Способ угнетения роста опухолевых клеток с помощью магниторезонансной гипертермии и таргетированных аптамерами магнитных наночастиц Российский патент 2024 года по МПК A61K47/00 G01N22/00 

Изобретение относится к биофизике, медицине в области экспериментальной онкологии и предназначено для угнетения роста опухолевых клеток как основной, так и сопутствующий способ терапии.

Для локальной гипертермии опухолей используются магнитные поля с различными амплитудными значениями в широком диапазоне частот. Известен способ [Патент RU 2203701 C2, МПК A61N5/02, опубл. 10.05.2003] для лечения злокачественных опухолей путем ее прогрева электромагнитной энергией СВЧ-диапазона. Способ осуществляют распределением электромагнитного сигнала генератора СВЧ между отдельными излучателями. Несмотря на то, что изобретение позволяет повысить точности фокусировки электромагнитного поля в заданной области нагрева, к основным недостаткам данного изобретения (и других устройств для СВЧ-нагрева) является возможность перегрева тканей с высоким сопротивлением (кости, сухожилия и т.д.).

Устройства, использующие СВЧ поля, характеризуются малой глубиной проникновения в биологические ткани. Более перспективным с точки зрения глубины проникновения являются подходы, использующие УВЧ поля (300-30 МГц). Так, известно устройство [Патент RU 2372116 C2, МПК A61N5/01, A61B18/12, опубл. 10.11.2009] для локальной гипертермии опухолей, которое содержит генератор УВЧ поля и подключенные к нему два электрода, каждый из которых снабжен аппликатором, выполненным в виде сильфона, содержащим эластичную рабочую стенку и заполненный жидким диэлектриком, средства для ориентации электродов и подачи жидкого диэлектрика, систему управления генератором УВЧ поля, игольчатые термодатчики с восьмиканальным термометрическим прибором. Устройство снабжено также сканирующим электромеханическим приводом, термостатом с возможностью автоматического регулирования температуры, мобильным гипертермическим столом для пациента и эластичным катетером с гибким термодатчиком, термостатом, при этом катетер заполнен электропроводной жидкостью. Данное устройство безусловно позволяет снизить риск термического повреждения здоровых тканей, однако очень сложно в исполнении.

Для нагрева опухолевых тканей хорошо известны подходы, использующие индукционный нагрев электропроводных материалов. Так, в изобретении [Патент RU 2497489 C1, МПК A61F7/12, опубл. 10.11.2013] предлагается использовать тканезамещающий аппликатор, изготовленный из полимерного материала (силиконовая слепочная масса Speedex putty) с добавлением электропроводных ферромагнитных стальных шаров размером 200-1000 мкм на частоте 50-150 кГц. В данном способе помимо нагрева за счет токов Фуко должно присутствовать тепловыделение за счет гистерезисных потерь при перемагничивании ферромагнитных шаров.

Известно изобретение [Патент RU 2733467 C1, МПК А61В18/18, A61F7/00, опубл.01.10.2020], также использующее индукционный нагрев, в котором в качестве тепловыделяющего агента (в имплантатах) используется жидкий легкоплавкий металлический сплав на основе индия и галлия (с добавлением олова и цинка) в переменных полях частотой 50-300 кГц. Основной недостаток в описанных изобретениях заключается в том, что имплантат, содержащий электропроводящие материалы, необходимо размещать вблизи опухоли (или в ложе удаленной опухоли), поэтому требует хирургического вмешательства.

Группа изобретений [Патент RU 2713375 C2, МПК A61N2/00, B82B1/00, опубл. 04.02.2020] посвящена разработке способа наномеханического воздействия на клеточные структуры с целью управления их функционированием, в том числе для онкотерапии. В данном подходе в качестве медиаторов предлагают использовать суперпарамагнитные наночастицы, постоянное (градиентное) магнитное поле и переменное низкочастотное магнитное поле. Амплитуда и частота переменного магнитного поля подбираются таким образом, чтобы обеспечить перемагничивание наночастиц за счет броуновского механизма. Предлагаемый подход позволяет избежать существенного нагрева наночастиц, однако обеспечивает периодическое механическое воздействие на прилегающие клеточные структуры. Основной недостаток предлагаемого способа воздействия заключается в сложности концентрирования препарата на клеточных мишенях, несмотря на использование градиентного магнитного поля.

Группа изобретений [Патент RU 2633918 C9, МПК A61N2/04, B82B1/00, опубл. 19.10.2017] посвящена лечению злокачественных новообразований с помощью магнитной гипертермии, основанной на эффектах перемагничивания наночастиц. Авторы предлагают использовать Zn-замещенные магнитные порошки феррита марганца формулы Zn_xMn_1-xFe₂O₄ (х=0-0,9) и фармацевтические композиции на их основе. В данном изобретении средний размер наночастиц составляет менее 40 нм, температура Кюри составляет от 39 до 550°С, и коэрцитивная сила составляет от 5 до 250 Э. Для перемагничивания наночастиц (обеспечивающего тепловыделение) предлагают использовать магнитные поля (переменного тока) с амплитудой от 14 Э до 300 Э и частотой от 80 до 1000 кГц. Основным недостатком данного изобретения (и других изобретений, посвященных магнитной гипертермии за счет перемагничивания) является необходимость использовать переменные магнитные поля (постоянные магнитные поля можно создавать постоянными магнитами) с амплитудами в сотни эрстед, и, следовательно, изготавливать конструкции для генерирования этих переменных магнитных полей.

В изобретении [Патент RU 2348436 C2, A61N2/04, A61N2/10, опубл. 10.03.2009] авторы используют постоянное и переменное магнитное поле и эффект тепловыделения при перемагничивании магнитоуправляемого противоопухолевого препарата, содержащего цитостатические средства (порошок γ-Fe₂O₃ от 3,6 до 54 мг, содержание цитостатического средства от 0,4 до 6 мкг, удельная намагниченность насыщения (M_s) 7.5 kA/m, pH 6.6, электрокинетический потенциал (ζ) +15 mV, удельная абсорбция электромагнитной энергии 260 Вт/г Fe), который вводят в опухоль. Для концентрирования препарата используют градиентное постоянное магнитное поле. Для нагрева используют переменное магнитное поле с частотой 0,01-1,0 МГц, напряженностью 7,2 - 12,0 кА/м, ((1 Э ≈ 80 А/м) или (90-151 Э)) мощностью 0,15-15 кВт. Недостатками данного изобретения являются сложности с фокусировкой препарата в опухоли, необходимость изготавливать конструкции для генерирования переменного магнитного поля и градиентного постоянного магнитного поля. Также, ввиду того что магнитное поле обладает высокой проницаемостью, оно неизбежно влияет на ткани, в которых окажутся наночастицы не только в рабочем пространстве, но и в достаточно большой области вокруг.

Известно устройство для лечения рака молочной железы с использованием суперпарамагнитных наночастиц Fe₂O₃ (маггемит), Y₃Fe₅O₁₂ (железоиттриевый гранат) [Патент US 7945335 B2, МПК A61F2/00, опубл. 17.05.2011], содержащее магнитную систему, формирующую градиентное магнитное поле для фокусировки магнитных наночастиц на опухоль и имеющее фазированную антенную решетку, предназначенную для формирования переменного магнитного поля в диапазоне частот от 100 до 200 МГц. Данное изобретение выбрано нами в качестве прототипа. Переменное электромагнитное поле является крайне неоднородным с амплитудой от 0 до ~ 0,1 Э. В патенте авторы предлагают модифицированный способ нагрева высокочастотным электромагнитным полем опухолевой ткани. На частотах 100-200 МГц осуществляется прогрев тканей на глубине до 20 см как здоровых, так и злокачественных до ≈ 42°С за счет электрической компоненты электромагнитного поля. Данные температуры являются безобидными для прогреваемых тканей (как для здоровых, так и для злокачественных). Дальнейшее повышение температуры (на 3-10°С) обеспечивается тепловыделением магнитных наночастиц. Авторы сравнивают тепловыделение за счет двух возможных механизмов: за счет неелевского перемагничивания суперпарамагнитных наночастиц (в переменном поле с частотой 100-200 МГц, с амплитудой h<0,1 Э) и за счет явления ферромагнитного резонанса (в качестве поля насыщения выступает градиентное поле, частота ВЧ поля 100-200 МГц, с амплитудой h<0,1 Э). Для расчетов выделяемой мощности при неелевском перемагничивании и при ферромагнитном резонансе необходимо использовать времена релаксации используемых наночастиц. Определение времени релаксации - это отдельная экспериментальная задача, которая в обсуждаемом патенте не решается. Авторы для расчета выделяемой мощности перебирают несколько значений времен релаксации, на основании чего делают выводы о возможных механизмах.

Недостатком предложенного устройства является существенная пространственная неоднородность высокочастотного магнитного поля, что вызвано использованием высокочастотной антенны, формирующей электромагнитные волны в области размещения объекта. Также недостатками данного изобретения являются сложности с фокусировкой магнитных наночастиц в опухоли и необходимости изготавливать конструкции для создания градиентного постоянного магнитного поля. Сложности нацеливания магнитных частиц на мишени приводит к нежелательному нагреву здоровых тканей независимо от реализующего механизма тепловыделения.

Техническим результатом изобретения является повышение связываемости модифицированных кремнием магнитных наночастиц и клеток опухоли, повышение эффективности нагрева за счет эффекта ферромагнитного резонанса в магнитных наночастицах, что приводит к инициации процессов апоптоза.

Технический результат достигается за счет того, что в способе угнетения роста опухолевых клеток с помощью магниторезонансной гипертермии и таргетированных аптамерами магнитных наночастиц, новым является то, что в качестве тепловых медиаторов используют магнитные наночастицы (МН), имеющие модифицированную оболочку из оксида кремния Fe₃O₄@SiO₂@NH₂ с конъюгированными аптамерами, комплементарными асцитной карциноме Эрлиха, на МН воздействуют постоянным магнитным и сверхвысокочастотным электромагнитным полем (СВЧ), используемые поля ортогональны, при совпадении частоты прецессии вектора намагниченности вокруг постоянного магнитного поля и частоты СВЧ поля возникает явление ферромагнитного резонанса (ФМР), в результате чего происходит нагрев магнитных наночастиц за счет поглощения энергии СВЧ поля.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается тем, что в качестве тепловых медиаторов используют магнитные наночастицы (МН), имеющие модифицированную оболочку из оксида кремния Fe3O4@SiO2@NH2 с конъюгированными аптамерами, комплементарными асцитной карциноме Эрлиха. Вторым существенным отличием является то, что тепловыделение происходит только за счет явления ферромагнитного резонанса.

Данное изобретение поясняется чертежами. На фиг. 1 представлен ФМР-спектр порошков магнетита с покрытием TEOS/APTES при СВЧ 8.9 ГГц при комнатной температуре. На фиг. 2 показана зависимость приращения температуры порошков магнетита с покрытием TEOS/APTES от времени при различных значениях усиления, т.е. (h/h₀)², в резонансном поле. На фиг. 3 показана жизнеспособность клеток асцитной карциномы Элриха после гипертермии: а - процент живых клеток, б - процент клеток в состоянии апоптоза, в - процент клеток в состоянии некроза.

Заявляемый способ гипертермии может быть реализован следующим образом.

Методом химического соосаждения изготавливают наночастицы магнетита. Для их получения в раствор двух- и трехвалентного железа в молярной пропорции 1 : 2 добавляют щелочь, формула получения может быть описана как:

FeCl₂+2FeCl₃+8NH₃*H₂O→Fe₃O₄+8NH₄Cl+4H₂O.

Функционализацию поверхности наночастиц проводят методом покрытия тетраэтоксисиланом (TEOS) и 3-аминопропилтриэтоксисиланом (APTES) с последующим присоединением аптаметров. Для реализации метода 1 мл суспензии наночастиц (20 мг порошка МН в деионизованной воде) добавляют к смеси, содержащей 95 мл этанола и 4 мл воды. Полученную суспензию подвергают воздействию ультразвука в течение 3 минут, после добавляют 10 мл 25% раствора NH₄OH и затем - 350 мл TEOS, капельно. Реакционную смесь выдерживают 3,5 часа на механической мешалке при комнатной температуре.

Осадок ферритсодержащих наночастиц собирают с применением магнита, супернатант удаляли. Далее к осадку приливают 100 мл смеси этанол-вода в соотношении 19 : 1, и снова перемешивают в течение 10 минут. По завершении добавляют 80 мл APTES. Помещают смесь на водяную баню и нагревают до 70°С в течение 30 минут при постоянном перемешивании, а затем переносят в комнатную температуру и доливают этанол до 100 мл. Оставлялют инкубироваться при постоянном механическом перемешивании на 20 часов. По окончании инкубации МН собирают магнитом, отмывают трижды по 150 мл воды и сохраняют в виде суспензии в воде.

Используют аптамер (олигонуклеотид) FAS9, комплементарный асцитной карциноме Эрлиха, с флуоресцентным белком. FAS9 представляет собой последовательность: [5 - /56-FAM/CTC CTC TGA CTG TAA CCA CGA CTG AGC TTT GGT GGG TCG AGC TAT GTG GTG CCT CTT CAC GCA TAG GTA GTC CAG AAG CC-3] [Коловская О.С., Замай Т.Н., Замай А.С., Глазырин Ю.Е., Спивак Е.А., Зубкова О.А., Кадкина А.В., Еркаев Е.Н., Замай Г.С., Савицкая А.Г., Труфанова Л.В., Петрова Л.Л., Березовский М.В. Взаимодействие ДНК-аптамер/белок как причина апоптоза и остановки пролиферации в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Биологические мембраны. 2013, Т.30, №5-6, стр. 398-411. DOI: 10.7868/S023347551305006X]. Аптамеры хранятся при температуре -20°С и для разморозки подвергаются быстрому оттаиванию при температуре 95°С в течение 20 минут, после чего постепенно остывают до комнатной температуры для формирования вторичной структуры. После стабилизации температуры аптамеры иммобилизируют на поверхности магнитных наночастиц.

Спектр ферромагнитного резонанса частиц показал, что на частоте СВЧ 8,9 ГГц максимум поглощения для частиц магнетита, функционализированных методом APTES-TEOS, регистрировался при H_res = 3,1 кЭ (фиг. 1). Температурные зависимости от времени при различной мощности СВЧ поля показаны на фиг. 2.

Далее наночастицы магнетита, функционализированные аптамерами FAS9, приливают к суспензии клеток асцитной карциномы Эрлиха из расчета 4 мг порошка на 1 мл суспензии. Получившуюся суспензию выдерживают в течение 10 минут в условиях ФМР при f_res = 8,9 ГГц, H_res ≈ 3 кЭ.

Для оценки эффективности гипертермического воздействия проведен цитометрический анализ (фиг. 3) жизнеспособности клеток асцитной карциномы Эрлиха сразу, через час и через два часа после воздействия. Использовали четыре группы для оценки жизнеспособности клеток опухоли. Группа контроля, группа клеток АКЭ+МНЧ - взаимодействующих с магнитными наночастицами, группа клеток АКЭ+СВЧ - без наночастиц подвергшихся воздействию постоянного магнитного поля и СВЧ, а также группа АКЭ+МНЧ+ФМР - в которой клетки опухоли взаимодействовали с магнитными наночастицами в условиях ферромагнитного резонанса.

Анализ жизнеспособности клеток опухоли проводили по процентному содержанию фракций клеток в суспензии: определяли процентное отношение живых клеток (фиг. 3, а), клеток в состоянии апоптоза (фиг. 3, б) и клеток в состоянии некроза (фиг. 3, в) к общему числу клеток. Полученные данные показывают, что процентное содержание живых клеток опухоли в суспензии изменялось только в случае ФМР-гипертермии, снижаясь с 92% в контроле до 79% в группе АКЭ+МНЧ+ФМР. Фракция апоптатических клеток показала рост только в группе АКЭ+МНЧ+ФМР. Фиксировалось повышение с 3-5% в контроле до 11,5%. Похожая картина наблюдалась и для фракции некротических клеток. Наблюдался рост в группе АКЭ+МНЧ+ФМР с 4% в контроле до 11,7%.

Изобретение относится к биофизике, медицине в области экспериментальной онкологии и предназначено для угнетения роста опухолевых клеток как основной, так и сопутствующий способ терапии. Представлен способ угнетения роста опухолевых клеток с помощью магниторезонансной гипертермии и таргетированных аптамерами магнитных наночастиц, характеризующийся тем, что в качестве тепловых медиаторов используют магнитные наночастицы (МН), имеющие модифицированную оболочку из оксида кремния Fe₃O₄@SiO₂@NH₂ с конъюгированными аптамерами, комплементарными асцитной карциноме Эрлиха, на МН воздействуют постоянным магнитным и сверхвысокочастотным электромагнитным полем (СВЧ), используемые поля ортогональны, при совпадении частоты прецессии вектора намагниченности вокруг постоянного магнитного поля и частоты СВЧ поля возникает явление ферромагнитного резонанса (ФМР), в результате чего происходит нагрев магнитных наночастиц за счет поглощения энергии СВЧ поля. Изобретение обеспечивает повышение связываемости модифицированных кремнием магнитных наночастиц и клеток опухоли, повышение эффективности нагрева за счет эффекта ферромагнитного резонанса в магнитных наночастицах, что приводит к инициации процессов апоптоза. 3 ил.

Способ угнетения роста опухолевых клеток с помощью магниторезонансной гипертермии и таргетированных аптамерами магнитных наночастиц, отличающийся тем, что в качестве тепловых медиаторов используют магнитные наночастицы (МН), имеющие модифицированную оболочку из оксида кремния Fe₃O₄@SiO₂@NH₂ с конъюгированными аптамерами, комплементарными асцитной карциноме Эрлиха, на МН воздействуют постоянным магнитным и сверхвысокочастотным электромагнитным полем (СВЧ), используемые поля ортогональны, при совпадении частоты прецессии вектора намагниченности вокруг постоянного магнитного поля и частоты СВЧ поля возникает явление ферромагнитного резонанса (ФМР), в результате чего происходит нагрев магнитных наночастиц за счет поглощения энергии СВЧ поля.