СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ЛИПОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 C12N9/20 A23C19/00 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к химической стимуляции активности микроорганизмов путем введения химических соединений и может быть использовано в различных областях биотехнологического синтеза.

Определение активности липолитических ферментов бактерий является необходимым аспектом для полной характеристики их участия в метаболизме, а также для оценки вклада отдельных ферментов в адаптацию микроорганизмов к различным условиям. На данный момент нет простых и быстрых способов стимулирования липолитической активности, поэтому разработка способа стимуляции липолитической активности лактобактерий является актуальной задачей.

Известен способ определения липолитической активности молочнокислых бактерий [García-Cano I., Rocha-Mendoza D., Ortega-Anaya J., Wang K., Kosmerl E., . Lactic acid bacteria isolated from dairy products as potential producers of lipolytic, proteolytic and antibacterial proteins // Applied Microbiology and Biotechnology. 2019. Т. 103, № 13. С. 5243-5257], включающий добавление 50 мкл п-нитрофенилацетата к 50 мкл суспензии бактерий Lactococcus lactis, которую предварительно культивируют на питательной среде MRS при 37°С в течение 12 ч, последующее термостатирование при 37°С c интервалом в 1 минуту в течение 1 часа и измерение липолитической активности при длине волны 410 нм на спектрофотометре.

Данный способ не позволяет стимулировать липолитическую активность бактерий Lactococcus lactis.

Также известен способ определения активности липолитических ферментов молочнокислых бактерий [Китаевская, С.В. Изучение способности молочнокислых бактерий продуцировать липолитические ферменты // Вестник Казанского технологического университета. - 2015. - Т. 18, № 18. - С. 256-258], который включает внесение пипеткой 0,9 мл нейтрального оливкового масла, 0,7 мл фосфатного буфера (pH=7,0) в сухую колбу емкостью 20-30 мл с притертой пробкой, дальнейшее встряхивание, введение 1 мл культуральной жидкости и встряхивание в течение 2-3 мин на качалке, термостатирование 2 часа при 37°С, последующее добавление 10 мл этилового спирта и титрование полученной смеси 0,05 моль/л раствором гидроксида натрия в присутствии 1 % раствора тимолфталеина.

Данный способ определяет только фактический уровень липолитической активности.

Технический результат предложенного изобретения заключается в создании способа стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis.

Согласно изобретению, способ стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis включает культивирование штамма бактерий Lactococcus lactis плотностью 10⁸ КОЕ/мл на жидкой питательной среде MRS в течение 24 часов при температуре 37°С. Затем биомассу бактерий отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость стерилизуют, пропуская через мембранный фильтр и получают культуральную жидкость. Отдельно смешивают 7 % оливкового масла от общего объема смеси и 6 % фосфатного буфера с pH 7,0 от общего объема смеси и встряхивают. К полученной смеси добавляют 8 % указанной культуральной жидкости от общего объема смеси и навеску порошка пирувата лития до получения концентрации раствора 1,5-20 ммоль/л, затем встряхивают, термостатируют в течение 2 часов при температуре 37°С и добавляют 79 % этилового спирта от общего объема смеси.

В предложенном изобретении для стимуляции липолитической активности используют пируват лития. Добавление пирувата лития в питательную среду в концентрации 1,5-20 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis в 1,1 раза.

Достигаемый эффект увеличения липолитической активности является перспективным для использования в микробиологии и биотехнологии.

На фиг. 1 представлена зависимость липолитической активности бактерий Lactococcus lactis от концентрации пирувата лития.

Пример 1

Штамм бактерий Lactococcus lactis B-13177 плотностью 10⁸ КОЕ/мл предварительно культивировали на жидкой питательной среде MRS [ГОСТ 10444.11-2013] в течение 24 часов при температуре 37°С в CO₂-инкубаторе (N-biotek NB203). По окончании культивирования биомассу бактерий отделили центрифугированием (Центрифуга MPW-55) при 8000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость простерилизовали, пропуская ее через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Далее в сухую колбу объемом 50 мл внесли пипеткой 0,9 мл оливкового масла и 0,7 мл фосфатного буфера (pH = 7,0) и осуществили встряхивание. Затем добавили полученную культуральную жидкость в количестве 1,0 мл и навеску порошка пирувата лития (BLD Pharm) до получения конечной концентрации раствора соли 1,5 ммоль/л, осуществили встряхивание в течение 3 мин на орбитальном шейкере WiseCube, термостатировали в течение 2 часов при температуре 37°С в термостате WiseCube и добавили 10,0 мл 96 % этилового спирта.

Для определения липолитической активности бактерий Lactococcus lactis полученную смесь оттитровали 0,05 моль/л раствором гидроксида натрия в присутствии 1 % водно-спиртового раствора тимолфталеина при постоянном перемешивании до появления синей окраски, определили объём гидроксида натрия, пошедшего на титрование, и по полученным данным рассчитали липолитическую активность в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при термостатировании 1 мл культуральной жидкости. Определение липолитической активности провели в трех повторениях. Полученные данные представлены в виде зависимости липолитической активности бактерий Lactococcus lactis от концентрации пирувата лития и приведены на фиг.1.

Пример 2 аналогичен примеру 1 с тем отличием, что добавили навеску порошка пирувата лития (BLD Pharm) до получения конечной концентрации раствора соли 10 ммоль/л. Полученные данные приведены на фиг.1.

Пример 3 аналогичен примеру 1 с тем отличием, что добавили навеску порошка пирувата лития (BLD Pharm) до получения конечной концентрации раствора соли 20 ммоль/л. Полученные данные приведены на фиг.1.

Пример 4 аналогичен примеру 1, но без добавления навески порошка пирувата лития. Полученные данные приведены на фиг.1.

Согласно полученным результатам, присутствие пирувата лития в концентрации 1,5 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis с 3,88 мкмоль/(мл·мин) до 4,08 мкмоль/(мл·мин). Присутствие пирувата лития в концентрации 10 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis с 3,88 мкмоль/(мл·мин) до 4,08 мкмоль/(мл·мин). Присутствие пирувата лития в концентрации 20 ммоль/л приводит к увеличению липолитической активности бактерий Lactococcus lactis с 3,88 мкмоль/(мл·мин) до 4,17 мкмоль/(мл·мин).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis, характеризующийся тем, что бактерии Lactococcus lactis плотностью 10⁸ КОЕ/мл культивируют на жидкой питательной среде MRS в течение 24 ч при температуре 37°С, биомассу бактерий отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость стерилизуют, пропуская через мембранный фильтр, и получают культуральную жидкость, отдельно смешивают 7% оливкового масла от общего объема смеси и 6% фосфатного буфера с pH 7,0 от общего объема смеси, встряхивают, далее к полученной смеси добавляют 8% указанной культуральной жидкости от общего объема смеси и навеску порошка пирувата лития до получения концентрации раствора 1,5-20 ммоль/л, затем встряхивают, термостатируют в течение 2 ч при температуре 37°С и добавляют 96%-ный этиловый спирт в количестве 79% от общего объема смеси. Изобретение обеспечивает повышение липолитической активности бактерий Lactococcus lactis. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

1. Способ стимуляции липолитической активности бактерий Lactococcus lactis, характеризующийся тем, что бактерии Lactococcus lactis плотностью 10⁸ КОЕ/мл культивируют на жидкой питательной среде MRS в течение 24 ч при температуре 37°С, биомассу бактерий отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость стерилизуют, пропуская через мембранный фильтр, и получают культуральную жидкость, отдельно смешивают 7% оливкового масла от общего объема смеси и 6% фосфатного буфера с pH 7,0 от общего объема смеси, встряхивают, далее к полученной смеси добавляют 8% указанной культуральной жидкости от общего объема смеси и навеску порошка пирувата лития до получения концентрации раствора 1,5-20 ммоль/л, затем встряхивают, термостатируют в течение 2 ч при температуре 37°С и добавляют 96%-ный этиловый спирт в количестве 79% от общего объема смеси.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что биомассу бактерий отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что надосадочную жидкость стерилизуют с помощью мембранного фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.