СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS Российский патент 2024 года по МПК C12N1/38 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к химической стимуляции активности микроорганизмов путем введения химических соединений и может быть использовано в различных областях биотехнологического синтеза.

Определение активности липолитических ферментов бактерий является необходимым аспектом для полной характеристики их участия в метаболизме, а также для оценки вклада отдельных ферментов в адаптацию микроорганизмов к различным условиям. На данный момент нет простых и быстрых способов стимулирования липолитической активности, поэтому разработка способа стимуляции липолитической активности лактобактерий является актуальной задачей.

Известен способ определения липолитической активности молочнокислых бактерий [García-Cano I., Rocha-Mendoza D., Ortega-Anaya J., Wang K., Kosmerl E., Jiménez-Flores R. Lactic acid bacteria isolated from dairy products as potential producers of lipolytic, proteolytic and antibacterial proteins // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2019. - Т. 103, № 13. - С. 5243-5257], включающий добавление 50 мкл п-нитрофенилацетата к 50 мкл суспензии бактерий Lactococcus lactis, которую предварительно культивируют на питательной среде MRS при 37 °С в течение 12 ч, последующее термостатирование при 37 °С c интервалом в 1 минуту в течение 1 часа и измерение липолитической активности при длине волны 410 нм на спектрофотометре.

Данный способ не позволяет стимулировать липолитическую активность бактерий Lactococcus lactis.

Также известен способ определения активности липолитических ферментов молочнокислых бактерий [Китаевская, С.В. Изучение способности молочнокислых бактерий продуцировать липолитические ферменты // Вестник Казанского технологического университета. - 2015. - Т. 18, № 18. - С. 256-258], который включает внесение пипеткой 0,9 мл нейтрального оливкового масла, 0,7 мл фосфатного буфера (pH=7,0) в сухую колбу емкостью 20-30 мл с притертой пробкой, дальнейшее встряхивание, введение 1 мл культуральной жидкости и встряхивание в течение 2-3 мин на качалке, термостатирование 2 часа при 37 °С, последующее добавление 10 мл этилового спирта и титрование полученной смеси 0,05 моль/л раствором гидроксида натрия в присутствии 1 % раствора тимолфталеина.

Данный способ определяет только фактический уровень липолитической активности.

Технический результат предложенного изобретения заключается в создании способа стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis.

Согласно изобретению, способ стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis включает культивирование штамма бактерий Lactococcus lactis плотностью 10⁸ КОЕ/мл культивируют на жидкой питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре 37 °С. Затем биомассу бактерий отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость стерилизуют, пропуская через мембранный фильтр и получают культуральную жидкость. Отдельно смешивают 7 % оливкового масла от общего объема смеси и 6 % фосфатного буфера с pH 7,0 от общего объема смеси и встряхивают. К полученной смеси добавляют 8 % указанной культуральной жидкости от общего объема смеси и навеску порошка сукцината лития до получения концентрации раствора 1,5-20 ммоль/л, затем встряхивают, термостатируют в течение 2 часов при температуре 37 °С и добавляют 96 % этиловый спирт в количестве 79 % от общего объема смеси.

В предложенном изобретении в качестве стимулятора липолитической активности используют сукцинат лития.

Добавление сукцината лития в питательную среду в концентрации 1,5-20 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis в 1,1-1,3 раза.

Достигаемый эффект увеличения липолитической активности является перспективным для использования в микробиологии и биотехнологии

На фиг. 1 представлена зависимость липолитической активности бактерий Lactococcus lactis от концентрации сукцината лития.

Пример 1

Штамм бактерий Lactococcus lactis B-13177 плотностью 10⁸ КОЕ/мл предварительно культивировали на жидкой питательной среде MRS [ГОСТ 10444.11-2013] в течение 24 часов при температуре 37 °С в CO₂-инкубаторе (N-biotek NB203). По окончании культивирования биомассу бактерий отделили центрифугированием (Центрифуга MPW-55) при 8000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость простерилизовали, пропуская ее через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Далее в сухую колбу объемом 50 мл внесли пипеткой 0,9 мл оливкового масла (7 % от общего объема смеси) и 0,7 мл фосфатного буфера (pH = 7,0), что составляет 6 % от общего объема смеси и осуществили встряхивание. Затем добавили полученную культуральную жидкость в количестве 1,0 мл (8 % от общего объема смеси) и навеску порошка сукцината лития (BLD Pharm) до получения конечной концентрации раствора соли 1,5 ммоль/л, осуществили встряхивание в течение 3 мин на орбитальном шейкере WiseCube, термостатировали в течение 2 часов при температуре 37 °С в термостате WiseCube и добавили 96 % этиловый спирт в количестве 10,0 мл (79 % от общего объема смеси).

Для определения липолитической активности бактерий Lactococcus lactis полученную смесь оттитровали 0,05 моль/л раствором гидроксида натрия в присутствии 1 % водно-спиртового раствора тимолфталеина при постоянном перемешивании до появления синей окраски, определили объём гидроксида натрия, пошедшего на титрование, и по полученным данным рассчитали липолитическую активность в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при термостатировании 1 мл культуральной жидкости. Определение липолитической активности провели в трех повторениях. Полученные данные представлены в виде зависимости липолитической активности бактерий Lactococcus lactis от концентрации сукцината лития и приведены на фиг.1.

Пример 2 аналогичен примеру 1, но добавили навеску порошка сукцината лития (BLD Pharm) до получения конечной концентрации раствора соли 10 ммоль/л. Полученные данные приведены на фиг.1.

Пример 3 аналогичен примеру 1 с тем отличием, что добавили навеску порошка сукцината лития (BLD Pharm) до получения конечной концентрации раствора соли 20 ммоль/л. Полученные данные приведены на фиг.1.

Пример 4 аналогичен примеру 1, но без добавления навески порошка сукцината лития. Полученные данные приведены на фиг.1.

Согласно полученным результатам, присутствие сукцината лития в концентрации 1,5 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis с 3,88 мкмоль/(мл·мин) до 4,08 мкмоль/(мл·мин). Присутствие сукцината лития в концентрации 10 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis с 3,88 мкмоль/(мл·мин) до 4,92 мкмоль/(мл·мин). Присутствие сукцината лития в концентрации 20 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis с 3,88 мкмоль/(мл·мин) до 5,00 мкмоль/(мл·мин).

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis. Указанный способ включает культивирование штамма бактерий Lactococcus lactis на жидкой питательной среде MRS, отделение биомассы бактерий центрифугированием, стерилизацию надосадочной жидкости, получение культуральной жидкости, которую затем добавляют к смеси оливкового масла и фосфатного буфера, и добавление к полученной смеси навески порошка сукцината лития до получения концентрации раствора 1,5-20 ммоль/л. Настоящее изобретение обеспечивает увеличение липолитической активности бактерий Lactococcus lactis в 1,1-1,3 раза. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

1. Способ стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis, характеризующийся тем, что штамм бактерий Lactococcus lactis плотностью 10⁸ КОЕ/мл культивируют на жидкой питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре 37°С, биомассу бактерий отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость стерилизуют, пропуская через мембранный фильтр, и получают культуральную жидкость, отдельно смешивают 7% оливкового масла от общего объема смеси и 6% фосфатного буфера с pH 7,0 от общего объема смеси, встряхивают, далее к полученной смеси добавляют 8% указанной культуральной жидкости от общего объема смеси и навеску порошка сукцината лития до получения концентрации раствора 1,5-20 ммоль/л, затем встряхивают, термостатируют в течение 2 часов при температуре 37°С и добавляют 96% этиловый спирт в количестве 79% от общего объема смеси.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биомассу бактерий отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что надосадочную жидкость стерилизуют с помощью мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.