Биологически активная добавка, фармацевтически приемлемый носитель, содержащий биологически активную добавку, и способ применения биологически активной добавки Российский патент 2024 года по МПК A61K35/30 A61K36/23 A61K36/28 A61K38/07 A61P1/16 

Группа изобретений относится к области пищевых продуктов, в частности композициям и способам их применения, причем указанные композиции представляют собой комплекс растительных и аминокислотных нутриентов, которые могут быть рекомендованы для употребления в целях профилактики разнородных стресс-факторов: профессиональных, психоэмоциональных, возрастозависимых, а также больными вирусными гепатитами в ходе реабилитации.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Из уровня техники известно фармакологическое средство, обладающее геропротекторной активностью, а также способ профилактики преждевременного старения [RU 2157233, МПК A61K 38/07, C07K 5/10, опубл. 10.10.2000].

Фармакологическое средство содержит активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, при этом в качестве активного начала содержит эффективное количество тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly или его солей.

Способ профилактики преждевременного старения заключается во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество тетрапептида L-Ala-L-Glu-L-Asp-Gly или его солей по аминогруппе, например ацетат, гидрохлорид, оксалат, или его солей по карбоксильным группам, например солей натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния, а также органических и неорганических катионов, например аммония, триэтиламмония в дозе 0,01 - 100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Из уровня техники известно, что вид травянистых растений рода Дудник Angelica keiskei обладает комплексом лечебных свойств, а также способностью увеличивать продолжительность жизни [https://ru.wikipedia.org/wiki/Angelica_keiskei].

Из указанного выше источника также известно, что Angelica keiskei проявляет цитотоксические, антидиабетические, антиоксидантные, противовоспалительные, антигипертензивные и антимикробные свойства в исследованиях in vitro. Обнаружено, что выделенные из растения Angelica keiskei халконы 4-гидроксидеррицин и ксантоангелол, повышали поглощение глюкозы адипоцитами и проявляли инсулиноподобную активность. Флавоноид 4,4′-диметоксихалькон из вышеуказанного растения обладает антивозрастными свойствами, что обусловлено индуцируемой им аутофагией.

Из уровня техники известно, что плоды расторопши пятнистой Silybum marianum нашли широкое применение как гепатопротекторные, антиоксидантные и холеретические лекарственные средства [С.В. Цаприлова, Р.А. Родионова, РАСТОРОПША ПЯТНИСТАЯ: ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ, СТАНДАРТИЗАЦИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ, Вестник фармации №3 (41) 2008]

Из указанного выше источника также известно проявление расторопшей пятнистой гепатопротективной активности при лечении и профилактике заболеваний и повреждений печени. На основе плодов расторопши пятнистой разработана целая серия лекарственных 9 средств: карсил, легалон, силибор, силимар и др. Выпускается большое количество биологически активных добавок. Эффективность лекарственных средств на их основе базируется на нескольких механизмах действия. Силибин стимулирует активность полимеразы (РНК) в клеточном ядре и через систему РНК в клетках печени стимулирует рибосомальный синтез протеина. Это в свою очередь стимулирует восстановительную способность печени и образование гепатоцитов. Флаволигнаны оказывают стабилизирующее действие на мембраны печеночных клеток, предотвращают проникновение гепатотоксинов во внутреннюю часть клетки, затрудняя выход растворенных составных частей клеток.

С учетом вышеизложенного представляет интерес создание композиции, обладающей комплексным действием, обусловленным фармакологическими свойствами упомянутых выше компонентов.

Наиболее близким к заявленному изобретению по технической сущности является композиция биологически активных веществ, обладающая геропротекторным действием, а также способ комплексной коррекции возрастных изменений гормонального баланса, функций эпифиза и антиоксидантного статуса [RU 2464816, МПК A23L 1/30, A23L 1/305, A61K 36/894, A61K 31/205, A61K 38/05, A61K 38/07, A61K 38/08, A61P 5/00, A61K 31/381, A61P 5/38, опубл. 27.10.2012].

Композиция содержит синергически действующие компоненты - концентрат растительных сапонинов, композицию пептидов Ala-Glu-Asp-Gly/Ala-His и комплекс ацетил-L-карнитин и альфа-липоевая кислота при следующем соотношении компонентов, мас.ч.:

концентрат растительных сапонинов 0,5-5,0 композиция пептидов Ala-Glu-Asp-Gly/Ala-His 0,001-0,01 комплекс ацетил-L-карнитин и альфа-липоевая
кислота 10,0-25,0

Способ включает пероральное введение композиции биологически активных веществ по 140-300 мг в сутки в течение 28-30 дней, затем перерыв 30 дней и повторный курс. Данный цикл принимать в течение 3-5 лет.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническим результатом является создание композиции, проявляющей гепатопротекторные и стресс-протекторные свойства с достижением синергетического эффекта, выражающегося в том, что эффективность композиции при ее применении существенно превышает эффективность компонентов, входящих в ее состав и взятых по отдельности, например, при проведении монотерапии, а также композиции, помещенной в капсулу, и способа применения композиции.

Технический результат достигается тем, что предложена группа изобретений, включающая композицию, обладающую гепатопротекторным и стресс-протекторным свойствами, композицию, помещенную в капсулу, а также способ применения композиции.

Композиция, обладающая гепатопротекторным и стресс-протекторным свойствами, содержит растительные и пептидный компоненты, при этом растительные компоненты представляют собой этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum и этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi, а пептидный компонент представляет собой лиофилизат гипоталамического экстракта, полученного из животных и содержащего тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly в количестве ≥80% мас. %, при следующем содержании компонентов, мас. %:

этиловый спиртоовой экстракт из семян Silybum marianum 16,7-83,2 этиловый спиртоовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi 16,7-83,2 лиофилизат гипоталамического экстракта 0,01-0,1

Существует вариант, в котором животные представляют собой крупный рогатый скот в возрасте 6-24 месяцев.

Композиция указанного выше состава, помещенная в капсулу из говяжьего желатина, на поверхность которой нанесено энтеросолюбильное полимерное покрытие, при этом содержание композиции в капсуле составляет 100-320 мг.

Существует вариант, в котором энтеросолюбильное полимерное покрытие выбрано из группы, включающей карбоксиметилцелюлозу и альгинат натрия.

Способ применения композиции указанного выше состава, в котором проводят цикл, включающий прием композиции перорально 1 раз в день в количестве 200-640 мг в утренние часы за 30 минут до приема пищи в течение 30 дней с последующим перерывом в приеме в течение 30 дней, после чего возобновляют цикл.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сухие экстракты из Silybum marianum, Angelica keiskei koidzumi получали путем реперколяции растительного сырья в 80% этиловом спирте, при температуре 60°С, с последующей отгонкой спирта при 78°С.

Способ приготовления лиофилизата гипоталамического экстракта раскрыт в источнике [RU944191, МПК A61K 35/30, опубл. 15.08.1994]. Гипоталамическую, включая эпифиз, область мозга животных обрабатывают н-гексаном при отношении н-гексана к сырью (8 - 10) : 1 при температуре 1-4°С, затем измельчают, экстрагируют 3%-ным раствором уксусной кислоты в присутствии хлористого цинка, экстракт центрифугируют, полученную надосадочную жидкость обрабатывают н-гексаном при температуре (-3) - (-5)°С, промывают гексаном при той же температуре, далее осадок растворяют 1%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением маннита при соотношении 1:3. Полученный раствор стерилизуют доступным образом при температуре 37°С, замораживают при температуре (-38)°С и лиофилизируют, путем высушивания в вакуумной камере до образования однородного пористого субстрата. Блоки субстрата измельчают до фракции 0 - 0,1 мм. Гипоталамический экстракт может быть получен из крупного рогатого скота в возрасте 6-24 месяцев.

Изучение химических свойств лиофилизата, выделенного их гипоталамо-эпифизарной области мозга, методом химического аминокислотного анализа позволило получить следующие данные. Содержание аминокислот в лиофилизате: аланин (Ala), глутаминовая кислота (Glu), аспарагин (Asp), глицин (Gly) в сумме превышает 80% от массы лиофилизата. В лиофилизате также содержаться аминокислоты: валин (Val), аспарагиновая кислота (Asn), лейцин (Leu) в сумме 15% от массы. Остальные аминокислоты в следовых количествах.

Структуру основного вещества в сравнении с эталоном Ala-Glu-Asp-Gly определяли методом ультраэффективной жидкостной хроматографии на колонке Waters ZQ2000, скорость потока 1,5 л/мин. Детекция при 392 нм, сканирование 220-825 нм. Содержание основного тетрапетида Ala-Glu-Asp-Gly составило более 80%.

Композицию готовили путем смешивания навесок этиловых спиртовых экстрактов из семян Silybum marianum, Angelica keiskei koidzumi, а также лиофилизата гипоталамического экстракта в смесителе сухих сред и просеивали при 35°С. Композиция представляет собой сухой, гомогенный порошок от желтого до коричневого цвета.

Композицию помещали в капсулу из говяжьего желатина, на поверхность которой нанесено энтеросолюбильное полимерное покрытие. Полимерное покрытие получали путем нанесения на поверхность капсулы 5-% раствора карбоксиметилцелюлозы или альгината натрия для придания ей устойчивости к кислотной среде и ферментам желудка человека в течение, по меньшей мере, 30 минут. Капсула содержит от 100 до 320 мг композиции.

Вышеописанным способом получены различные составы композиции, помещенные в капсулы, имеющие различное содержание композиции и энтеросолюбильное полимерное покрытие (см. Таблицу 1).

Таблица 1.

№ примера Содержание компонента, мас. % Содержание композиции в капсуле, мг Энтеросолюбильное полимерное покрытие Silybum marianum Angelica keiskei koidzum Лиофилизат
гипоталамического экстракта 1 17,49 82,50 0,01 100 карбоксиметилцелюлоза 2 82,50 17,49 0,01 100 карбоксиметилцелюлоза 3 83,2 16,75 0,05 150 альгинат натрия 4 16,75 83,2 0,05 150 альгинат натрия 5 16,7 83,2 0,1 320 карбоксиметилцелюлоза 6 83,2 16,7 0,1 320 альгинат натрия

Ниже приведен способ применения композиции.

Пациент М., 50 лет. Медицинский работник. В анамнезе алкоголизм 1-2а ст. (бытовой тип), профессиональный контакт с кровью носителей гепатита. Вирусный гепатит С (сер. 1С) более 15 лет. Хронический гепатит (с признаками печеночной дисфункции с 2015 г.), цирроз печени 1-2 ст. по классификации Чайлда-Пью, гипертоническая болезнь 2 ст., токсическая энцефалопатия, хронический панкреатит, компенсированная портальная гипертензия, спленомегалия, расширение печеночных ворот портальной вены, варикоз вен нижних конечностей, геморрой, функциональная диспепсия и метеоризм.

Истинная полицитемия (диагноз с 2016 г.), паноцитемия (эритремия, тромбоцитемия, лимфоцитоз) с гистологическим и генетическим подтверждением.

Лечение: диета, исключен алкоголь и табак, регулярная кинезитерапия и лечебная физкультура. С 2015 г. прием противовирусных препаратов (софосбувир, дакладасвир 9 мес) до отрицательных значений anti-HCV (ИФА), RNA HCV, прием препаратов ПЭГ-Интерферона-а2 пожизненно.

С 2016 г. применение композиции согласно примерам 1-3, приведенным в таблице 1, путем проведения цикла, включающий прием композиции перорально 1 раз в день в количестве 200-640 мг в утренние часы за 30 минут до приема пищи в течение 30 дней с последующим перерывом в приеме в течение 30 дней, после чего возобновление цикл.В результате приема композиции в течение первого года отмечали прогрессивное исчезновение признаков портальной гипертензии, в т.ч. варикоза вен нижних конечностей, спленомегалии, диспепсии, синтетическую функцию печени, регресс признаков энцефалопатии, существенное увеличение физической и интеллектуальной активности.

В течение 2-4 лет наблюдали полное восстановление функции печени по косвенным признакам (пищеварение, психический статус, физическая активность, знаки портальной гипертензии) и биохимическим критериям.

В 2023 г. после 8 лет приема композиции выполнен анализ на установление биологического возраста пациента. Пациент при паспортном возрасте 50 лет, получил оценку биологического возраста 38 лет (см. Таблицу 2). Методика оценки: Aging.AI 3.0: Полина Мамошина, Кирилл Кочетов, Евгений Путин, Франко Кортезе, Александр Алипер, Вон-Сук Ли, Сун-Мин Ан, Ли Ун, Нил Скьодт, Ольга Ковальчук, Мортен Шейбье-Кнудсен Алексей Жаворонков; «Специфичные для населения биомаркеры старения человека: исследование больших данных с использованием популяций пациентов Южной Кореи, Канады и Восточной Европы», Журналы геронтологии: Серия A, gly005; https://doi.org/10.1093/gerona/gly005).

Таблица 2.

№ Показатели Статус 2015 год.
После терапии Hep.С. Перед началом приема композиции Статус 2023 год.
После приема композиции 1 2 3 4 Общий анализ крови 1 Эритроциты, 10х¹²/л 8,3 4,9 2 Hb, г/л 195,2 150,0 3 Тромбокрит, % 65,2 46,4 4 Тромбоциты, 10х⁹/л 619 295 5 Лейкоциты, 10х⁹/л 9,5 4,2 6 Эритропоэтин, мМЕ/мл <1,0 32,0

Продолжение Таблицы 2 1 2 3 4 Биохимия 7 Альбумин, г/л 46 49 8 Глюкоза, ммоль/л 4,6 5,6 9 Креатинин, мкмоль/л 70,6 113,2 10 Общий билирубин, мкмоль/л 53,3 15,2 11 Не связанный билирубин, мкмоль/л 47,2 9,7 12 АЛС, Е/л 86,0 21,2 13 АСТ, Е/л 73 12 14 Холестерин, ммоль/л 2,19 4,28 15 АПТВ/АЧТВ, сек 36,8 26,7 16 Фибриноген, г/л 1,8 2,5 Оценка по классификации Чайлда-Пью (цирроз) 17 Баллы 6-7 класс А-В 0 Ультразвуковое исследование печени 18 Размер печени Увеличен Нормальный 19 Размер воротной вены, мм 15,4 12,4 20 Эхогенная плотность Повышена Нормальная Оценка возраста Пациента 21 Паспортный возраст 42 г 50 г 22 Биологический возраст по модели
https://doi.org/10.1093/gerona/gly005 нет 38 г

Исследование гепатопротекторных свойств композиции проводили в эксперименте на крысах.

Для изучения гепатопротекторного действия изолированного и комбинированного воздействия элементов композиции создавали модель острого токсического гепатита на 15 белых, нелинейных крысах, самках, массой 180-200 г. Крысам группы наблюдения внутрижелудочно вводили 1,2-дихлорэтан в дозе 0,2 мл/кг (для формирования острого токсического гепатита). Группа контроля состояла из 20 животных, которым вводили исключительно ксенобиотик. С целью оценки эффективности, формировали четыре группы.

Опытной первой группе внутрижелудочно вводили этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг (см. Таблицы 3, 4, опыт 1 Silybum).

Опытной второй внутрижелудочно вводили этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг (см. Таблицы 3, 4, опыт 2 Angelica).

Опытной третьей группе внутрижелудочно вводили лиофилизат гипоталамического экстракта в расчетной дозе 0,03-0,3 мг/кг (см. Таблицы 3, 4, опыт 3 Peptidi).

Опытной четвертой группе внутрижелудочно вводили композицию, содержащую этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг, этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг, лиофилизат гипоталамического экстракта в расчетной дозе 0,03-0,3 мг/кг, при условии, что содержание компонентов составляет, мас. %:

этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum 16,7-83,2 этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi 16,7-83,2 лиофилизат гипоталамического экстракта 0,01-0,1

(см. Таблицы 3, 4, опыт 4 Композиция).

Композиция была помещена в оболочку из говяжьего желатина, на поверхность которой нанесено энтеросолюбильное полимерное покрытие, в частности, карбоксиметилцелюлоза или альгинат натрия (см. Таблицы 3, 4, опыт 4 Композиция).

С целью оценки эффективности изучали биохимический состав крови, кортизол в течение 7, 30, 60 дней.

Таблица 3. Динамика гематологических и биохимических показатели крови крыс в эксперименте

Показатели Старт 7 сутки 30 сутки 60 сутки 1 2 3 4 5 Общий анализ крови Эритроциты, 10⁶/ml Контроль 8,45±0,83 9,03±1,13 7,91±1,69 6,33±1,97 Опыт 1 Silybum 8,51±0,91 8,6±1,21 8,14±1,37 7,7±1,41 Опыт 2 Angelica 8,60±0,75 8,7±1,09 8,05±1,23 6,6±1,72 Опыт 3 Peptidi 8,43±0,84 8,9±1,17 8,32±1,27 7,2±1,61 Опыт 4 Композиция 8,61±0,87 8,63±1,07 8,95±1,14 8,33±0,79 Лейкоциты, 10³/ml Контроль 9,95±3,49 39,95±9,13 28,95±4,11 7,95±3,41 Опыт 1 Silybum 9,87±4,11 29,13±6,33 22,30±4,93 18,17±4,31

Продолжение Таблицы 3 1 2 3 4 5 Опыт 2 Angelica 10,07±3,38 41,31±9,31 37,43±5,53 23,07±4,53 Опыт 3 Peptidi 9,79±4,08 36,34±7,34 28,33±5,37 21,23±3,97 Опыт 4 Композиция 10,01±3,31 21,35±6,05* 19,33±6,31* 12,05±2,93* Биохимия крови Эритропоэтин, mU/ml Контроль 21,1±9,42 43,3±11,32 55,7±18,15 37,0±9,53 Опыт 1 Silybum 21,3±11,31 38,7±12,04 45,2±13,31 33,3±9,37 Опыт 2 Angelica 20,9±8,93 39,5±11,97 50,1±11,93 41,1±11,43 Опыт 3 Peptidi 21,7±9,18 40,3±10,73 47,1±11,31 33,7±8,73 Опыт 4 Композиция 22,0±9,42 39,1±10,12 37,05±5,32 29,3±9,07 С-реактивный протеин, μg/mL Контроль 620,9±136,0 16764,3±3671,9 11176,2±2447,9 9313,5± 2039,9 Опыт 1 Silybum 671,4 ±143,0 12997,1±3071,3 6887,1±1977,0 5331,3±1771,9 Опыт 2 Angelica 702,3±167,1 15221±3317,05 9911,7±2113,1 6239,7±1799,4 Опыт 3 Peptidi 685,1±112,0 11305±2977,0 6871,3±1731,3 5944,5±2101,3 Опыт 4 Композиция 625,0±132,2 10625,8±2248,7 4625,5±978,8* 2875,0±608,3* Общий билирубин, µmol/L Контроль 6,4±1,2 59,9±11,9 56,0±11,4 34,8±6,9 Опыт 1 Silybum 6,8±1,9 45,7±9,7 44,1±10,3 28,4±11,5 Опыт 2 Angelica 6,5±1,3 51,3±10,3 54,3±13,7 33,1±9,7 Опыт 3 Peptidi 6,5±1,5 49,1±10,1 48,1±13,1 30,0±8,9 Опыт 4 Композиция 6,7±1,3 43,2±8,7 38,4±7,8 18,9±2,8 Свободный билирубин, µmol/L Контроль 0,31±0,06 3,18±0,66 2,70±0,35 1,70±0,35 Опыт 1 Silybum 0,29±0,05 2,23±0,71 1,5±0,43 1,2±0,71 Опыт 2 Angelica 0,33±0,08 2,99±0,51 2,2±0,57 1,6±0,45 Опыт 3 Peptidi 0,30±0,06 2,55±0,63 2,3±0,31 1,1±0,31 Опыт 4 Композиция 0,31±0,05 1,56±0,33 1,71±0,36 0,88±0,18 * АЛТ, IU/L Контроль 60,95±9,94 1285,2±240,4 670,45±109,36 304,75±49,71 Опыт 1 Silybum 64,79±10,11 890,03±198,33 440,05±108,43 204,11±57,31 Опыт 2 Angelica 59,33±9,95 1073,21±270,18 630,53±183,71 288,83±58,09 Опыт 3 Peptidi 62,11±10,75 1009,92±310,11 510,19±119,97 226,03±73,17 Опыт 4 Композиция 61,20±10,23 673,2±112,53 370,5±59,53 183,6±30,69 АСТ, IU/L Контроль 55,08±19,94 1420,4±381,33 719,2±59,84 415,5 ± 79,59 Опыт 1 Silybum 52,13±21,43 883,07±217,83 530,47±47,99 280,03±119,11 Опыт 2 Angelica 55,84±19,20 1479,00±299,33 701,73±66,30 409,33±70,55 Опыт 3 Peptidi 58,35±23,75 1220,23±253,75 693,23±53,05 387,74±78,45 Опыт 4 Композиция 55,35±17,5 926,4±104,1 425,4±36,4* 230,44 ± 67,6* Холестерин, mmol/L Контроль 2,26±0,63 1,28 ± 0,34 1,03±0,24 0,77±0,23 Опыт 1 Silybum 2,05±0,64 1,38±0,39 1,29±0,33 1,18±0,81 Опыт 2 Angelica 1,87±0,71 1,21±0,21 1,37±0,13 0,99±0,43 Опыт 3 Peptidi 2,33±1,05 1,29±0,73 1,44±0,57 1,17±0,15 Опыт 4 Композиция 1,94±0,75 1,39±0,52 1,49±0,59 1,32±0,47 Кортизол, µg/dL Контроль 21,95±5,79 125,43±34,47 14,29±4,35 10,42±3,06 Опыт 1 Silybum 21,30±7,37 140,56±37,31 62,71±17,11 17,81±5,71 Опыт 2 Angelica 19,33±6,71 152,13±39,11 21,29±8,27 12,73±3,90 Опыт 3 Peptidi 19,75±8,33 139,91±51,17 33,77±11,07 13,33±5,76 Опыт 4 Композиция 18,43±4,79 113,70± 38,16 27,03±5,14 * 24,40±4,05 * Гибель животных в течение 60 дней наблюдения Контроль - 0 1 1 Опыт 1 Silybum - 0 0 0 Опыт 2 Angelica - 0 0 1

Продолжение Таблицы 3 1 2 3 4 5 Опыт 3 Peptidi - 0 1 0 Опыт 4 Композиция - 0 0 0 Значения, отмеченные «*», представляют достоверные отличия между группой контроля и группой, получавшей композицию, исходя из условия р<0,05, где p - индекс достоверности (p-уровень), с помощью которого можно было оценить, был эксперимент удачным или нет.
В случае, если p≤0,05, получен статистически значимый результат.

Таблица 4. Сравнительная оценка эффективности применения монотерапии и композиции по данным биохимических параметров крови крыс на 60 сутки эксперимента

Показатели Старт 60 сутки Отличия на 60 сутки:
моно / три 1 2 3 4 Эритроциты, 10⁶/ml Опыт 1 Silybum 8,51±0,91 7,7±1,41 7,16±1,58 Опыт 2 Angelica 8,60±0,75 6,6±1,72 Опыт 3 Peptidi 8,43±0,84 7,2±1,61 Опыт 4 Композиция 8,61±0,87 8,33±0,79 8,33±0,79
лучше на 16% Лейкоциты, 10³/ml Опыт 1 Silybum 9,87±4,11 18,17±4,31 20,82±4,27 Опыт 2 Angelica 10,07±3,38 23,07±4,53 Опыт 3 Peptidi 9,79±4,08 21,23±3,97 Опыт 4 Композиция 10,01±3,31 12,05±2,93* 12,05±2,93*
лучше на 43% Биохимия крови Эритропоэтин, mU/ml Опыт 1 Silybum 21,3±11,31 33,3±9,37 33,0±9,91 Опыт 2 Angelica 20,9±8,93 41,1±11,43 Опыт 3 Peptidi 21,7±9,18 33,7±8,73 Опыт 4 Композиция 22,0±9,42 29,3±9,07 29,3±9,07
лучше на 13% С-реактивный протеин, μg/mL Опыт 1 Silybum 671,4±143,0 5331,3±1771,9 5838,5±1891,2 Опыт 2 Angelica 702,3±167,1 6239,7±1799,4 Опыт 3 Peptidi 685,1±112,0 5944,5±2101,3 Опыт 4 Композиция 625,0±132,2 2875,0±608,3 2875,0±608,3
лучше на 48% Общий билирубин, µmol/L Опыт 1 Silybum 6,8±1,9 28,4±11,5 30,5±10,0 Опыт 2 Angelica 6,5±1,3 33,1±9,7 Опыт 3 Peptidi 6,5±1,5 30,0±8,9 Опыт 4 Композиция 6,7±1,3 18,9±2,8 18,9±2,8
лучше на 39% Свободный билирубин,
µmol/L Опыт 1 Silybum 0,29±0,05 1,2±0,71 1,3±0,51 Опыт 2 Angelica 0,33±0,08 1,6±0,45 Опыт 3 Peptidi 0,30±0,06 1,1±0,31

Продолжение Таблицы 4 1 2 3 4 Опыт 4 Композиция 0,31±0,05 0,88±0,18 0,88±0,18
лучше на 32% АЛТ, IU/L Опыт 1 Silybum 64,79±10,11 204,11±57,31 239,99±63,25 Опыт 2 Angelica 59,33±9,95 288,83±58,09 Опыт 3 Peptidi 62,11±10,75 226,03±73,17 Опыт 4 Композиция 61,20±10,23 183,6±30,69 183,6± 30,69
лучше на 34% АСТ, IU/L Опыт 1 Silybum 52,13±21,43 280,03±119,11 359,03±91,88 Опыт 2 Angelica 55,84±19,20 409,33±70,55 Опыт 3 Peptidi 58,35±23,75 387,74±78,45 Опыт 4 Композиция 55,35±17,5 230,44±67,6 230,44 ± 67,6
лучше на 36% Холестерин, mmol/L Опыт 1 Silybum 2,05±0,64 1,18±0,81 1,11±0,53 Опыт 2 Angelica 1,87±0,71 0,99±0,43 Опыт 3 Peptidi 2,33±1,05 1,17±0,15 Опыт 4 Композиция 1,94±0,75 1,32±0,47 1,32±0,47
лучше на 18% Опыт 1 Silybum 21,30±7,37 17,81±5,71 14,62±5,22 Опыт 2 Angelica 19,33±6,71 12,73±3,90 Опыт 3 Peptidi 19,75±8,33 13,33±5,76 Опыт 4 Композиция 18,43±4,79 24,40±4,05 24,40±4,05
лучше на 67% Гибель животных Опыт 1 Silybum - 0 10% Опыт 2 Angelica - 1 Опыт 3 Peptidi - 1 Опыт 4 Композиция - 0 0

В результате проведенных исследований получены объективные данные, характерные для острого токсического гепатита. В контрольной группе крыс, без лечения, количество эритроцитов на 60 сутки сократилось в 1,3 раза (p>0,05), при увеличении эритропоэтина в 1,7-2,6 раз, что свидетельствует об угнетении эритропоэза. В опытных группах, где использовали монотерапию растительными экстрактами или лиофилизатом, реакция на введение ксенобиотика была менее выражена, чем в контрольной группе (р>0,05). В группе крыс, которые получали комбинацию нутриентов, снижение эритроцитов было менее выражено (р>0,05), чем в группах с мнотерапией.

У крыс контрольной группы на 60 сутки фиксировали лейкопению как признак цитотоксического поражения. Напротив, у животных, получавших монотерапию растительными экстрактами или лиофилизатом, фиксировали лейкоцитоз, средний уровень повышения составил 20,82%. В группе, получавшей композицию, число лейкоцитов достоверно было ниже (р<0,05), чем в группах с монотерапией и достоверно не отличалось от исходных значений.

Уровень С-реактивного протеина на 30, 60 сутки в опытной группе, где применяли комплекс экстрактов, его уровень был в 2,4-3,2 раза меньше, чем в группах с монопрепаратами и контрольной группе, что говорит о менее выраженном системном воспалительном ответе.

Токсический гепатит в контрольной группе, в группах с монотерапией растительными экстрактами или лиофилизатом, был более выражен, чем в группе с применением композиции, что подтверждается показателями детоксицирующей, синтетической функции печени. Так, уровень общего билирубина в контрольной группе за период от начала исследования (старта) до его окончания (60 сутки) вырос в несколько раз (р<0,05). В контрольной группе наблюдали критическое повышение уровня свободного/неконьюгированного билирубина, в отличие от опытной группы, получавшей композицию.

Об остром гепатотоксическом действии дихлорэтана свидетельствует ферментопатия. Так уровень АЛТ и АСТ значительно повышался в пике на 7 день у всех групп животных. Однако, на 60 сутки у животных, которые получали композицию, восстановление нормальных значений АЛТ и АСТ происходило значительно быстрее (p<0,05), в отличие у крыс, получавших монотерапию растительными экстрактами или лиофилизатом.

Уровень кортизола у животных всех групп повышался, что говорит о сильной стресс-реакции на ксенобиотик. При этом уровень кортизола у группы крыс, получавшей композиции, на 30 и 60 сутки был в 1,9 и 2,3 больше (p<0,05), чем у контрольных животных, что косвенно говорит о благоприятном течении стресс-реакции и сохранении адаптивного ответа на химическую травму. У животных контрольной группы на 60 сутки уровень кортизола, напротив, снижался, что может свидетельствовать об угнетении функции надпочечников. Изменения уровня гормона стресса у групп, в которых применяли монотерапию, имели характер, мало отличавшийся от группы контроля.

Прямо о негативном течение восстановительного периода после химической травмы у крыс контрольной группы и группы с вариантом монотерапии, говорит гибель двух животных, в отличие от группы, получавшей композицию, где все животные выжили в течение 60 дней.

При сопоставлении средних значений, оцениваемых показателей на 60 сутки эксперимента, отмечали, что использование композиции в отличие от мототерапии растительными экстрактами или лиофилизатом, сопровождалось позитивными изменениями, характеризующими гомеостаз, процесс восстановления животных после отравления: число эритроцитов было на 16% больше; лейкоцитов на 43% меньше; эритропоэтина на 13% меньше; С-реактивного протеина на 48% меньше; общего билирубина на 39% меньше; свободного билирубина на 32% меньше; АЛТ на 34% меньше; АСТ на 36% меньше; холестерина на 18% больше; кортизола на 67% больше. Также в группе, получавшей композицию, гибели животных не было, в отличие от группы контроля и в группах, где использовали Angelica и Peptidi.

Результаты исследования биологически активных веществ при лечении острого токсического гепатита вызванного 1,2-дихлорэтаном, позволяют расставить эффективность растительных экстрактов и лиофилизата в последовательности: Angelica<Peptidi<Silybum. Использование растительных экстрактов и лиофилизата в варианте монотерапии достоверно уступает эффективности применения композиции, где: Angelica<Peptidi<Silybum< Композиция. Эффективность применения композиции во всех рассматриваемых аспектах была больше, чем в случае монотерапии растительными экстрактами и лиофилизатом пептидов.

Достоверные отличия между группами животных, получавших монотерапию, либо композицию, свидетельствуют о наличии взаимного усиления (синергетического эффекта) гепатопротекторной активности компонентов, входящих в состав композиции.

Исследование стресс-протекторного эффекта композиции проводили в эксперименте на мышах.

В эксперименте изучали эффект этиловых спиртовых экстрактов из семян Silybum marianum, Angelica keiskei koidzumi, а также лиофилизата гипоталамического экстракта как стресс-протекторов, в варианте монотерапии, а также их применения в составе композиции. Результат стресс-протекции оценивали по интегральному показателю: средняя продолжительность жизни белых мышей.

Стресс фактор формировали за счет помещения контрольной и опытных групп мышей в сухожаровой шкаф на 10 минут, с температурой 55°С, в режиме 5 дней опыт, 2 дня пауза. Контрольная группа состояла из 20 небеременных самок белых нелинейных мышей массой 110-180 г. Опытная группа состояла из 20 самок, белых нелинейных мышей. Всего брали четыре группы мышей:

- мыши опытной группы №1 в составе суточного рациона получали этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг (см. Таблицы 5, 6, опыт 1 Silybum);

- мыши опытной группы №2 в составе суточного рациона получали этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг (см. Таблицы 5, 6, опыт 2 Angelica);

- мыши опытной группы №3 в составе суточного рациона получали лиофилизат гипоталамического экстракта в расчетной дозе 0,03-0,3 мг/кг (см. Таблицы 5, 6, опыт 3 Peptidi);

мыши опытной группы № 4 в составе суточного рациона получали композицию, содержащую этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг, этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi в расчетной дозе 50-249,97 мг/кг, лиофилизат гипоталамического экстракта в расчетной дозе 0,03-0,3 мг/кг, при условии, что содержание компонентов составляет, мас. %:

этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum 16,7-83,2 этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi 16,7-83,2 лиофилизат гипоталамического экстракта 0,01-0,1

(см. Таблицы 5, 6, опыт 4 Композиция).

Композиция была помещена в оболочку из говяжьего желатина, на поверхность которой нанесено энтеросолюбильное полимерное покрытие, в частности, карбоксиметилцелюлоза или альгинат натрия.

Мышей кормили два раза в день, утром и днем, из расчета 2,5 г сухого корма/сутки. Каждое животное находилось в отдельном секторе и полностью поедало выделенный корм.

Оценку стресс-протекторного воздействия в контрольной и опытных группах проводили по: 1) ориентировочно-пространственной реакции животных в методе «открытое поле» на 120 день; 2) продолжительности жизни мышей в результате ненасильственной смерти. Методика «открытое поле» позволяет оценить сохранность когнитивных функций у грызунов. Продолжительность жизни позволяет оценить резистентность организма взрослых животных в условиях хронического, надпорогового, температурного стресса.

Таблица 5. Исследование стресс-факторов в опытах 1, 2, 3, 4 и контроле

Показатели Контроль Опыт Отличие контроль-опыт 1 2 3 4 Опыт 1 Silybum Ориентировочно-познавательный комплекс реакций. Двигательная активность. Перемещение животных по секторам на 120 день, количество/10 мин Старт 0 день 60,5±5,8 59,8±5,1 p>0,05 Финиш 120 день 11,4±1,2 16,6±1,5 p<0,05 Исследовательское поведение.
Вставание животных на задние лапы на 120 день, количество/10 мин Старт 0 день 25,7±2,5 25,5±3,1 p>0,05 Финиш 120 день 2,9±0,38 8,0±1,29 p<0,05 Средняя продолжительность жизни Продолжение Таблицы 5 1 2 3 4 Сутки 147,3±10,9 156,5±10,9 p>0,05 Опыт 2 Angelica Ориентировочно-познавательный комплекс реакций. Двигательная активность.
Перемещение животных по секторам на 120 день, количество/10 мин Старт 0 день 60,5±5,8 58,6±6,7 p>0,05 Финиш 120 день 11,4±1,2 15,6±1,5 p>0,05 Исследовательское поведение.
Вставание животных на задние лапы на 120 день, количество/10 мин Старт 0 день 25,7±2,5 25,2±2,8 p>0,05 Финиш 120 день 2,9±0,38 6,8±1,24 p<0,05 Средняя продолжительность жизни Сутки 147,3±10,9 168,0±9,5 p>0,05 Опыт 3 Peptidi Ориентировочно-познавательный комплекс реакций. Двигательная активность.
Перемещение животных по секторам на 120 день, количество/10 мин Старт 0 день 60,5±5,8 59,2±4,6 p>0,05 Финиш 120 день 11,4±1,2 23,4±2,2 p<0,05 Исследовательское поведение.
Вставание животных на задние лапы на 120 день, количество/10 мин Старт 0 день 25,7±2,5 25,6±2,3 p>0,05 Финиш 120 день 2,9±0,38 8,3±1,36 p<0,05 Средняя продолжительность жизни Сутки 147,3±10,9 179,3±10,8 p<0,05

Опыт 4 Композиция Ориентировочно-познавательный комплекс реакций. Двигательная активность.
Перемещение животных по секторам на 120 день, количество/10 мин 1 Старт 0 день 60,5±5,8 59,6±6,9 p>0,05 2 Финиш 120 день 11,4±1,2 29,8±3,2 p<0,05 Исследовательское поведение.
Вставание животных на задние лапы на 120 день, количество/10 мин 3 Старт 0 день 25,7±2,5 25,2±1,7 p>0,05 4 Финиш 120 день 2,9±0,38 13,6±1,31 p<0,05 Средняя продолжительность жизни 5 Сутки 147,3±10,9 231,1±11,7 p<0,05

Таблица 6. Сопоставление значений стресс-факторов в опытах 1, 2, 3, 4

Группы животных Результат в опытной группе Среднее значение Отличие
моно/композиция 1 2 3 4 Ориентировочно-познавательный комплекс реакций. Двигательная активность.
Перемещение животных по секторам на 120 день, количество/10 мин Опыт 1 Silybum 16,6±1,5 18,5±1,76 p<0,05
на 63%больше Опыт 2 Angelicа 15,6±1,5 Опыт 3 Peptidi 23,4±2,2 Опыт 4 Композиция 29,8±3,2 29,8±3,2 Исследовательское поведение.
Вставание животных на задние лапы на 120 день, количество/10 мин Опыт 1 Silybum 8,0±1,29 7,7±1,30 p<0,05
на 76% больше Опыт 2 Angelicа 6,8±1,24 Опыт 3 Peptidi 8,3±1,36 Опыт 4 Композиция 13,6±1,31 13,6±1,31 Средняя продолжительность жизни Продолжение Таблицы 6 1 2 3 4 Опыт 1 Silybum 156,5±10,9 167,9±10,42 p<0,05
на 36% больше Опыт 2 Angelicа 168,0±9,5 Опыт 3 Peptidi 179,3±10,8 Опыт 4 Композиция 231,1±11,7 229,45±10,8

Температурный хронический стресс является мощным индуктором системных воспалительных реакций у млекопитающих и служит хорошей моделью для исследования стресс-протекторных свойств у различных биологически-активных веществ. Температурный стресс вызывает как активацию хронических очагов воспаления, так и быстрое истощение механизмов регуляции гомеостаза. В результате, у лабораторных животных наблюдается снижение массы тела, угнетение поисковых и адаптационных рефлексов, развиваются дистрофии паренхиматозных органов и желез внутренней секреции, стремительно деградирует миокард и интима сосудов, наблюдается бактериемия за счет нарушения барьерной функции кишечника. Срок жизни животных, помещенных в экстремальные условия существования существенно, в 2-4 раза, сокращается, как за счет снижения внешней адаптации, так и за счет развития дистрофических процессов в витальных системах организма.

Использование в моноварианте этилового спиртового экстракта из семян Silybum marianum показало позитивное влияние на комплекс ориентировочно-познавательных реакций и исследовательское поведение животных в условиях хронического стресса. Но, не сопровождалось при этом достоверным увеличением жизни мышей (р>0,05). Использование в моноварианте этилового спиртового экстракта из семян Angelica keiskei koidzumi для коррекции теплового стресса сопровождалось умеренным сохранением когнитивных функций у мышей на 120 сутки эксперимента, но сдвиги не были выраженными (р>0,05). Коррекция нарушений исследовательски-ориентировочных реакций, возникающих при температурном стрессе, с помощью лиофилизата гипоталамического экстракта позитивно влияло на грызунов опытной группы (р<0,05).

Лучшую, выраженную сохранность когнитивных функций животных в эксперименте фиксировали у мышей, получавших композицию. Так, среднее значение двигательной активности в группе, получавшей композицию, было достоверно больше (на 63% больше, при p<0,05), чем средняя величина в группах с монотерапией растительными экстрактами и лиофилизатом. Животные, получавшие композицию на 120 день наблюдений, вставали на задние лапы, в среднем, на 76% чаще (p<0,01), чем животные, получавшие только один из растительных экстрактов или лиофилизат. Важно, что продолжительность жизни мышей, получавших композицию, была на 36% больше (p<0,05), чем у животных, получавших монотерапию. В сравнении с контрольной группой, мыши, получавшие композицию, жили на 56% дольше (p<0,05).

Таким образом в хроническом эксперименте, при создании температурного стресса опытные мыши, получавшие композицию, адаптировались, сохраняли поисково-ориентировочные рефлексы значительно лучше, жили на 56% дольше, чем мыши контрольной группы и животные, получавшие только один из растительных экстрактов или лиофилизат.

Достоверные отличия между группами животных, получавших монотерапию, либо композицию, свидетельствуют о наличии взаимного усиления (синергетического эффекта) стресс-протекторной активности компонентов, входящих в состав композиции.

Таким образом, показана возможность осуществления заявленной группой изобретений указанного технического результата.

Группа изобретений относится к области фармацевтической промышленности, а именно к композиции, обладающей гепатопротекторными и стресс-протекторными свойствами, и к способу ее применения. Композиция, обладающая гепатопротекторным и стресс-протекторным свойствами, содержащая растительные и пептидный компоненты, отличающаяся тем, что растительные компоненты представляют собой этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum и этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi, а пептидный компонент представляет собой лиофилизат гипоталамического экстракта, полученного из животных и содержащего тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly в количестве ≥80% мас. %, при следующем содержании компонентов, мас. %: этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum 16,7-83,2; этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi 16,7-83,2; лиофилизат гипоталамического экстракта 0,01-0,1. Способ применения указанной композиции для проявления гепатопротекторных и стресс-протекторных свойств, в котором проводят цикл, включающий прием композиции перорально 1 раз в день в количестве 200-640 мг в утренние часы за 30 минут до приема пищи в течение 30 дней с последующим перерывом в приеме в течение 30 дней, после чего возобновляют цикл. Использование группы изобретений обеспечивает создание композиции, проявляющей гепатопротекторные и стресс-протекторные свойства с достижением синергетического эффекта, выражающегося в том, что эффективность композиции при ее применении существенно превышает эффективность компонентов, входящих в ее состав и взятых по отдельности, например, при проведении монотерапии, а также создание фармацевтически приемлемого носителя, выполненного в виде капсулы, содержащей указанную композицию. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 табл., 1 пр.

1. Композиция, обладающая гепатопротекторным и стресс-протекторным свойствами, содержащая растительные и пептидный компоненты, отличающаяся тем, что растительные компоненты представляют собой этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum и этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi, а пептидный компонент представляет собой лиофилизат гипоталамического экстракта, полученного из животных и содержащего тетрапептид Ala-Glu-Asp-Gly в количестве ≥80% мас. %, при следующем содержании компонентов, мас. %:

этиловый спиртовой экстракт из семян Silybum marianum 16,7-83,2 этиловый спиртовой экстракт из семян Angelica keiskei koidzumi 16,7-83,2 лиофилизат гипоталамического экстракта 0,01-0,1

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что животные представляют собой крупный рогатый скот в возрасте 6-24 месяцев.

3. Композиция по любому из пп. 1, 2, где композиция помещена в капсулу из говяжьего желатина, на поверхность которой нанесено энтеросолюбильное полимерное покрытие, при этом содержание композиции в капсуле составляет 100-320 мг.

4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное полимерное покрытие выбрано из группы, включающей карбоксиметилцелюлозу и альгинат натрия.

5. Способ применения композиции по пп. 1, 2, для проявления гепатопротекторных и стресс-протекторных свойств, в котором проводят цикл, включающий прием композиции перорально 1 раз в день в количестве 200-640 мг в утренние часы за 30 минут до приема пищи в течение 30 дней с последующим перерывом в приеме в течение 30 дней, после чего возобновляют цикл.