Синтетические олигонуклеотидные праймеры для высокочувствительного экспресс-выявления ДНК вируса африканской чумы свиней методом петлевой изотермической амплификации Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней в биологическом материале с целью лабораторной диагностики инфекционной болезни путем проведения петлевой изотермической амплификации (LAMP) с использованием набора олигонуклеотидных праймеров в установленных последовательностях.

Молекулярная биология является одной из важнейших отраслей биологии, которая позволяет проводить диагностику вирусных и бактериальных болезней животных. На сегодняшний день одной из основных задач отрасли в ветеринарии является получение точных результатов при диагностике инфекционных болезней животных.

Африканская чума свиней (АЧС) - это высококонтагиозная вирусная болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, цианозом кожи и обширными геморрагиями во внутренних органах. Относится к особо опасным заразным болезням животных [1].

Возбудитель африканской чумы свиней - ДНК-содержащий оболочечный вирус с икосаэдрическим капсидом семейства Asfarviridae. Вирус репродуцируется в организме диких и домашних свиней.

Вирус устойчив к широкому диапазону температур, изменениям рН среды, к высушиванию, гниению и многим дезинфицирующим средствам. Солнечные лучи инактивируют вирус через 40-60 мин.

Распространение АЧС наносит большие экономические потери, обусловленные убоем всего восприимчивого поголовья на территории очага инфекции.

В настоящее время для диагностики АЧС широко применяют молекулярно-генетический метод - полимеразную цепную реакцию (ПЦР), но несмотря на многолетний опыт использования данной методики, он имеет ряд недостатков, главный из которых - значительные временные затраты.

Аналогом ПЦР является метод петлевой амплификации, LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), предложенный японским ученым Tsugunori Notomi в 2000 году, позволяющий проводить амплификацию в течение 15-30 минут, при постоянной температуре [2, 3]. Детекция результатов возможна визуальным способом.

Задачей изобретения является разработка наиболее подходящих последовательностей олигонуклеотидных праймеров для постановки реакции LAMP с целью обнаружения вируса африканской чумы свиней в биологическом материале.

Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность предлагаемых последовательностей олигонуклеотидных праймеров, а также повышение аналитической чувствительности LAMP-исследования.

Заявленный технический результат достигается благодаря созданию последовательностей олигонуклеотидных праймеров, комплементарных участку гена p10 вируса АЧС, и подбору условий для проведения петлевой изотермической амплификации, обеспечивающей получение результата в течение 30-35 минут, что является быстрой альтернативой ПЦР.

Сущность изобретения заключается в проведении модифицированной петлевой изотермической амплификации с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров, имеющих нуклеотидный состав, представленный в таблице 1.

Таблица 1 - Праймеры LAMP для выявления ДНК вируса АЧС название последовательность (5’-3’) длина F3 TCCAAATGGACTTCCCAC 18 B3 TTTGGAGTTGCTCCAGAAC 19 LB TCCTGCGATCACGAAGTTCAAAAAA 25 FIP GCTCTGCGAGATCTTAGAGTGATTTCGCGTTGCTTAACCCT 41 BIP ACGGAACAAAATAATACGGATTTTAGTCTTTTGTTTTAGGTGTTTCACTTGAAC 54

Перед началом проведения LAMP-исследования проводят экстракцию ДНК из биологического материла.

Далее готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:

ДНК-проба5 мкл

смесь праймеров5 мкл

буфер для LAMP10 мкл

деионизированная вода4 мкл

Bst ДНК-полимераза1 мкл

Компоненты реакционной смеси смешивают непосредственно перед проведением LAMP-исследования. Смесь перемешивают и вносят в пробирки по 25 мкл.

Амплификатор запрограммировать для выполнения программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала - 65°С, 30 мин, детекция после каждого цикла на каналах Green и Yellow, установить 60 циклов. По завершении LAMP-исследования проводят анализ полученных данных.

Оценка результатов возможна визуальным способом: при наличии в отобранном биологическом материале ДНК вируса АЧС реакционный раствор становится мутным. Для определения степени мутности раствора можно использовать спектрофотометр.

Интерпретация результатов исследования по завершении амплификации сводится к наличию либо отсутствию пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией (показатель порогового цикла Ct): реакция считается положительной при определении значения Ct по каналу Yellow; реакция считается отрицательной при отсутствии значения Ct на канале Yellow.

Пример 1. Определение аналитической чувствительности LAMP-исследования при использовании представленных последовательностей олигонуклеотидных праймеров.

Были подготовлены разведения ДНК рекомбинантной плазмиды, содержащей фрагмент генома вируса АЧС.

Режимы амплификации были выставлены согласно представленному изобретению: 65°С, 30 мин, детекция после каждого цикла на каналах Green и Yellow, 60 циклов. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Определение аналитической чувствительности LAMP-исследования при использовании представленных последовательностей олигонуклеотидных праймеров Образец ДНК вируса АЧС, копий/мл Значение Ct по каналу Yellow Результат, ДНК вируса АЧС 10^4 25,09 обнаружена 10^4 25,30 обнаружена 10^4 25,35 обнаружена 2*10^3 30,57 обнаружена 2*10^3 30,60 обнаружена 2*10^3 29,98 обнаружена 10^3 N/A не обнаружена 10^3 N/A не обнаружена 10^3 N/A не обнаружена К+ 21,58 соответствует К- N/A соответствует

Аналитическая чувствительность метода LAMP при использовании предложенных последовательностей олигонуклеотидных праймеров составляет 2*10^3 копий/мл (20 копий ДНК на реакцию).

Пример 2. Определение специфичности LAMP-исследования при использовании заявленных изобретением последовательностей олигонуклеотидных праймеров.

Для оценки специфичности были подготовлены пробы ДНК вируса АЧС и гетерологичных вирусов (классической чумы свиней, болезни Ауески).

Режимы амплификации были выставлены согласно представленному изобретению: 65°С, 30 мин, детекция после каждого цикла на каналах Green и Yellow, 60 циклов. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Определение специфичности LAMP-исследования при использовании заявленных изобретением последовательностей олигонуклеотидных праймеров. Образец ДНК Значение Ct по каналу Результат, ДНК вируса АЧС Green Yellow Вирус АЧС N/A 26,32 обнаружена Вирус КЧС 23,58 N/A не обнаружена Вирус болезни Ауески 40,55 N/A не обнаружена К+ ND 25,40 соответствует К- N/A N/A соответствует

Все образцы, содержащие ДНК гетерологичных вирусов (КЧС, болезнь Ауески) дали отрицательные результаты LAMP-исследования с использованием предложенных последовательностей олигонуклеотидных праймеров.

Таким образом, заявленное изобретение может помочь в ветеринарной практике быстро и точно определить наличие ДНК вируса АЧС в отобранном биологическом материале, что поспособствует диагностике инфекционной болезни и быстрому принятию решений по ликвидации эпизоотического очага.

Литература

1. Бельтран Алькрудо, Д., Ариас, М., Гайардо, К., Крамер, С. и Пенрит, М.Л Африканская чума свиней: обнаружение и диагностика - Руководство для ветеринаров, ФАО, 2017. Руководство по животноводству и охране здоровья животных № 19. Рим. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Организации Объединенных Наций (ФАО). 104 стр.

2. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loopmediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12): E63. doi:10.1093/nar/28.12.e63. PMID: 10871386; PMCID: PMC102748.

3. Nagamine K, Hase T, Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes. 2002 Jun;16(3):223-9. doi: 10.1006/mcpr.2002.0415. PMID: 12144774.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="СИНТЕТИЧЕСКИЕ

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО

ЭКСПРЕСС-ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ

ПЕТЛЕВОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-09-12">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>123</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-09-09</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>123</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>123</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-09-09</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И.

Скрябина</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Educational Institution

of Higher Education &quot;Moscow State Academy of Veterinary Medicine

and Biotechnology - MVA named after K.I.

Skryabin&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ

ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ЭКСПРЕСС-ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВИРУСА

АФРИКАНСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ МЕТОДОМ ПЕТЛЕВОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ

АМПЛИФИКАЦИИ</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tccaaatggacttcccac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tttggagttgctccagaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tcctgcgatcacgaagttcaaaaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gctctgcgagatcttagagtgatttcgcgttgcttaaccct</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>54</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..54</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>African swine fever

virus</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acggaacaaaataatacggattttagtcttttgttttaggtgtttcact

tgaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней методом петлевой изотермической амплификации, комплементарных участку гена p10 вируса АЧС. Техническим результатом заявленного изобретения является высокая специфичность предлагаемых последовательностей олигонуклеотидных праймеров, а также повышение аналитической чувствительности LAMP-исследования. 3 табл., 2 пр.

Набор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления ДНК вируса африканской чумы свиней методом петлевой изотермической амплификации, комплементарных участку гена p10 вируса АЧС, имеющих следующий состав:

F3: TCCAAATGGACTTCCCAC

B3: TTTGGAGTTGCTCCAGAAC

LB: TCCTGCGATCACGAAGTTCAAAAAA

FIP: GCTCTGCGAGATCTTAGAGTGATTTCGCGTTGCTTAACCCT

BIP: ACGGAACAAAATAATACGGATTTTAGTCTTTTGTTTTAGGTGTTTCACTTGAAC.