Тест-система для скрининга нарушений минерального гомеостаза крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 

Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии, медицинским и биологическим реактивам, а именно к реактивам для определения способности организма: 1) к компенсации нарушений минерального гомеостаза путем прямой детекции кальций-фосфатных комплексов (КФК) в сыворотке крови и 2) к декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови на основании оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами кальция и фосфат-анионами.

Поддержание фосфорнокальциевого гомеостаза является необходимым условием для обеспечения функционирования ряда клеточно-тканевых процессов (возбуждение нейронов, мышечное сокращение и свертывание крови, за которые ответственен кальций) и внутриклеточных метаболических процессов (синтез фосфолипидных мембран и репликация ДНК, для которых требуется фосфор). Основные этапы метаболизма кальция и фосфора включают в себя абсорбцию данных химических элементов в кишечнике, их отложение в костной ткани параллельно с ее резорбцией, а также реабсорбцию и выведение почками, при этом каждый из этих процессов жестко регулируется кальциотропными (паратиреоидный гормон, кальцитонин, 1,25-дигидроксивитамин D, ионизированный кальций) и фосфотропными (паратиреоидный гормон, 1,25-дигидроксивитамин D, FGF-23) факторами и их рецепторами (PTHR - рецептор к паратиреоидному гормону, CALCR - рецептор к кальцитонину, VDR - рецептор к 1,25-дигидроксивитамину D, CaSR - рецептор ионизированного кальция, Klotho - рецептор к FGF-23). Нарушения минерального гомеостаза в зависимости от своей тяжести могут привести к повышению уровней ионизированного кальция и фосфора до «высоких нормальных» значений или даже к превышению их физиологической нормы, что, в свою очередь, связано с развитием внескелетной кальцификации и ассоциировано с высоким риском острых сердечно-сосудистых событий, хронической сердечной недостаточности и смерти от болезней системы.

Особой важностью в этом отношении характеризуется ионизированный кальций, который не связан с белками крови и в силу этого является физиологически активной фракцией циркулирующего кальция, также будучи ассоциированным с высоким риском инфаркта миокарда и ишемического инсульта. Интересно, что «высокий нормальный» уровень фосфора также ассоциирован с развитием не только инфаркта миокарда и ишемического инсульта, но и микрососудистой дисфункции, которая, в свою очередь, ассоциирована с указанными сердечно-сосудистыми событиями. При этом «низкий нормальный» уровень ионов магния, являющегося физиологическим антагонистом кальция, также ассоциирован с повышенным риском неблагоприятных сердечно-сосудистых исходов и смерти от сердечнососудистых заболеваний. Назначение пациентам с хронической болезнью почек кальцимиметика цинакальцета (препарата, выступающего как альтернативный лиганд кальций-чувствительного рецептора CaSR и. снижающего выработку паратиреоидного гормона, а вследствие этого и уровень кальция и фосфора в крови) приводило к снижению частоты острых сердечно-сосудистых событий. Кроме того, последние мета-анализы показали, что системные фармакологические вмешательства, направленные на повышение уровня кальция и витамина D - одного из основных биоактивных факторов, увеличивающих поступление кальция из кишечника и его выделение из костной ткани в кровь - не снижают риск развития инфаркта миокарда, инсульта и сердечно-сосудистой смерти.

Помимо системы кальциотропных и фосфотропных гормонов и их рецепторов, уровень ионизированного кальция в крови также контролируется циркулирующими белками-скевенджерами кальция. Видным представителем таких белков является альбумин, который связывает циркулирующие в крови положительно заряженные ионы кальция посредством большого количества отрицательно заряженных аминокислот, распределенных по всей его третичной структуре. Хотя связывание ионов кальция по такому механизму и осуществляется с низкой аффинностью, многократно более высокая концентрация альбумина в крови по сравнению с любым другим белком обусловливает его ведущую роль в поддержании минерального гомеостаза крови. Другим важным белком с точки зрения ингибирования внескелетной минерализации является фетуин-А, который стабилизирует зарождающиеся кластеры фосфата кальция в мономерной форме, образуя так называемые кальципротеиновые мономеры. Считается, что при перенасыщении крови ионами кальция и фосфат-анионами в кальципротеиновых мономерах содержится до 50% от всех данных ионов (выше порога перенасыщения) и до 95% всего фетуина-А крови. Вторая половина превышающих порог перенасыщения ионов кальция и фосфат-анионов крови, а также остаточные 5% фетуина-А находится в составе кальципротеиновых частиц, которые с позиции патобиохимии также справедливо называть кальций-фосфатными комплексами (КФК). В отличие от субнаноразмерных кальципротеиновых мономеров, КФК представляют собой частицы карбонат-гидроксиапатита от 50 до 500 нм в диаметре, которые способны адсорбировать белки крови. Стабильное состояние КФК обеспечивается за счет покрывающего их слоя фетуина-А, хотя в их состав также входят альбумин и прочие «кислые» белки сыворотки, получившие название минеральных шаперонов.

Последние крупные эпидемиологические исследования и мета-анализы достаточно убедительно продемонстрировали, что, по аналогии с «высоким нормальным» уровнем кальция и фосфора, «низкий нормальный» уровень фетуина-А и альбумина ассоциирован с повышенным риском развития инфаркта миокарда, ишемического инсульта и сердечно-сосудистой смерти. Таким образом, для клинической медицины является достаточно важной связь «высокого нормального» уровня кальция (в том числе ионизированного кальция) и фосфора, а также «низкого нормального» уровня альбумина и фетуина-А с повышенным риском инфаркта миокарда, ишемического инсульта и смерти от сердечно-сосудистых заболеваний.

Фундаментальные исследования последствий нарушений минерального гомеостаза крови (особенно характерных для пациентов с остеопорозом и гиперпаратиреозом) показали, что они приводят к формированию КФК, которые повреждают эндотелий и вследствие этого запускают развитие атеросклероза, таким образом приводя к ишемической болезни сердца и повышая риск ишемического инсульта. Клиническая значимость циркуляции КФК в крови отмечена по результатам клинического испытания Trial to Assess Chelation Therapy (TACT, NCT00044213), которое включало 1708 пациентов (50 лет и старше) с инфарктом миокарда в анамнезе, получавших (839 больных) или не получавших (869 больных) в течение 30 недель 40 внутривенных инфузий объемом 500 мл, включавших 3 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2-ЭДТА, 1,5 г/л) как хелатирующего агента в сочетании с витаминной и электролитной смесью. У получавших указанную терапию пациентов в 1,22 раза реже регистрировалась первичная комбинированная конечная точка (в которую входили летальный исход независимо от причины, повторный инфаркт миокарда, острое нарушение мозгового кровообращения, коронарная реваскуляризация или госпитализация по поводу стенокардии). Данный эффект был особенно выражен в когорте пациентов с сахарным диабетом, первичная комбинированная конечная точка у которых отмечалась в 1,69 раза реже, и в субкогорте пациентов с сахарным диабетом и заболеваниями периферических артерий, являющихся клиническим проявлением мультифокального атеросклероза, у которых снижение частоты первичной комбинированной конечной точки достигло 1,92 раза. Эти результаты приобретают особый интерес в свете того, что пик формирования КФК в крови приходится на первые 2 часа после приема пищи; таким образом, существует ассоциативная связь между постпрандиальной гликемией и образованием КФК. Положительным эффектом протестированного в исследовании TACT режима терапии также является его безопасность. В то же время низкая биодоступность Na2-ЭДТА при пероральном употреблении (около 5%) существенно ограничивает ее клиническое применение, а внутривенный путь введения лекарственных средств в регулярной терапевтической практике в настоящее время считается сопряженным с достаточно высоким риском осложнений. В настоящее время проводятся клинические испытания ТАСТ2 (NCT02733185) и ТАСТ3а (NCT03982693) которые сфокусированы на эффективности терапии Na2-ЭДТА у пациентов с перенесенным инфарктом миокарда и сахарным диабетом (ТАСТ2) и у пациентов с данными патологиями и критической ишемией нижних конечностей (ТАСТ3а).

Помимо терапии Na2-ЭДТА, в клинических испытаниях (NCT03565913) показала положительные результаты пероральная форма (растворимый порошок) цитрата кальция и магния (7,5 ммоль Са²⁺, 5 ммоль Mg²⁺, 20 моль-экв. Н⁺и 15 ммоль цитрата, прием 3 раза в сутки в течение 1 недели), которая замедляла формирование КФК у пациентов с ХБП5. Вполне вероятно, что именно за такой формой препаратов с хелатирующим действием стоит будущее терапии, направленной на элиминацию КФК из организма человека. Также относительно успешно в этом отношении прошли клинические испытания (NCT02216877) перорального приема доноров ионов магния (360 мг гидроксида магния, эквивалентные 15 ммоль Mg²⁺, 1 или 2 раза в сутки в течение 8 недель), которые ингибировали формирование КФК у пациентов с хронической болезнью почек 3 и 4 стадий. Подтверждение эффективности ионов магния для ингибирования формирования КФК было получено чуть позже в клиническом испытании (NCT02977117) повышенной концентрации ионов магния (2 моль-экв./л вместо 1 моль-экв./л) в растворе для гемодиализа, который проводился в течение 4 недель. Тем не менее, адекватное проведение клинических испытаний способов элиминации КФК из кровотока после выполнения ими своей гомеостатической функции прежде всего требует методов объективной оценки содержания КФК в крови.

Природная организация КФК такова, что, с одной стороны, они являются необходимым звеном минерального гомеостаза (по сути, выступая в роли вторичного депо ионов кальция и фосфат-анионов, в том числе агрегирующего избыточные ионы кальция и фосфат-анионы и выводящего их из кровотока), а с другой - патогенным циркулирующим в крови субстратом в силу своей химической природы (покрытый белками крови карбонат-гидроксиапатит). Широко известные биохимические показатели крови не позволяют определить способность сыворотки крови к компенсации и декомпенсации нарушений минерального гомеостаза, поскольку выраженные изменения этих маркеров встречаются при тяжелой хронической почечной недостаточности или тяжелом гиперпаратиреозе, а незначительные изменения неспецифичны, и терапии не подвергаются.

Таким образом, для выявления нарушений в системе минерального гомеостаза, которые могут приводить к эктопической минерализации (кальцификации мягких тканей), необходимо учитывать все факторы, ингибирующие или запускающие этот процесс в сыворотке крови. Создание высокоточного и быстрого скринингового метода диагностики сыворотки или плазмы крови к компенсации (прямая детекция КФК) и декомпенсации (оценка склонности сыворотки крови к формированию КФК) нарушений минерального гомеостаза крови будет способствовать получению ранней информации о предрасположенности организма к наступлению сердечно-сосудистых событий или о риске развития кальцификации у пациентов.

Известен способ (Koeppert S, Ghallab A, Peglow S, Winkler CF, Graeber S, Biischer A, Hengstler JG, Jahnen-Dechent W. Live Imaging of Calciprotein Particle Clearance and Receptor Mediated Uptake: Role of Calciprotein Monomers. Front Cell Dev Biol. 2021;9:633925. doi: 10.3389/fcell.2021.633925), где к исследуемому образцу и имеющимся стандартам для построения калибровочной кривой добавляют реагент, способный формировать хромогенный комплекс с ионами кальция и с ионами фосфора. Ионизированный кальций, присутствующий в образце, реагирует с комплексоном орто-крезолфталеином, образуя окрашенный комплекс, который можно количественно определить с помощью спектрофотометрического анализа при 570 нм. Ионизированный фосфор реагирует с молибдатом в кислой среде с образованием фосфомолибдата аммония, оптическая плотность которого максимальна при 340 нм.

Недостатками данного способа является количественное измерение ионизированных кальция и фосфора (представленных в свободной форме и не связанных с белками) в сыворотке крови, а не измерение склонности сыворотки крови к формированию КФК посредством повышения оптической плотности.

Известен способ (Uedono Н, Mori К, Ochi A, Nakatani S, Miki Y, Tsuda A, Morioka T, Nagata Y, Imanishi Y, Shoji T, Inaba M, Emoto M. Effects of fetuin-A-containing calciprotein particles on posttranslational modifications of fetuin-A in HepG2 cells. Sci Rep.2021;11(1):7486. doi: 10.1038/s41598-021-86881-0), в котором измеряли содержание ионизированного кальция в составе КФК путем добавления хромогенного реагента с дальнейшей детекцией результата при 575 нм.

Недостатками данного способа является количественное измерение ионизированного кальция только в составе КФК, а не во всей биологической жидкости, где эти комплексы формируются. Кроме того, данный способ не позволяет оценить склонность сыворотки к формированию КФК и не дает представления об актуальной концентрации данных частиц в циркулирующей крови.

Известен способ (How to determine the tendency of calcification, JP 6104265 B2, https://patents.google.com/patent/JP6104265B2 и Method for determining the propensity for calcification, US 10054601 B2, https://patents.google.com/patent/US10054601B2) измерения времени полуперехода низкокристаллических менее патогенных сферических КФК в высококристаллические патогенные игольчатые КФК (так называемый тест Т₅₀). Тест Т₅₀ применяется в качестве прогностического биомаркера в большинстве когортных исследований (в качестве примера можно привести два недавних исследования: Bundy JD, Cai X, Scialla Л, Dobre MA, Chen J, Hsu CY, Leonard MB, Go AS, Rao PS, Lash JP, Townsend RR, Feldman HI, de Boer IH, Block GA, Wolf M, Smith ER, Pasch A, Isakova T; CRIC Study Investigators. Serum Calcification Propensity and Coronary Artery Calcification Among Patients With CKD: The CRIC (Chronic Renal Insufficiency Cohort) Study. Am J Kidney Dis. 2019;73(6):806-814. doi: 10.1053/j.ajkd.2019.01.024. и Eelderink С, Те Velde-Keyzer CA, Frenay AS, Vermeulen EA, Bachtler M, Aghagolzadeh P, van Dijk PR, Gansevoort RT, Vervloet MG, Hillebrands JL, Bakker SJL, van Goor H, Pasch A, de Borst MH; NIGRAM2+ consortium. Serum Calcification Propensity and the Risk of Cardiovascular and All-Cause Mortality in the General Population: The PREVEND Study. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2020;40(8): 1942-1951. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314187). Измерение проводится в 96-луночном планшете, в каждую лунку которого последовательно добавляют 20 мкл хлорида натрия (140 ммоль/л NaCl), 80 мкл исследуемой сыворотки, 50 мкл фосфата (исходными солями для приготовления раствора могут быть 24 ммоль/л Na₂HPO₄ или 24 ммоль/л NaH₂PO₄) и 50 мкл раствора хлорида кальция (40 ммоль/л CaCl₂). Растворы фосфата и кальция готовятся на 140 ммоль/л NaCl и 100 ммоль/л HEPES с выравниванием рН до 7,4 при 37°С с помощью 10 ммоль/л NaOH. Конечные концентрации солей в лунке 96-луночного планшета составляют: NaCl - 140 ммоль/л, фосфата - 6 ммоль/л, кальция - 10 ммоль/л, HEPES - 50 ммоль/л. Инкубация исследуемых проб и измерение результатов занимает от 2 до 14 часов при помощи нефелометрии. Значения определяются по графику зависимости светорассеяния раствора от времени. Увеличение показателей происходит из-за повышения мутности исследуемого образца при образовании сферических и игольчатых КФК.

Недостатком данного способа являются высокие конечные концентрации солей в исследуемой лунке, что может повлиять на итоговый результат, поскольку чем выше перенасыщение исследуемого образца ионами кальция и фосфора, тем ниже значение Т₅₀. Кроме того, интерпретация результатов теста кажется весьма времязатратной, поскольку необходимо отдельно рассчитывать светорассеяние для сферических КФК и игольчатых КФК и затем определять среднее арифметическое между светорассеяниями, по значению которого определяется момент времени Т₅₀. Еще одним сомнительным моментом может быть отсутствие физиологической релевантности такого физико-химического перехода между сферическими и игольчатыми КФК, поскольку продолжительность теста Т₅₀ составляет от 2 до 14 часов, в то время как интернализация КФК моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками происходит в течение 1 часа. Поэтому представляется все же более правильным оценивать общую склонность сыворотки или плазмы крови к преципитации КФК по увеличению оптической плотности после ее перенасыщения ионами кальция и фосфора.

Известен способ (Smith ER, Hewitson TD, Cai MMX, Aghagolzadeh P, Bachtler M, Pasch A, Holt SG. A novel fluorescent probe-based flow cytometric assay for mineral-containing nanoparticles in serum. Sci Rep.2017;7(1):5686. doi: 10.1038/s41598-017-05474-y) прямой детекции (определении исходной концентрации) КФК в сыворотке или плазме крови при помощи связывания КФК флюоресцентно меченым бисфосфонатом (OsteoSense 680ЕХ, Perkin Elmer) в сочетании с окрашиванием имеющих сходную размерность внеклеточных везикул липофильным мембранным красителем (PKH67, MIDI67-1KT, Sigma). Сочетание этих флюоресцентных зондов позволяет отличить КФК (OsteoSense- положительные РКН-отрицательные события) от внеклеточных везикул (OsteoSense-отрицательные РКН-положительные события, при этом кальцифицирующиеся внеклеточные везикулы детектируются как OsteoSense- и РКН-положительные события) при проточной цитометрии и анализировать концентрацию КФК в сыворотке/плазме крови. Для калибровки проточного цитометра в данном способе использовали коммерческие наборы ApogeeMix (1493, Apogee Flow Systems) и Nano Blank Polystyrene Size Standard Kit (NPPS-4K, Spherotech), а так же флюоресцентно-меченые OsteoSense 680EX стандарты сферических КФК и игольчатых КФК для установки компенсации сигналов флюоресценции. Первый набор способствует калибровке частиц крупного диаметра и состоит из водной смеси силикагелевых сфер диаметром 180, 240, 300, 590, 880 и 1300 нм. Второй набор применяется для калибровки наноразмерных частиц с диаметром от 0,1 до 1,9 мкм. Флюоресцентно-меченые OsteoSense 680ЕХ стандарты сферических и игольчатых КФК приготовлены путем использования предварительно очищенной сыворотки человека от естественных КФК методом ступенчатого центрифугирования: 1) для осаждения крупных частиц применялось центрифугирование при 10000 х g в течение 30 минут при 4°С, 2) для осаждения частиц всего спектра размерности применялось центрифугирование при 100000 х g в течение 120 минут при 4°С. Далее к 4 мл предварительно очищенной человеческой сыворотки добавляли 1 мл раствора хлорида натрия (140 ммоль/л NaCl), 2,5 мл раствора фосфата с рН 7,4 и 2,5 мл раствора кальция с рН 7,4. Раствор фосфата содержит 19,44 ммоль/л Na₂HPO₄, 4,56 ммоль/л NaH₂PO₄, 140 ммоль/л NaCl, 25 ммоль/л Tris. Раствор кальция содержит 40 ммоль/л CaCl₂, 140 ммоль/л NaCl, 25 ммоль/л Tris. Оба раствора доводили до значения рН 7,4 при помощи NaOH с концентрацией 10 моль/л при 37°С. Полученные 10 мл суспензии, содержащей смесь КФК (как сферических КФК, так и игольчатых КФК), инкубировали при 37°С с постоянным помешиванием и дальнейшим выделением сферических КФК через один час инкубации, а игольчатых КФК через 12 часов при помощи высокоскоростного центрифугирования (30000 х g в течение 120 минут при 4°С). Полученный осадок трижды отмывали холодным TBS (Tris Buffered Saline) и получали заново при помощи центрифугирования. Далее отмытый образец сферических и игольчатых КФК растворяли в 500 мкл предварительно нагретого TBS. Следующим этапом было аликвотирование 25 мкл сферических или игольчатых КФК с последующим добавлением 75 мкл OsteoSense 680ЕХ (24 мкмоль/л) с дальнейшей инкубацией образцов в темноте в течение двух часов при 4°С. По завершении инкубации окрашенные сферические и игольчатые КФК осаждали центрифугированием при 30000 х g в течение 120 минут при 4°С. Концентрация и размерность полученных частиц измерялась при помощи автоматического анализатора Nanosight NS500, способного детектировать частицы диаметром от 10 до 2000 нм. Для пробоподготовки образцов сыворотки необходимо аликвотировать 50 мкл чистой сыворотки и развести ее в соотношении 1:5 в дважды отфильтрованном через поры с диаметром 220 нм Tris-буферном растворе (TBS, рН 7,4) с дальнейшим центрифугированием при 10,000 × g в течение 15 минут при 4°С для осаждения нецелевого крупного дебриса. Затем необходимо аликвотировать 200 мкл надосадка и смешать с 250 мкл флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ (предварительно разведенного в соотношении 1:50 в вышеуказанном Tris-буферном растворе). Далее образцы инкубируют в течение 50 минут в темноте при 4°С и добавляют 25 мкл флюоресцентного красителя РKН67, предварительно растворенного в соотношении 1:100 в растворителе С из прилагаемого набора, с дальнейшим ресуспендированием и инкубацией в темноте в течение 10 минут при 4°С. Скорость потока (flow rate) для измерения образца составляет 50 мкл/мин в течение 1 минуты или до сбора 30000 событий.

Недостатком данного способа является высокая скорость потока (flow rate) большинства проточных цитометров, которая влияет на точность измерения концентрации КФК. Скорость потока должна быть как можно ниже (не более 10 мкл/мин), поскольку это позволяет минимизировать детекцию ложноположительных «засвеченных частиц». Кроме того, использование наноразмерных силикагелевых сфер, не конъюгированных с флюоресцентной меткой, не позволяет проводить калибровку содержания кальций-фосфатных частиц с формой, отличной от сферической. Следует отметить, что использование коммерческих наборов для калибровки проточного цитометра основывается на теории рассеяния света частицами сферической формы, предполагая наличие однородных сфер в среде (теория Ми). Использование предварительно очищенной сыворотки человека от естественных КФК всего спектра размерности методом ступенчатого центрифугирования для синтезирования флюоресцентно-меченых OsteoSense 680ЕХ стандартов сферических КФК и игольчатых КФК не позволяет синтезировать КФК в нужном количестве и разного диапазона размерности, поскольку предварительно очищенная сыворотка будет лишена части альбумина и фетуина-А, связавшегося с утилизированными КФК в процессе ступенчатого центрифугирования. Это сдвигает синтез в сторону большего формирования игольчатых КФК, имеющих большую размерность. Кроме того, использование в данном способе перенасыщение сыворотки крови ионами кальция и фосфат-анионами не позволяют оценить способность организма к декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови на основании оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК.

Известен способ (Novel calciprotein particle (СРР) measurement method using fluorescent probe, JP 6566697 B2, https: //patents.google.com/patent/JP6566697B2), который был апробирован в качестве диагностического маркера хронической болезни почек и показывает увеличение количества КФК при снижении функции почек. Пробоподготовка к измерению общей фракции КФК проводится путем добавления 5 мкл сыворотки крови пациента (объем исследуемой сыворотки может быть от 0,5 до 5 мкл) к 45 мкл 50 мкмоль/л флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ (объем флюоресцентного красителя может быть от 10 до 100 мкл и с концентрацией от 5 до 50 мкмоль/л) с инкубацией исследуемого образца при комнатной температуре в течение часа (время инкубации может быть увеличено до двух часов). Затем образец при помощи спин-колонки для гель-фильтрации очищают от несвязавшегося флюоресцентного красителя и собирают элюат центрифугированием при 1000 g в течение 2 минут. Нерастворимые флюоресцентно меченные КФК, содержащиеся в 40 мкл собранного элюата, ресуспендируют путем последовательного добавления 10 мкл раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, концентрация 250-500 ммоль/л) и 10 мкл додецилсульфата натрия (в концентрации 5-10%) с инкубацией при комнатной температуре в течение 5 минут (время экспозиции может быть увеличено до 10 минут). Интенсивность флюоресцентного красителя считывается сканером ближнего инфракрасного диапазона (к примеру, LI-COR Odyssey CLx). Концентрацию КФК в крови или сыворотке определяют по интенсивности считываемой флюоресценции зонда, связавшегося с гидроксиапатитом в составе КФК. Кроме того, данным способом пробоподготовки возможно анализировать низкокристаллические КФК, которые получают из цельной сыворотки путем ее центрифугирования при 16,000 g в течение 2 часов. В пробоподготовку берется 5 мкл полученного надосадка с последующим соблюдением шагов, описанных выше. Высококристаллические КФК определяются путем вычитания значений низкокристаллических КФК из значений общей фракции КФК. В качестве проб для построения калибровочной кривой используются серийные разведения коммерчески доступных стандартов кристаллов фосфата кальция в концентрации 1000, 500, 150, 125, 62,5 мкг/мл.

Недостатком данного способа является отсутствие показателей границ физиологической нормы для КФК у условно здоровых субъектов. Несмотря на то, что цифровое изображение позволяет дать качественную и количественную оценку (измерение плотности лунок планшета в программе Fiji, National Institutes of Health) кратности изменения интенсивности флюоресценции, остается неясным количество КФК, которое позволяло стабильно бы поддерживать минеральный гомеостаз крови путем связывания избыточных ионов кальция, количество которых оценить также не представляется возможным. Кроме того, данный способ не позволяет оценить склонность сыворотки к формированию КФК. Еще одним из недостатков данного способа является использование сканера ближнего инфракрасного диапазона, который не распространен в клинико-диагностических лабораториях.

Известен способ оценки отдельных параметров минерального гомеостаза (к примеру, на современных автоматизированных биохимических анализаторах с использованием коммерчески доступных реагентов). Спектр данных параметров при оценке в рутинной клинико-лабораторной диагностике достаточно узок и ограничивается измерением общего белка (границы нормы 64-83 г/л), альбумина (границы нормы 35-50 г/л), общего кальция (границы нормы 2,2-2,55 ммоль/л) и фосфора (границы нормы 0,78-1,42 ммоль/л).

Недостатком данного способа является широкий диапазон границ нормы, выраженные нарушения которых встречаются лишь при тяжелой хронической почечной недостаточности или декомпенсированном гиперпаратиреозе, а незначительные изменения в пределах границ норм считаются незначимыми и терапии не подвергаются.

Ввиду описанных обстоятельств целью настоящего изобретения является создание тест-системы для скрининга нарушений минерального гомеостаза крови, позволяющей непосредственно и высокоточно измерять концентрацию КФК в крови с параллельной оценкой склонности сыворотки крови к формированию КФК.

Техническим результатом изобретения является набор реактивов тест-системы, позволяющих определить нарушения минерального гомеостаза крови с разработанными протоколами их использования и установленными значениями референсных границ (границ нормы) концентрации КФК.

Предложенная тест-система для скрининга нарушений минерального гомеостаза крови включает в себя способ оценки исходной компенсации нарушений минерального гомеостаза (определение исходной концентрации КФК в сыворотке) и выраженности его декомпенсации при минеральном стресс-тесте.

Основным отличием данного изобретения от аналогов является быстрота проведения исследования (результат определения исходной компенсации нарушений минерального гомеостаза выдается через 2 часа от начала работы, результат выраженности декомпенсации при минеральном стресс-тесте - через 24 часа) и высокоточное измерение концентрации КФК с показателем склонности сыворотки к формированию КФК всего спектра размерности. Предложенный способ позволяет создать условия in vitro для непосредственного быстрого скрининга работы антикальцифицирующих кислых белков (минеральных шаперонов, прежде всего альбумина и фетуина-А) в исследуемой сыворотке.

Протокол специфичной оценки способности организма к компенсации нарушений минерального гомеостаза крови путем прямой детекции КФК в сыворотке крови.

В протоколе представлен способ специфичной оценки способности организма к компенсации нарушений минерального гомеостаза крови при помощи прямой детекции кальций-фосфатных комплексов в сыворотке крови посредством специфично связывающего фосфат кальция флюоресцентно меченного бисфосфоната (OsteoSense 680ЕХ, NEV10020EX, Perkin-Elmer) и проточной цитометрии (CytoFlex, Beckman Coulter). Для дифференцировки КФК от имеющих схожий спектр диаметров (200-1000 нм) внеклеточных мембранных везикул используется краситель липидных мембран PKH67 (MIDI67-1KT, Sigma). Спектр данных красителей не перекрывается, что позволяет избавиться от настройки компенсации на проточном цитометре и достичь максимальной точности результатов. После окрашивания КФК детектируются на проточном цитометре как OsteoSense 680ЕХ-положительные PKH67-отрицательные события.

Необходимые растворы:

1. Раствор TBS (Tris Buffered Saline), рН 7,4.

a. Для приготовления 1 л раствора необходимо: 6,05 г Tris + 8,76 г NaCl + 800 мл ddH₂O.

b. Измерить рН. Если рН>7,4, то довести рН до 7,4 при помощи 1М НС1.

с. Готовый раствор необходимо отфильтровать через поры диаметром 220 нм.

2. OsteoSense 680 EX, NEV10020EX, Perkin-Elmer.

a. OsteoSense 680ЕХ изначально поставляется в лиофилизированном виде в концентрации 24 нмоль. Порошок нужно растворить в 1,2 мл TBS (рН 7,4) в пластмассовой пробирке типа Eppendorf на 1,5 мл. После растворения концентрация OsteoSense 680 EX составит 24 мкмоль/л.

b. Разведенный OsteoSense 680ЕХ (24 мкмоль/л) центрифугировать при 13000 х g в течение 30 минут для осаждения крупных частиц красителя. Приготовленный раствор имеет ярко-синий цвет.

c. После центрифугирования 0,2 мл 24 мкмоль/л OsteoSense 680ЕХ аликвотировать в чистый эппендорф (резервный объем), а 1 мл OsteoSense 680ЕХ растворить в 74 мл TBS (рН 7,4, предварительно отфильтрованном). Итоговое разведение должно быть 1:75.

d. Рабочий раствор OsteoSense (бледно-голубой цвет) объемом 75 мл необходимо повторно отфильтровать через поры диаметром 220 нм (для удаления крупных частиц красителя, способных создать шум при анализе методом проточной цитометрии).

Протокол работы с исследуемой сывороткой

1. Образцы сыворотки крови после разморозки необходимо центрифугировать в течение 5 минут при 3500 × g (Microfuge 20R, Beckman Coulter) для осаждения криопреципитата. Чистый надосадок необходимо перенести в новую пробирку с соответствующей маркировкой.

2. Аликвотировать 15 мкл чистой сыворотки и развести ее в соотношении 1:5 в дважды отфильтрованном через поры диаметром 220 нм Tris-буферном растворе (TBS, рН 7,4).

3. Разведенные в TBS образцы необходимо центрифугировать для осаждения нецелевого крупного дебриса при 10,000 × g в течение 15 минут при 4°С (Microfuge 20R, Beckman Coulter).

4. Для дальнейшего окрашивания необходимо аликвотировать 66,8 мкл надосадка и смешать с 83,5 мкл флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ, тропного к фосфату кальция (предварительно разведенного в соотношении 1:74 в вышеуказанном Tris-буферном растворе).

5. Образцы инкубировать в течение 50 минут в темноте при 4°С.

6. По истечении времени инкубации в пробирку добавить 8,3 мкл флюоресцентного красителя PKH67 (липофильный краситель, тропный к внеклеточным везикулам, имеющим аналогичную с КФК размерность), растворенного в вышеуказанном Tris-буферном растворе в соотношении 1:100, с дальнейшим ресуспендированием и инкубацией в течение 10 минут при 4°С. Количественный анализ КФК на проточном цитометре

Проточный цитометр должен быть оснащен двумя лазерами (488, 638) и позволять детектировать частицы диаметром до 200 нм. В качестве отмывочной жидкости необходимо использовать отфильтрованную через поры диаметром 220 нм бидистиллированную воду либо рекомендованную к прибору проточную жидкость (Sheath Fluid).

Для детекции флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ используется лазер с длиной волны 638 нм (фильтр 712/25 BP), для детекции PKH67 - лазер с длиной волны 488 нм (фильтр 525/40 BP).

В качестве контроля (холостые пробы) для установки напряжения каналов флюоресценции и ежедневной проверки сходимости показаний прибора необходимо использовать рабочие растворы обоих указанных флюоресцентных красителей и чистый TBS без внесения сыворотки пациентов, а также разведенную в TBS и отцентрифугированную сыворотку без добавления флюоресцентных красителей.

Настройка прибора

1. Целевой гейт событий установить по логарифмической шкале гистограммы FSC-H/SSC-H.

2. Гейт перенести на гистограммы PKH67/SSC-H, OsteoSense 680EX/SSC-H и PKH67/OsteoSense 680ЕХ.

3. По холостой пробе PKH67/OsteoSense 680ЕХ установить отсекающие гейты и дискриминирующую сетку для разделения положительных и отрицательных событий.

4. Для сбора событий установить минимальную скорость 10 мкл/мин. Длительность регистрации событий в каждой пробе установить 2 минуты, что позволит собрать достаточное количество (не менее 10000) событий и достоверно измерить концентрацию КФК в образце.

5. Начало записи событий осуществлять через 20-30 секунд после запуска пробы (для стабилизации сигнала).

6. Все измерения рекомендуется проводить трижды для повышения точности анализа.

7. Стабильность измерений оценивать с помощью графика зависимости SSC-Н от времени.

8. После каждого измеренного образца дважды проводить функцию Backflush (короткая промывка) для исключения кросс-контаминации между различными образцами.

9. Подсчет результатов проводить путем деления полученного значения на 3 (количество технических повторов) и 20 (объем проанализированного образца) с последующим умножением полученного значения на 14,4 (фактор разведения сыворотки).

Референсное значение концентрации КФК в сыворотке крови условно здоровых доноров должно быть не менее 378 КФК/мкл (межквартильный интервал: 245-495 КФБ/мкл).

Протокол определения декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови путем оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами Са²⁺и РО₄^3-

Необходимые растворы

1. Отфильтрованная через поры диаметром 220 нм стерильная бидистиллированная вода.

2. Отфильтрованный через поры диаметром 220 нм раствор солей кальция (0,1M CaCl₂, донор ионов кальция).

3. Отфильтрованный через поры диаметром 220 нм раствор солей фосфора (0,1M Na₂HPO₄, донор фосфат-анионов).

Протокол работы с исследуемой сывороткой

1. В исследовании необходимо использовать 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты. Сыворотку пациента необходимо аликвотировать в дублях по 100 мкл на лунку с последующим выделением контрольной лунки и экспериментальной лунки.

2. Во все выделенные контрольные лунки добавить 4 мкл предварительно отфильтрованной через поры диаметром 220 нм стерильной бидистиллированной воды. Во все выделенные экспериментальные лунки добавить 2 мкл 0,1М CaCl₂ и + 2 мкл 0,1М Na₂HPO₄ (предварительно отфильтрованных через поры диаметром 220 нм). Конечная концентрация добавляемых растворов кальция и фосфора составляет 2 ммоль/л.

3. Планшет инкубировать в течение 24 часов в физиологических условиях (37°С, соотношение воздуха и углекислого газа 95%:5% и высокая влажность для предотвращения высыхания содержимого лунок).

4. Измерить величину оптической плотности растворов в лунках стрипов на спектрофотометре вертикального сканирования на длине волны 650 нм.

5. Подсчет результатов проводить путем вычитания значений контрольной сыворотки из значений экспериментальной.

А-В=С, где

А - значение экспериментальной сыворотки, усл.ед.

В - значение контрольной сыворотки, усл.ед.

С - склонность сыворотки крови к формированию КФК, усл.ед.

Степень увеличения оптической плотности при данном подходе отражает склонность сыворотки к преципитации КФК в условиях минерального стресса, которая может быть обусловлена как «низким нормальным» уровнем общего белка, так и «высоким нормальным» уровнем ионизированного кальция в исследуемом образце.

Склонность сыворотки к формированию КФК не должна превышать +0,009 усл.ед. ОП₆₅₀.

Пример осуществления и использования изобретения.

В исследование было включено 308 субъектов: 1) 88 участников эпидемиологического исследования PURE (Prospective Urban Rural Epidemiology Study), обследованных на базе НИИ КПССЗ и не имеющих гемодинамически значимого (стеноз >50% просвета сосуда) каротидного атеросклероза по данным ультразвуковой допплерографии и симптоматического коронарного атеросклероза в анамнезе; 2) 88 пациентов, поступивших в нейрохирургическое отделение ГБУЗ КО «КОККД им. акад. Л.С. Барбараша» с цереброваскулярной болезнью (ЦВБ, включающей в себя хроническую ишемию головного мозга или ишемический инсульт, требующие проведения каротидной эндартерэктомии); 3) 88 пациентов, поступивших в кардиохирургическое отделение НИИ КПССЗ или кардиологическое отделение ГБУЗ КО «КОККД им. акад. Л.С. Барбараша» с ишемической болезнью сердца (ИБС), потребовавшей чрескожного коронарного вмешательства (инфаркт миокарда) или коронарного шунтирования (хронический коронарный синдром); 4) 44 пациента с хронической болезнью почек 5 стадии (ХБП5, определяемой как скорость клубочковой фильтрации (СКФ) <15 мл/мин/1,73 м² по формуле CKD-EPI), поступивших в Центр нефрологии и гемодиализа ГАУЗ «КОКБ им. С,В. Беляева» с целью проведения гемодиализа. Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской Декларации. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ (протокол №80/2018, утвержден 10.09.2018). До включения в исследование от всех пациентов было получено письменное информированное согласие. Гендерно-возрастные характеристики, коморбидные патологии и лекарственный анамнез включенных в исследование субъектов приведены в Таблице 1.

У включенных в исследование пациентов оценивалась способность организма к компенсации (путем прямой детекции КФК в сыворотке крови) и декомпенсации (путем оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами Са²⁺и РО₄^3-) нарушений минерального гомеостаза крови.

Компенсаторная способность организма к нарушениям минерального гомеостаза оценивается путем добавления к исследуемой сыворотке флюоресцентных красителей OsteoSense 680ЕХ (бисфосфонат, тропный к фосфату кальция) и PKH67 (липофильный краситель, тропный к имеющим схожую с КФК размерность внеклеточным везикулам), сочетание которых позволило детектировать КФК при проточной цитометрии как OsteoSense 680ЕХ-положительные PKH67-отрицательные события. В результате проточно-цитометрических измерений было выявлено, что медианная концентрация КФК в сыворотке крови условно здоровых доноров составляет 378 (МКИ: 245-495 КФК/мкл), у пациентов с ЦВБ - 258 (МКИ: 178-323), у пациентов с ИБС - 210 (МКИ: 156-280), у пациентов с ХБП5 до гемодиализа - 308 (253-371), у пациентов с ХБП5 после гемодиализа - 292 (234-419) (фиг. 1). Примеры репрезентативных гейтов (графиков прибора) приведены на фиг. 2-6. Техническая верификация разработанной тест-системы на положительном контроле (искусственно синтезированные КФК) и отрицательных контролях (рабочие растворы обоих указанных флюоресцентных красителей, смешанные с чистым Tris-буферным раствором без внесения сыворотки пациентов, а также сыворотка пациентов без внесения флюоресцентных красителей) приведена на рис. 7-9. На основании этих экспериментов был сделан вывод о том, что сыворотка условно здоровых доноров крови обладает сохранной способностью к компенсации нарушений минерального гомеостаза путем агрегации избыточного кальция и фосфора с белками (биохимический процесс, лежащий в основе формирования КФК). Сниженное формирование КФК у пациентов с ССЗ и у больных с ХБП5 свидетельствует о нарушенной способности крови агрегировать избыточный кальций и фосфор (вероятно, вследствие сниженного уровня общего белка и альбумина), что приводит в том числе и к повышению концентрации ионизированного (не связанного с белками) кальция в крови.

Когда компенсаторный механизм подержания минерального гомеостаза в виде формирования КФК полностью исчерпывает свои возможности по связыванию избыточных ионов кальция с белками, оценивается способность организма к декомпенсации нарушений минерального гомеостаза. В 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты было аликвотировано по 100 мкл сыворотки пациента на лунку с последующим выделением контрольной лунки (с добавлением ультрафильтрованной стерильной бидистиллированной воды) и экспериментальной лунки с предварительно ультрафильтрованными растворами солей кальция и фосфора (+2 ммоль/л CaCl₂ и Na₂HPO₄) (фиг. 10). Данная молярная концентрация указанных солевых растворов была выбрана на основании кривой формирования КФК, показывающей, что именно она индуцирует преципитацию КФК вследствие искусственной декомпенсации минерального гомеостаза у всех без исключения пациентов (фиг. 11). Далее планшеты были инкубированы в течение 24 часов при 37°С, поддержании атмосферы 95% воздуха: 5% CO₂ для поддержания рН и высокой влажности для предотвращения высыхания содержимого лунок (фиг. 10). После этого во всех лунках была измерена оптическая плотность на длине волны 650 нм на спектрофотометре Multiskan Sky (Thermo Scientific) с последующим вычитанием фонового шума путем вычитания значений контрольной сыворотки из значений экспериментальной.

В результате апробации данного метода было выявлено, что пациенты с ЦВБ, ИБС, а также ХБП5 до и после гемодиализа характеризуются повышенной склонностью крови к преципитации КФК в сравнении с условно здоровыми донорами (вероятно, вследствие повышенной молярной концентрации ионизированного кальция), что отражает декомпенсацию нарушений минерального гомеостаза крови в условиях искусственного фосфорнокальциевого стресса. Медианное повышение оптической плотности на длине волны 650 нм у условно здоровых доноров крови составило +0,009 усл.ед. (МКИ: 0,003-0,024), у пациентов с ЦВБ - +0,026 усл.ед. (МКИ: 0,015-0,046), у пациентов с ИБС - +0,014 усл.ед. (МКИ: 0,010-0,021), у пациентов с ХБП5 до гемодиализа - +0,018 усл.ед. (МКИ: 0,009-0,028), у пациентов с ХБП5 после гемодиализа - +0,023 усл.ед. (МКИ: 0,015-0,033) (фиг. 12).

Описание чертежей

Фиг. 1. Концентрация КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительные PKH67-отрицательные события) в сыворотке крови исследованных субъектов. PURE - условно здоровые лица, ЦВБ - цереброваскулярная болезнь, ИБС - ишемическая болезнь сердца, ХБП5 - хроническая болезнь почек 5 стадии. Критерий Краскела-Уоллиса с FDR-поправкой на множественные сравнения. Значения Р указаны над графиками. Каждая точка на графике отражает анализ по одному пациенту. График типа «коробка с усами», центральная линия отражает медиану, границы «коробок» - 25-й и 75-й процентиль, границы «усов» - минимальное и максимальное значения.

Фиг. 2. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Условно здоровые доноры крови.

Фиг. 3. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ЦВБ.

Фиг. 4. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ИБС.

Фиг. 5. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ХБП5 до гемодиализа.

Фиг. 6. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Пациенты с ХБП5 после гемодиализа.

Фиг. 7. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Искусственно синтезированные КФК (положительный контроль).

Фиг. 8. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (в центре) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Контрольный образец без внесения сыворотки крови (отрицательный контроль).

Фиг. 9. Репрезентативные гейты (проточно-цитометрические карты), отражающие процент КФК (OsteoSense 680ЕХ-положительных PKH67-отрицательных событий, слева), распределение размерности событий (слева) и стабильность детекции КФК между образцами одной и той же группы (справа). Сыворотка крови без внесения флюоресцентных красителей (отрицательный контроль).

Фиг. 10. Схема определения декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови путем оценки склонности сыворотки крови к формированию КФК при ее перенасыщении ионами Са²⁺и РО₄^3-. Донором ионов кальция является CaCl₂, фосфора - Na₂HPO₄. Выполнение анализа занимает 24 часа в физиологических условиях культивирования клеток с дальнейшим измерением оптической плотности на длине волны 650 нм (ОП₆₅₀) и последующим вычитанием фоновых значений (ОП₆₅₀ образца сыворотки, культивируемого в аналогичных условиях, но без добавления CaCl₂ и Na₂HPO₄) из значений экспериментальных.

Фиг. 11. Тест-кривая формирования КФК при различных добавляемых в сыворотку крови молярных концентрациях CaCl₂ и Na₂HPO₄.

Фиг. 12. Преципитация КФК (увеличение оптической плотности на длине волны 650 нм при искусственном перенасыщении солями кальция и фосфора) в сыворотке крови исследованных субъектов. PURE - условно здоровые лица, ЦВБ - цереброваскулярная болезнь, ИБС - ишемическая болезнь сердца, ХБП5 - терминальная хроническая почечная недостаточность. Критерий Краскела-Уоллиса с FDR-поправкой на множественные сравнения. Значения Р указаны над графиками. Каждая точка на графике отражает анализ по одному пациенту. График типа «коробка с усами», центральная линия отражает медиану, границы «коробок» - 25-й и 75-й процентиль, границы «усов» - минимальное и максимальное значения.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии. Раскрыт способ скрининга нарушений минерального гомеостаза крови, в котором: к сыворотке крови, предварительно центрифугированной при 3500×g в течение 5 минут, добавляют флюоресцентный краситель OsteoSense 680ЕХ с последующим смешиванием с флюоресцентным красителем PKH67 для определения исходной концентрации кальций-фосфатных комплексов и определения компенсации нарушений минерального гомеостаза крови методом проточной цитометрии, причем значение кальций-фосфатных комплексов у условно здорового донора крови должны быть не менее 378 кальций-фосфатных комплексов /мкл; к сыворотке крови, предварительно центрифугированной при 3500×g в течение 5 минут, добавляют растворы хлорида кальция и гидрофосфата натрия в конечной концентрации 2 ммоль/л для оценки склонности сыворотки крови к формированию кальций-фосфатных комплексов, при этом степень увеличения оптической плотности, детектируемая методом спектрофотометрии на длине волны 650 нм, используется для оценки выраженности декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови, причем значения оптической плотности в норме не должны превышать +0,009 усл. ед. относительно сыворотки того же пациента без ее перенасыщения. Изобретение обеспечивает оценку исходной компенсации нарушений минерального гомеостаза и выраженности его декомпенсации при минеральном стресс-тесте. 12 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ скрининга нарушений минерального гомеостаза крови, в котором:

- к сыворотке крови, предварительно центрифугированной при 3500×g в течение 5 минут, добавляют предварительно отфильтрованный через поры диаметром 220 нм трис-буферный солевой раствор в соотношении 1:5 с последующим центрифугированием при 10,000×g в течение 15 минут при 4°С для осаждения нецелевого крупного дебриса и аликвотированием 66,8 мкл надосадка для смешивания с 83,5 мкл флюоресцентного красителя OsteoSense 680ЕХ, предварительно разведенного в соотношении 1:74 в трис-буферном растворе, и инкубацией в течение 50 минут в темноте при 4°С с последующим смешиванием с 8,3 мкл флюоресцентного красителя PKH67, предварительно разведенного в соотношении 1:100 в трис-буферном растворе, и инкубацией в течение 10 минут в темноте при 4°С для определения исходной концентрации кальций-фосфатных комплексов и определения компенсации нарушений минерального гомеостаза крови методом проточной цитометрии с использованием лазеров длиной волны 638 нм и 488 нм с фильтрами 712/25 ВР и 525/40 ВР соответственно, установкой скорости для сбора событий 10 мкл/мин и с началом сбора событий через 20-30 секунд после запуска пробы в течение двух минут, причем значение кальций-фосфатных комплексов у условно здорового донора крови должны быть не менее 378 кальций-фосфатных комплексов /мкл;

- к сыворотке крови, предварительно центрифугированной при 3500×g в течение 5 минут, добавляют растворы хлорида кальция и гидрофосфата натрия в конечной концентрации 2 ммоль/л для оценки склонности сыворотки крови к формированию кальций-фосфатных комплексов, при этом степень увеличения оптической плотности, детектируемая методом спектрофотометрии на длине волны 650 нм, используется для оценки выраженности декомпенсации нарушений минерального гомеостаза крови, причем значения оптической плотности в норме не должны превышать +0,009 усл. ед. относительно сыворотки того же пациента без ее перенасыщения.