СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ПРОТОННОЙ ТЕРАПИИ НА СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ Российский патент 2023 года по МПК A61M5/00 A61K31/7068 A61K31/17 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и радиологии, и может быть использовано для повышения эффективности лучевой терапии меланомы.

Несмотря на активное развитие новых подходов, включающих использование химиопрепаратов в составе наночастиц, таргетных и иммунотерапевтических препаратов, лучевая терапия остается в настоящее время одним из наиболее распространенных способов лечения онкологических заболеваний различной локализации, поскольку используется более чем в 50% случаев (Olivares-Urbano М.А., Grinan-Lison С., Marchal J.A. and CSC Radioresistance: A Therapeutic Challenge to Improve Radiotherapy Effectiveness in Cancer//Cells. - 2020. - V.9, N.7. - P. 1651). Как и другие методы противоопухолевого лечения, лучевая терапия постоянно совершенствуется, внедряются все новые методы радиационного воздействия на опухолевый очаг (адронная, бинарная, тканевая, фотодинамическая терапия и пр.). Однако это не всегда приводит к удовлетворительному клиническому эффекту благодаря резистентности к терапии опухолевой массы или наименее ее чувствительной части, которая представлена опухолевыми стволовыми клетками (ОСК) (Rycaj K., Tang D.G. Cancer stem cells and radioresistance//Int J Radiat Biol. - 2014. - V. 90, N 8. - P. 615-621). Ha молекулярном уровне одним из ключевых регуляторов стволового состояния опухолевых клеток является ген Nanog (Vasefifar P., Azad R.M., Maleki L.A., Najafi S., Ghrobaninezhad F., Najafzadeh В., Alemohammad H., Amini M., Baghbanzadeh A., Baradaran B. Nanog, as a key cancer stem cell marker in tumor progression// Gene. - 2022 Mar 22. doi: 10.1016/j.gene.2022.146448. Online ahead of print). Известно, что белковый продукт гена Nanog является транскрипционным фактором, который играет важную роль в развитии злокачественного фенотипа клеток: способствует метастазированию, активации процесса эпителиально-мезенхимальной транзиции, поддержанию пула ОСК и формированию резистентности последних к повреждающим воздействиям. Поэтому ингибирование сигнальных путей, связанных с экспрессией Nanog, рассматривается в качестве перспективного способа элиминации ОСК (Yang L., Shi P., Zhao G., Xu J., Peng W., Zhang J., Zhang G., Wang X., Dong Z., Chen F., Cui H. Targeting cancer stem cell pathways for cancer therapy//Signal Transduct Target Ther. - 2020. - V. 5, N1: 8).

К числу радиорезистентных злокачественных новообразований (ЗНО) относится меланома, основным методом лечения которой является хирургический, по показаниям дополняющийся системной терапией. Вместе с тем, в случаях невозможности хирургического иссечения первичной опухоли локальная лучевая терапия является рекомендованным методом лечения первичной меланомы кожи. Кроме того, в исследованиях последних лет продемонстрирована целесообразность проведения лучевой терапии после радикальной лимфаденэктомии при высоком риске регионарного рецидива (Клинические рекомендации Министерства здравоохранения России «Меланома кожи и слизистых оболочек», 2020 г.). Поэтому совершенствование лучевой терапии меланомы (как и других ЗНО) является актуальной проблемой радиационной онкологии.

Один из перспективных методов лучевой терапии основан на использовании протонных пучков (Vanderwaeren L., Dok R., Verstrepen К., Nuyts S. Clinical Progress in Proton Radiotherapy: Biological Unknowns//Cancers (Basel). - 2021. - V. 13, N.4. - P. 604; Han J.E., Chang J., Rosen L., Hartsell W., Tsai H., Chen J., Mishra M.V., Krauss D., Isabelle Choi J., Simone C.B. 2nd, Hasan S. Treatment interruptions affect biochemical failure rates in prostate cancer patients treated with proton beam therapy: Report from the multi-institutional proton collaborative group registry//Clin Transl Radiat Oncol. - 2020. - V.25. - P. 94-101). Благодаря особому пространственному распределению дозы ионизирующего излучения протонная терапия (по сравнению с традиционной фотонной) обеспечивает безопасное повышение эффективной дозы ионизирующего излучения в опухолевой ткани (без превышения толерантных доз для нормальных тканей), даже если мишень вплотную прилежит к критическим структурам организма. Кроме того, протонное излучение способно формировать плотноионизирующие треки в пике Брэгга, что увеличивает повреждающее воздействие на опухолевые клетки, в том числе на ОСК. Известны данные о способности протонного излучения снижать радиорезистентность ОСК (Zhang X., Lin S. Н., Fang В., Gillin М., Mohan R., Chang J.Y. Therapy-resistant cancer stem cells have differing sensitivity to photon versus proton beam radiation//J Thorac Oncol. - 2013. - V. 8, N.12. - P. 1484-1491; Dini V., Belli M., Tabocchini M.A. Targeting cancer stem cells: protons versus photons//Br J Radiol. - 2019. - V.92: 20190225; Konings K., Vandevoorde C, Baselet В., Baatout S., Moreels M. Combination Therapy With Charged Particles and Molecular Targeting: A Promising Avenue to Overcome Radioresistance//Front Oncol. - 2020. - V. 10:128). В многочисленных исследованиях феномен радиорезистентности ОСК был зарегистрирован для традиционного фотонного излучения в отношении ЗНО различных локализаций, включая меланому (Bertrand G., Maalouf М., Boivin A., Battiston-Montagne P., Beuve M., Levy A., Jalade P., Fournier C., Ardail D., Magne N., Alphonse G., Rodriguez-Lafrasse C. Targeting head and neck cancer stem cells to overcome resistance to photon and carbon ion radiation//Stem Cell Rev Rep.- 2014. - V. 10, N1. - P. 114 -126; Krause M., Dubrovska A., Linge A., Baumann M. Cancer stem cells: radioresistance, prediction of radiotherapy outcome and specific targets for combined treatments//Adv Drug Deliv Rev. - 2017. - V.109. - P. 63-73; Матчук O.H., Орлова H.B., Замулаева И.А. Изменение относительного количества клеток SP меланомы линии В16 после облучения in vivo//Радиационная биология. Радиоэкология. - 2016. - Т. 56, N.5. - С. 487-493). Доказано, что одним из механизмов радиорезистентности ОСК является более эффективная репарация повреждений ДНК.

Вместе с тем, биологическая эффективность протонного излучения в плане элиминации ЗНО относительно невелика и лишь в 1,1-1,3 раза превышает эффективность фотонного излучения. Это обстоятельство определяет необходимость использования имеющихся радиосенсибилизаторов и поиск новых соединений, которые могли бы повысить эффективность протонной терапии и, что особенно важно, повысить эффективность элиминации ОСК, составляющих наиболее резистентную часть опухолевой массы (Konings К., Vandevoorde С, Baselet В., Baatout S., Moreels М. Combination Therapy With Charged Particles and Molecular Targeting: A Promising Avenue to Overcome Radioresistance//Front Oncol. - 2020. - V. 10:128).

Такой известный радиосенсибилизатор как цисплатин, давно применяющийся в комбинации с фотонной лучевой терапией, в настоящее время используется с той же целью и при проведении протонной терапии ЗНО различных локализаций, включая меланому (Ebner D.K., Malouff T.D., Frank S.J., Koto M. The Role of Particle Therapy in Adenoid Cystic Carcinoma and Mucosal Melanoma of the Head and Neck//Int J Part Ther. - 2021. - V. 8, N1. - P. 273-284; Gunn G.B., Garden A.S., Ye R., Ausat N., Dahlstrom K.R., Morrison W.H., Fuller C.D., Phan J., Reddy J.P., Shah S.J., Mayo L.L., Chun S.G., Chronowski G.M., Moreno A.C., Myers J.N., Hanna E.Y., Esmaeli В., Gillison M.L., Ferrarotto R., Hutcheson K.A., Chambers M.S., Ginsberg L.E., El-Naggar A.K., Rosenthal D., Zhu X.R., Frank S.J. Proton Therapy for Head and Neck Cancer: A 12-Year, Single-Institution Experience//Int J Part Ther. - 2021. - V. 8, N1. - P. 108-118). Однако неизвестно, как этот препарат в комбинации с протонным излучением воздействуют на ОСК - наиболее радиорезистентную часть ЗНО.

В последние годы происходит активная разработка новых радиосенсибилизаторов на основе малых молекул, макромолекул и наночастиц различного химического строения (Wang Н., Mu X., Не Н., Zhang X.-D. Cancer Radiosensitizers//Trends Pharmacol Sci. - 2018. - V. 39, №1. - P. 24-48). Однако подавляющая часть разработок относится к радиосенсибилизаторам для традиционной радиотерапии с использованием фотонных излучений. Значительно меньше данных известно в отношении сенсибилизации опухолевых клеток или тканей к протонному излучению, влияние которого на экспрессию генов, повреждение ДНК и репарацию, механизмы клеточной гибели, иммунный ответ отличается от такового для фотонного излучения (Wang L., Fossati P., Paganetti H., Ma L., Gillison M., Myers J.N., Hug E., Frank S.J. The Biological Basis for Enhanced Effects of Proton Radiation Therapy Relative to Photon Radiation Therapy for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma//Int J Part Ther. - 2021. - V. 8, N1. - P. 3-13). Поэтому использование одних и тех же соединений в качестве сенсибилизаторов к фотонному и протонному излучениям может быть в ряде случаев неоправданным.

Известны способы сенсибилизации клеток к протонному излучению с использованием наночастиц<100 нм на основе золота (Peukert D., Kempson I., Douglass M., Bezak E. Metallic nanoparticle radiosensitisation of ion radiotherapy: A review//Phys Med. - 2018. - V. 47. P. 121-128; Cunningham C, de Kock M., Engelbrecht M., Miles X., Slabbert J., Vandevoorde C. Radiosensitization Effect of Gold Nanoparticles in Proton Therapy/ZFront Public Health. - 2021. - V. 9: 699822).

Однако данные способы не раскрывают возможность радиосенсибилизации ОСК к протонному излучению.

Известны способы сенсибилизации опухолевых клеток (рак легкого, поджелудочной железы, пищевода, головы и шеи) к протонному излучению при использовании олапариба - ингибитора белков семейства поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), которые участвуют в репарации повреждений ДНК ( Lobbens А., Stoyanov М., Lucas S., Michiels С.Radiation-induced synthetic lethality: combination of poly(ADP-ribose) polymerase and RAD51 inhibitors to sensitize cells to proton irradiation// Cell Cycle. - 2019. - V. 18. - P. 770-1783; Kageyama S.-L, Junyan D., Hojo H., Motegi A., Nakamura M., Tsuchihara K., Akimoto T. PARP inhibitor olaparib sensitizes esophageal carcinoma cells to fractionated proton irradiation//J Radiat Res. - 2020. - V. 61, N2. - P. 177-186; Lee D.W., Kim J.E., Lee G.-H., Son A., Park H.C., Oh D., Jo K., Choi C. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Array Platform for Evaluating Sensitivity of Proton-Drug Combinations// Int J Mol Sci. - 2022. - V. 23: 587).

Однако эти способы не предоставляют информацию о комбинированном действии олапариба и протонного излучения на ОСК.

Известен способ сенсибилизации клеток немелкоклеточного рака легкого к протонному излучению при использовании гефинитиба - ингибитора рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (Park H.J., Oh J.S., Chang J.W., Hwang S.G., Kim J.S. Proton irradiation sensitizes radioresistant non-small cell lung cancer cells by modulating epidermal growth factor receptor-mediated DNA repair//Anticancer Res. - 2016. - V.36. - P. 205-212).

Однако и в данном случае отсутствуют сведения о влиянии комбинированного действия указанного препарата и протонного излучения на ОСК.

Известен способ сенсибилизации клеток меланомы к протонному излучению с применением препарата Бевацизумаб, который связывается с фактором роста эндотелия сосудов, препятствуя его взаимодействию с рецепторами на поверхности эндотелиальных клеток (Koricanac L.B., Zakula J.J., Petrovic I.M., Valastro L.M., Cirrone G.A., Cuttone G., Ristic-Fira A.M. Anti-tumour activity of fotemustine and protons in combination with bevacizumab//Chemotherapy. - 2010. - V.56 - P. 214-222).

Однако и этот способ разрабатывался без учета его возможного воздействия на ОСК.

Прототипом настоящего изобретения является способ повышения частоты образования двунитевых разрывов ДНК в клетках человека при действии ионизирующих излучений в условиях влияния радиомодификаторов - 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (АраЦ) и гидроксимочевины (ГМ) in vitro (RU 2699670 С1). АраЦ встраивается в концевое звено молекулы ДНК во время ее синтеза в процессе репликации, что ведет к нарушению репликативных процессов. АраЦ блокирует активность ДНК полимераз α и β, принимающих участие в синтезе ДНК в процессе репарации, вследствие чего происходит фиксация однонитевых разрывов ДНК, возникающих в результате облучения. Более того, при попытке репарировать однонитевые разрывы ДНК в присутствии АраЦ и ГМ образуются ферментативные двунитевые повреждения ДНК. ГМ является ингибитором рибонуклеотидредуктазы и снижает внутриклеточный пул нуклеотидов, в частности, цитозина, поэтому ГМ может рассматриваться как дополняющий агент, усиливающий действие АраЦ. В связи с описанным механизмом действия АраЦ можно предположить, что радиосенсибилизующий эффект этого соединения будет выражен сильнее в клетках с более эффективной репарацией радиационных повреждений ДНК, например, в ОСК.

Однако известный способ не дает никакой информации о комбинированном действии протонного излучения на фоне АраЦ или АраЦ+ГМ на наиболее радиорезистентную фракцию опухолевых клеток - ОСК. Недостатком также является отсутствие информации об эффектах комбинированного воздействия АраЦ+ГМ и ионизирующего излучения на опухолевые клетки in vivo.

Однако ответ опухолевых клеток, в том числе ОСК, in vitro и in vivo может значительно отличаться в связи с известным влиянием в организме физических, химических и биологических факторов опухолевого микроокружения, отсутствующих в условиях in vitro (Najafi М., Mortezaee K., Majidpoor J. Cancer stem cell (CSC) resistance drivers// Life Sci. - 2019. - V. 234:116781; Najafi M., Farhood В., Mortezaee K., Kharazinejad E., Majidpoor J., Ahadi R. Hypoxia in solid tumors: a key promoter of cancer stem cell (CSC) resistance// J Cancer Res Clin Oncol. - 2020. - V. 146. - P. 19-31).

Технический результат заявляемого изобретения заключается в повышении чувствительности стволовых клеток меланомы к действию протонного излучения.

Технический результат достигается тем, что так же, как и в известном способе (прототипе) опухолевые клетки подвергают воздействию АраЦ и ГМ, после чего облучают пучком протонов.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что за 1 час до локального облучения в дозе 10 Гр первичного опухолевого очага меланомы осуществляют одновременное внутривенное введение АраЦ из расчета 2,5 мг/мышь и гидроксимочевины (ГМ) из расчета 0,03 мг/мышь, или за 1 час до локалбного облучения в дозе 10 Гр вводят только АраЦ из расчета 2,5 мг/мышь.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - График распределения клеток меланомы линии В16 по интенсивности прямого светорассеяния и флуоресценции пропидиум йодида (propidium iodide -PI). Выделен регион PI^- неповрежденных клеток (R1).

Фиг. 2 - Графики распределения клеток меланомы линии В16 из региона R1 по интенсивности флуоресценции Хехста33342: а) в синей и красной областях спектра в образцах без верапамила; б) после инкубации с верапамилом. Выделен регион клеток (R2), образующих боковую популяцию (side population - SP), и указан процент клеток в этом регионе. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции в красной области спектра

(λ=675±20 нм); по оси ординат - интенсивность флуоресценции в синей области спектра (λ=424±20 нм).

Фиг. 3 - Типичные графики распределения клеток линии меланомы линии В16 по интенсивности флуоресценции Хехста33342 в синей и красной областях спектра в образцах опухолей из 4-х экспериментальных групп через 9 суток после облучения протонами или комбинированного воздействия протонов и ингибиторов синтеза ДНК (АраЦ и ГМ) (а) Контроль; б) Протоны; в) АраЦ+Протоны; г) АраЦ+ГМ+Протоны). На графиках показано по 12 тыс.клеток (часть записанного файла). Выделен регион SP и указан процент клеток в этом регионе. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции в красной области спектра (λ=675±20 нм); по оси ординат - интенсивность флуоресценции в синей области спектра (λ=424±20 нм).

Фиг. 4 - Доля ОСК (клеток SP) через 9 суток после облучения протонами или комбинированного воздействия ингибиторов синтеза ДНК и протонов:

*р=0,03 по сравнению с группой «Протоны»;

**р=0,003 по сравнению с группой «Протоны».

Фиг. 5 - Индекс абсолютного количества ОСК (клеток SP) через 9 суток после облучения протонами или комбинированного воздействия ингибиторов синтеза ДНК и протонов. Указаны значения р при сравнении соответствующих групп.

Фиг. 6 - Облучение мыши с меланомой В16; перекрестье лазера соответствует центру протонного пучка.

Фиг. 7 - Дозиметрическая верификация поля с помощью радиохромной пленки Gafchromic ЕВТ3: а) результаты представлены в виде двумерного поля (цветовая шкала показывает поглощенную дозу); б) одномерные сечения дозы по оси абсцисс; в) оси ординат в центральной точке.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки меланомы линии В16 культивируют в полной питательной среде DMEM (ПанЭко, РФ), содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (BioSera, Франция), пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (50 мкг/мл) и глютамин (292 мкг/мл), в CO2 инкубаторе (Shellab, США) с 5% содержанием CO2 при температуре +37°С. Для трансплантации используют опухолевые клетки в логарифмической стадии роста. Клетки снимают с подложки в среду DMEM в концентрации 2,0⋅10⁶кл/мл, затем вводят внутримышечно в заднюю правую лапу мышей линии C57Bl/6j с массой тела 20 г по 200 тыс.клеток в объеме 0,1 мл. Каждые 2 суток проводят визуальный контроль роста опухоли. Формируют группы животных с одинаковым средним размером

опухолевого очага: 1) Контроль (интактные животные-опухоленосители); 2) Протоны; 3) АраЦ+Протоны; 4) АраЦ+ГМ+Протоны

На 12 сутки после введения опухолевых клеток, когда опухоли визуализируются макроскопически, за 1 час перед облучением вводят АраЦ (2,5 мг/мышь) и ГМ (0,03 мг/мышь) или только АраЦ (2,5 мг/мышь) в хвостовую вену мышей. Локальное облучение опухолевого очага в дозе ЮГр производят пучком протонов в модифицированном пике Брэгга (комплекс протонной терапии «Прометеус», МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России). Диапазон энергий в модифицированном пике - от 33 до 56 МэВ, размер модифицированного пика - 20 мм. Длительность синхротронного импульса - 250 мс, пауза между импульсами - 1,3 с.

Экспериментальная часть, подтверждающая повышение чувствительности стволовых клеток меланомы к действию протонного излучения.

А. Идентификация и количественная оценка пула ОСК с помощью проточной цитометрии методом SP.

ОСК идентифицировали по их способности откачивать во внешнюю среду флуоресцентные липофильные красители, в том числе Хехст33342, и формировать так называемую боковую популяцию (side population - SP) слабо окрашенных клеток, которые регистрируют при исследовании с помощью проточной цитометрии. Остальные (не стволовые) клетки не обладают такой способностью, как показано для многих злокачественных новообразований и клеточных культур, включая линию В16 меланомы мыши.

Количество ОСК определяли в аутопсийном материале из периферических зон первичного очага меланомы через 9 суток после облучения (21 сутки после трансплантации) в 4 группах:

- «Контроль»,

- «Протоны»,

- «АраЦ+Протоны»,

- «АраЦ+ГМ+Протоны».

Перед извлечением аутопсийного материала вычисляли объем каждой опухоли по формуле:

где V - объем опухолевого очага, D - средний диаметр опухоли, определенный с помощью штангенциркуля в двух взаимно перпендикулярных направлениях.

Аутопсийный материал подвергали ферментативному разобщению в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержащей коллагеназу (1 мг/мл, Sigma, США) и ДНКазу (0.02%, Sigma, США), в течение 1 часа при +37°С и постоянном перемешивании. Полученную суспензию клеток фильтровали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40 мкм и определяли концентрацию ядросодержащих клеток с помощью камеры Горяева. Далее клетки инкубировали с Хехстом 33342 и йодистым пропидием (propidium iodide - PI) в соответствии с методикой, описанной ниже.

Собирали аликвоты по 1 млн клеток, затем центрифугировали при 200×g в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 1 мл теплой бессывороточной DMEM. К суспензии клеток добавляли флуоресцентный краситель Хехст33342 (Calbiochem, США) до конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубировали в течение 60 мин при +37°С и периодическом перемешивании. В контрольную пробу за 15 мин до внесения Хехста 33342 добавляли верапамил (ВП) - блокатор комплекса АТФ-связывающих транспортеров, который препятствует обратному транспорту ряда веществ (в том числе, Хехста33342) из клетки, до конечной концентрации 25 мкг/мл. В связи с этим при введении ВП процент SP значительно уменьшается, что используют в качестве методического контроля. После окончания инкубации с Хехстом33342 пробы отмывали холодным раствором Хенкса (ПанЭко, Россия), содержащим 2% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и 10 мМ Hepes (ПанЭко, Россия), с помощью центрифугирования при 200×g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали и фильтровали через нейлоновый фильтр с порами 40 мкм. Хранение образца возможно при температуре +4°С не более 30 мин. Для исключения из анализа мертвых и погибающих клеток добавляли раствор PI (Calbiochem, США) до конечной концентрации 2 мкг/мл непосредственно перед цитофлуориметрией. Накопление Хехста33342 анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Vantage (BDIS, США), оборудованном двумя лазерами с длиной волны 364 нм и 488 нм. Флуоресценцию Хехста33342 измеряли в красной (675±20 нм) и синей (424±20 нм) областях спектра (λ_возб=364 нм). Флуоресценцию PI регистрировали при 585±20 нм (λ_возб=488 нм). В каждом образце анализировали не менее 400 тысяч событий.

Полученные данные обрабатывали с помощью программы CellQuestPro (BDIS, США). Строили график распределения клеток по интенсивности прямого светорассеяния и флуоресценции PI, с помощью которого исключали мертвые/погибающие клетки и дебрис, отбирая группу PI^- клеток (Фиг. 1). Для РГ клеток построили график распределения клеток по интенсивности флуоресценции Хехста33342 в красной и синей

областях спектра (Фиг. 2). Затем выделяли слабо окрашенные (Xexcт33342^low) клетки, составляющие SP. Регион для ОСК устанавливали таким образом, чтобы в контрольном образце с ВП в него попадало минимальное количество клеток.

Долю ОСК (клеток SP) определяли в результате деления количества Хехст33342^low клеток на количество PI^- клеток и вычисляли в процентах.

Индекс абсолютного количества ОСК определяли для каждого животного путем умножения объема опухолевого очага (см³) на долю ОСК (%) и выражали в условных единицах.

Б. Определение экспрессии гена Nanog - одного из ключевых регуляторов пула ОСК - с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени

Образцы аутопсийного материала объемом 10-20 мм³ извлекали из первичного очага меланомы линии В16 в группах «Контроль», «Протоны» и «АраЦ+Протоны» через 9 суток после облучения. Полученные образцы незамедлительно фиксировали в 300 мкл реагента «IntactRNA» (Евроген, Россия) в целях предотвращения деградации РНК. Выделение РНК проводили методом фенольной экстракции с использованием реагента RNAzol RT (Sigma, USA) согласно инструкции производителя. Для удаления следов геномной ДНК полученный препарат РНК переосаждали при помощи 12М раствора LiCl. Полученный осадок промывали дважды 75% этанолом и растворяли в 20 мкл деионизированной воды, свободной от ДНКаз и РНКаз. Далее определяли концентрацию и параметры качества РНК (соотношение поглощения при 230/280 нм и 260/280 нм) на спектрофотометре NanoDrop (USA). Для всех образцов были получены значения (более 1,8 для 230/280 нм и более 2,0 для 260/280 нм), указывающие на высокое качество приготовленных препаратов РНК.

Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции в объеме 20 мкл с использованием набора «MMLV RT» (Евроген, Россия), случайных гексануклеотидных праймеров (100 рМ/реакцию; Бигль, Россия) и 1 мкг/реакцию РНК в качестве матрицы. Анализ уровня экспрессии гена Nanog осуществляли при помощи ПЦР с детекцией в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе «Rotor Gene» («Corbet Research)), Австралия) с использованием набора реагентов qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) согласно инструкции производителя. Обработку данных проводили методом ΔΔCt (Pfaffl M.W., Tichopad A., Prgomet С, Neuvians Т.Р. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper - Excel_based tool using pair_wise correlations// Biotechnol Lett. - 2004. - V. 26, N6. - P. 509-515), в качестве референсных были взяты гены домашнего хозяйства Hprt и Ipo8, стабильность экспрессии которых была проверена при помощи сервиса RefFinder (Xie et al., 2012; https://heartcure.com.au/reffinder/).

Дизайн геноспецифических праймеров проводили при помощи онлайн-сервиса Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi). В результате были разработаны пары праймеров со следующими характеристиками:

- прямой праймер для Nanog: 5'-TTGCTTACAAGGGTCTGCTACTG-3', Tm=60,6°C;

- обратный праймер для Nanog: 5'-AGCTTTTGTTTGGGACTGGTAGA-3', Tm=60,1°С;

- прямой праймер для Hprt: 5'-TGACACTGGTAAAACAATGCAAACT-3', Tm=60,1°С;

- обратный праймер для Hprt: 5'-TGGCCTGTATCCAACACTTCG-3', Tm=60,3°С;

- прямой праймер для Ipo8: 5'-CCAACGCTCTGCTGTCAAATC-3', Tm=60,1°C;

- обратный праймер для Ipo8: 5'-CAGCATAGCACTCGGCATCT-3', Tm=60,3°C;

Синтез праймеров осуществляла компания «Бигль» (Россия).

Пример 1 - Изменение доли ОСК, определенной методом SP, через 9 суток после облучения протонами в дозе 10 Гр и комбинированных воздействий.

С помощью проточной цитометрии определена доля ОСК меланомы линии В16 в группах «Контроль», «Протоны», «АраЦ+Протоны», «АраЦ+ГМ+Протоны» через 9 суток после облучения первичного очага. На фиг. 3 можно наблюдать типичные графики распределения клеток по флуоресценции Хехста33342, использованные для идентификации и определения доли ОСК методом SP. Видно, что доля ОСК существенно снижена в опухолях, подвергшихся комбинированному воздействию протонов на фоне АраЦ или АраЦ+ГМ, по сравнению с таковой после облучения пучком протонов или в необлученном контроле.

Групповой анализ результатов показал статистически значимое уменьшение средней доли ОСК (SP) в группе «АраЦ+Протоны» в 2,8 раза по сравнению с группой «Протоны» и в 3,3 раза по сравнению с группой «Контроль» (по критерию Стьюдента) (Фиг. 4). В группе «АраЦ+ГМ+Протоны» уменьшение этого показателя составило 3,1 и 3,6 раза по сравнению с группами «Протоны» и «Контроль», соответственно. Эффекты действия АраЦ и АраЦ+ГМ на пул ОСК не отличаются друг от друга. Таким образом, АраЦ и АраЦ в комбинации с ГМ оказывают сильное радиосенсибилизирующее действие на популяцию ОСК, причем этот эффект регистрируется в отдаленные сроки после облучения.

Пример 2 - Изменение индекса абсолютного количества ОСК через 9 суток после облучения протонами в дозе 10 Гр и комбинированных воздействий.

В данном примере был использован новый показатель - индекс абсолютного количества ОСК, вычисленный для каждой опухоли путем умножения доли ОСК на объем опухолевого очага (Фиг. 5). Применение этого показателя дает возможность оценки общего числа ОСК в опухоли в определенный момент времени, а не только доли ОСК в массе опухолевых клеток, которая уменьшается после радиационного воздействия.

Фигура 5 отражает эффекты всех использованных в эксперименте воздействий и при этом индекс абсолютного количества ОСК учитывает уменьшение общего пула этих клеток при действии протонов по сравнению с контролем (чего не происходило при изучении доли ОСК, пример 1, фиг. 4). С помощью индекса абсолютного количества ОСК зарегистрировано наличие статистически значимых различий практически между всеми группами при высоком уровне значимости (кроме «АраЦ+Протоны» и «АраЦ+ГМ+Протоны»). Так, уменьшение индекса абсолютного количества ОСК в группе «АраЦ+Протоны» составило в среднем 3,9 раза по сравнению с группой «Протоны» и 8,1 раза по сравнению с группой «Контроль» (р=0,03 и 0,00008, соответственно, по критерию Стьюдента) (Фиг. 4). В группе «АраЦ+ГМ+Протоны» уменьшение этого показателя составило 3,6 и 7,4 раза по сравнению с группами «Протоны» (р=0,04) и «Контроль» (р=0,0005), соответственно.

Пример 3 - Анализ эффектов протонной терапии после введения АраЦ.

Мышь №13, самка, линия C57Bl/6j, возраст 2 мес, масса тела 20 г. Клетки меланомы линии В16 были трансплантированы внутримышечно в заднюю правую лапу животного в количестве 200 тыс.клеток в объеме 0,1 мл питательной среды DMEM. На 12 сутки после транслантации опухолевых клеток в хвостовую вену мыши ввели АраЦ в количестве 2,5 мг в 100 мкл физиологического раствора. Через 1 ч после введения АраЦ произвели локальное облучение опухолевого очага в дозе 10 Гр пучком протонов в модифицированном пике Брэгга (комплекс протонной терапии «Прометеус», МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России) (Фиг. 6). Выполнили дозиметрическую верификацию поля облучения с помощью радиохромной пленки Gafchromic ЕВТ (Фиг. 7). Диапазон энергий в модифицированном пике составил от 33 до 56 МэВ, размер модифицированного пика - 20 мм. Длительность синхротронного импульса - 250 мс, пауза между импульсами - 1,3 с.

Анализ аутопсийного материала меланомы, проведенный через 9 суток после облучения, показал, что доля ОСК в первичном очаге мыши №13 составила 0,27%, что в 2,9 раза меньше, чем средняя доля ОСК в группе мышей после одиночного

действия протонов (0,78%). При этом индекс абсолютного количества ОСК у мыши №13 составил 0,10 усл. ед., что в 4,3 раза меньше, чем среднее значение этого показателя в группе мышей после одиночного действия протонов (0,43 усл. ед.). Таким образом, показано повышение чувствительности ОСК меланомы мыши №13 к протонной терапии при предварительном введении животному АраЦ.

Пример 4 - Анализ эффектов протонной терапии после введения АраЦ и ГМ.

Мышь №19, самка, линия C57Bl/6j, возраст 2 мес, масса тела 20 г. Клетки меланомы линии В16 были трансплантированы внутримышечно в заднюю правую лапу животного в количестве 200 тыс.клеток в объеме 0,1 мл питательной среды DMEM. На 12 сутки после транслантации опухолевых клеток в хвостовую вену мыши ввели АраЦ и ГМ в количестве 2,5 мг и 0,03 мг в 100 мкл физиологического раствора. Через 1 ч после введения АраЦ и ГМ произвели локальное облучение опухолевого очага в дозе 10Гр пучком протонов в модифицированном пике Брэгга (комплекс протонной терапии «Прометеус», МРНЦ им. А.Ф. Цыба - филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России). Диапазон энергий в модифицированном пике составил от 33 до 56 МэВ, размер модифицированного пика - 20 мм. Длительность синхротронного импульса - 250 мс, пауза между импульсами - 1,3 с.

Анализ аутопсийного материала меланомы, проведенный через 9 суток после облучения, показал, что доля ОСК в первичном очаге мыши №19 составила 0,27%, что в 2,9 раза меньше, чем средняя доля ОСК в группе мышей после одиночного действия протонов (0,78%). При этом индекс абсолютного количества ОСК у мыши №19 составил 0,16 усл. ед., что в 2,7 раза меньше, чем среднее значение этого показателя в группе мышей после одиночного действия протонов (0,43 усл. ед.). Таким образом, показано повышение чувствительности ОСК меланомы мыши №19 к протонной терапии при предварительном введении животному АраЦ и ГМ.

Пример 5 - Изменение экспрессии гена Nanog через 9 суток после облучения протонами в дозе 10 Гр, а также после комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения.

С помощью метода ПЦР в режиме реального времени определена экспрессия гена Nanog в образцах аутопсийного материала, извлеченных из первичного очага меланомы линии В16 в группах «Контроль», «Протоны» и «АраЦ+Протоны» через 9 суток после облучения. Установлено, что экспрессия этого гена снижается после комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения в 2,3 раза по сравнению с контролем и в 2,1 раз по сравнению с одиночным облучением протонами. При этом протонное излучение

само по себе практически не влияет на экспрессию Nanog по сравнению с контролем. Данные по уровню экспрессии этого гена, играющего ключевую роль в регуляции пула ОСК, подтверждают результаты определения относительного количества (доли) ОСК после изученных воздействий в сравнении с контролем и друг с другом, а также объясняют молекулярный механизм обнаруженного эффекта снижения пула ОСК после комбинированных воздействий с использованием АраЦ.

Таким образом, примеры с 1 по 4 доказывают на групповом и индивидуальном уровне повышение чувствительности стволовых клеток меланомы к действию протонного излучения при предварительном введении АраЦ или АраЦ в комбинации с ГМ. Так, облучение протонами на фоне АраЦ или АраЦ в комбинации с ГМ приводит к многократному уменьшению относительного количества (доли) ОСК по сравнению с одиночным облучением в 2,8 и 3,1 раза, а также их абсолютного количества в 3,9 и 3,6 раза, т.е. использованные соединения обладают радиосенсибилизирующим действием на эту популяцию не только по критерию относительного, но и абсолютного количества этих клеток. Пример №5, доказывающий снижение экспрессии гена Nanog в опухолевой ткани, проясняет молекулярный механизм уменьшения пула ОСК после комбинированного воздействия АраЦ и протонного излучения.

Изобретение позволяет повысить эффективность протонного излучения при использовании комбинированных методов лечения ЗНО, и может стать основой для разработки и улучшения современных методов лучевой терапии.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии и радиологии, и может быть использовано для повышения эффективности лучевой терапии меланомы. Для этого за 1 ч до локального облучения в дозе 10 Гр первичного опухолевого очага меланомы осуществляют одновременное внутривенное введение АраЦ из расчета 2,5 мг/мышь и гидроксимочевины (ГМ) из расчета 0,03 мг/мышь или только внутривенное введение АраЦ из расчета 2,5 мг/мышь. Изобретение позволяет повысить эффективность протонного излучения при использовании комбинированных методов лечения злокачественных новообразований и может стать основой для разработки и улучшения современных методов лучевой терапии. 7 ил., 5 пр.

Способ повышения эффективности действия протонной терапии на стволовые клетки меланомы, включающий воздействие 1-β-D-арабинофуранозилцитозина (АраЦ) на клетки и последующее облучение пучком протонов, отличающийся тем, что за 1 ч до локального облучения в дозе 10 Гр первичного опухолевого очага меланомы осуществляют одновременное внутривенное введение АраЦ из расчета 2,5 мг/мышь и гидроксимочевины (ГМ) из расчета 0,03 мг/мышь, или за 1 ч до локального облучения в дозе 10 Гр внутривенно вводят только АраЦ из расчета 2,5 мг/мышь.