СПОСОБ АДАПТАЦИИ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ К УСЛОВИЯМ EX VITRO Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 A01G7/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro и может быть использовано в специализированном промышленном растениеводстве и в биологических исследованиях.

Анатомические и физиологические особенности растений являются определяющими на стадии адаптации к условиям ex vitro.

Известен способ адаптации растений льна-долгунца, полученных в культуре in vitro, к выращиванию в условиях ex vitro, задачей которого является улучшение состава грунта путём применения бактерий-супрессоров. Недостатком способа является сложность воспроизведения и ограниченность применения из-за использования специфических бактерий-супрессоров (BY 11993 C1 2009.06.30 Республика Беларусь).

Известен способ адаптации растений в гидропонных установках «Минивит 0,35» с применением минерального питательного раствора для земляники, примулы и смородины, применение которого позволяет регенерантам наращивать корневую массу. (Вечернина Н.А., Таварткиладзе О.К., Бородуллина И.Д., Эрст А.А. Адаптация растений-регенерантов с использованием гидропоники // Известия Алтайского государственного университета. 2008. №3 (59). С. 7-10.).

Это решение наиболее близко к заявленному и принято за прототип.

К недостаткам прототипа относится бессубстратное выращивание растений, что при пересадке не позволяет обеспечить целостность корневой системы и снижает приживаемость растений.

Целью заявленного решения является создание способа адаптации растений-регенерантов из условий in vitro в нестерильные условия ex vitro для уменьшения влияния водного стресса и патогенной флоры на растения.

Технический результат - увеличение приживаемости растений в условиях ex vitro.

Это достигается тем, что способ адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro включает отбор растений-регенерантов, полученных в культуре тканей, подготовку субстрата, высадку растений-регенерантов в субстрат, при этом растения с отмытой корневой системой высаживают в рассадные кассеты, содержащие на дне каждой ячейки слой минеральной ваты и наполненные влажным кокосовым субстратом с добавлением перлита и вермикулита 3:1:1, кассеты помещены в вентилируемую камеру со светодиодными модулями полного спектра, обеспечивающими 16-часовой фотопериод с диапазоном длин волн 440-660 нм и 5-8 тыс. лк, в камере создают и поддерживают среду водно-дисперсионного тумана с размером капель 2-7 мкм при температуре 25-27 °С с интенсивностью подачи тумана в течение первых 3 суток 5 л/ч, каждые последующие 3 суток интенсивность подачи снижают на 1 л/ч, через 7 суток однократно вводят в искусственный туман суспензию системного фунгицида, на 12 сутки прекращают подачу тумана в камеру и проводят закаливание растений при температуре среды камеры и относительной влажности 60-65%; полив растений-регенерантов производят 1 раз в неделю питательным раствором с электропроводностью 0,6-1,0 мСм методом подтопления.

Способ осуществляется следующим образом: укоренённые нормально развитые растения-регенеранты отмывают от агаризированной питательной среды в растворе калия перманганата KMnO₄. В рассадные кассеты с ячейкой 90 см³ (486 шт/м²), помещают слой минеральной ваты и наполняют кокосовым субстратом с добавлением перлита и вермикулита (3:1:1). Кассеты помещают на подготовленный капиллярный мат. Укорененные отмытые растения-регенеранты высаживают во влажный субстрат. Древесные растения пересаживают без заглубления корневой шейки. Адаптацию растений-регенерантов осуществляют в условиях водно-дисперсионной среды, создаваемой мембранным генератором искусственного тумана (размер капли 2-7 мкм). Освещение растений-регенерантов осуществляют светодиодными модулями полного спектра, диапазон длин волн 440-660 нм, 5-8 тыс.лк, световой период 16 часов. Полив производят методом подтопления интервалом один раз в неделю с внесением комплексного удобрения для гидропонных систем. Уровень насыщенности растворимых солей в питательном растворе поддерживают электропроводность(ЕС) в пределах 0,6-1,0 мСм, кислотность (рН) - 5.8-6.0. Для поддержания тургора растений в течение 3 суток интенсивность подачи тумана наибольшая 5 л/ч. Для активации работы устьичного аппарата растений интенсивность подачи тумана периодически снижают через каждые последующие 3-е суток на 1 л/ч. Через 7 суток однократно вводят в искусственный туман системный фунгицид. Полученный мелкофракционный аэрозоль равномерно оседает на все поверхности и препятствует размножению плесневых грибов в среде камеры. Через 12 суток прекращают подачу тумана в камеру и проводят закаливание растений при температуре среды камеры при относительной влажности воздушной среды 60-65 %. С началом роста зачаточных листьев у 80 % растений этап адаптации считают завершённым. Снижение водного стресса у растений путём подачи в камеру искусственного тумана и пересадки во влажный субстрат со своевременной профилактикой грибных болезней позволяет ускорить процесс адаптации, сохранить апикальную почку и тургор растений, в результате растения раньше трогаются в рост и наращивают массу корневой системы.

Пример 1.

Растения in vitro укореняли в питательной среде с половинным составом минеральной основы стандартной питательной среды Murashige and Skoog medium (для Lonicera caerulea L. использовали Woody plant medium), сахарозы 30 г/л, без добавления регуляторов роста для устранения их остаточного влияния на развитие растений на этапе адаптации. В опыт выбирали растения с хорошо развитой корневой системой и соотношение вегетативной к корневой частей 1:1. Для каждого вида отбирали по 30 пробирок в 4-кратной повторности. Регенеранты имели 4-5 междоузлий и 2-3 корня. Растения пересаживали в рассадные кассеты с влажным кокосовым субстратом с добавлением перлита и вермикулита (3:1:1), на дно ячейки кассеты укладывали слой минеральной ваты 2 см для предотвращения вымывания субстрата и прорастания корней наружу. Проводили водоподготовку для приготовления питательного раствора. Питательный раствор для полива растений готовили на основе полностью растворимого комплексного удобрения «Мультимолинг» 0,3 %. Уровень насыщенности растворимых солей в питательном растворе поддерживали ЕС в пределах 0,6-1,0 мСм, кислотность (рН) - 5.8-6.0. Освещение обеспечивали светодиодными модулями FITO-LX33 с диапазоном длин волн 440-660 нм. Подачу водно-дисперсионного тумана осуществляли и регулировали генератором искусственного холодного тумана для поддержания температуры в камере 25-27 °С. Интенсивность подачи тумана поддерживали в течение первых 3-х суток 5 л/ч, последующие 3-е суток интенсивность подачи снижали на 1 л/ч, поддерживая 100%-ную влажность воздушно-газовой среды камеры. Через 7 суток однократно вводили в искусственный туман системный фунгицид «Фундазол» в концентрации 0,3 %. Полив растений осуществляли один раз в неделю, методом временного подтопления на 30 минут, что позволяет формировать корневую систему в объёме кассетной ячейки. Через 12 суток прекращают подачу тумана в камеру и проводят закаливание растений при температуре среды камеры при относительной влажности воздушной среды 60-65 %. С началом роста зачаточных листьев у 80 % растений этап адаптации считали завершённым и проводили учёт. Результаты опыта приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Приживаемость растений-регенерантов на этапе адаптации

Вид растений Количество адаптированных растений регенерантов, шт Среднее значение количества адаптированных растений, шт Доля адаптированных растений, % Период адаптации, сут. 1 2 3 4 Rubus arcticus L. «Astra» 30 30 29 30 29,8 99,2 14 Vitis vinifera L. 29 28 30 29 29,0 98,3 16 Lonicera kamtschatica Suvenir 30 29 30 29 29,5 99,2 18 Heuchera hybrida «Caramel» 30 30 30 29 29,8 99,2 14 Syringa chinensis Willd. 27 29 29 29 28,5 95,0 16 Populus tremula L. (клон 35) 28 28 29 29 28,5 95,0 16

Таблица 2 - Статистический анализ результатов опыта

Вид
Параметр Rubus arcticus L. (Astra) Vitis vinifera L Lonicera kamtschatica Suvenir Heuchera 'Caramel' Syringa chinensis Willd. Populus tremula L (клон 35) Среднее значение, % 99,2 98,3 99,2 99,2 95 95 Стандартное отклонение 0,5 0,82 0,58 0,5 1 0,58 Стандартная ошибка (среднего) 0,25 0,41 0,29 0,25 0,5 0,29 Коэффициент вариации, % 1,7 2,8 2,0 1,7 3,5 2,0 Минимум, %. 96,7 93,3 96,7 96,7 90 93,3 Максимум, % 100 100 100 100 96,7 96,7

Анализ данных таблиц 1 и 2 показывает, что предложенный способ адаптации растений-регенерантов позволяет сохранить от 90% до 100% растений, продолжительность этапа адаптации к нестерильным условиям составляет 14-18 дней, после чего растения-регенеранты доращивают в открытой вентилируемой камере и перемещают в теплицу.

Таким образом, результаты опыта подтверждают эффективность предложенного способа адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro в изолированных камерах и дает возможность получать посадочный материал с закрытой корневой системой до 486 шт с 1 м² полезной площади.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к cпособу адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro. Изобретение позволяет эффективно адаптировать растение к условиям ex vitro. 2 табл., 1 пр.

Способ адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro, включающий отбор растений-регенерантов, полученных в культуре тканей, подготовку субстрата, высадку растений-регенерантов в субстрат, отличающийся тем, что растения с отмытой корневой системой высаживают в рассадные кассеты, содержащие на дне каждой ячейки слой минеральной ваты и наполненные влажным кокосовым субстратом с добавлением перлита и вермикулита 3:1:1, кассеты помещены в вентилируемую камеру со светодиодными модулями полного спектра, обеспечивающими 16-часовой фотопериод с диапазоном длин волн 440-660 нм и 5-8 тыс. лк, в камере создают и поддерживают среду водно-дисперсионного тумана с размером капель 2-7 мкм при температуре 25-27°С с интенсивностью подачи тумана в течение первых 3 суток 5 л/ч, каждые последующие 3 суток интенсивность подачи снижают на 1 л/ч, через 7 суток однократно вводят в искусственный туман суспензию системного фунгицида, через 12 суток прекращают подачу тумана в камеру и проводят закаливание растений при температуре среды камеры и относительной влажности 60-65%; полив растений-регенерантов производят 1 раз в неделю питательным раствором с электропроводностью 0,6-1,0 мСм методом подтопления.