Способ оценки эффективности терапии in vitro и in vivo в мышиной экспериментальной модели имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 G09B23/28 C12N5/78 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно, к оценке эффективности противовоспалительного действия лекарственных средств в экспериментальной модели имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита, и может быть использовано для доклинических исследований лекарственных препаратов местного и системного действия.

Модель имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита используется для изучения патогенеза псориаза и оценки эффективности терапии. С этой целью исследователи проводят оценку выраженности воспаления кожи и осуществляют исследования органов и тканей экспериментальных животных. В частности, анализируются показатели экспрессии генов, кодирующих цитокины, другие медиаторы иммунной системы, секреции воспалительных цитокинов, изучается клеточный состав органов (лимфатических узлов, селезенки, периферической крови, кожи). Одним из методов таких исследований может стать оценка интенсивности воспаления с целью определения эффективности терапии в рамках доклинических исследований лекарственных препаратов. В научной литературе имеются упоминания способов исследования интенсивности имиквимод-индуцированного воспаления, в том числе в целях изучения эффективности лечения псориаза на мышиной модели.

Известен «Способ оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза» [патент RU № 2764549], в котором авторы описывают измерение уровня экспрессии маркера Т-лимфоцитов (CD3) и пролиферативной активности клеток с маркером пролиферации (Ki-67) иммуногистохимическим методом (со световой микроскопией образцов) в коже мышей с имиквимод-индуцированным дерматитом. Одновременное уменьшение количества CD3+ и Ki-67+-клеток в 2 раза и более по сравнению с контрольной группой является критерием эффективного антипсориатического действия препарата. Существенной характеристикой метода является использование объективного метода контроля in vitro.

Недостатки метода: трудоемкость (применение иммуногистохимического анализа, более трудоемкого, чем проточная цитометрия), отсутствие оценки содержания γδ-Т-лимфоцитов и клеток Лангерганса (CD207+), отсутствие исследования на модели хронического/рецидивирующего воспаления.

Известно также исследование [Chen С., Tan L., Zhu W., Lei L., Kuang Y., Liu P., Li J., Chen X., Peng C. Targeting Myeloid-Derived Suppressor Cells Is a Novel Strategy for Anti-Psoriasis Therapy. Mediators Inflamm. 2020 Jun 28;2020:8567320. doi: 10.1155/2020/8567320], в котором авторы используют модель имиквимод-индуцированного псориазоподобного воспаления кожи мышей BALB/c (6-8 недель). Целью исследования было изучение роли миелоидных супрессорных клеток (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs) в патогенезе псориаза, в ходе исследования было доказано накопление этих клеток в псориатических бляшках. Лечение гемцитабином, иммуносупрессантом, оказывающим действие преимущественно на накопление этих клеток, приводило к снижению MDSCs одновременно с регрессией псориаза, при этом снижалось количество Th17 и Treg в коже и снижалась экспрессия генов Timd2 и IL-21 в Т-хелперах. Существенной характеристикой метода является анализ клеточного состава селезенки и кожи и возможность использования метода в доклинических исследованиях. К недостаткам метода относятся: отсутствие исследования на модели хронического воспаления; использование мышей линии BALB/c, у которых по сравнению с мышами линии C57BL/6 развивается менее интенсивное воспаление; отсутствие учета γδ-Т-лимфоцитов; трудоемкость - анализ клеточного состава и кожи, и селезенки, с проведением функционального теста на секрецию IL-17A Т-хелперами.

В статье [Huang Z.Z., Xu Y., Xu M., Shi Z.R., Mai S.Z., Guo Z.X., Tang Z.Q., Luo Y.J., Guo Q., Xiong H. Artesunate alleviates imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis in BALB/c mice. Int Immunopharmacol. 2019 Oct;75:105817. doi: 10J016/j.mtimp.2019.105817.] модель имиквимод-индуцированного дерматита воспроизводят на мышах-самцах линии BALB/c возраста 8-10 недель. Далее исследуют с помощью проточной цитометрии клеточный состав селезенки и дренирующих лимфоузлов на содержание γδТ-лимфоцитов (помимо оценки воспаления кожи по mPASI, измерения ее толщины и гистопатологического исследования). В этой статье авторы изучают действие артесуната - производного артемизинина, препарата для лечения малярии, на развитие IMQ-индуцированного дерматита у мышей. В результате обнаруживают, что применение артесуната уменьшает клиническую выраженность псориазиформного воспаления, толщину кожи, экспрессию Ki-67 (фактора пролиферативной активности клеток), также в дренирующих пораженный участок кожи лимфатических узлах снижается число γδТ-лимфоцитов. Достоинства метода: анализ клеточного состава селезенки и дренирующих лимфоузлов; исследование γδТ-лимфоцитов.

Недостатки: невозможность применения метода в изучении эффективности наружных и системных методов терапии - отсутствие универсальности метода; использование мышей линии BALB/c, у которых по сравнению с мышами линии C57BL/6 развивается менее интенсивное воспаление; отсутствие исследований на модели хронического воспаления; не исследовали клеточный состав лейкоцитов кожи.

В статье [Nakamizo S., Honda Т., Adachi A., Nagatake Т., Kunisawa J., Kitoh A., Otsuka A., Dainichi T., Nomura T., Ginhoux F., Bcuta K., Egawa G., Kabashima K. High fat diet exacerbates murine psoriatic dermatitis by increasing the number of IL-17-producing γδ T celis. Sci Rep.2017 Oct 26;7(1):14076. doi: 10.1038/s41598-017-14292-1] авторы индуцируют у мышей дикого типа (WT) псориазоподобный дерматит ушей с помощью имиквимода. В этой статье изучается влияние богатой жирами диеты на развитие псориаза в модели IMQ-индуцированного дерматита у мышей. У мышей, получавших богатую жирами пищу, наблюдают обострение псориатического дерматита, который сопровождался повышенным накоплением в коже IL-17А-продуцирующих Vγ4+ γδ-Т-клеток. Эта диета также индуцирует увеличение содержания Vγ4+ γδ-Т-клеток в других органах, таких как дренирующие кожу лимфатические узлы, что предшествует их увеличению в коже. Кроме того, у мышей, получавших жирную диету, наблюдают повышенную экспрессию нескольких хемокинов, рекрутирующих γδ-Т-клетки в кожу. С другой стороны, у мышей ob/ob, другой модели мышиного ожирения при нормальном питании, не было ни обострения псориатического дерматита, ни накопления γδ-Т-клеток в дерме. Эти результаты показывают, что богатая жирами диета является важным фактором в обострении IMQ-индуцированного псориатического дерматита. Достоинства метода: анализ клеточного состава селезенки, кожи и дренирующих лимфоузлов с изучением γδТ-лимфоцитов и секреции цитокинов.

Недостатки: сложность в выполнении (извлечение лимфатических узлов) и затруднительно применение метода для изучения действия наружных лекарственных средств; использование мышей дикого типа, у которых по сравнению с мышами линии C57BL/6 развивается менее интенсивное воспаление; интенсивность воспаления не оценивали по mPASI, что не позволяет сделать объективную оценку эффективности терапии; отсутствие исследований на модели хронического воспаления; воспроизведение воспаления в области ушей - площадь поражения при таком воспроизведении меньше, чем при индукции воспаления в области спины животных.

В статье [Chen Y., Yan Y., Liu H., Qiu F., Liang C.L., Zhang Q., Huang R.Y., Han L., Lu C., Dai Z. Dihydroartemisinin ameliorates psoriatic skin inflammation and its relapse by diminishing CD8⁺ T-cell memory in wild-type and humanized mice. Theranostics. 2020 Aug 21;10(23):10466-10482. doi: 10.7150/thno.4521L] авторы изучают терапевтические эффекты дигидроартемизинина (ДГА) при псориазе и его рецидивах, а также лежащие в его основе механизмы, используя модель имиквимод-индуцированного воспаления у мышей BALB/c и NSG с трансплантированной кожей людей с псориазом. Мыши BALB/c были разделены на пять групп, включая контрольную, с нанесением нейтрального крема, с применением ДГА в низкой дозе, ДГА в высокой дозе и метотрексата. Используется модель острого имиквимод-индуцированного воспаления (7 дней применения имиквимода в дозе 62,5 мг накожно) и его рецидива (применение имиквимода в течение 7 дней в дозе 20,8 мг через 14 дней после первичного применения имиквимода). Во время первого воспроизведения модели животные соответствующих групп получают лечение вышеуказанными препаратами. Далее исследуют клеточный состав селезенки и экспрессию цитокинов в коже. Показано, что ДГА облегчает как острое воспаление кожи у мышей с псориазом, так и рецидив за счет уменьшения CD8+ центральных Т-клеток памяти (ТСМ) и CD8+ резидентных Т-клеток памяти (TRM). ДГА уменьшает инфильтрацию Т-клеток в коже мышей с имиквимод-индуцированным псориазом, одновременно подавляя экспрессию IL-15, IL-17 и других провоспалительных цитокинов в коже. ДГА снижает число CD8+, но не CD4+, субпопуляции CD44_highCD62L_high ТСМ у мышей с псориазом, тогда как метотрексат снижает CD4+, но не CD8+, частоту и количество ТСМ. Кроме того, ДГА, но не метотрексат, уменьшает присутствие клеток CD8+CLA+, CD8+CD69+ или CD8+CD103+TRM в коже мышей. Лечение ДГК, но не метотрексатом, во время первого проявления псориаза в значительной степени предотвращает рецидив псориаза, вызванный низкими дозами имиквимода, через две недели. Введение рекомбинантного IL-15 или CD8+, но не CD4+, клеток ТСМ приводит к полному рецидиву псориаза у мышей, ранее получавших ДГК. Наконец, ДГА облегчает псориатические поражения кожи человека у гуманизированных мышей NSG, которым трансплантировали пораженную кожу пациентов с псориазом, и снижает количество клеток CD8+ТСМ и CD 103+ TRM человека у гуманизированных мышей. Достоинства метода: используют модель рецидива псориаза. Недостатки: не исследовали клеточный состав кожи количественно цитофлуориметрическим методом; использование мышей линии BALB/c, у которых по сравнению с мышами линии C57BL/6 развивается менее интенсивное воспаление; трудоемкость: использование иммуногистохимического анализа. Кроме того, в исследовании используют различные методы, такие как ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинг, трансплантация кожи человека иммунодефицитным мышам, что является очень важным в фундаментально-научном аспекте, но малоприменимо как метод доклинического исследования лекарственных средств; авторы не проводят исследования γδТ-лимфоцитов и клеток Лангерганса.

В статье [Yang D., Guo Y., Wu J., Qin J., Wu J., Lu Y., Xiao Y., Zhang X., Ye J. Chinese herbal medicine Jia Wei Jing Xie Yin (JWJXY) ameliorates psoriasis via suppressing the Th17 cell response. Ann Transl Med. 2022 Mar;10(6):332. doi: 10.21037/atm-22-967] авторы исследуют травяной сбор китайской традиционной медицины Jia Wei Jing Xie Yin (JWJXY) на модели имиквимод-индуцированного дерматита самок мышей линии BALB/c. После воспроизведения модели анализируют кожу гистологически и иммуногистохимически (на CD11b и CD4), состав клеток селезенки анализируют с помощью проточной цитометрии, а также кожу - на экспрессию генов, связанных с Th17 клетками, с помощью ПЦР. Было показано, что JWJXY значительно уменьшает толщину кожи и ее инфильтрацию Т-клетками CD11b+ и CD4+. Результаты проточной цитометрии показали, что JWJXY снижает долю клеток В220 и Th17 в ткани селезенки мышей. Не было значительного влияния на долю Th1 или регуляторных Т-клеток (Treg). Кожа мышей в группе JWJXY показала значительно сниженную экспрессию РНК интерлейкина-17А (IL-17A), IL-17F, RORγt, IL -1β, IFN-γ и TNF-α. Достоинства метода: исследования секреции цитокинов; доклинические исследования.

Недостатки: используют мышей BALB/c, которые характеризуются по сравнению с мышами линий C57BL/6 более слабым воспалением; интенсивность воспаления не оценивали по mPASI, что не позволяет сделать объективную оценку эффективности терапии; не исследуют клеточный состав кожи количественно цитофлуориметрическим методом; не проводят исследований на модели хронического воспаления; не проводят исследования γδТ-лимфоцитов и клеток Лангерганса.

В статье [Xie X.J., Di Т.Т., Wang Y., Wang M.X., Meng Y.J., Lin Y., Xu X.L., Li P., Zhao J.X. Indirubin ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesions in mice by inhibiting inflammatory responses mediated by IL-17A-producing γδ T cells. Mol Immunol. 2018 Sep;101:386-395. doi: 10.1016/j.molimm.2018.07.011] изучают терапию индирубином имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита у мышей BALB/c. Мышей лечат физиологическим раствором (контроль), метотрексатом (положительный контроль), или различными дозами индирубина внутрь. Исследовали пролиферацию кератиноцитов, инфильтрацию воспалительными клетками, экспрессию воспалительных цитокинов и белков, связанных с путем JAKJSTAT, в пораженной коже. Численность γδ-Т-клеток в лимфатических узлах и селезенке определяют с помощью проточной цитометрии. Были протестированы экспрессия и секреция IL-17, а также активация путей Jak3/Stat3 в культивируемых in vitro γδ-Т-клетках. Индирубин улучшает пролиферацию кератиноцитов, уменьшает инфильтрацию CD3+ Т-клетками, IL-17-продуцирующих γδ Т-клетками и CD11b+ нейтрофилами, ингибирует экспрессию мРНК IL1, IL6, IL23, IL17a и IL22, а также экспрессию молекул сигнального пути JAKJSTAT. Индирубин также снижает количество γδ Т-клеток и CCR6+ γδ-Т-клеток (основной продуцент IL-17 А) в селезенке и лимфатических узлах. В культуре γδ-Т-клеток индирубин ингибирует экспрессию мРНК IL17a и Ifng и секрецию IL-17A, одновременно подавляя активацию путей Jak3/Stat3. Достоинства метода: исследования секреции цитокинов; проведение исследования эффективности терапии и возможность применения метода в доклинических исследованиях; исследование γδ-Т-клеток.

Недостатки: не исследован клеточный состав кожи количественно цитофлуориметрическим методом; использовались мыши дикого типа, которые характеризуются по сравнению с мышами линий C57BL/6 более слабым воспалением; трудоемкость за счет использования многообразных методов оценки экспрессии факторов иммунной системы; не проводились исследования на модели хронического воспаления.

Авторы статьи [Di Т.Т., Ruan Z.T., Zhao J.X., Wang Y., Liu X., Wang Y., Li P. Astilbin inhibits Thl7 cell differentiation and ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like skin lesions in BALB/c mice via Jak3/Stat3 signaling pathway. Int Immunopharmacol. 2016 Mar;32:32-38. doi: 10.1016/j.intimp.2015.12.035] используют мышиную модель псориаза, вызванного имиквимодом, для исследования влияния астильбина на воспаление. Мышам вводят от 25-50 мг/кг астильбина. Воспаление кожи оценивают с помощью проведения патогистологического исследования, уровни циркулирующих Т-клеток оценивают с помощью проточной цитометрии, цитокины - с помощью иммуноанализа на шариках. Jak/Stat3 в выделенных Т-клетках оценивали с помощью вестерн-блоттинга, экспрессию RORγt оценивали с помощью ОТ-ПЦР. Введение астильбина уменьшает индуцированную имиквимодом пролиферацию кератиноцитов, инфильтрацию CD3+ клетками в псориатических очагах, содержание в крови циркулирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток и воспалительных цитокинов (IL-17A, TNF-α, IL-6, IFN-γ и IL-2). In vitro астильбин ингибирует дифференцировку клеток Th17 и секрецию IL-17 изолированными Т-клетками, а также ингибирует передачу сигналов Jak/Stat3 в клетках Th17, повышая при этом экспрессию ингибитора Stat3 SCOSE3. Достоинства метода: исследования секреции цитокинов; возможность с помощью метода проведения доклинических исследований. Недостатки: использовались мыши BALB/c, которые характеризуются по сравнению с мышами линий C57BL/6 более слабым воспалением; не исследовались γδ-Т-клетки и клетки Лангерганса; отсутствуют исследования на модели хронического воспаления.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ, описанный в статье [Yoshiki R., Kabashima К., Honda Т., Nakamizo S., Sawada Y., Sugita K., Yoshioka H., Ohmori S., Malissen B., Tokura Y., Nakamura M. IL-23 from Langerhans cells is required for the development of imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis by induction of IL-17A-producing γδ T cells. J Invest Dermatol. 2014 Jul;134(7):1912-1921. doi: 10.1038/jid.2014.98.]. Авторы рассматривают вопросы роли Th17-, γδ-Т-клеток и клеток Лангерганса в развитии псориаза с использованием модели имиквимод-индуцированного псориаза у мышей. Показано, что истощение клеток Лангерганса с помощью дифтерийного токсина у мышей с нокаутированным лангериновым рецептором подавляет гиперкератоз, паракератоз и отек уха в областях, обработанных имиквимодом. Кроме того, у мышей с истощением клеток Лангерганса наблюдалось снижение уровня цитокинов, связанных с Th17, в очагах воспаления кожи. Обработанная имиквимодом кожа мышей с истощением клеток Лангерганса показала снижение количества IL-17А-продуцирующих CCR6+ γδ-Т-клеток. Эти результаты свидетельствуют о том, что клетки Лангерганса необходимы для развития псориазоподобных поражений, вызванных имиквимодом, у мышей. Достоинства метода: анализ клеточного состава кожи; авторы исследуют γδТ-лимфоциты, клетки Лангерганса и секрецию цитокинов.

Недостатки: воспроизведение воспаления в области ушей - площадь поражения при таком воспроизведении меньше, чем при индукции воспаления в области спины животных; интенсивность воспаления не оценивалась по mPASI, что не позволяет сделать объективную оценку эффективности терапии; трудоемкость метода - применение нескольких методов исследования - патогистология, иммуногистохимическое исследование, ПЦР в реальном времени, проточная цитофлюориметрия, исследование состава дренирующих лимфатических узлов; нет оценки воспаления с помощью индекса mPASI, что является необходимым для оценки выраженности воспаления; отсутствие исследований на модели хронического воспаления.

Задачей заявляемого изобретения является создание количественного способа оценки интенсивности воспаления при имиквимод-индуцированной модели псориаза мышей с помощью цитофлуориметрического анализа содержания γδ-Т-лимфоцитов и CD207+ клеток Лангерганса в коже мышей в целях доклинического исследования эффективности методов терапии.

Технический результат применения заявляемого способа: предложен количественный метод оценки интенсивности воспаления при имиквимод-индуцированной модели псориаза мышей с помощью цитофлуориметрического анализа содержания γδ-Т-лимфоцитов и CD207+ клеток Лангерганса в коже мышей в целях доклинического исследования эффективности методов терапии.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что способ включает следующие этапы:

1) оценивают интенсивность воспаления кожи у мышей по клиническим признакам (по шкале mPASI) и измеряют толщину кожи в очаге воспаления;

2) мышей подвергают эвтаназии, берут биоптаты пораженных участков кожи;

3) часть биоптатов подвергают патогистологическому исследованию, оценивая выраженность патоморфологических признаков псориазоподобного воспаления;

4) из биоптатов кожи получают суспензию клеток с помощью расщепления ткани кожи в растворе коллагеназы, далее клетки отмывают от ферментов и окрашивают с помощью моноклональных антител для проточной цитометрии;

5) методом проточной цитометрии оценивают доли γδТ-лимфоцитов и клеток Лангерганса.

Способ осуществляется следующим образом.

Мышей линии C57BL/6J индуцируют имиквимод-индуцированный псориазоподобный дерматит с локализацией в области спины. Мышам опытной группы во время воспроизведения модели проводят терапию в виде ежедневного нанесения на очаги воспаления кожи 1% мази гидрокортизона, в ежедневной дозе 62,5 мг/см на мышь в течение 7 дней; мыши группы сравнения не получают терапии. По окончании воспроизведения модели мышей подвергают эвтаназии и производят биопсию кожи в области сформированной кожной патологии и в аналогичной локализации у здоровых мышей группы контроля, размерами 2×2 см. Клеточную суспензию из кожи получают методом энзиматического расщепления, затем полученные клеточные суспензии инкубируют с антителами в 96-луночном кругл о донном планшете в течение 30 мин., после чего удаляют излишек несвязавшихся антител, добавляя в лунки планшета фосфатно-солевой буфер, центрифугируя при 400g и удаляя супернатант. Осадок клеток ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере и анализируют на проточном питометре. Наряду с количественной оценкой клеточного состава используют визуальную оценку с использованием шкалы mPASI.

Сходство прототипа с заявляемым изобретением заключается в выборе модели имиквимод-индуцированного псориазоподобного воспаления кожи мышей, применении мышей C57BL/6J, исследовании γδ-Т-лимфоцитов и клеток Лангерганса в коже.

Преимуществами заявленного изобретения в сравнении с прототипом являются: 1) использование кожи спины мышей, что позволяет получить большую площадь поражения, оптимальную для проведения оценки выраженности воспаления и большую площадь и объем тканей для патогистологического и цитофлуориметрического анализа; 2) простота в исполнении и экономичность - используют только один метод для количественной оценки - проточной цитофлюориметрии и только два маркера; 3) объективность оценки воспаления - наряду с количественной оценкой клеточного состава лейкоцитов кожи используется визуальная оценка интенсивности воспаления с помощью индекса mPASI, также проводится сопоставление данных mPASI, патогистологических признаков и содержания γδ-Т-лимфоцитов и клеток Лангерганса в коже; 4) метод универсален для оценки эффективности методов наружной и системной терапии.

Наиболее значимыми преимуществами данного изобретения являются ее универсальность для объективной оценки эффекта различных методов терапии, экономичность с учетом условия использования одного метода - проточной цитофлюориметрии, наряду с визуальной оценкой воспаления с помощью индекса mPASI и патогистологическими характеристиками, а также с учетом изучения только двух маркеров (γδTCR+ и CD207+). Способ эффективен как в модели острого, так и хронического воспаления, является объективным методом оценки воспаления in vitro. Используется кожа спины мышей, что позволяет получить большую площадь поражения, оптимальную для проведения оценки выраженности воспаления и большую площадь и объем тканей для патогистологического и цитофлуориметрического анализа.

Заявляемое изобретение иллюстрируется таблицами 1-4.

В таблице 1 дана сравнительная характеристика группы, получавшей 1% мазь гидрокортизона на фоне индуктора патологии - 5% крема имиквимода, и группы, получавшей только индуктор патологии - 5% крем имиквимода, по степени выраженности эритемы, инфильтрации, шелушения и площади поражения на 7-й день воспроизведения модели.

В таблице 2 представлена сравнительная характеристика группы, получавшей 1% мазь гидрокортизона на фоне индуктора патологии 5% крема имиквимода, и группы, получавшей только индуктор патологии крема 5% крема имиквимода, по толщине кожи в очаге воспаления.

В таблице 3 представлены сравнительные данные патогистологических признаков псориазоподобного имиквимод-индуцированного воспаления в двух группах - в результате применения мази гидрокортизон 1% на фоне индуктора патологии крема имиквимода 5% и в результате применения только индуктора патологии крема имиквимода 5%.

В таблице 4 представлены данные проточной цитофлюориметрии о содержании субпопуляций лейкоцитов, выделенных из кожного биоптата мышей с имиквимод-индуцированным воспалением. Группа 1 получала терапию мазью гидрокортизон 1% на фоне индуктора патологии, группа 2 получала только индуктор патологии. По данным проточной цитофлюориметрии клеток, выделенных из кожного биоптата мышей с хроническим имиквимод-индуцированным воспалением, были получены данные, свидетельствующие о наличии субпопуляций, которые были достоверно изменены в 1 и 2 исследуемых группах мышей и имели однонаправленный характер (рост или снижение). К этим параметрам относятся клетки с иммунофенотипом CD4+, CD11c+, CD80+, CD83+, CD83+CD86+.

Пример 1. Изучение эффективности 1% мази гидрокортизона на модели хронического псориазоподобного воспаления, индуцированного имиквимодом, с заявленными характеристиками.

В опыт были взяты самки мышей линии C57BL/6J массой тела 20±0,6 г и возрастом 9 недель к первому дню исследования. Животные прошли карантинизацию в течение 14 дней до включения в исследование. Животных во время карантина и во время проведения опыта содержали в стандартных условиях: 20-26°С и относительной влажности воздуха 30-70%, NH₃≤10 мг/м₃, CO₂≤0,15 об. %. Световой режим составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Далее всем животным удаляли шерсть площадью равной примерно 2×3 см с помощью гипоаллергенного эпилирующего крема. На следующий день равномерно на кожу эпилированного участка наносили 5% крем имиквимода в ежедневной дозе 62,5 мг/см² на животное в течение 7 дней. Аккуратно массажными движениями крем втирали до полного впитывания в кожу. После воспроизведения острой патологии на 7-й день мыши были оставлены без применения наружных средств на 14 дней для купирования воспаления. Спустя 14 дней отдыха на 21-й день исследования всем мышам после проведения измерений массы тела и толщины кожи было проведено 7-ми дневное нанесение индуктора патологии в тех же дозах. Первая группа мышей на фоне воспроизведения патологии получала терапию 1% мазью гидрокортизона в ежедневной дозе 62,5 мг/см² на животное в течение 7 дней, вторая группа животных оставалась без лечения. По окончанию терапии проводилась оценка выраженности воспаления с помощью измерения толщины кожи, выраженности эритемы, шелушения и инфильтрации по системе баллов, был определен индекс тяжести воспаления (mPASI), а также с помощью фотографирования области спины в месте нанесения препарата.

Было показано, что к седьмому дню терапии гидрокортизоном у мышей, подвергающихся одновременному воздействию имиквимода, выраженность воспаления по клиническим признакам была значимо ниже, чем у мышей, получавших только имиквимод. Это нашло отражение в снижении в группе, получавшей гидрокортизон, эритемы с (12,8±1,13) до (3,6±0,73) баллов, инфильтрации с (3,6±0,4) до (1,2±0,53) баллов, шелушения с (3,2±0,53) до (0,6±0,4) баллов, соответственно индекс тяжести mPASI снизился в этой группе с (19,2±1,33) до (5,4±0,93) балов. Площадь поражения уменьшилась при применении мази гидрокортизон, с (90±10%) до (45±13,33%) (табл.1).

При сравнении динамики толщины кожи мышей в очагах имиквимод-индуцированного дерматита наблюдали значимые изменения толщины кожи: утолщение кожи в группе мышей, получавших только имиквимод, и уменьшение толщины ее в группе мышей, получавших также лечение гидрокортизоном. На 7 день терапии гидрокортизоном толщина кожи у двух групп мышей значимо (р<0,01) отличалась, толщина кожи у леченных гидрокортизоном мышей была в 1,5 раза меньше (1,03±0,045 мм) по сравнению с группой 1 (1,58±0,24 мм) (табл. 2).

После проведения оценки воспаления мыши подвергнуты эвтаназии и осуществлена биопсия кожи в области нанесения препаратов (имиквимод/гидрокортизон), в контрольной группе также осуществлен забор биоптатов кожи в той же локализации.

Образцы кожи вырезают так, чтобы в микроскопическом срезе сохранялись топографические соотношения, характерные для исследуемого материала. Биоптат кожи помещают в емкость с фиксатором, объем фиксирующей жидкости превышал в 20 раз объем фиксируемого объекта. Если объект был разрезан на фрагменты толщиной более 5-6 мм, его оставляют в фиксаторе на 2-3 часа для уплотнения, после чего ткань рассекают на пластины толщиной 2-3 мм и помещают в свежий раствор фиксатора. Ткани для гистологического исследования фиксировались в 10%-ом растворе нейтрального формалина в течение 24 часов. Далее производилась проводка материала на аппарате вакуумного типа Excelsior AS (Thermo Shandon): парафин - ксилол - парафин. Суммарное время проводки 13 часов 30 минут. После по общепринятой методике фрагменты тканей заливались в парафин. Затем изготавливались срезы толщиной 3 мкм, с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином. Анализ гистологических препаратов проводился при помощи светооптического микроскопа Carl Zeiss Axio Imager A2 (Германия) при увеличении х400. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры AxioCam 105 Color 1 и программного обеспечения ZEN 2.5 (blue edition) (Германия). Для оценки воспаления кожи была применена полуколичественная оценка поражения 0-3 баллов, где: 0 - отсутствие воспаления; 1 - воспаление слабой степени: небольшое количество лимфоцитов определяется в эпидермисе, дерме и в подлежащей жировой клетчатке, носит очаговый характер, гиперкератоз незначителен; 2 - воспаление умеренной степени: увеличение количества клеток воспаления, увеличение площади поражения, небольшие участки некроза в пределах эпидермиса; 3 - выраженное воспаление: большое количество воспалительных элементов, может наблюдаться некроз, процесс распространяется обширно вплоть до подкожно-жировой клетчатки и мышечного слоя, выраженный гиперкератоз. Также каждый морфологический признак был оценен по шкале баллов от 0 до 3. Для морфометрической оценки изменений в коже была измерена толщина эпидермиса.

Результаты патогистологического исследования продемонстрировали, что группа, получающая местную терапию мазью гидрокортизон, характеризуется снижением признаков воспаления, выраженности акантоза до (0,3±0,56) баллов, гиперкератоза и папилломатоза до (0,15±0,36) баллов, лимфоцитарной инфильтрации кожи до (0,25±0,62) баллов, а также полным отсутствием микроабсцессов Мунро и уменьшением толщины кожи до (0,05±0,21) баллов. Группа 1 достоверно отличалась от группы 2 по всем изучаемым характеристикам псориазоподобного воспаления кожи (табл.3).

Далее проведена подготовка образцов кожи для изоляции клеток с целью проведения цитофлуориметрии. Лоскуты кожи погружают в раствор коллагеназы (1,6 мг/мл) и инкубируют в течение 3-х часов, после чего суспензию клеток отмывают дважды в фосфатно-солевом буфере методом центрифугирования-ресуспендирования. Концентрацию суспензии доводят до 1 млн/мл. Суспензии клеток инкубируют с антителами в 96-луночном круглодонном планшете в течение 30 мин., после чего удаляют излишек несвязавшихся антител, добавляя в лунки планшета фосфатно-солевой буфер, центрифугируя при 400g и удаляя супернатант. Осадок клеток ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере и анализируют на проточном питометре.

В результате определения субпопуляций лейкоцитов, выделенных из кожного биоптата мышей с имиквимод-индуцированным воспалением, были получены данные, свидетельствующие о наличии субпопуляций, которые были достоверно изменены в 1 и 2 исследуемых группах мышей и имели однонаправленный характер (рост или снижение). К этим параметрам относятся клетки с иммунофенотипом CD4+, CD11c+, CD80+, CD83+, CD83+CD86+.

Субпопуляция CD4+клеток была снижена у мышей в 1 группе в 7,3 раз (2,66±0,25%) по сравнению с контролем, в группе, получавшей терапию гидрокортизоном, этот показатель повысился до (13,2±0,64%), однако был ниже показателя в группе здоровых мышей (19,14±0,48%).

Клетки с фенотипом CD80+ были обнаружены в меньшем количестве также в сравниваемых группах 1 и 2, в 2,4 и 3,7 раз соответственно.

Доля клеток, экспрессирующих дифференцировочные антигены дендритных клеток (CD11c+, CD83+, CD83+CD86+), была повышена у мышей исследуемых групп. Уровень клеток с фенотипом CD11c+ был повышен в 2,1-2,3 раза, терапия не повлияла на нормализацию этого показателя.

Процент CD83+ клеток был выше в 1,8-2,8 раз: значения в исследуемых группах составили (49,52±2,66%) и (37,16±1,23%) соответственно, при этом терапия не привела к изменению содержания в коже этих клеток.

Доля клеток, экспрессирующих CD86, была повышена в 2,2 раза у мышей 1-й группы по сравнению с контролем (26,64±0,63% против 11,72±0,77%), в то время как в группе, где применялся наружно гидрокортизон в виде мази, этот показатель не отличался от здоровых мышей в группе контроля (11,46±0,39%).

Субпопуляция CD83+CD86+ клеток в коже мышей в исследуемых группах содержалась в 1,4-3,3 раз большем количестве по сравнению с контролем, при этом максимальное увеличение данных клеток отмечалось у мышей 1-й группы без лечения, применение терапии гидрокортизоном привело к снижению этого показателя (6,74±0,31%) почти до нормальных значений (4,18±0,86%).

Количество Т-клеточной субпопуляции CD8a+было снижено в группе 2 мышей, получавшей гидрокортизон на фоне продолжения нанесения имиквимода (2,68±0,34%) и это значительно ниже этого показателя группы здоровых мышей.

Количество клеток с активационным маркером CD38 у мышей 1 и 2 групп различалось и составило (47,92±2,45%) и (33,02±0,90%) соответственно, и таким образом в группе воспроизведенной хронической патологии этот показатель немного превышал показатель в группе контроля, в то время как при применении гидрокортизона наружно этот показатель снижался ниже показателя группы контроля.

Клетки с иммунофенотипом CD205+, были повышены по сравнению с контролем, в группе без лечения патологии (64,52±0,49%), в то время как применение гидрокортизона способствовало снижению числа этих клеток до (51,04±0,75%), что указывает на нормализацию этого показателя в ходе терапии гидрокортизоном.

Содержание γδ-Т-клеток было значительно выше (в 2,8 раза) у мышей, не получавших терапии псориазоподобного дерматита и составило (64,6±2,36%), в то время как при применении наружно мази гидрокортизона этот показатель снижался до (37,64±1,31%), приближаясь к показателям в группе здоровых мышей (22,82±0,86%).

В наибольшей степени изменялась доля клеток, считающихся одними из основных факторов воспаления при псориазе - γδ-Т-лимфоцитов и клеток Лангерганса (CD207+). Количество клеток Лангерганса, выявляемых по экспрессии маркера CD207, у мышей 1-й группы было увеличено в 8,1 раза ((13,84±0,71%) против (1,7±0,2%) в контроле), применение терапии гидрокортизоном привело к нормализации этого показателя до (1,32±0,26%).

Таким образом, надо отметить, что при имиквимод-индуцированном воспалении кожи применение противовоспалительной терапии приводит к снижению исходно высоких значений содержания субпопуляций γδ-Т-лимфоцитов более, чем в 2 раза и клеток, экспрессирующих маркер CD207 (клеток Лангерганса) не более, чем в 10 раз. Также терапия мазью гидрокортизона привела к снижению исходно высоких значений процентного содержания CD83+CD86+ клеток, и повысила содержание CD4+ клеток (табл. 4).

В заявленном изобретении используется экспериментальная модель хронического имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита у мышей (самок линии C57BL/6), при этом для формирования оценки эффективности терапии исследуются признаки, отражающие интенсивность воспаления в этой модели.

Оценку эффективности терапии проводят по критериям снижения количества γδ-Т-лимфоцитов в 2 и более раз, клеток Лангерганса CD207+ не более, чем в 10,5 раз, а также с использованием шкалы mPASI (табл. 4).

Заявляемый метод оценки эффективности терапии позволяет выполнить более точную оценку противовоспалительного эффекта лекарственных препаратов и химических веществ с помощью предложенных критериев, которые имеют количественные характеристики, при проведении доклинических исследований.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно для доклинических исследований лекарственных препаратов местного и системного действия, и касается оценки эффективности терапии в мышиной экспериментальной модели имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита. Мышам опытной группы проводят терапию 1% мазью гидрокортизона в ежедневной дозе 62,5 мг/см на животное в течение 7 дней. Из биоптатов пораженных участков кожи спины мышей получают суспензию клеток с помощью расщепления ткани кожи в растворе коллагеназы. Далее клетки отмывают от ферментов и окрашивают с помощью моноклональных антител для проточной цитометрии; методом проточной цитометрии проводят оценку процентного содержания γδ Т-лимфоцитов - γδTCR+ клеток и клеток Лангерганса - CD207+ клеток в коже. Проведенную терапию оценивают эффективной при снижении количества γδ Т-лимфоцитов в 2 и более раз, клеток Лангерганса CD207+ не более чем в 10,5 раз и снижении индекса mPASI относительно значений в группах мышей без проводимого лечения. Изобретение обеспечивает количественную оценку интенсивности воспаления при имиквимод-индуцированной модели псориаза мышей с помощью цитофлуориметрического анализа содержания γδ Т-лимфоцитов и CD207+ клеток Лангерганса в коже мышей в целях доклинического исследования. 4 табл.

Способ оценки эффективности терапии в мышиной экспериментальной модели имиквимод-индуцированного псориазоподобного дерматита, включающий применение наружного противовоспалительного препарата у самок линейных мышей C57BL/6J, оценку процентного содержания γδ Т-лимфоцитов - γδTCR+ клеток и клеток Лангерганса - CD207+ клеток в коже, отличающийся тем, что мышам опытной группы проводят терапию 1% мазью гидрокортизона в ежедневной дозе 62,5 мг/см на животное в течение 7 дней, из биоптатов пораженных участков кожи спины мышей получают суспензию клеток с помощью расщепления ткани кожи в растворе коллагеназы, далее клетки отмывают от ферментов и окрашивают с помощью моноклональных антител для проточной цитометрии; методом проточной цитометрии оценивают доли γδ Т-лимфоцитов и клеток Лангерганса в коже; проведенная терапия является эффективной при снижении количества γδ Т-лимфоцитов в 2 и более раз, клеток Лангерганса CD207+ не более чем в 10,5 раз и снижении индекса mPASI относительно значений в группах мышей без проводимого лечения.