111 l/tbed.12989 (2018).

7. Pejsak, Z., Truszczynski, M., Niemczuk, K., Kozak, E. & Markowska-Daniel, I. Epidemiology of African Swine Fever in Poland since the detection of the first case. Pol. J. Vet. Sci. 17, (2014).

8. Mazloum, A., van Schalkwyk, A., Shotin, A., Igolkin, A., Shevchenko, I., Gruzdev, K.N., Vlasova, N. Comparative Analysis of Full Genome Sequences of African Swine Fever Virus Isolates Taken from Wild Boars in Russia in 2019. Pathogens 2021, 10, 521.

9. OIE World Animal Health Information System. Available at http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Wahidhome/Home (Accessed 11th October 2018) (2018).

10. Dixon LK, et al. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. Vet. Immunol. Immunopathol. 2004;100:117-134.

11. Leon P, Bustos MJ, Carrascosa AL. Laboratory methods to study African swine fever virus. Virus Res. 2013;173:168-79.

12. Rodriguez F, et al. African swine fever: morphopathology of a viral haemorrhagic disease. Vet. Rec. 1996;139:249-254.

13. Gallardo C, et al. Genetic Variation among African Swine Fever Genotype II Viruses, Eastern and Central Europe. Emerg. Infect. Dis. 2014;20:1544-1547.

14. Ikeda Т., Tanaka W., Mikami M., Endo M., Hirano H.-Y. Generation of artificial drooping leaf mutants by CRISPR-Cas9 technology in rice // Genes & Genetic Systems. - 2016. - Vol.90, no. 4. - P. 231-235.

15. Li Fang, Scott M. J. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the white and Sex lethal loci in the invasive pest, Drosophila suzukii // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2016. - Vol.469, no. 4. - P. 911- 916.

16. Dixon LK, Chapman DAG, Netherton CL, Upton C. African swine fever virus replication and genomics. Virus Res. 2013;173:3-14.

17. Mazloum, A., Zinyakov, N. G., Pershin, A. S., Shevchenko, I. V., Zhukov, I. Y., Fedoseyeva, D. N., et al. (2019). Analysis of changesin african swine fever virus genetic structure and biological prorerties during adaptation to continuous cell culture. Vet. Sci. Today 2018, 21-25.

18. Gallardo C, et al. Assessment of African Swine Fever Diagnostic Techniques as a Response to the Epidemic Outbreaks in Eastern European Union Countries: How To Improve Surveillance and Control Programs. J. Clin. Microbiol. 2015;53:2555-2565.

19. Malogolovkin A, Yelsukova A, Gallardo C, Tsybanov S, Kolbasov D. Molecular characterization of African swine fever virus isolates originating from outbreaks in the Russian Federation between 2007 and 2011. Vet. Microbiol. 2012;158:415^H9.

20. Fr^czyk M, et al. Evolution of African swine fever virus genes related to evasion of host immune response. Vet. Microbiol. 2016;193:133-144.

21. Sanchez EG, et al. Phenotyping and susceptibility of established porcine cells lines to African Swine Fever Virus infection and viral production. Sci. Rep.2017;7:10369.

22. Chapman DAG, et al. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17:599-605.

23. Monteagudo PL, Lacasta A, Lopez E, Bosch L, Collado J, Pina-Pedrero S, Correa-Fiz F, Accensi F, Navas MJ, Vidal E, Bustos MJ, Rodriguez JM, Gallei A, Nikolin V, Salas ML, Rodriguez F. BA71ACD2: a New Recombinant Live Attenuated African Swine Fever Virus with Cross-Protective Capabilities. J Virol. 2017 Oct 13;91(21):e01058-17.

24. Attenuated African swine fever virus vaccine URL: https://patents.justia.com/patent/10507237 (Дата обращения: 24.08.2022).

25. Fan Y, Chen W, Jiang C, Zhang X, Sun Y, Liu R, Wang J, Yang D, Zhao D, Bu Z, He X. Host Responses to Live-Attenuated ASFV (HLJ/18-7GD). Viruses. 2022 Sep 10;14(9):2003.

26. Gibson, D.G. et al. (2009) Nature Methods, 901-903.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="MGF.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-07-04">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-07-04</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>559</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-07-04</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ редактирования ДНК вируса

африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением

плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>10</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>caggctgtaaaaaggctatagccggtgtttcgtcctttccacaagat</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cgccctttgatatgtactaagccggtgtttcgtcctttccacaagat</

INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>46</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..46</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtccgacatttttccgatatgttttagagctagaaatagcaagtta</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>46</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..46</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcgggaaactatacatgattgttttagagctagaaatagcaagtta</I

NSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>60</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..60</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gatcccgccggaagcgccaggacaatgggatcgggtgggactagctagg

ccagctagcag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="6">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>49</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..49</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctggccagccaggttttaagttggattgctaattggctagctattcagt

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="7">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>43</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..43</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctagccaattagcaatccaacttaaaacctggctggccagaag</INSD

Seq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="8">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>62</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..62</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aatttaaatttttaataaaattcctgtctcagtttcctgaaacccccag

agaatgaacttgg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="9">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ccaagttcttcttgtggagga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="10">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Asfivirus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gccgaccgaatcttaaatga</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9. Указанный способ предусматривает создание на основе плазмиды U6 плазмиды-гиды (gRNA), содержащей 20 п.н., комплементарных участку генома вируса АЧС с генами MGF 110_4L-6L в позициях 8724-10107 н.о. генома вируса АЧС, создание на основе плазмиды pJET1.2 челночной плазмиды Shuttle plasmid, которая содержит два фрагмента генома вируса АЧС - Left-arm (L-arm) и Right-arm (R-arm), фланкирующих гены MGF 110_4L-6L для их делеции, редактирование генома вируса АЧС в области генов MGF 110_4L-6L и отобранного штамма вируса АЧС в первичной культуре клеток селезенки свиньи, выделение ДНК вируса АЧС, проведение секвенирования и подтверждение наличия делеции генов MGF 110_4L-6L. Изобретение эффективно для редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET 1.2 и фермента Cas9. 5 ил., 4 табл., 4 пр.

Способ редактирования ДНК вируса африканской чумы свиней в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9, предполагающий проведение следующих этапов геномного редактирования:

- создание на основе плазмиды U6 плазмиды-гиды (gRNA), содержащей 20 п.н., комплементарных участку генома вируса АЧС с генами MGF 110_4L-6L в позициях 8724-10107 н.о. генома вируса АЧС с применением следующих олигонуклеотидных праймеров:

- создание на основе плазмиды pJET1.2 челночной плазмиды Shuttle plasmid, которая содержит два фрагмента генома вируса АЧС - Left-arm (L-arm) и Right-arm (R-arm), фланкирующих гены MGF 110_4L-6L для их делеции, с применением следующих олигонуклеотидных праймеров:

- редактирование генома вируса АЧС в области генов MGF 110_4L-6L с применением плазмид U6, pJET1.2 и фермента Cas9;

- селекция и репродукция мутанта вируса АЧС с разработкой олигонуклеотидных праймеров Deletion-Fwd1 5' - CCAAGTTCTTCTTGTGGAGGA-3' и Deletion-Rvs1 5' - GCCGACCGAATCTTAAATGA-3';

- репродукция отобранного штамма вируса АЧС в первичной культуре клеток селезенки свиньи и выделение ДНК вируса АЧС, проведение секвенирования и подтверждение наличия делеции генов MGF 110_4L-6L.