БИОКОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИТОКСИЧЕСКИМ И АНТИАПОПТОЗНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ ДОБАВКА НА ЕЕ ОСНОВЕ Российский патент 2008 года по МПК A61K36/28 A61K31/683 

Предлагаемое изобретение относится к области фармакологии и биотехнологии, точнее касается композиции, обладающей антитоксическим и антиапоптозным действием на основе смеси флаволигнанов (силибин, силидианин и силикристин) из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), смеси очищенных липидов, а также глицина. Композиция может дополнительно содержать незаменимые L-аминокислоты в различных комбинациях, а также некоторые растительные экстракты.

В связи с наблюдаемой тенденцией к устойчивому росту различных токсических и онкогенных воздействий окружающей среды как инфекционной, так и неинфекционной природы, ростом клеточных и молекулярных поражений органов и тканей, таких как воспаления различного генеза, аллергии, токсические гепатопоражения (алкогольные, пищевые, лекарственные, соединениями тяжелых металлов) и др., особую актуальность приобретает поиск надежных и эффективных терапевтических и протекторных антитоксических средств.

В последнее время в связи с ухудшением общей экологической обстановки и увеличением количества «вредных» производств увеличивается доля патологических процессов, основывающихся на усилении апоптоза, которое вызвано действием внешних апоптогенных факторов. Апоптоз, или программируемая клеточная гибель, - это активная форма гибели клетки, являющаяся результатом реализации ее генетической программы или ответом на внешние факторы и воздействия. Хотя апоптоз - нормальный процесс, он может быть патологически усилен при действии ряда экзогенных факторов, таких как оксидативный стресс, аноксия, ионизирующее излучение, токсиканты. На первом месте среди факторов, стимулирующих апоптоз, находится ионизирующая радиация. Аналогичный эффект дают многие химиотерапевтические препараты, некоторые нестандартные пищевые продукты, а также гормоны, прежде всего глюкокортикоиды, широко применяемые при лечении различных заболеваний. Источником апоптогенных факторов служит внешняя среда. Нормальное окружение человека практически не является источником апоптогенных воздействий, однако при формировании экологического неблагополучия во внешней среде накапливаются факторы, моделирующие или вызывающие развитие апоптоза. Наиболее ярким примером агрессивных факторов, загрязняющих среду, которые способны вызвать гибель клеток путем индукции апоптоза, относятся случайные выбросы диоксана в атмосферу, не редко повышенная солнечная активность, форсмажорные выбросы различных вредных химических производств.

Известны биопрепараты, обладающие протекторными свойствами в отношении антитоксического действия на клетки печени, такие как «Легален» и «Карсил», в которых биологически активными веществами являются флаволигнаны, полученные из расторошпи пятнистой. Однако недостатками этих препаратов являются ограниченность их действия, поскольку должна сопровождаться приемом других препаратов - противовоспалительных, желчегонных, иммуномодулирующих и др., низкая биодоступность, связанная с их плохой водорастворимостью, невозможность антиапоптозной защиты.

В связи с этим для увеличения терапевтической эффективности флаволигнанов предпринимались попытки создания более эффективных многокомпонентных фармкомпозиций.

Известна биологически активная композиция с гепатопротекторными свойствами, используемая для снижения алкогольной токсичности (Патент РФ 2201247). Наряду с флаволигнанами предлагаемая авторами композиция содержит большое число дополнительных компонентов: экстракт и порошок корня куджу, корни одуванчика и желтокорня канадского, листья алоэ, Готу Кола, корень горечавки, пантотеновую и альфа-липоевую кислоты, N-ацетилцистеин и L-глутатион. Несмотря на то, что предложенная авторами композиция улучшает метаболические процессы, обладает протекторным действием и способствует укреплению всего организма в целом, нельзя не отметить и ее существенных недостатков - многокомпонентность состава существенно усложняет процедуру получения препарата, оказывает негативное влияние на его стоимость и может оказаться фактором риска для проявления побочных эффектов при применении препарата у отдельных пациентов.

Близким к настоящему изобретению является патент РФ 2252029 (20.05.2005 г.). Изобретение касается оздоровительно-профилактической композиции, оказывающей благотворное действие на гепатобилиарную систему и включающей соевый фосфолипидный комплекс и экстракты из различных растений. На основе данной композиции предлагается биологически активная добавка к пище, в которой дополнительно могут содержаться вспомогательные фармацевтические носители, такие как лактоза и стеарат магния, витамины, кофермент Q10 и микроэлементы цинк и селен. Однако мишенью действия данной композиции в организме человека являются в основном клетки печени, в то время как при длительном проживании в загрязненных промышленных регионах страдает не только гепатобилиарная система, но и мозг, сердечно-сосудистая и иммунная системы, нарушаются процессы метаболизма, увеличивается вероятность появления аллергических, онкологических и других заболеваний, ослабевает система клеточкой защиты в целом.

Технической задачей настоящего изобретения являлось создание композиции, обладающей как усиленным антитоксическим, так и выраженным антиапоптозным действием, сочетающей компоненты с различными мишенями действия и обеспечивающей антитоксическое и антиапоптозное действие не только на клетки печени и органов пищеварения, но и на другие уязвимые для токсического воздействия клеточные системы организма. Это особенно необходимо людям, подверженным воздействию различных экологически неблагоприятных, а также канцерогенных факторов,

Поставленная задача достигается тем, что создана композиция, обладающая антитоксическим и антиапоптозным действием, которая содержит смесь флаволигнанов (силибин, силидианин и силикристин) из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), смесь очищенных липидов, включающая триглицериды (около 10%) и остальное - диглицериды, в частности фосфатидилхолины, содержащие остатки насыщенных жирных кислот (20-25%), одноненасыщенных жирных кислот (6-15%), двухненасыщенных жирных кислот (55-65%), трехненасыщенных жирных кислот (5-8%), а также глицин при следующем соотношении компонентов (вес.%): смесь флаволигнанов - 20,0-70,0, глицин - 2,0-8,0, смесь липидов - 25,0-72,0. Композиция дополнительно содержит одну или несколько незаменимых L-аминокислот, выбранных из группы: валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, треонин, лизин в дозе 0,5-2,0 вес.% каждой. Композиция дополнительно может содержать один или несколько растительных экстрактов, выбранных из группы: экстракт почек и листьев березы повислой (Betula pendula Roth), экстракт почек и листьев березы пушистой (Betula pubescens Ehrh), экстракт цветов пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.), экстракт корня лопуха (Arctium Tomentosum Schrank) в дозе 2,0-50,0 вес.% для каждого.

Флавоноиды (силибин, силикристин и силидианин) из расторопши пятнистой оказывают гепатопротекторное и регенерирующее действие на клетки печени, усиливают ее детоксицирующую и внешнесекреторную функциональную активность. Липиды (в том числе триглицериды) являются естественными компонентами клеточных мембран организма. Прием липидных препаратов при токсических поражениях печени, в том числе лекарственных, космических, а также поражениях соединениями тяжелых металлов и радионуклидами, способствует стабилизации и регенерации структуры клеточных мембран печени, стабилизирует состав желчи, препятствует образованию желчных камней и нормализует работу гепатобилиарной системы в целом. Липиды положительно влияют также на сердечно-сосудистую систему. Глицин снимает стресс, неврозы, нормализует психоэмоциональное состояние, повышает работоспособность мозга. Глицин, так же, как и незаменимые L-аминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, треонин, лизин), стимулируют метаболические процессы в организме, ослабленном длительным приемом алкоголя или воздействием неблагоприятных условий окружающей среды. Дополнительные компоненты предлагаемого средства - растительные экстракты почек и листьев березы, цветов пижмы и корня лопуха, обладая мочегонным и желчегонным действием, способствуют очищению организма от токсических веществ.

В основе изобретения лежит новая композиция, обладающая антитоксическими и антиапоптозными свойствами, отличающаяся эмпирически подобранным сочетанием компонентов, оказывающих комплексное профилактическое, укрепляющее и оздоравливающее воздействие на пораженный организм в целом, в том числе и высокотоксическими и канцерогенными факторами. Композиция и биологическая добавка к пище на ее основе могут применяться как дополнительное поддерживающее средство при гепатитах различной природы, токсических поражениях печени и почек, включая лекарственные, соединениями тяжелых металлов и радионуклидами, алкоголизме и алкогольной болезни печени. Композиция и биологическая добавка к пище на ее основе могут быть также рекомендованы как профилактические средства для людей, проживающих в условиях неблагоприятной экологической обстановки, в промышленных регионах, в особенности для работающих на вредных производствах. К заболеваниям, при которых в реализации основного поражения решающая роль принадлежит апоптозу, относятся различные виды поражений клеток защитных органов, таких как эпителиальные или клетки печени. Наиболее распространенными токсикантами, вызывающими апоптоз клеток, например печени, являются четыреххлористый углерод, хлороформ, бромбензол, фосфор, афлатоксины, диметилнитрозамин, пуромицин, алкалоиды пирролизидинового ряда, бериллий. Некоторые из этих веществ использовали для исследования антиапоптозной активности композиции.

Композицию получают следующим образом: в смеситель последовательно загружают компоненты получаемой композиции в необходимых количествах в следующем порядке - 1) смесь флаволигнанов из расторопши, 2) глицин, 3) смесь липидов, 4) аминокислоты, выбранные из перечисленных выше (по необходимости), 5) растительные экстракты, выбранные из перечисленных выше (по необходимости). После добавления каждого последующего компонента производят тщательное перемешивание.

Изобретение иллюстрируется примерами:

Пример 1.

Композиция характеризуется следующим основным составом компонентов (вес.%):

Флаволигнаны (содержащие в весовых %: силибинин 80-85%, силидианин - 10%, силикристин - остальное)- 20,0-70,0Глицин- 2,0-8,0Смесь очищенных липидов- 25,0-72,0.

Пример 2

Композиция содержит основной состав компонентов, как в примере 1, но при этом дополнительно содержит следующие (вес.%):

Валин- 0,5-2,0Лейцин- 0,5-2,0Изолейцин- 0,5-2,0Метионин- 0,5-2,0Фенилаланин- 0,5-2,0Триптофан- 0,5-2,0Треонин- 0,5-2,0Лизин- 0,5-2,0.

Пример 3

Композиция может содержать основные компоненты, как указано в примере 1, кроме того, дополнительные компоненты как в примере 2, а также может содержать один или несколько нижеприведенных компонентов в любом сочетании (вес.%):

Экстракт почек и листьев березы- 2,0-50,0Экстракт цветов пижмы- 2,0-50,0Экстракт корня лопуха- 2,0-50,0.

Другим объектом настоящего изобретения является биологическая добавка на основе описанной композиции.

Сущность ее состоит в том, что создана биологическая добавка к пище, обладающая антитоксическим и антиапоптозным действием, содержащая композицию, охарактеризованную выше, и разрешенные к применению фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, используемые для формирования таблеток из указанной композиции, а также твердых или мягких желатиновых капсул.

В качестве вспомогательных веществ биологическая добавка к пище на основе предлагаемой композиции может содержать крахмал кукурузный или картофельный, тальк, сахарозу, лактозу или другой фармацевтически приемлемый сахар, стеарат магния или кальция, лактаты и другие компоненты в количестве, необходимом получения сухой смеси для наполнения желатиновых капсул или для формирования таблетки.

Свойства композиции иллюстрируется следующими примерами.

Пример 4. Исследование антитоксической активности композиции на модели острого токсического гепатита.

Исследование антитоксической активности композиции проводили на стандартной модели острого токсического гепатита у мышей. В опытах использованы белые беспородные мыши в половозрелом возрасте.

Композицию, описанную в примере 1, вводили внутрижелудочно с помощью зонда в виде суспензии в дозе 100 мг/кг. В качестве токсического средства использовали раствор четыреххлористого углерода или парацетамол (модель лекарственного гепатита). Одной группе животных композицию вводили ежедневно в течение 6 суток до введения токсина; другой экспериментальной группе композицию вначале вводили за 1 ч до введения токсина, а затем еще трижды с интервалом в 2 дня. В качестве препарата сравнения использовали «Карсил», который вводили по аналогичным схемам в соответствующих дозах. Контрольным животным вводили только токсин (четыреххлористый углерод или парацетамол) и растворитель в эквиобъемных дозах. Через сутки после последнего введения препаратов животных декапитировали и проводили вскрытие и изучение биохимических показателей крови. Активность аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ) определяли по методу Райтмана-Френкеля. Общий белок определяли с помощью биуретового реактива. Относительная масса печени у контрольных животных с гепатитом была увеличена по сравнению со здоровыми интактными животными на 36.7-48.1%; у экспериментальных животных этот показатель составлял от 24.6 до 27.1% (29.6-31.2% при приеме «Карсила») (см. таблицу 1). Таким образом, степень выраженности антитоксического действия у животных, получавших заявленную композицию, заметно усилилась в сравнении с контролем. Исследование активности трансаминаз в сыворотке крови показало, что у контрольных мышей уровни аланинаминотрансферазы (АЛАТ) и аспартатаминотрансферазы (АСАТ) были повышены по сравнению с интактными животными на 413-451% и 203-218%; у животных, получавших заявляемую композицию, описанную в примере 2, эти показатели снижались до 229-263% и 54-75% соответственно (280% и 83% при приеме «Карсила») (таблица 1), что также подтверждает усиление антитоксического действия нашей композиции практически на 25-30% в сравнении с контролем. Уровень общего белка в сыворотке крови больных животных снижался до 60-64% (100% - у интактных здоровых животных), в то время как применение композиции положительно влияло на уровень белка в крови, увеличивая этот показатель до 81-87% (74-78% у животных, получавших «Карсил») (см. таблицу 1). При применении исследуемой композиции активность щелочной фосфатазы была снижена на 49% по сравнению с контролем.

В качестве дополнительного контроля при проведении экспериментов использовали также смеси соевых фосфолипидов и экстракта расторопши (что соответствовало композиции, предлагаемой в РФ 2252029 (прототип)) (данные приведены в таблице 1).

Таким образом, применение предлагаемой композиции положительно влияет на обменные, метаболические, холеретические и дезинтоксикационные функции клеток, в частности печени, как в случае профилактики, так и лечения острого токсикоза. Эффект от композиции в обоих случаях превышал эффект от препарата сравнения «Карсил» и композиции-прототипа.

Пример 5. Исследование антитоксической активности заявляемой композиции на модели алкогольной интоксикации экспериментальных животных (таблица 2).

Действие нашей композиции исследовали на мышах, подвергшихся форсированной алкогольной интоксикации. Этанол давали экспериментальным животным в течение шести суток, после чего в течение 3 дней вводили внутрижелудочно исследуемый препарат, описанный в примере 1. Состояние интоксикации печени алкоголем характеризовали содержанием малонового диальдегида. Малоновый диальдегид определяли в гомогенатах печени спектрофотометрическим методом (Esterbaner G., Bichem. J., 1982, 208, 129-134). Уровень малонового диальдегида у животных, получавших только этанол, увеличивался в 3,6 раза по сравнению со здоровыми интактными мышами; применение заявленной композиции значительно снижало этот показатель, что наглядно показано в таблице 2. Применение композиции-прототипа приводило лишь к незначительному снижению уровня малонового диальдегида у алкоголизированных мышей (таблица 2). Проведенные исследования двигательной активности показали, что, в отличие от прототипа, препарат также нормализует поведенческие реакции в постинтоксикационный период.

Таким образом, предлагаемая композиция улучшает метаболические процессы в организме и способствует уменьшению токсического влияния четыреххлористого углерода, алкоголя и других токсикантов.

Пример 6. Исследование антиапоптозного действия заявляемой композиции.

Наличие апоптоза паренхиматозных клеток экспериментальных мышей с модельным острым токсическим воздействием на паренхиматозные клетки различных органов (почки, печень, эпителий кишечника и др.) с последующим определением методом электрофореза. Характерным признаком апоптоза клетки является формирование разрывов ДНК и ее деградация, при этом на электрофореграмме наблюдается так называемая «лестница» ДНК.

В опытах использованы белые беспородные мыши в половозрелом возрасте. У экспериментальных животных вызывали острый токсикоз введением четыреххлористого углерода или парацетамола.

Композицию, описанную в примере 1 или примере 2, вводили внутрижелудочно с помощью зонда в виде суспензии в дозе 100 мг/кг, за 1 ч до введения токсина, а затем еще трижды с интервалом в 2 дня. Контрольным животным вводили только токсин (четыреххлористый углерод или парацетамол) и растворитель в эквиобъемных дозах. По окончании курса приема композиции животных декапитировали и изымали печень, почки, эпителий кишечника. Кусочки каждого из органов гомогенизировали и подвергали протеолизу протеиназой К (0,5 мг/мл) в присутствии 0,1% лаурилсаркозината натрия в Трис-ЭДТА буфере при 50°С в течение ночи. ДНК осаждали этанолом и ресуспендировали в 10 мМ Трио-буфере, рН 8.0, содержащем 1 мМ ЭДТА. Аликвоты растворов ДНК исследовали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. После завершения процесса электрофореза гель вымачивали в растворе этидиумбромида (0,1 мг/мл); визуализацию ДНК проводили под ультрафиолетовым освещением.

Образование характерной для апоптоза картины «ДНК-лестницы» наблюдалось в образцах тканей животных с экспериментальным токсикозом, не получавших лечения нашей композицией (см. фиг.1, где 1 - маркеры молекулярной массы, 2-5 - образцы печени мышей с токсикозом). В то же время, фрагментации ДНК не наблюдалось в образцах печени мышей, получавших заявляемую композицию (фиг.2: 1 - маркеры молекулярной массы, 2-5 - образцы тканей мышей с токсикозом, подвергшихся лечению композицией). На представленных фигурах отчетливо видно, что в образцах тканей печени контрольных животных ДНК в большей части фрагментирована (свидетельство наличия процесса апоптоза), а образцах тканей печени животных, получавших композицию, подобные фрагменты практически отсутствуют.

Таким образом, можно говорить о том, что предлагаемая композиция эффективно предотвращает процесс апоптоза в клетках, вызванный токсическими поражениями.

Преимущество изобретения заключается в усилении антитоксической и проявления выраженной антиапоптозной активности композиции за счет синергизма действия всех ее компонентов.

Таблица 1.ТоксинСхема применения композицииОтносительная масса печени*Активность АЛАТ**Активность АСАТ**Общий белок**Четыреххлористый углеродНе вводилась136,7±2,6451,6±10,8203,2±8,864,0±5,06 суток ежедневно до введения токсина126,4±3,1246,3±9,654,1±2,984,2±6,3Однократно за 1 ч перед введением токсина, затем 3 раза с интервалом 2 дня127,1±2,4263,1±10,474,8±6,381,4±6,8Смесь соевых фосфолипидов и экстракта расторопши (прототип)131,0±2,6278,0±12,381,6±3,577,9±5,9ПарацетамолНе вводилась148,1±2,6412,8±12,0218,2±9,759,8±4,76 суток ежедневно до введения токсина125,2±1,9229,0±8,768,7±4,980,9±6,0Однократно за 1 ч перед введением токсина, затем 3 раза с интервалом 2 дня124,6±1,7267,8±6,972,0±8,686,6±5,9Смесь соевых фосфолипидов и экстракта расторопши (прототип)138,8±2,1302,7±10,882,4±7,769,2±7,1* - % от массы печени здоровых интактных животных** - % от показателей у здоровых интактных животных

Таблица 2.Схема применения композицииУровень малонового диальдегида*Не применялась360,4±28,7Ежедневно в течение 3 дней224,9±19,4Смесь соевых фосфолипидов и экстракта расторопши (прототип)320,7±23,9* - % от уровня малонового диальдегида у интактных животных

Изобретение относится к области фармакологии и биотехнологии и может быть использовано для предотвращения различных экологически неблагоприятных воздействий, а также воздействия канцерогенных факторов, особенно на людей. Настоящая композиция содержит смесь флаволигнанов (силибин, силидианин и силикристин) из расторопши пятнистой, смесь очищенных липидов, а также глицин, а также может дополнительно содержать незаменимые L-аминокислоты, а также некоторые растительные экстракты. Изобретение обеспечивает усиленный антитоксический и антиапоптозный эффект в отношении не только клеток печени и органов пищеварения, но и на другие клеточные системы организма за счет синергизма действия всех компонентов. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.

1. Биокомпозиция, обладающая антитоксическим и антиапоптозным действием, отличающаяся тем, что содержит смесь флаволигнанов (силибинин 80-85%, силидианин - 10%, силикристин - 5-10%) из расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn), смесь очищенных липидов, включающая триглицериды около 10% и остальное - диглицериды, в частности фосфатидилхолины, содержащие остатки насыщенных жирных кислот 20-25%, одноненасыщенных жирных кислот 6-15%, двухненасыщенных жирных кислот 55-65%, трехненасыщенных жирных кислот 5-8%, а также глицин при следующем соотношении компонентов, вес.%:

смесь флаволигнанов20,0-70,0глицин2,0-8,0смесь очищенных липидов25,0-72,0