Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата ткани предстательной железы Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 G01N33/68 

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к урологии, разделу хирургической андрологии с использованием методологии молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики, и может быть использовано с целью диагностики бактериальных и абактериальных хронических воспалительных заболеваний предстательной железы.

Хронический простатит является наиболее частым урологическим заболеванием у мужчин моложе 50 лет и занимает третье место по распространенности среди урологических заболеваний, сразу после гиперплазии предстательной железы и рака простаты. Данное заболевание составляет до 25% всех амбулаторных урологических консультаций, что примерно равно 8 миллионам посещений и затрагивает 5% всех мужчин в возрасте от 20 до 50 лет.

В настоящее время ХП/СХТБ представляет собой сложную проблему в повседневной клинической практике, поскольку он ассоциирован с хронической болью, снижением качества жизни и, в конечном итоге, с мужским бесплодием (Graziani A, Grande G, Martin M, et al, 2023). Около 15-20% супружеских пар в мире сталкиваются с проблемой бесплодия, при этом на долю мужского фактора приходится до 50% всех случаев (Chen J, Chen J, Fang Y, Shen Q, Zhao K, Liu C, et al, 2015). В последние годы все больше исследований показывают, что микроорганизмы играют ключевую роль в возникновении и развитии заболеваний, снижающих репродуктивный потенциал мужчины (Chen J, Chen J, Fang Y, Shen Q, Zhao K, Liu C, Zhang H., 2023.) Микробиота относительно стабильна, в основном представлена в полостях, таких как урогенитальный тракт, ротовая полость и желудочно-кишечный тракт. Микробиологический состав урогенитального тракта человека представляет собой широкий спектр микроорганизмов и все большее число исследований микробиоты мужских половых путей доказывают взаимосвязь между наличием микроорганизмов и развитием мужского бесплодия (Zuber A, Peric A, Pluchino N, Baud D, Stojanov M., 2023).

В течение последнего десятилетия исследования показали, что помимо известных прогностических факторов, таких как продолжительность субфертильности, возраст мужчины, индекс массы тела, андропаузы и гормональных нарушений, микробиом также может влиять на фертильность (Hao Y, Feng Y, Yan X, Chen L, et al, 2022).

Из существующего уровня техники известен способ полимеразной цепной реакции амплификации бактериальных генов 16s рРНК в биоптатах предстательной железы у мужчин без хронического простатита (S Keay'C O Zhang, B R Baldwin, R B Alexander. Urology. 1999 Mar;53(3):487-91.doi: 10.1016/s0090-4295(98)00553-6). Согласно описанию метода ДНК выделяли из ткани предстательной железы и проводили двухэтапную амплификацию с использованием вложенных праймеров из высококонсервативной области бактериального гена 16s рРНК. Амплифицированную ДНК очистили и секвенировали, а полученные последовательности сравнили с генами бактериальной рРНК, зарегистрированными в GenBank. Результаты. Одиннадцать из 18 образцов биопсии от 8 из 9 пациентов были положительными на бактериальную ДНК с помощью ПЦР. Данные о последовательности показали преобладающий организм в 8 из 11 образцов с более чем 95% гомологией ДНК нескольких различных родов бактерий, включая Escherichia и Bacteroides. Все 9 контрольных образцов из инструментов перед биопсией были отрицательными.

Недостаток данного способа в том, что методика ПЦР диагностики позволяет выявить строго определенный спектр микроорганизмов, в то время, как методы секвенирования выявляют полный микробиологический спектр в исследуемом локусе, включая вирусы и флору, не ассоциирующуюся ранее с воспалением предстательной железы категории 3В.

Описан способ выделения ДНК из биологического материала (https://dna-technology.ru/sites/default/files/androflorskrin_ivd_b.pdf).

Выделение ДНК проводят в соответствии с инструкцией к используемому комплекту реагентов. Рекомендуемые комплекты для выделения ДНК из биологического материала: ПРОБА-МЧ, ПРОБА-ГC-ПЛЮС, ПРОБА-НК-ПЛЮС. Независимо от используемого комплекта для выделения ДНК одновременно с выделением ДНК из анализируемых образцов необходимо провести через все этапы пробоподготовки отрицательный контрольный образец (в его качестве можно использовать физиологический раствор в объеме, согласно инструкции к комплекту реагентов для выделения ДНК).

Недостатком данной методики является отсутствие предварительной инкубации лизоцимом в ТЕ буфере для разрушения бактериальной клеточной стенки, применение лизоцима способствует увеличению качественного и количественного выделения бактериальной ДНК.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ изучения микробиологического состава образцов ткани простаты, полученной путем биопсии тканей предстательной железы. Микробиологический пейзаж тканей предстательной железы сравнивали с микробиотой мочи, собранной путем катетеризации мочевого пузыря. Один из образцов был заморожен и хранился при температуре -80°С до выделения бактериальной ДНК. Бактериальную ДНК экстрагировали из образцов с помощью набора DN easy Power Soil Kit (Qiagen, Venlo, The Netherlands). Ампликоны, нацеленные на вариабельные области V1-V2 гена 16S рРНК, были созданы с использованием праймеров 27Fmod (5'-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3') и 338R (5'-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'). Затем было выполнено парное секвенирование ампликонов длиной 251 п. н. с использованием MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA). Полученные последовательности с парными концами были объединены, отфильтрованы и очищены от примесей с использованием DADA2 (Callahan B. J., McMurdie P. J., Rosen M. J., Han A. W., Johnson A. J., Holmes S. P. (2020). DADA2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat. Methods 13 (7), 581-583.doi:10.1038/nmeth.3869). Таксономическое назначение было выполнено с использованием плагин классификатора объектов QIIME2 с базой данных Greengenes 13_8. Конвейер QIIME2 версии 2020.2 использовался в качестве биоинформационной среды при обработке всех соответствующих необработанных данных секвенирования. Альфа-разнообразие оценивалось с помощью анализа разрежения индекса Chao1, индекса филогенетического разнообразия (PD) Фейта и индекса Шеннона (Okada K, Takezawa K, Tsujimura G, Imanaka T, Kuribayashi S, Ueda N, Hatano K, Fukuhara S, Kiuchi H, Fujita K, Motooka D, Nakamura S, Koyama Y, Shimada S, Nonomura N. Localization and potential role of prostate microbiota. Front Cell Infect Microbiol. 2022 Dec 7;12:1048319. doi: 10.3389/fcimb.2022.1048319. PMID: 36569206; PMCID: PMC9768196.). Данный способ принят нами за прототип.

Недостатками прототипа являются: ненадлежащая подготовка образцов к выделению бактериальной ДНК, неполное описание непосредственно подготовительной фазы выделения бактериальной ДНК, из нативного биоптата ткани предстательной железы пригодной для проведения NGS-секвенирования, что вызывает дополнительные трудности при проведении данной работы.

Также, в первой фазе подготовки биологического материала не указаны среды и использованные буферные растворы, их концентрация, время экспозиции и режимы центрифугирования для получения необходимого количества бактериальной ДНК из ткани предстательной железы, что делает способ практически невыполнимым.

Большинство современных методов выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения состоят из таких этапов: разрушение клеточных стенок; лизис клеточных мембран; очистка от ингибиторов ферментативных реакций (ПЦР, рестрикции). Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение является снижение трудоемкости способа выделения бактериальной ДНК из ткани биоптата предстательной железы и повышение точности диагностики воспалительных изменений предстательной железы.

Данная задача решается за счет того, что забор образца ткани простаты осуществляют интраоперационно путем биопсии предстательной железы после чего образец подвергают криоконсервации при температуре - 30°С, после чего проводят очистку интактной ДНК из ткани предстательной железы с помощью набора для выделения тотальной ДНК из животной ткани TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, выделяя пробу интактной ДНК с использованием колонок в настольной микроцентрифуге, добавляют к образцу ткани предстательной железы 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл, тщательно перемешивают, встряхивают, инкубируют при 37°С 1-2 часа, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 220 мкл Лизис - буфера, встряхивают 10 секунд, вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе Микроспин FV - 2400 в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 270 мкл связывающего буфера, встряхивают 1 минуту и центрифугируют, колонки помещают внутрь пробирки для сбора образца и переносят жидкость на мембрану колонки, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 в 1 мин и добавляют 500 мкл промывочного раствора, центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость, колонку переносят в чистую микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюят бактериальной ДНК ткани простаты криоконсервируют для последующего анализа.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является снижение трудоемкости метода, улучшение тактики ведения пациентов и прогнозирования результатов лечения.

На сегодняшний день высказывается все больше предположений о наличии собственной микробиоты в органах и тканях. Так, Jain S и соавторы провели 16S - метагеномный анализ ткани простаты, полученной при трансуретральной резекции у 20 пациентов, и обнаружили 1239 видов бактерий (Jain S, Samal AG, Das B, Pradhan B, at al., 2020.).

Большинство современных методов выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения состоят из таких этапов: разрушение клеточных стенок; лизис клеточных мембран; очистка от ингибиторов ферментативных реакций (ПЦР, рестрикции). Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота.

В предлагаемом нами способе использована предварительная инкубация лизоцимом в ТЕ буфере для разрушения бактериальной клеточной стенки, что является новизной при данном подходе. Лизоцим вносили в объёме 20 мкл из стокового раствора с концентрацией 50 мг/мл согласно методу Бирнбойма-Доли/ Birnboin H.C., Doly J. Rapidalkalineextractionmethodforscreeningrecombinantplasmid DNA// Nucl. AcidRes. 1979. 7. 1513-1522./ к образцу, содержащему 160 мкл ТЕ-буфера. Обработка лизоцимом способствует увеличению выхода бактериальной ДНК. Далее проводили инкубирование в шейкере-термостате при 37°С в течение 1-2 часов при помешивании. Последующие этапы проводили по стандартному протоколу выделения ДНК из животных тканей. Данный способ был впервые применен в отношении ткани биоптата предстательной железы человека, полученной из интактной ткани простаты с целью выделения бактериальной ДНК пригодной для последующего секвенирования методом NGS.

Способ апробирован нами на ткани биоптата предстательной железы, полученной при интраоперационной биопсии простаты у 41 пациента с воспалительными изменениями предстательной железы категории 3В, полученный биологический материал был секвенирован методом NGS. Использование заявленного способа в клинической практике в течение последних 2-х лет зарекомендовало себя как надежный метод получения бактериальной ДНК, характеризующий таксономическую структуру микробиоты предстательной железы.

Разработанная нами прецинзионная технология выделения бактериальной ДНК из ткани биоптата предстательной железы позволит сократить трудоемкость и повысить точность диагностики воспалительных заболеваний простаты ассоциирующихся с доброкачественной гиперплазией предстательной железы, раком простаты, а также, возможным снижением репродуктивного потенциала мужчин, что впоследствии позволит улучшить алгоритм диагностики и лечения пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.

Подробное описание способа и примеры его клинического выполнения

В операционных условиях, по стандартной методике биопсии предстательной железы производят забор ткани простаты у пациентов. Ткань помещают в стерильный эппендорф и хранят при температуре криоконсервации не более - 30°. Все процедуры выполнялись в стерильных условиях, с использованием одноразовых материалов и оборудования. Следующим этапом проводят очистку интактной ДНК из ткани предстательной железы с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, что обеспечивает быструю и простую очистку интактной ДНК из ткани простаты. Образцы выделяют с использованием миниколонок в настольной микроцентрифуге.

Геномная ДНК, выделенная таким способом, имеет высокое качество и может быть использована в ПЦР - анализе. К каждому образцу биоптата простаты добавляют 160 мкл ТЕ - буфера, затем 20 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе Микроспин FV - 2400, встряхивают и осаждают путем краткого центрифугирования. Затем инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 1 - 2 часов.

К гомогенизированному образцу добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К (PK) и 220 мкл Лизис - буфера с целью лизиса клеток в пробирке и встряхивают на вортексе Микроспин FV - 2400 в течение 10 секунд. Затем вновь инкубируют при 56°С в течение 2 часов. После чего добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, к каждому образцу и перемешивают на вортексе Микроспин FV - 2400 в течение 10 секунд с последующим инкубированием в термостате при 56°С в течение 10 минут. Следующим этапом добавляют в извлеченные пробирки из термостата 270 мкл связывающего буфера (BBA) и перемешивают в течение 1 минуты с последующим кратким центрифугированием.

Связывающие колонки помещают внутрь пробирки для каждого образца и переносят часть жидкости образца на связывающую колонку, с последующим центрифугированием в течение 1 минуты дважды на скорости 3000 оборотов в минуту.

Затем извлекают пробирки с протекшей жидкостью и перемещают связывающую колонку в новую пробирку с последующим добавлением 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD) в колонку, центрифугируют в течение 2 минут на скорости 3000 оборотов в минуту, затем отделяют протекшую жидкость.

После чего помещают колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавляют 50 мкл воды в колонку, центрифугируют. Удалив связывающую колонку, сохраняют элюат с целью последующего секвенирования методом NGS (секвенирования следующего поколения).

Нельзя использовать повторно колонки или пробирки. Геномная ДНК может недолго храниться при 4°С или длительно при не более - 30°С.

Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример 1.

Пациент П-ов, 1967г.р. обратился в ГБУЗ МО ГКБ г. о. Жуковский, с жалобами на учащенное мочеиспускание, императивные позывы на мочеиспускание, ноктурию до 2 - х раз. Анамнез жизни - в анамнезе ДГПЖ, хронический простатит, острый простатит в 2018 году. В июле 2023 года находился на стационарном лечении с диагнозом: хронический простатит, обострение. По данным амбулаторного ПСА крови от 10.10.2023 ПСА крови -5,5 нг/мл. Проф. вредности отрицает. Бактериальный посев секрета простаты (культуральный метод) - микрофлора не выделена. ПЦР на заболевания, передающиеся половым путем - микрофлора не выделена диагноз: гиперплазия предстательной железы с воспалительным компонентом. Малигнизация?

В операционных условиях, по стандартной методике выполнена полифокальная биопсия предстательной железы под ТРУЗИ навигацией из 14 точек, произвели забор ткани простаты у пациента. Полученный материал криоконсервирован при температуре - 30°. Все процедуры выполняли интрооперационно в стерильных условиях, с использованием одноразовых материалов и оборудования. Следующим этапом провели очистку интактной ДНК из ткани простаты с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, что обеспечило выделение интактной ДНК ткани биоптата простаты. Образцы готовили с использованием мини колонок в настольной микроцентрифуге. Геномная ДНК, выделенная таким способом, имеет высокое качество и может быть использована в ПЦР-анализе. К каждому образцу биоптата ткани предстательной железы добавили 160 мкл ТЕ - буфера, затем 20 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл. Содержимое пробирок тщательно перемешали на вортексе Микроспин FV - 2400 и осадили путем краткого центрифугирования затем инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 1-2 часов. К гомогенизированному образцу добавили 20 мкл раствора Протеиназы К (PK) и 220 мкл Лизис - буфера с целью лизиса клеток в пробирке и перемешали на вортексе Микроспин FV - 2400 в течение 10 секунд. Затем вновь инкубируют при 56°С в течение 2 часов. После чего добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А к каждому образцу и перемешали на вортексе Микроспин FV - 2400 в течение 10 секунд с последующим инкубированием в термостате при 56°С в течение 10 минут. Следующим этапом добавили в извлеченные пробирки из термостата 270 мкл связывающего буфера (BBA) и встряхивали в течение 1 минуты с последующим центрифугированием. Мини колонки поместили внутрь пробирки для образца и перенесли жидкость на мембрану колонки, с последующим центрифугированием в течение 1 минуты дважды на скорости 3000 оборотов в 1 мин. Затем извлекли пробирку с протекшей жидкостью и переместили связывающую колонку в другую пробирку с последующим добавлением 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD), центрифугировали в течение 2 минут на скорости 3000 в 1 минуту, затем отделили протекшую жидкость.

После чего поместили колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавили 50 мкл воды. Удалив связывающую колонку, сохранили элюат с целью последующего секвенирования.

В результате чего была получена таксономическая структура микробиоты ткани простаты, при наличии стерильных посевов, проведенных по стандартным, культуральным методикам.

Пример 2.

Пациент З-ов, 1974 г. р. обратился в центр «Авиценна-Доктор», с жалобами на бесплодный брак более 2,5 лет, учащенное мочеиспускание, императивные позывы на мочеиспускание, ноктурию до 3-х раз. Анамнестически: в анамнезе хронический простатит. Брак 1. Детей ранее не было. Перенесенные заболевания, передающиеся половым путем - клинически санированы. Проф. вредности отрицает. Половая жизнь с 18 лет. В настоящее время половая жизнь регулярная без применения средств контрацепции (2-3+ в неделю). Посещение бани - отрицает. Ранее по поводу бесплодия лечился без эффекта с диагнозом МБ-1. Азооспермия. Результаты обследования: спермограмма - азооспермия. AZF. CFTR - мутаций не выявлено. Гормоны крови: Тс, ЛГ, ФСГ, пролактин вариант нормы. Ингибин В - 63.69 пг/мл - норма. Исследование эякулята на бактериальную флору - микрофлора не выделена. Бактериальный посев секрета простаты - микрофлора не выделена. ПСА 5,5 нг/мл. Ректально: пальпаторно выявлен плотный участок в правой доле предстательной железы. По данным ТРУЗИ выявлено увеличение предстательной железы, малигнизация?

Было решено выполнить биопсию предстательной железы. По данным патоморфологического исследования: доброкачественная гиперплазия предстательной железы с воспалительным компонентом. Супруга обследована у репродуктолога, данных за женский фактор бесплодия нет. Диагноз: ДГПЖ. Мужское бесплодие, азооспермия.

При проведении забора биологического материала из ткани предстательной железы использовали заявленный способ при условии инкубирования в термостате при температуре 37°С в течение 2-х часов. Выявлено наличие инфекции, передаваемой половым путем в невысоком бактериальном титре Acinetobacter ursingii в минимальном титре, а также 191 таксон разновидности урогенитального микробиома. Данная клиническая картина изменила тактику и стратегию ведения пациента, что позволило в последующем сократить экономические затраты и срок реабилитации. В результате было произведено лечение хронического простатита, после чего проведен протокол ВРТ, в котором было выполнено micro TESE, забор с последующим протоколом ИКСИ. В результате проведения протокола ВРТ получена не только прогрессирующая беременность, но и возможность криоконсервации здоровых эмбрионов.

Разработанный нами способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата ткани предстательной железы позволил сократить трудоемкость выделения бактериальной ДНК из биоптата ткани предстательной железы, повысить точность диагностики воспалительных изменений предстательной железы, ассоциирующихся с гиперплазией простаты, раком предстательной железы и репродуктивным потенциалом мужчины, а также подтвердить обоснованность программы выбора алгоритма лечения, что сократит сроки медико-социальной реабилитации пациентов.

Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата ткани предстательной железы успешно апробирован в клинике, показал свою применимость и результативность и может быть рекомендован к применению в специализированных лабораториях.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата ткани предстательной железы. Забор образца биоптата ткани простаты осуществляют путем биопсии предстательной железы, после чего образец подвергают сухой криоконсервации, после чего проводят очистку интактной ДНК из ткани предстательной железы, добавляют к образцу ткани предстательной железы 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима, тщательно перемешивают, встряхивают, инкубируют при 37°С, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 220 мкл Лизис-буфера, встряхивают, вновь инкубируют при 56°С, добавляют 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе с последующим инкубированием при 56°С, сразу добавляют 270 мкл связывающего буфера, встряхивают и центрифугируют, колонки помещают внутрь пробирки для сбора образца и переносят жидкость на мембрану колонки, центрифугируют и добавляют 500 мкл промывочного раствора, центрифугируют и отделяют жидкость, колонку переносят в чистую микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюат бактериальной ДНК ткани предстательной железы криоконсервируют для последующего анализа. Способ позволяет сократить трудоемкость, повысить точность диагностики хронических воспалительных заболеваний предстательной железы, репродуктивного потенциала, а также обоснованность программы выбора алгоритма лечения. 2 пр.

Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата ткани предстательной железы, заключающийся в том, что забор образца ткани простаты осуществляют интраоперационно путем биопсии предстательной железы, после чего образец подвергают криоконсервации при температуре -30°С, после чего проводят очистку интактной ДНК из ткани предстательной железы с помощью набора для выделения тотальной ДНК из животной ткани TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, выделяя пробу интактной ДНК с использованием колонок в настольной микроцентрифуге, добавляют к образцу ткани предстательной железы 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 20 мг/мл, тщательно перемешивают, встряхивают, инкубируют при 37°С 1-2 часа, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 220 мкл Лизис-буфера, встряхивают 10 секунд, вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 270 мкл связывающего буфера, встряхивают 1 минуту и центрифугируют, колонки помещают внутрь пробирки для сбора образца и переносят жидкость на мембрану колонки, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 в 1 мин и добавляют 500 мкл промывочного раствора, центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость, колонку переносят в чистую микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюат бактериальной ДНК ткани простаты криоконсервируют для последующего анализа.