Способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом Российский патент 2017 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины и может быть использовано для выделения ДНК из среза парафинового блока с образцом ткани для гистологического исследования.

ДНК несет генетическую информацию о человеке и может использоваться для медико-биологических исследований, а также для установления родства, идентификации личности и других целей. Нередко патогенез различных заболеваний изучают с использованием ДНК из гистологического материала больных. Однако в процессе морфологического исследования биоматериал проходит несколько этапов пробоподготовки, включая фиксацию в формалине и закрепление в парафине, что приводит к разрывам в молекуле ДНК и, как следствие, к ее фрагментации, значительно снижающей количество ДНК, пригодной для полноценного использования в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

При выделении ДНК из срезов парафиновых блоков наиболее важными являются стадия депарафинизации (или ее отсутствия) и стадия денатурализации биоматериала с целью разрушения биополимеров и надмолекулярных структур, возникших в процессе фиксации/обезвоживания образца, необходимая для высвобождения в раствор максимального количества нуклеиновых кислот в свободном виде.

Традиционный подход к депарафинизации заключается в растворении парафина в ксилоле и удалении ксилола путем последовательной инкубации в растворах спиртов с уменьшающейся концентрацией спирта. Некоторые исследователи отказываются от предварительного удаления парафина, однако есть данные о том, что даже небольшие количества парафина могут помешать дальнейшему анализу ДНК (Coombs N.J., Gough А.С., Primrose J.N. Optimisation of DNA and RNA extraction from archival formalin-fixed tissue. Nucleic Acids Res. 1999. 27(16): p. e12).

Несмотря на большое количество разработанных способов выделения ДНК из парафиновых блоков, до сих пор не существует общепринятого единого протокола пробоподготовки для выделения ДНК. Это приводит к тому, что качество препаратов ДНК и количество ДНК, получаемое из парафиновых блоков, сильно варьируют, а данные, получаемые в результате анализа ДНК в различных лабораториях, зачастую не совпадают.

Таким образом, получение высокоочищенных препаратов ДНК из срезов парафиновых блоков, пригодных для последующего анализа (ПЦР, микрочиповый анализ, полногеномное секвенирование) является актуальной проблемой современной молекулярной биологии и диагностической медицины.

В настоящее время существует несколько принципиально различных способов выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом.

Известен способ выделения ДНК из парафиновых блоков, заключающийся в том, что к срезу парафинового блока с гистологическим биоматериалом толщиной 20 мкм добавляют 100 мкл 0,5% водного раствора детергента Твин 20, полученную смесь нагревают при 90°С, добавляют к ней 50 мкг протеиназы К при температуре 55°С и инкубируют смесь при этой температуре в течение 3-х часов с дальнейшим нагреванием смеси до 99°С. Затем добавляют 100 мкл 5% водного раствора Челекс 100 и буферный раствор (Трис-HCl, рН 7,5) и раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), центрифугируют при 10500 об/мин в течение 15 мин, охлаждают и удаляют застывший слой парафина. Остаток нагревают с хлороформом при температуре 45°С, затем центрифугируют при 10500 об/мин в течение 15 мин и супернатант используют для ПЦР (патент RU 2351652 С1, оп. 10.04.2009).

Недостатками известного способа являются длительная процедура депарафинизации образца, низкий выход ДНК, пригодной для ПЦР, составляющий 61,3%, и низкая степень очистки целевого продукта, содержащего реагенты, ингибирующие ПЦР.

Известен способ выделения ДНК из парафиновых блоков, в котором депарафинизацию образца проводят с использованием минерального масла. Для этого к 3-4 парафиновым срезам добавляют 300 мкл минерального масла и инкубируют при 90°С в течение 20 минут для растворения парафина. Затем из полученного раствора выделяют ДНК при помощи фенольной экстракции (Lin J., Kennedy S.H., Svarovsky Т., Rogers J., Kemnitz J.W., Xu A., Zondervan K.T. High-quality genomic DNA extraction from formalin-fixed and paraffin-embedded samples deparaffinized using mineral oil. Anal Biochem. 2009. 395(2): p. 265-7).

Данный способ позволяет получать ДНК, пригодную для ПЦР анализа, с выходом 80%. К недостаткам этого способа относятся трудоемкость, длительное время обработки образца, высокие требования к квалификации персонала. Кроме того, при выполнении этого способа используются токсичные вещества и остаются токсичные отходы, которые должны специальным образом утилизироваться. Все это делает способ малопригодным для работы с большим количеством образцов в рутинной клинической практике.

Наиболее близким к предлагаемому способу - прототипом, является способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом, заключающийся в следующем. Парафиновый блок толщиной 10-20 мкм депарафинизируют ксилолом, остатки ксилола удаляют 96% этанолом. Далее к осадку добавляют денатурирующий буфер (90 мкл), содержащий 50 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 10 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл), и инкубируют 16 ч при 37°С. Затем протеиназу К инактивируют нагреванием до 95°С в течение 20 мин, центрифугируют реакционную смесь и переносят супернатант в новую емкость. К супернатанту добавляют 100 мкл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивают и центрифугируют при 16.000 g. Водную фазу переносят в новую емкость, добавляют 60 мкл изопропилового спирта, перемешивают и центрифугируют 15 мин при 16.000 g и температуре 4°С. Супернатант удаляют, осадок промывают 75% этанолом и высушивают на воздухе. ДНК растворяют в 50 мкл воды (Alvarez-Aldana A., Martinez J.W., Sepulveda-Arias J.C. Comparison of five protocols to extract DNA from paraffin-embedded tissues for the detection of human papillomavirus. Pathol Res Pract. 2015. 211(2): p. 150-5).

Недостатками прототипа являются недостаточный выход (около 70%) и низкая степень очистки ДНК (содержание ингибиторов ПЦР), плохая воспроизводимость, а также длительность процедуры выделения ДНК.

Задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, сокращение материальных и временных затрат на выделение ДНК из парафиновых блоков.

Технический результат: упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

К парафиновому блоку (с гистологическим биоматериалом) толщиной 10-20 мкм добавляют ксилол (1 мл) для удаления парафина, смесь инкубируют и осаждают биологический материал центрифугированием при 10.000-16.000 g при комнатной температуре. Супернатант удаляют, осадок промывают 96% этанолом (1 мл) и обрабатывают денатурирующим буферным раствором (290-490 мкл), содержащим 10 мМ Tris-ацетат, рН 6.5, 3 М гуанидин хлорид, 10-20 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубируют 1-4 ч при 42-56°С. Протеиназу К инактивируют нагреванием при 90°С в течение 1-2 ч, центрифугируют при 10.000-16.000 g, супернатант переносят в новую емкость. К полученному супернатанту добавляют 1/3 объема 96% этанола и наносят на колонку «БиоСилика» со стекловокнистым сорбентом методом вакуумной фильтрации или центрифугированием. Сорбент промывают буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10 мМ Трис-ацетат рН 6.5, 25% этанол, а затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl рН 7.5, 0,1М NaCl, 75% этанол. Элюцию ДНК с сорбента осуществляют стерильной водой.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. Депарафинизированный образец, содержащий ДНК, обрабатывают денатурирующим буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид и протеиназу К, что позволяет эффективно гидролизовать белки, препятствующие выделению ДНК и сократить время выделения.

2. К полученному супернатанту добавляют 1/3 объема 96% этанола и наносят на колонку «БиоСилика» со стекловокнистым сорбентом, что позволяет повысить эффективность связывания ДНК с сорбентом, денатурировать оставшиеся белки/липопротеины и обеспечить дополнительную диссоциацию нуклеопротеиновых комплексов. Эта процедура увеличивает эффективность связывания фрагментированной ДНК с поверхностью сорбента, увеличивает чистоту и выход продукта.

3. Отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют последовательно сначала буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10 мМ Трис-ацетат, рН 6.5, 25% этанол, а затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl рН 7.5, 0.1М NaCl, 75% этанол, что обеспечивает эффективное удаление примесей ненуклеотидной природы с поверхности сорбента и повышает чистоту получаемого препарата ДНК.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет более просто, быстро и эффективно выделять ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1. Выделение ДНК из срезов парафиновых блоков с гистологическим материалом здорового донора.

Выделение ДНК из 10 срезов парафиновых блоков здоровых доноров проводили с использованием способа-прототипа и предлагаемого способа.

Согласно способу-прототипу к парафиновым срезам толщиной 10 мкм добавляли 1 мл ксилола, инкубировали в течение 10 минут и центрифугировали при 16.000 g. Супернатант удаляли, к осадку добавляли 1 мл 96% этанола, перемешивали и центрифугировали при 16.000 g, супернатант удаляли. Затем к осадку добавляли 90 мкл лизис-буфера (50 мМ Tris-HCl, рН 8.0), 10 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали 16 ч при 37°С. Далее проводили инактивацию протеиназы К путем нагревания до 95°С. Смесь центрифугировали при 16.000 g, супернатант переносили в новую пробирку. Затем к супернатанту добавляли 100 мкл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали при 16.000 g. Водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли 60 мкл изопропилового спирта, перемешивали и центрифугировали 15 мин при 16.000 g при температуре 4°С. Супернатант удаляли, осадок промывали 75% этанолом и сушили на воздухе. Осадок ДНК растворяли в 50 мкл воды.

Согласно предлагаемому способу к парафиновым срезам толщиной 10 мкм добавляли 1 мл ксилола, инкубировали в течение 5 минут и центрифугировали при 16.000 g. Супернатант удаляли. Затем к осадку добавляли 1 мл 96% этанола, перемешивали и центрифугировали при 16.000 g, супернатант удаляли. Затем к осадку добавляли 290 мкл денатурирующего буфера (10 мМ Tris-ацетат, рН 6.5, 3 М гуанидин хлорид), 10 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали 4 ч при 42°С. Затем смесь инкубировали 1 ч при 90°С. Смесь центрифугировали при 16.000 g, супернатант переносили в новую пробирку объемом 1,5 мл. К полученному супернатанту добавляли 1/3 объема 96% этанола и наносили на колонку «БиоСилика» (BioSilica Ltd, Россия) со стекловокнистым сорбентом, с последующим центрифугированием при 2.000 g. Сорбент промывали буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10 мМ Трис-ацетат рН 6.5, 25% этанол, а затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl рН 7.5, 0.1М NaCl, 75% этанол. Элюцию ДНК с сорбента осуществляли стерильной водой.

Концентрацию ДНК, выделенной разными способами, определяли с помощью количественной ПЦР на L1 элементы (Morozkin E.S., Babochkina T.I., Vlassov V.V., Laktionov P.P. The effect of protein transport inhibitors on the production of extracellular DNA. Ann N.Y. Acad. Sci. 2008. 1137: p. 31-35).

Результаты выделения ДНК представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход ДНК более чем на 25% и сократить длительность способа не менее чем на 10 часов.

Данный пример иллюстрирует возможность использования разработанного способа в клинических лабораториях, применяющих поточные методы с высокой воспроизводимостью.

Пример 2. Выделение ДНК из срезов парафиновых блоков с тканью больных раком легкого.

Для оценки эффективности выделения ДНК проводили выделение ДНК из срезов парафиновых блоков, полученных из биоптатов тканей 10 больных раком легкого с использованием коммерческого набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) и предлагаемым способом.

Для этого к срезам парафиновых блоков толщиной 10 мкм добавляли 1 мл ксилола, инкубировали в течение 10 минут и центрифугировали при 10.000 g. Супернатант удаляли. Затем к осадку добавляли 1 мл 96% этанола, перемешивали и центрифугировали при 10.000 g, супернатант удаляли. Затем к осадку добавляли 490 мкл денатурирующего буфера (10 мМ Tris-ацетат, рН 6.5, 3 М гуанидин хлорид), 20 мкл раствора протеиназы К (20 мг/мл) и инкубировали 1 ч при 56°С. Затем смесь инкубировали 1 ч при 90°С. Смесь центрифугировали при 16.000 g, супернатант переносили в новую пробирку. К полученному супернатанту добавляли 1/3 объема 96% этанола и наносли на колонку «БиоСилика» (BioSilica Ltd, Россия) методом вакуумной фильтрации. Сорбент промывали буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10 мМ Трис-ацетат рН 6.5, 25% этанол, а затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl рН 7.5, 0.1М NaCl, 75% этанол. Элюцию ДНК с сорбента осуществляли стерильной водой.

Все операции выделения ДНК коммерческим набором QIAamp DNA FFPE Tissue Kit выполняли, как рекомендовано инструкцией производителя.

Концентрацию ДНК, выделенной разными способами, определяли с помощью количественной ПЦР на L1 элементы. Результаты сравнения эффективности выделения ДНК с использованием разных способов представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход ДНК в среднем на 12%.

Использование предлагаемого способа позволит увеличить выход ДНК в среднем на 12-25%, а также сократить время выделения ДНК не менее чем на 10 часов.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины. Предложен способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом. Удаляют парафин из образца биоматериала, инкубируют и осаждают биологический материал центрифугированием. Осадок промывают 96% этанолом и обрабатывают денатурирующим буфером, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10-20 мкл раствора протеиназы К в концентрации 20 мг/мл и 10 мМ Трис-ацетат. Полученный нерастворимый осадок осаждают центрифугированием. К супернатанту добавляют 1/3 объема 96% этанола и наносят образец ДНК на колонку со стекловолокнистым сорбентом, например, сорбентом «БиоСилика». Сорбент отмывают буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10 мМ Трис-ацетат рН 6.5, 25% этанол, а затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 75% этанол. ДНК элюируют стерильной дистиллированной водой. Изобретение позволяет сократить выделение ДНК из парафиновых блоков не менее чем на 10 ч и повысить выход ДНК на 12-25%. 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ выделения ДНК из парафиновых блоков с гистологическим биоматериалом, включающий депарафинизацию образца биоматериала, обработку образца денатурирующим буферным раствором, содержащим протеиназу К, инактивирование протеиназы К нагреванием, отделение супернатанта центрифугированием, добавление к супернатанту спирта с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что образец биоматериала обрабатывают денатурирующим буферным раствором, содержащим 10 мМ Трис-ацетат, рН 6.5, 3 М гуанидин хлорид, 10-20 мкл раствора протеиназы К в концентрации 20 мг/мл, смесь инкубируют и осаждают нецелевые биополимеры центрифугированием, к полученному супернатанту добавляют 1/3 объема 96% этанола и наносят на колонку со стекловолокнистым сорбентом, а отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют сначала буферным раствором, содержащим 3 М гуанидин хлорид, 10 мМ Трис-ацетат рН 6,5, 25% этанол, а затем буферным раствором, содержащим 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, элюцию ДНК с сорбента осуществляют стерильной водой.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к образцу биоматериала добавляют 290-490 мкл денатурирующего буферного раствора.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец биоматериала инкубируют с денатурирующим буфером при 42-56°С в течение 1-4 часов и центрифугируют при 10000-16000g.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для выделения ДНК используют колонки со стекловолокнистым сорбентом «БиоСилика».