Способ выращивания брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.) Российский патент 2024 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, лесного хозяйства и биотехнологии и может быть использовано для ускоренного биологического получения оздоровленного посадочного материала путем микроклонального размножения с целью последующей закладки ягодных плантаций.

Известны классические способы получения посадочного материала брусники: ее возможно размножать как семенами, так и вегетативно-корневищными черенками, одревесневшими и зелеными стеблевыми черенками, парциальными кустами с частью корневищ, редко - отрезками корневищ. Недостатками этих способов являются: маленький выход посадочного материала, сезонность в работе (ограниченные сроки заготовки материала), необходимость поддержания в течение 4 недель высокой влажности для адаптации черенков, что приводит к увеличению затрат на получение большого объема посадочного материала и удорожанию технологии (Holloway P. Rooting of Lingonberry, Vaccinium vitis-idaea, Stem Cuttings // Plant. Propagator. 1985. Vol. 31. No. 4. P. 7-9; Сидорович E.A., Рубан H.H., Шерстеникина A.B. Интродукция и опыт выращивания клюквы крупноплодной, голубики высокорослой и брусники // Обзорная информация. Минск: БелНИИНТИ, 1991. С. 1-53; Тяк Г.В., Черкасов А.Ф., Алтухова С.А. Опыт выращивания брусники в условиях Костромской области // Вопросы использования и восстановления древесных и недревесных ресурсов леса южной тайги. М., 1998. С. 50-63; Морозов О.В. Культура брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idea L): проблемы и перспективы: моногр. Минск: Белорусская наука, 2008. 150 с; Тяк Г.В., Курлович Л.Е., Макаров С.С. и др. Размножение перспективных гибридных форм брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.) // Вестник БГСХА им. В.Р. Филиппова. 2022. №1 (66). С. 113-118).

Однако для получения чистосортного и здорового посадочного материала, освобожденного от вирусной и грибной инфекции, используется метод клонального микроразмножения растений в культуре in vitro, который позволяет в кратчайшие сроки получить большое количество жизнеспособных растений, предназначенных как для садоводов, так и для промышленного выращивания (Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 232 с.; Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-Пресс, 1999. 160 с.; Шевелуха B.C. и др. Сельскохозяйственная биотехнология и биоинженерия: учеб. М.: URSS, 2015.715 с.).

Известен способ клонального микроразмножения брусники (патент BY 991 C1, А01 Н 4/00, 15.12.1995. Сидорович Е.А., Кутас Н.Н. Способ размножения Vaccinium vitis-idaea L. in vitro) с использованием модифицированной питательной среды Андерсона с добавлением 2-изопентениладенина и индилилуксусной кислоты, однако данный способ направлен на получение каллусовой культуры. При этом имеет место специфическая реакция растения на введение в состав среды тех или иных регуляторов роста в зависимости от сорта, что приводит к наличию положительного эффекта только на какой-либо одной культуре или сорте. В свою очередь это способствует снижению ценности разработки и приводит к потере ее универсальности для других сортов (Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение интродуцированных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной в культуре in vitro в связи с генотипами // Вестник Нац. акад. навук Беларусi Сер. бiял. навук. 1998. №3. С. 5-9; Божидай Т.Н., Кухарчик Н.В. Влияние генотипа и ауксина на процесс ризогенеза ex vitro сортов брусники обыкновенной (Vaccinium vitis-idaea L.) // Биотехнология в плодоводстве: мат-лы Междунар. науч. конф. (Самохваловичи, 13-17 июня 2016 г.). Самохваловичи, 2016. С. 99-101).

К наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков относятся способы клонального микроразмножения брусники с использованием питательной среды по прописи Андерсона (1975) с добавлением регуляторов роста цитокининовой, ауксиновой и фенольной природы (Gajdosova A., Ostrolucka M.G., Libiakova G., Ondruskova E. Protocol for Micropropagation of Vaccinium vitis-idaea L. // Protocols for Micropropagation of Woody Trees and Fruits / M. Jain, H. Haggman (eds.). 2007. P. 457-464). Однако к недостаткам данного способа можно отнести недостаточно высокий коэффициент размножения на этапе пролиферации побегов и недостаточный уровень укореняемости и развития корневой и надземной систем растений на этапе укоренения в культуре in vitro. Это приводит к снижению выхода посадочного материала и увеличению цепочки технологического цикла его производства.

Заявляемое изобретение направлено на решение проблемы: повышение коэффициента размножения и процента укоренения микропобегов; снижение затрат на получение стандартного посадочного материала; увеличение урожайности.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении коэффициента размножения растений брусники при снижении трудозатрат на выращивание саженцев.

Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата в способе выращивания брусники, включающем посадку экспланта на питательную среду, введение в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, в соответствии с предложенным техническим решением:

- экспланты стерилизуют в растворе AgNO₃ 0,2% в течение 10 мин;

- в качестве источника углеводов в питательной среде используют глюкозу в количестве 20,0 г/л питательной среды;

- на этапе собственно микроразмножения в питательную среду Андерсона добавляют Цитодеф в концентрации 0,1 мг/л;

- на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют индолилмасляную кислоту 1,0 мг/л и березовый уголь 5,0 г/л;

- на этапе адаптации растений in vitro к почвенным условиям ex vitro используют субстрат из смеси торфа переходного типа и сфагнового очеса в соотношении 3:1.

Преимущества предложенного способа, поясняющие сущность изобретения, представлены в табл. 1-5.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа

Примеры конкретного выполнения

Стерилизация растительного материала. Для стерилизации стеблей, почек, и других фрагментов растений, предназначенных для вычленения экспланта, применяют водные растворы 5% перекиси водорода, 0,2% нитрата серебра, 5% дезинфицирующего средства Лизоформин 3000, 0,01% дезинфицирующего средства Ника-2, дезинфицирующего средства Доместос в разведении 1:3. Перед тем, как приступить к стерилизации стебли растений тщательно моют щеткой с мылом в теплой проточной воде, промывают бидистиллированной водой и отпускают на 5 секунд в абсолютный спирт, а затем на 5-15 минут - в основной стерилизующий раствор.

Этап введения в культуру in vitro. Свободный от вирусов посадочной материал для клонального микроразмножения растений можно получить методом культуры изолированных апикальных меристем, которые являются наиболее здоровой, свободной от вирусов частью растений и представляют собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мкр) и шириной 0,25 мм. На этапе введения в культуру эксплант помещают на модифицированную питательную среду Андерсона (табл. 1) с добавлением регулятора роста Цитодеф в концентрации 0,1 мг/л. Полученные из апикальных меристем растения-регенеранты размножают методом микрочеренкования.

В результате исследований выявлено, что на этапе введения в культуру in vitro брусники наиболее эффективными основным стерилизующим агентом оказался 0,2% раствор нитрата серебра при экспозиции 10 мин, где выявлена максимальная жизнеспособность эксплантов (90%) (табл. 2).

Клональное микроразмножение путем черенкования. При культивировании микрорастений на питательной среде с добавлением цитокинина 6-БАП происходит снятие апикального доминирования, что приводит к активации развития пазушных меристем, которые в дальнейшем развиваются в микропобеги. Полученные адвентивные микропобеги отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на новой питательной среде. Для увеличения коэффициента размножения применяют микрочеренкование - деление побегов на черенки, содержащих одну или две пазушные почки.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения брусники на микрочеренки с 2-3 междоузлиями и пересадить на питательную среду 1/2 WPM с добавлением регулятора роста Цитодеф 0,1 мг/л. Уровень рН среды должен быть 4,0...4,5. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, 16-часовой фотопериод, температура +25°С и влажность воздуха 70%. Культивирование проводят в течение 25-30 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Установлено, что на этапе собственно микроразмножения наибольшие значения суммарной длины микропобегов брусники (в среднем 6,3 см) выявлены на питательной среде Андерсона с добавлением регулятора роста Цитодеф в концентрации 0,1 мг/л (табл. 3).

Процесс корнеобразования in vitro. На данном этапе необходимо создать наиболее благоприятный состав питательной среды, обеспечивающий получение высокого процента укорененных микропобегов. Для этого на последнем этапе клонального микроразмножения уменьшают концентрацию минеральных солей, сахарозы, а также исключают из состава питательной среды цитокинины. Основным регуляторным фактором корнеобразования является присутствие в составе питательной среды ауксинов. Наиболее часто для этого используют ИМК или ИУК в концентрациях от 1,0 до 5,0 мг/л. Выбор гормона и его концентрации зависит от видовых и сортовых особенностей исследуемых растений. Укоренившиеся микропобеги высаживают в условия грунта для адаптации.

В условиях ламинар-бокса нужно достать исходные растения из культурального сосуда и положить их на стерильный матрасик. При помощи скальпеля и пинцета разделить растения на микрочеренки длиной 1,0-1,5 см с двумя междоузлиями, удаляя нижние листочки и пересадить их на питательную среду, содержащую ауксин ИМК в концентрации 0,5-1,0 мг/л. После этого горлышко сосуда необходимо обжечь над пламенем спиртовки, закрыть пищевой пленкой и поставить в световую комнату, где поддерживается освещение 2500-3000 лк, фотопериод 16/8 ч, температура +25°С и относительная влажность воздуха 80%. Культивирование проводят в течение 30-50 суток. Полученный в конце пассажа биоматериал вновь используют для дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Выявлено, что на этапе укоренения микропобегов in vitro брусники наибольшие значения суммарной длины корней (14,2 см) отмечены на питательной среде Андерсона с добавлением ИМК в концентрации 1,0 мг/л и березового угля в количестве 5,0 г/л (табл. 4).

Адаптация растений in vitro к нестерильным условиям ex vitro. Для адаптации пробирочных растений в почвогрунт самым благоприятным временем года считается период со 2-й декады апреля. Тогда растения с хорошо развитой корневой системой с 2-3 листьями способны адаптироваться к условиям ex vitro. Почвенный субстрат предварительно проливают 5% раствором перманганата калия и оставляют на 14 суток в темном месте. Для лесных ягодных культур в качестве субстрата используют верховой или переходный торф и песок (3:1) и мульчируют сверху мхом сфагнумом, так как мох является хорошим антисептиком и влагоудержителем. Приготовленный субстрат раскладывают в кассеты или микропарники, в которые пересаживают растения in vitro. Температура должна быть +25°С, влажность - 80…90%. Для успешного и 100% приживаемости целесообразно использовать туманообразующую установку (как правило, используется в производственных масштабах). Для небольших партий растений целесообразно применять микропарники или использовать индивидуальное закрытие растений полиэтиленовыми стаканчиками на 14-20 суток, которые потом убирают. По мере роста растений, их пересаживают в более объемные емкости со свежим субстратом. Дальнейшее их выращивание проходит по принятой агротехнике для данного вида растения.

Растения in vitro с хорошо развитой корневой системой вынимают из пробирки пинцетом. Корни промывают в 1% раствором перманганата калия (слабо-розовый цвет) для того, чтобы впоследствии не развивалась патогенная микрофлора. Растения пересадить в кассеты с почвогрунтом, прижать почву и полить водой. После чего кассеты поставить в условия освещения (5000 лк). Каждый день необходимо опрыскивать растения водой в течение 1 недели. Через 10 суток провести первую ревизию растений.

Отмечено, что состав субстрата по-разному влиял на процент приживаемости, длину побегов и количество листьев брусники. Наилучший показатель приживаемости (100%) растений составил в варианте использования смеси торфа переходного типа и сфагнового очеса в соотношении 3:1, тогда как на переходном торфе данный показатель составил 80%, смеси торфа с песком 3:1 - 75%, на смеси торфа с перлитом 3:1 - 65% (табл. 5).

Технико-экономические преимущества или иная эффективность изобретения по сравнению с прототипом

Данная технология получения посадочного материала брусники (Vaccinium vitis-idaea L.) может быть использована при массовом получении оздоровленного посадочного материала с последующей закладкой маточников, питомников и сортоучастков. Предложенный способ предусматривает использование в качестве эксплантов меристемы растений, которые пересаживаются на модифицированную питательную среду с добавлением глюкозы, березового угля, а также цитокининов (Цитодеф) и ауксинов (ИМК). Данный способ позволяет повысить коэффициент размножения растений брусники в 5 и более раз, ее адаптацию в нестерильных условиях с применением субстрата из смеси торфа переходного типа и сфагнового очеса (3:1) до 100%, а также снизить в 2 раза трудозатраты при выращивании саженцев брусники.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ выращивания брусники обыкновенной. Способ включает посадку экспланта на питательную среду, введение экспланта в культуру in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, отличающееся тем, что экспланты стерилизуют в растворе нитрата серебра 0,2% в течение 10 минут, в качестве источника углеводов в питательной среде используют глюкозу в количестве 20,0 г/л питательной среды, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют Цитодеф в концентрации 0,1 мг/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют ИМК в концентрации 1,0 мг/л и березовый уголь в количестве 5,0 г/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси торфа переходного типа и сфагнового очеса в соотношении 3:1. Изобретение обеспечит повышение коэффициента размножения растений брусники обыкновенной при снижении трудозатрат на получение саженцев. 5 табл.

Способ выращивания брусники обыкновенной, включающий посадку экспланта на питательную среду, укоренение в культуре in vitro для получения растений-регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков в культуре in vitro на питательной среде, содержащей углеводы, последующую адаптацию растений к нестерильным условиям ex vitro, отличающийся тем, что экспланты стерилизуют в растворе нитрата серебра 0,2% в течение 10 минут, в качестве источника углеводов в питательной среде используют глюкозу в количестве 20,0 г/л питательной среды, на этапе собственно микроразмножения в питательную среду добавляют Цитодеф в концентрации 0,1 мг/л, на этапе укоренения микропобегов в культуре in vitro в питательную среду добавляют ИМК в концентрации 1,0 мг/л и березовый уголь в количестве 5,0 г/л, адаптируют растения in vitro к почвенным условиям ex vitro, используя субстрат из смеси торфа переходного типа и сфагнового очеса в соотношении 3:1.