СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ И КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ, ПРИГОДНОЙ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 1999 года по МПК C12N15/10 C12P19/34 C07H21/04 G01N33/48 

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно, к методам выделения ДНК, и к медицине, в частности, к методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний и может быть использовано в лабораторной и исследовательской практике для выделения ДНК из микроорганизмов и животных клеток (крови, тканей, органов) с целью последующей ПЦР-амплификации специфического участка изолированной ДНК.

Известен способ выделения ДНК, основанный на использовании лизоцима, додецил сульфата натрия, ЭДТА, в качестве индукторов лизиса клеточной стенки, с последующей депротеинизацией лизата хлороформом или фенолом и осаждением ДНК изопропанолом (Marmur J.A. procedure fоr the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. - 1961. - Vol. 3. - P. 208 - 218). Однако этот способ имеет ряд недостатков, которые затрудняют его использование в качестве способа выделения ДНК, с целью последующей постановки ПЦР.

Недостатки способа:
1) трудоемкость в исполнении;
2) дороговизна;
3) токсичность используемых реактивов.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ выделения нуклеиновых кислот с использованием гуанидинтиоцианата (Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.H., Wertheimvan Dillen P. M. E., Van der Noorda J. Rapid and Simple method for purification of nucleic acids // J. of Clinical Microb. - 1990. - Vol. 28, N. 3. - P. 495 - 503). Способ осуществляют следующим образом: микропробирку объемом 1,5 мл заполняют 900 мкл лизирующего буфера, состоящего из гуанидинтиоцианата, ЭДТА, "Тритона Х100", и добавляют 40 мкл суспензии сорбента нуклеиновых кислот SiO₂, перемешивают на вортексе и вносят 50 мкл исследуемой пробы, перемешивают на вортексе, инкубируют при комнатной температуре 10 мин, опять перемешивают на вортексе и центрифугируют 15 сек в микроцентрифуге при 12000 об/мин, супернатант отсасывают и отбрасывают, а осадок сорбента промывают 2 раза отмывающим буфером, состоящим из раствора гуанидинтиоцианата, 2 раза 70% этанолом и 1 раз ацетоном. После каждого промывания осадка делают центрифугирование 15 сек, а супернатант отсасывают и отбрасывают. После удаления ацетона осадок сорбента в пробирке подсушивают при +56^oC в течение 10 мин. К осадку сорбента добавляют 50 - 75 мкл ТЕ-буфера, инкубируют 10 мин при +56^oC, перемешивают на вортексе и центрифугируют 2 мин, после чего супернатант пригоден для постановки ПЦР.

Недостатками способа прототипа являются:
1) неэффективность лизиса микроорганизмов, обладающих клеточной стенкой, устойчивой к действию лизирующих агентов, в частности, микроорганизмов рода Brucella;
2) длительность и значительная трудоемкость выполнения способа;
3) неудобство в работе и возможность контаминации микропипеток при отсасывании супернатанта вследствие присутствия в лизирующем буфере "Тритона Х100", который вызывает сильное вспенивание раствора с лизируемой пробой;
4) многокомпонентность используемых растворов и высокая стоимость применяемых реактивов;
5) невозможность изготовления в условиях обычной клинической лаборатории основных растворов по причине недоступности таких реактивов, как гуанидинтиоцианат, "Тритон Х100", SiO₂;
6) потенциальная токсичность для исполнителей таких реактивов как гуанидинтиоцианат (при контакте с кислотами гуанидинтиоцианат может образовывать HCN) и ацетон.

Целью изобретения является повышение эффективности, снижение трудоемкости и удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что берут исследуемый образец в количестве 5 - 10 мкл, помещают материал в 182 мкл лизирующе-осаждающего раствора, включающего в себя 38 мкл лизирующего раствора: 3,45 М NaOH, 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола, перемешивают и составляют при комнатной температуре в течение 10 - 15 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 12000 - 14000 об/мин, супернатант отбрасывают, а осадок промывают 500 мкл 80% этанола однократно. Затем вновь центрифугируют 2 мин при 12000 - 14000 об/мин, супернатант отбрасывают, а осадок сушат при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. К сухому осадку добавляют 15 - 30 мкл ТЕ-буфера или дистиллированной воды и перемешивают.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что исследуемый образец берут в количестве 5 - 10 мкл и помещают его в 182 мкл лизирующе-осаждающего раствора, включающего в себя 38 мкл лизирующего раствора: 3,45 М NaOH, 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола, центрифугируют 5 мин при 12000 - 14000 об./мин, осадок промывают 500 мкл 80% этанола однократно, затем центрифугируют 2 мин при 12000 - 14000 об/мин, осадок высушивают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин и затем добавляют к осадку ТЕ-буфер или дистиллированную воду в количестве 15 - 30 мкл.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных областях. Так, нами не найдено способа выделения ДНК, в котором были бы использованы аналогичные или близкие по значению количества компонентов лизирующе-осаждающего раствора, в частности, 38 мкл лизирующего раствора: 3,45 М NaOH и 0,36 М NaCl, и 144 мкл 96% этанола, сравнимое количество исследуемого образца 5 - 10 мкл и совпадение последующих условий реализации с предлагаемым способом. Предлагаемый лизирующе-осаждающий раствор позволяет осуществлять эффективный лизис клеточной стенки микроорганизмов и клеток, экстракцию ДНК и одновременное ее осаждение.

Таким образом, предлагаемые режимы способа позволяют достичь:
1) высокой эффективности выделения ДНК за счет применения 3,45 М раствора NaOH, позволяющего эффективно разрушать клеточную стенку микроорганизмов и клеток (в том числе у микроорганизмов рода Brucella, обладающих клеточной стенкой, особо устойчивой к действию лизирующих агентов), что способствует более полной экстракции ДНК и одновременному осаждению ДНК в присутствии 0,36 М NaCl и этанола;
2) снижение трудоемкости, путем уменьшения числа этапов способа до минимума;
3) простоты приготовления растворов и исполнения способа, не требующих особой подготовки персонала лабораторий;
4) экономичности, достигаемой применением только доступных отечественных реактивов и оборудования, используемых в обычной лабораторной практике;
5) экологической безопасности, состоящей в исключении использования токсичных химреактивов (фенола, хлороформа, изопропанола, гуанидинтиоцианата, ацетона).

Данный способ выделения ДНК может быть выполнен в клинической и научно-исследовательской лабораториях и использован в качестве первого этапа в ПЦР-диагностике инфекционных заболеваний.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критериям изобретения "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом:
1) в микропробирку объемом 1,5 мл добавляют 38 мкл лизирующего раствора состава: 3,45 М NaOH, 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола, размешивают на вортексе или вручную;
2) вносят 5 - 10 мкл исследуемой пробы: сыворотки крови, мочи, суспензии цервикального или уретрального соскоба в 100 мкл физиологического раствора, перемешивают на вортексе или вручную и выдерживают при комнатной температуре 10 - 15 мин;
3) центрифугируют 5 мин при 12000 - 14000 об/мин в микроцентрифуге, супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу;
4) к осадку на дне пробирки добавляют 500 мкл 80% этанола, осадок промывают, переворачивая пробирку несколько раз, и центрифугируют 2 мин при 12000 - 14000 об/мин, этанол сливают, пробирку с осадком подсушивают при комнатной температуре на фильтровальной бумаге в течение 5 - 10 мин;
5) к осадку добавляют 15 - 30 мкл буфера ТЕ pH 7,0 или дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике, после чего проба готова к исследованию в ПЦР.

Для проведения ПЦР используют 3 мкл полученного препарата на конечный объем амплификационной смеси 25 мкл.

Выделенные препараты ДНК могут длительно храниться в условиях холодильника.

Пример 1.

1. В микропробирку объемом 1,5 мл добавляют 38 мкл лизирующего раствора состава 3,45 М NaOH, 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола, перемешивают на вортексе или вручную.

Вносят 5 мкл сыворотки крови, полученной от больного бруцеллезом человека, перемешивают на вортексе или вручную и выдерживают при комнатной температуре 10 мин.

3. Центрифугируют 5 мин при 1200 об/мин в микроцентрифуге. Супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу.

4. К осадку на дне пробирки добавляют 500 мкл 80% этанола, осадок промывают, переворачивая пробирку несколько раз, и центрифугируют 2 мин при 12000 об/мин. Этанол сливают, пробирку с осадком подсушивают при комнатной температуре на фильтровальной бумаге в течение 5 мин.

5. К осадку добавляют 15 мкл буфера ТЕ pH 7,0 и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике, после чего проба готова к исследованию в ПЦР. Для проведения ПЦР используют 3 мкл полученного препарата на конечный объем амплификационной смеси 25 мкл.

После проведения ПЦР и электрофореза в 1,5% агарозном геле был зарегистрирован положительный результат амплификации специфического участка хромосомной ДНК бруцелл размером 269 пар нуклеотидов, что является доказательством эффективности предлагаемого способа и присутствия в сыворотке крови возбудителя бруцеллеза.

Сравнительно ставилась ПЦР с ДНК, полученной по способу-прототипу, результат регистрации амплификации в геле был отрицательным, что свидетельствует о неэффективности лизиса клеточной стенки бруцелл.

Пример 2.

1. В микропробирку объемом 1,5 мл добавляют 38 мкл лизирующего раствора состава 3,45 М NaOH, 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола, перемешивают на вортексе или вручную.

2. Вносят 10 мкл пробы из 100 мкл суспензии цервикального соскоба в физиологическом растворе, перемешивают на вортексе или вручную и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.

3. Центрифугируют 5 мин при 14000 об/мин в микроцентрифуге. Супернатант сливают, остаткам раствора в пробирке дают стечь на фильтровальную бумагу.

4. К осадку на дне пробирки добавляют 500 мкл 80% этанола, осадок промывают, переворачивая пробирку несколько раз и центрифугируют 2 мин при 14000 об/мин. Этанол сливают, пробирку с осадком подсушивают при комнатной температуре на фильтровальной бумаге в течение 10 минут.

5. К осадку добавляют 30 мкл дистиллированной воды и содержимое пробирки перемешивают путем пипетирования в отдельном стерильном наконечнике, после чего проба готова к исследованию в ПЦР. Для проведения ПЦР используют 3 мкл полученного препарата на конечный объем амплификационной смеси 25 мкл.

После проведения ПЦР и электрофореза в 1,5% агарозном геле был зарегистрирован положительный результат амплификации специфического участка хромосомной ДНК Ch. trachomatis, размером 501 пара нуклеотидов, что является доказательством присутствия в исследуемом материале возбудителя генитального хламидиоза.

Результат ПЦР с ДНК, полученный способом-прототипом, был также положительным.

Предлагаемые режимы являются необходимыми и достаточными для достижения поставленной задачи - выделения ДНК, пригодной для постановки ПЦР, а именно:
1) 5 - 10 мкл исследуемого образца - оптимальное количество пробы для выделения из нее ДНК в достаточном количестве для последующей амплификации специфического участка ДНК в ПЦР, при уменьшении количества образца менее 5 мкл соответственно снизится выход ДНК, увеличение количества образца приведет к дополнительному выпадению в осадок белка и недостаточному растворению ДНК;
2) выдерживание образца в лизирующе-осаждающем растворе при комнатной температуре 5 - 10 мин достаточно для эффективного лизиса микроорганизмов и клеток и осаждения их ДНК, уменьшение этого времени приведет к неполному лизису и снижению выхода ДНК, увеличение времени удлинит общее время исполнения способа;
3) центрифугирование при 12000 - 14000 об/мин достаточно для осаждения экстрагированной ДНК, снижение оборотов менее 12000 об/мин приведет к увеличению времени центрифугирования, что удлинит всю процедуру способа, увеличение более 14000 об/мин приведет к удорожанию способа, так как потребует для этого дополнительное оборудование;
4) высушивание осадка в течение 5 - 10 мин достаточно для полного его высыхания и быстрого последующего растворения, при уменьшении времени высушивания менее 5 мин, осадок может содержать остатки этанола, что затруднит его растворение в буфере или будет ингибировать активность Tag-ДНК-полимеразы в ПЦР, увеличение времени высушивания осадка более 1 мин, приведет к его пересушиванию и более длительному растворению;
5) количестве ТЕ-буфера или дистиллированной воды 15 - 30 мкл необходимо и достаточно для перевода ДНК в раствор, уменьшение этого количества может привести к защелачиванию препарата ДНК, что может ингибировать ферментативную реакцию в ПЦР, увеличение количества ТЕ-буфера приведет к уменьшению концентрации ДНК в амплификационной смеси.

Предлагаемый способ был апробирован при исследовании с помощью ПЦР препаратов ДНК, полученных из 85 сывороток крови от больных бруцеллезом людей, 6 суспензий внутренних органов (печень, селезенка) и лимфатических узлов в физиологическом растворе от больных бруцеллезом коров с целью детекции возбудителя бруцеллеза и 43 цервикальных и 2 уретральных соскобов, переведенных в физиологический раствор, от пациентов акушерско-гинекологических стационаров с воспалительными заболеваниями репродуктивных органов на выявление генитального хламидиоза. ПЦР-позитивными оказались 64 сыворотки крови и 1 суспензия из внутренних органов, что было также подтверждено комплексом иммунологических тестов, 1 уретральный и 30 цервикальных соскобов.

Данный способ может быть, применен в качестве первого этапа в ПЦР-ДНК-детекции возбудителей инфекционных заболеваний.

Предлагаемый способ эффективен, так как позволяет выделять ДНК, пригодную для постановки ПЦР из минимального количества диагностического материала (крови, компонентов крови, мочи, гистологического материала), прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования, реактивов и особой подготовки персонала лабораторий, экологически безопасен.

Способ применим для клинической и научно-исследовательской практики.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии. Для выделения ДНК исследуемый образец в количестве 5-10 мкл помещают в 182 мкл лизирующе-осаждающего раствора. включающего в себя 38 мкл лизирующего раствора: 3,45 М NaOH 0,36 M NaCl и 144 мкл 96% этанола, перемешивают и оставляют при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Затем центрифугируют в течение 5 мин при 12000-14000 об/мин. Супернатант отбрасывают, а осадок промывают 500 мкл 80% этанола однократно. Затем вновь центрифугируют 2 мин при 12000-14000 об/мин, супернатант отбрасывают, а осадок сушат при комнатной температуре в течение 5-10 мин. К сухому осадку добавляют 15-30 мкл ТЕ-буфера и перемешивают. В результате чего достигаются эффективность выделения ДНК за счет лизиса клеток, обладающих клеточной стенкой, устойчивой к действию большинства лизирующих агентов, удешевление способа за счет использования доступных и недорогих реактивов, снижение трудоемкости способа путем сокращения этапов способа, экологическая безопасность за счет исключения использования токсических химреактивов.

Способ выделения ДНК из микроорганизмов и клеток животных, пригодный для постановки полимеразной цепной реакции, включающий взятие исследуемого образца, помещение его в лизирующий раствор и перемешивание, затем оставляют раствор при комнатной температуре на 10 - 15 мин, после чего центрифугируют, супернатант отбрасывают, а осадок промывают и высушивают, затем добавляют к осадку ТЕ-буфер и перемешивают, отличающийся тем, что исследуемый образец берут в количестве 5 - 10 мкл и помещают в 182 мкл лизирующе-осаждающего раствора, состоящего из 38 мкл лизирующего раствора: 3,45 М NaOH, 0,36 М NaCl и 144 мкл 96% этанола, центрифугируют 5 мин при 12000 - 14000 об/мин, осадок промывают 500 мкл 80% этанола однократно, затем центрифугируют 2 мин при 12000 - 14000 об/мин, осадок высушивают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин и затем добавляют к осадку ТЕ-буфер или дистиллированную воду в количестве 15 - 30 мкл.