СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ В КЛЕТКАХ, РАСПОЛОЖЕННЫХ ДО ОБЛУЧАЕМОГО ОБЪЕМА ПРИ СОЧЕТАННОЙ ИОН-ПРОТОННОЙ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2024 года по МПК A61N5/10 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к лучевой терапии, и направлено на определение уровня генетических повреждений в клетках, находящихся вне мишени облучения (опухоли) на пути прохождения пучков заряженных частиц при сочетанном облучении ионами углерода и протонами.

Уровень техники

Использование в лучевой терапии ускоренных заряженных частиц обусловлено их физическими характеристиками, основными из которых является малое рассеяние в веществе, что больше выражено для тяжелых ионов, и наличие максимума ионизации в конце пробега первичных частиц (пик Брэгга). Дозовое распределение ускоренных заряженных частиц в веществе (кривая Брэгга), как правило, подразделяют на три части: проксимальная («плато»), пик Брэгга, дистальная (за пиком, «хвост»). При облучении объемной мишени (опухоли) используют метод активной или пассивной модификации пучка по энергии для создания расширенного пика Брэгга.

Для ионной терапии, как и для любого другого вида дистанционной лучевой терапии, свойственно повреждение не только опухоли (мишени), но и находящихся на пути прохождения ионизирующего излучения тканей вне опухоли. В зависимости от типа используемого в терапии ионизирующего излучения соотношение поглощенных доз в мишени и окружающих тканях может быть различно. В случае ускоренных ионов это соотношение уменьшается при увеличении ширины пика Брэгга. Одним из способов улучшения дозового распределения является сочетанная или мульти-ионная терапия.

Способы реализации мульти-ионной терапии описаны в [Kopp B., Mein S., Dokis I., Harrabi S., Bӧhlen T.T., Haberer T., Debus J., Abdollahi A., Mairani A. Development and validation of Single Field Multi-Ion Particle Therapy Treatments, International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics, 2020, V. 106, № 1, P. 194-205]. Представлены расчеты в системе планирования, а также валидация с помощью дозиметрических и радиобиологических методов. В работе рассмотрены два варианта сочетаний: ионы углерода и ионы гелия, ионы углерода и протоны. В данном способе предполагается подведение разных типов ионов в течение одной фракции, что невозможно сделать в большинстве центров и может рассматриваться как недостаток способа.

При наличии в одном или находящихся поблизости центрах ускорителей частиц разных типов более реализуемым выглядит подведение к опухоли дозы разных ионов двумя или более фракциями с некоторым интервалом, позволяющим транспортировать пациента между облучательными установками.

Известен способ сочетанного облучения протонами и ионами углерода (Трошина М.В., Корякина Е.В., Потетня В.И., Соловьев А.Н., Сабуров В.О., Лычагин А.А., Иванов С.А., Каприн А.Д., Корякин С.Н. Биологический ответ клеток B14-150 на последовательное комбинированное воздействие протонов и ионов ¹²С, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2023, Т. 176, № 7, С. 49-52; Матчук О.Н., Селиванова Е.И., Якимова А.О., Сабуров В.О., Соловьев А.Н., Трошина М.В., Литун Е.В., Корякин С.Н., Пикалов В.А., Абрамова М.Р., Иванов С.А., Замулаева И.А., Влияние сочетанного действия ионов углерода и протонов на пул стволовых клеток рака молочной железы линии MCF-7 in vitro, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2023, Т. 176, № 7, с. 95-100; RU 2799517 С1, 05.07.2023, Трошина М.В., Потетня В.И., Корякина Е.В., Сабуров В.О., Соловьев А.Н., Лычагин А.А., Корякин С.Н. Способ снижения жизнеспособности опухолевых клеток). В известных источниках описан способ сочетанного воздействия, а также рассматривается увеличение или снижение эффективности между разными схемами облучения мишени и межфракционными интервалами.

Однако определение эффективности в указанных способах проводилось только в облучаемой в расширенном пике Брэгга области, в которой при проведении лучевой терапии находится опухоль (мишень). Определение биологических эффектов в проксимальной области кривой Брэгга, в которой предполагается нахождение здоровых тканей, не проводилось.

Самыми близкими (прототипом) являются следующие источники:

- Изучение генетических повреждений в клетках, облучаемых ионами углерода и протонами в проксимальной области кривой Брэгга представлено в работах [Troshina M., Usoltseva P., Koryakina E., Baykuzina R., Potetnya V., Solovev A., Koryakin S. The frequency of chromosome aberrations induced in mammalian cells by combined exposure to carbon ions and protons, International Scientific Conference «Innovative Technologies of Nuclear Medicine and Radiation Diagnostics and Therapy», International Youth School «Innovative nuclear physics methods of hightech medicine», Programme. Book of absracts. Мoscow, LPI, MEPhI, 2022, с. 134-135,

- Индукция аберраций хромосом в клетках CHO-K1 после сочетанного воздействия ионов углерода и протонов, Международная молодежная школа «Инновационные ядерно-физические методы высокотехнологичной медицины», Усольцева П.А., Корякина Е.В., Трошина М.В., Потетня В.И., Соловьев А.Н., Сабуров В.О., Корякин С.Н. Программа. Сборник тезисов. Москва. ФИАН, НИЯУ МИФИ, 2023, с. 154-155.

Однако в указанных работах показан уровень биологического эффекта для двух вариантов соотношения доз в проксимальной области: 1) 75% (ионы углерода) и 25% (протоны); 2) 50% (ионы углерода) и 50% (протоны), но не имеет сопоставления с соотношением доз, подводимых к мишени (опухоли). Также недостатком данного способа является то, что при расчетах не учитывалась возможная нелинейность биологического эффекта от поглощенной дозы излучения в диапазоне низких доз.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение информации о генетических нарушениях в клетках, находящихся при проведении определенной схемы сочетанной ион-протонной лучевой терапии в проксимальной области кривых Брэгга пучков ионов углерода и протонов.

Указанный технический результат достигается тем, что так же, как и в известных способах проводят облучение монослоя клеток в проксимальной области кривой Брэгга ионов углерода и протонов, с помощью метафазного анализа определяют уровень цитогенетических повреждений и вычисляют коэффициент эффективности сочетанного действия указанных видов излучений в проксимальной области кривых Брэгга указанных видов излучения.

Особенностью заявляемого способа является то, что оценку осуществляют по следующим этапам:

- рассчитывают параметры облучения мишени, находящейся в расширенном пике Брэгга пучков заряженных частиц, ионами углерода и протонами таким образом, чтобы вклад ионов углерода в суммарную поглощенную дозу соответствовал 40% с учетом относительной биологической эффективности ионов углерода и протонов, причем расчет полей облучения проводят для однопольного облучения в геометрии водного фантома и с помощью дозиметрического оборудования определяют поглощенную дозу в проксимальной части кривой Брэгга;

- помещают флакон с монослоем клеток в водный фантом таким образом, чтобы клетки находились в проксимальной области кривой Брэгга ионов углерода и проводят облучение пучком ионов углерода, согласно рассчитанному методом Монте-Карло плану или времени облучения, которое определяют во время проведения дозиметрических измерений, через 2-2,5 часа после окончания облучения пучком ионов углерода, флакон с монослоем клеток располагают в водном фантоме таким образом, чтобы монослой находился в проксимальной области кривой Брэгга протонного пучка и проводят облучение протонами согласно рассчитанному методом Монте-Карло плану облучения;

- после облучения, флакон с клетками при пониженной температуре для торможения процессов восстановления повреждений, транспортируют в биологическую лабораторию и проводят фиксацию и приготовление препаратов для используемой линии клеток;

- определяют уровень генетических повреждений методом метафазного анализа и с помощью имеющихся дозовых зависимостей для используемых клеток, определяют уровень эффекта из предположения независимого действия излучений; при отсутствии дозовых зависимостей проводят дополнительные исследования, заключающиеся в определении зависимости биологического эффекта от поглощенной дозы используемых излучений в диапазоне низких доз;

- рассчитывают коэффициент эффективности сочетанного действия (К) как отношение определенного уровня генетических повреждений в клетках после сочетанного облучения ионами углерода и протонами к рассчитанному из дозовых зависимостей уровню биологического эффекта и если К больше 1, то эффект является синергическим, т.е. уровень генетических повреждений в клетках, находящихся в проксимальной части кривой Брэгга ионов углерода и протонов при облучении мишени-опухоли в области расширенного пика Брэгга ионов углерода и протонов, при котором соотношение доз в расширенном пике Брэгга составляет 40% ионов углерода и 60% протонов, выше, чем рассчитанный из предположения независимого действия ионов углерода и протонов.

Изобретение поясняется описанием, экспериментальным исследованием и иллюстрациями, на которых представлено:

Фиг. 1 - Схема расположения флакона с монослоем клеток внутри водного фантома при проведении модельного эксперимента по облучению мишени (опухоли) последовательно ионами углерода и протонами: 1 - кривая Брэгга модифицированного пучка ионов углерода и протонов; 2 - флакон с монослоем клеток; 3 - область облучения - мишень (опухоль).

Фиг. 2 - Графическое изображение зависимостей биологического эффекта от поглощенной дозы излучения в диапазоне низких доз излучений: 1 - стандартное γ-излучение ⁶⁰Co; 2 - пучок протонов (проксимальная часть кривой Брэгга); 3 - пучок ионов углерода (проксимальная часть кривой Брэгга).

Способ осуществляют следующим образом.

1 этап.

Рассчитывают параметры облучения мишени (опухоли), находящейся в расширенном пике Брэгга пучков заряженных частиц, ионами углерода и протонами таким образом, чтобы вклад ионов углерода в суммарную поглощенную дозу соответствовал 40% с учетом относительной биологической эффективности ионов углерода и протонов. Расчет полей облучения проводят для однопольного облучения в геометрии водного фантома, с помощью дозиметрического оборудования определяют поглощенную дозу в проксимальной части кривой Брэгга.

2 этап.

Помещают флакон с монослоем клеток в водный фантом таким образом, чтобы клетки находились в проксимальной области кривой Брэгга ионов углерода. Проводят облучение пучком ионов углерода согласно рассчитанному методом Монте-Карло плану или времени облучения. По истечении 2-2,5 ч после окончания облучения пучком ионов углерода, флакон с монослоем клеток располагают в водном фантоме таким образом, чтобы монослой находился в проксимальной области кривой Брэгга протонного пучка. Проводят облучение протонами согласно рассчитанному методом Монте-Карло плану облучения.

3 этап.

После облучения флакон с клетками при пониженной температуре для торможения процессов восстановления повреждений транспортируют в биологическую лабораторию. Фиксацию и приготовление препаратов проводят в соответствии со стандартными протоколами для используемой линии клеток, а именно: в стерильных условиях из флакона удаляют содержащуюся в нём среду, добавляют раствор трипсина, через 1-1,5 минуты раствор трипсина удаляют и встряхивают флакон для открепления клеток от ростовой поверхности флакона; добавляют 2 мл питательной среды с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), ресуспендируют и переносят всю суспензию клеток в чистый стерильный флакон, добавляют 8 мл питательной среды с содержанием 20% ЭТС; инкубируют при температуре 37°С и содержании 5% СО₂ в течении 24-26 часов с учетом задержки деления; за два часа до окончания инкубации добавляют колхицин для накопления клеток в стадии метафазы.

4 этап.

Определяют уровень генетических повреждений методом метафазного анализа. С помощью имеющихся дозовых зависимостей биологического эффекта для используемых клеток, определяют уровень эффекта из предположения независимого действия излучений. При отсутствии дозовых зависимостей проводят дополнительные исследования по изучению зависимости биологического эффекта от поглощенной дозы используемых излучений в диапазоне низких доз.

5 этап.

Рассчитывают коэффициент эффективности сочетанного действия К, как отношение величины биологического эффекта, полученной экспериментально, к рассчитанному из дозовых зависимостей уровню эффекта. Если значение коэффициента К превышает 1, то уровень эффекта (количество повреждений в клетках) сочетанного воздействия выше, чем при независимом действии излучений; если К меньше 1, то количество повреждений в клетках ниже, чем при независимом действии ионов углерода и протонов.

Предлагаемый способ позволил оценить уровень биологического эффекта в облучаемых в проксимальной области клетках непосредственно для выбранной схемы сочетанного воздействия ионами углерода и протонами на мишень (опухоль). Уровень эффекта учитывает возможную нерегулярную дозовую зависимость биологического эффекта в диапазоне низких доз, определяемую в литературных источниках как гиперчувствительность (ГЧ) и индуцированная радиорезистентность (ИР), игнорирование которой может привести к некорректной оценке конечного биологического эффекта. Кроме того, в качестве биологического эффекта предлагается рассматривать генетические повреждения, определяемые стандартным методом метафазного анализа, который позволяет оценить количество структурных нарушений в клетке, которое в свою очередь пропорционально симметричным перестройкам, потенциально приводящим к мутациям и образованию вторичных опухолей.

Пример реализации способа при экспериментальном исследовании

Для примера использовали монослой клеток китайского хомячка линии B14-150 в стационарной фазе роста культуры. Для облучения клетки выращивали в культуральном флаконе на ростовой поверхности площадью 25 см² (Corning, США), перед началом экспериментального исследования флакон заполняли раствором с солями Хенкса («ПанЭко», РФ). В примере использованы 2 одинаковых образца.

На первом этапе рассчитывали планы для последовательного облучения предполагаемой мишени (опухоли) в расширенном до 30 мм пике Брэгга ионами углерода и протонами по схеме, включающей вклад ионов углерода 40% в суммарную поглощенную дозу 3,2 Гр(ОБЭ) с учетом ОБЭ обоих видов излучений. Доза ионов углерода в расширенном пике Брэгга составила 1,3 Гр(ОБЭ), при этом физическая доза была равна 0,35 Гр. Биологическая и физическая дозы протонного излучения составляли 1,9 Гр(ОБЭ) и 1,4 Гр соответственно. Определенные ионизационным методом поглощенные дозы в проксимальной области кривых Брэгга ионного пучка составляли 0,24 Гр, протонного пучка - 1 Гр.

На втором этапе проводили последовательное облучение установленного внутри водного фантома флакона с монослоем клеток ионами углерода на пучке ионов углерода с начальной энергией 400 МэВ/н (ЦКП ИФВЭ, г. Протвино) и спустя 2-2,5 часа сканирующим пучком протонов (КПТ «Прометеус», расположен в МРНЦ, г. Обнинск). Расстояние между монослоем клеток и центром расширенного пика Брэгга составляло 115±5 мм для обоих типов пучком заряженных частиц. Схема размещения флакона внутри водного фантома изображена на Фиг. 1.

На третьем этапе по окончании второй фракции облучения (протонами) флакон с монослоем клеток помещали в пенопластовый контейнер с элементами холода и при пониженной температуре транспортировали в биологическую лабораторию.

В стерильных условиях, создаваемых внутри ламинарного бокса, из флакона удаляли раствор с солями Хенкса, добавляли 5 мл раствора трипсина-ЭДТА («ПанЭко», РФ), через 60-90 с удаляли раствор и инкубировали при 37°С в течении 1-3 мин до открепления клеток с подложки. Добавляли во флакон с клетками 2 мл среды DMEM («ПанЭко», РФ) с содержанием ЭТС (Biosera, Франция) 10%, переносили клеточную суспензию в стерильный флакон и добавляли 8 мл среды DMEM с содержанием ЭТС 20%. Инкубировали 24,5 ч в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С и содержании 5% СО₂. За два часа до окончания инкубации добавляли колхицин в концентрации 3,6 мкг на 1 мл.

Фиксацию клеток и приготовление препаратов проводили в соответствии со стандартными протоколами и методиками, а именно: спустя 2 часа после добавления колхицина из флакона удаляли питательную среду, добавляли 5 мл раствора трипсина и выдерживали 3-5 минут в термостате при температуре 37°С, затем встряхивали флакон для открепления клеток от ростовой поверхности, ресуспендировали и переносили всю суспензию в центрифужные пробирки объёмом 10-11 мл. Осаждали суспензию методом центрифугирования, отбирали надосадочную жидкость, встряхивали с помощью вортекса, добавляли 10 мл раствора 0,15 M KCl и инкубировали 10 минут в термостате при 37°С. Затем осаждали клетки центрифугированием, отбирали надосадочную жидкость и добавляли 5 мл охлажденного фиксирующего раствора, состоящего из ледяной уксусной кислоты и этилового спирта в соотношении 1:3. Смену фиксатора проводили трижды, после этого отбирали часть надосадочной жидкости, оставляя около 0,5 мл, ресуспендировали осадок и наносили суспензию на охлажденные обезжиренные стекла, высушивали, гидролизовали в течение 10 минут в 5N HCl, промывали в проточной и дистиллированной воде, окрашивали красителем Гимза, снова промывали в дистиллированной воде и высушивали на воздухе.

На четвертом этапе проводили метафазный анализ на световом микроскопе. Учитывали все типы хромосомных аберраций, видимых при стандартном окрашивании (по Гимза). В данном случае биологическим эффектом являлось количество аберраций хромосом (АХ) на 100 проанализированных метафаз. При последовательном облучении флакона с монослоем клеток ионами углерода в дозе 0,24 Гр и протонами в дозе 1 Гр суммарная частота АХ для образца №1 составила 38,5±3,39 АХ/100 кл, для образца №2 - 44,7±3,78 АХ/100 кл.

На пятом этапе рассчитывали уровень АХ с использованием имеющихся зависимостей суммарной частоты АХ от поглощенной дозы, представленных на Фиг. 2, и оценивали эффективность сочетанного облучения по формуле [Обатуров Г.М., Потетня В.И. Комбинированное действие излучения разного качества, Атомная энергия, 1998, т. 84, № 1, с. 42-50]:

где:

h(y+x) - эффект (частота аберраций хромосом), полученный при сочетанном облучении ионами углерода в дозе D_C и протонами в дозе D_p (экспериментально полученное значение);

h(y) и h(x) - эффекты после однократного облучения ионами углерода в дозе D_C (определяли из дозовых кривых 2 на Фиг. 2: для D_C=0,24 Гр h(y)= 12,5±1,05 АХ/100 кл) и протонами в дозе D_p (определяли из дозовых кривых 3 на Фиг. 2: для D_p=1 Гр h(х)=22,3±1,05 АХ/100 кл).

Для образца №1 коэффициент К₁=1,1, для образца №2 К₂=1,3. Значения К1 и К2 превышают 1, т.е. уровень эффекта сочетанного воздействия ионами углерода и протонами выше, чем при независимом действии излучений.

Приведенный пример показывает, что при однопольном облучении мишени (опухоли) последовательно ионами углерода и протонами в расширенном до 30 мм пике Брэгга при соотношении доз ионов углерода и протонов соответственно 40% и 60%, в проксимальной области кривой Брэгга уровень генетических повреждений в клетках, в данном примере находящихся на расстоянии 115±5 мм от центра расширенного пика Брэгга, выше, чем рассчитанный из предположения независимого действия ионов углерода и протонов.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить информацию об уровне биологического эффекта, наблюдаемого в области, находящейся за пределами облучаемой мишени, что в свою очередь может быть использовано для предварительной оценки лучевых осложнений, а также отдаленных последствий при разработке схем ион-протонной лучевой терапии.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к лучевой терапии, и направлено на определение уровня генетических повреждений в клетках, находящихся вне мишени облучения (опухоли) на пути прохождения пучков заряженных частиц при сочетанном облучении ионами углерода и протонами. Способ позволяет определить уровень генетических повреждений в клетках, подвергающихся облучению в области, в которой при проведении сочетанной лучевой терапии находятся здоровые ткани. Способ может быть использован для предварительной оценки лучевых осложнений, а также рисков/отдаленных последствий при разработке схем ион-протонной лучевой терапии для целей лечения пациентов со злокачественными новообразованиями. 2 ил., 1 пр.

Способ оценки генетических нарушений в клетках, расположенных до облучаемого объема при сочетанной ион-протонной лучевой терапии, включающий облучение монослоя клеток в проксимальной области кривой Брэгга ионов углерода и протонов, определении с помощью метафазного анализа уровня цитогенетических повреждений и вычисления коэффициента эффективности сочетанного действия указанных видов излучений в проксимальной области кривых Брэгга указанных видов излучения, отличающийся тем, что оценку осуществляют по следующим этапам:

- рассчитывают параметры облучения мишени, находящейся в расширенном пике Брэгга пучков заряженных частиц, ионами углерода и протонами таким образом, чтобы вклад ионов углерода в суммарную поглощенную дозу соответствовал 40% с учетом относительной биологической эффективности ионов углерода и протонов, причем расчет полей облучения проводят для однопольного облучения в геометрии водного фантома и с помощью дозиметрического оборудования определяют поглощенную дозу в проксимальной части кривой Брэгга;

- помещают флакон с монослоем клеток в водный фантом таким образом, чтобы клетки находились в проксимальной области кривой Брэгга ионов углерода и проводят облучение пучком ионов углерода, согласно Методу Монте-Карло или времени облучения, которое определяют во время проведения дозиметрических измерений, через 2-2,5 часа после окончания облучения пучком ионов углерода, флакон с монослоем клеток располагают в водном фантоме таким образом, чтобы монослой находился в проксимальной области кривой Брэгга протонного пучка, и проводят облучение протонами, согласно рассчитанному методом Монте-Карло плану облучения;

- после облучения флакон с клетками при пониженной температуре для торможения процессов восстановления повреждений, транспортируют в биологическую лабораторию и проводят фиксацию и приготовление препаратов для используемой линии клеток;

- определяют уровень генетических повреждений методом метафазного анализа и с помощью имеющихся дозовых зависимостей для используемых клеток определяют уровень эффекта из предположения независимого действия излучений; при отсутствии дозовых зависимостей проводят дополнительные исследования, заключающиеся в определении зависимости биологического эффекта от поглощенной дозы используемых излучений в диапазоне низких доз;

- рассчитывают коэффициент эффективности сочетанного действия (К) как отношение определенного уровня генетических повреждений в клетках после сочетанного облучения ионами углерода и протонами к рассчитанному из дозовых зависимостей уровню биологического эффекта, и если: К больше 1, то уровень генетических повреждений в клетках, находящихся в проксимальной части кривой Брэгга ионов углерода и протонов при облучении мишени-опухоли в области расширенного пика Брэгга ионов углерода и протонов, при котором соотношение доз в расширенном пике Брэгга составляет 40% ионов углерода и 60% протонов выше, чем рассчитанный из предположения независимого действия ионов углерода и протонов.