СПОСОБ ФЕРМЕНТАЦИИ УГЛЕВОДОВ БАКТЕРИЯМИ ESCHERICHIA COLI Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/19 

Изобретение относится к способу ускорения биохимических процессов микроорганизмами и может быть использовано в различных областях биотехнологического синтеза.

Известен способ ферментации углеводов микроорганизмами [SU 1090717 Α1, МПК C12Q 1/04 (2006.01), опубл. 07.05.1984], включающий посев чистой культуры бактерий P.aeruginosa, Staphylococcus aureus в пробирки с питательной средой, содержащей никотиновую кислоту, хлористый кальций, сернокислый магний, сернокислое железо, углевод, хлористый натрий, фосфорнокислый двузамещенный калий, бромтимоловый голубой и дистиллированную воду, с последующим созданием в пробирке анаэробных условий, инкубированием посевов и определением ферментации по изменению окраски среды.

Для осуществления данного способа требуется многокомпонентная питательная среда и длительный период времени.

Известен способ ферментации углеводов [ГОСТ 30726-2001], таких как сорбит, лактоза и глюкоза, выбранный в качестве прототипа, который включает посев чистой культуры Escherichia coli в пробирки с питательной средой или Кларка, или Гисса, последующее инкубирование и учет ферментации по изменению цвета среды.

Однако учет ферментации по изменению цвета среды не является количественным показателем процесса.

Технический результат изобретения заключается в создании способа ферментации углеводов бактериями Escherichia coli, позволяющего ускорить процесс ферментации и провести его количественный учет.

Предложенный способ ферментации углеводов, также как в прототипе, включает посев чистой культуры Escherichia coli на стерильную питательную среду, инкубирование и учет ферментации по изменению цвета культуральной среды.

Согласно изобретению, до стерилизации питательной среды в нее вносят навеску порошка пирувата лития в количестве 5-20 ммоль/дм³, а учет ферментации дополнительно проводят по изменению рН.

Если углеводом является глюкоза, то в качестве питательной среды используют среду Кларка.

Если углеводом является лактоза или сорбит, то в качестве питательной среды используют среду Гисса.

Добавление пирувата лития в питательную среду в концентрации 5-20 ммоль/дм³ приводит к сокращению времени ферментации глюкозы до 40 с и к изменению рН культуральной среды до 2; к сокращению времени ферментации лактозы до 20 с при изменении рН культуральной среды до 5; к сокращению времени ферментации сорбита до 6 с при изменении рН культуральной среды до 5.

Достигаемый эффект ускорения процесса ферментации выявлен впервые и является перспективным для использования в биотехнологических процессах.

В таблице 1 представлены результаты ферментации глюкозы бактериями Escherichia coli.

В таблице 2 представлены результаты ферментации лактозы бактериями Escherichia coli.

В таблице 3 представлены результаты ферментации сорбита бактериями Escherichia coli.

Пример 1. Ферментация глюкозы

Музейный штамм бактерий Escherichia coli АТСС25922 предварительно инкубирововали на мясопептонном агаре (Merck) в течение 24 часов при температуре 37°С в термостате-шейкере WiseCube. Из выращенной культуры готовили водную суспензию с плотностью бактерий 10⁸ КОЕ/мл согласно стандарту Макфарланда №3.

Параллельно приготовили питательную среду Кларка. Для этого в 1 дм³ дистиллированной воды при нагревании растворили 5,0 г пептона, 5,0 г глюкозы, 5,0 г фосфорнокислого двузамещенного калия, затем охладили до 47°С и установили рН 7,2 [ГОСТ 30726-2001]. Полученную среду разлили по 4 см³ в каждую из 8 пробирок.

Затем в 6 пробирок с полученной питательной средой Кларка добавили навеску порошка пирувата лития (BLD Pharm) в количестве 5 ммоль/дм³, 10 ммоль/дм³ и 20 ммоль/дм³ (по две пробирки на каждую концентрацию).

Подготовленные 8 пробирок с содержимым простерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин.

После этого в каждую пробирку внесли по 1 см³ ранее полученной суспензии бактерий Escherichia coli.

Две пробирки, содержащие стерильную питательную среду Кларка без пирувата лития и суспензию бактерий Escherichia coli, использовали для контроля.

Инкубирование бактерий Escherichia coli во всех 8 пробирках проводили в термостате-шейкере WiseCube при температуре 37°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 48 часов.

После этого в каждую пробирку добавили по 5 капель реактива Кларка, полученного при растворении 0,1 г метилового красного в 300 см этилового спирта с последующим добавлением 200 см дистиллированной воды [ГОСТ 30726-2001].

Контроль ферментации глюкозы бактериями Escherichia coli в каждой пробирке осуществляли визуально по изменению окраски и с использованием универсальной индикаторной бумаги НПО Экрос (рН 0-12) в течение 1 мин.

Присутствие пирувата лития в концентрации 5-20 ммоль/дм³ (таблица 1) в питательной среде Кларка приводит к уменьшению времени ферментации глюкозы до 56-40 с изменением окраски культуральной среды с красной в малиновую. рН культуральной среды снизилась в 2,5 с 5 до 2.

Пример 2. Ферментация лактозы

Музейный штамм бактерий Escherichia coli АТСС25922 предварительно инкубирововали на мясопептонном агаре (Merck) в течение 24 часов при температуре 37°С в термостате-шейкере WiseCube. Из выращенной культуры готовили водную суспензию с плотностью бактерий 10⁸ КОЕ/мл согласно стандарту Макфарланда №3.

Параллельно приготовили питательную среду Гисса с лактозой (ГОСТ 10444.1-84): 10,0 г пептона сухого ферментативного и 5,0 г хлористого натрия растворили в дистиллированной воде. Отфильтровали, чтобы раствор был прозрачным и прибавили 10 г лактозы. Установили рН 7,0-7,2 и прибавили раствор индикатора Андреде (кислый фуксин, гидроокись натрия, дистиллированная вода). Полученную среду разлили в 8 пробирок по 4 см³ в каждую.

Затем в 6 пробирок с питательной средой Гисса добавили навеску порошка пирувата лития (BLD Pharm) в количестве 5 ммоль/дм³,10 ммоль/дм³ и 20 ммоль/дм³ (по две пробирки на каждую концентрацию).

Подготовленные 8 пробирок простерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин. После чего в каждую пробирку внесли ранее полученную суспензию бактерий Escherichia coli в количестве 1 см³. Две пробирки, содержащие стерильную питательную среду Гисса без пирувата лития и суспензию бактерий Escherichia coli, использовали для контроля.

Культивирование бактерий Escherichia coli во всех 8 пробирках проводили в термостате-шейкере WiseCube при температуре 44°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 24 часов.

Контроль ферментации лактозы бактериями Escherichia coli в каждой пробирке осуществляли визуально по изменению окраски и с использованием индикаторной бумаги (универсальная, рН 0-12, НПО Экрос) в течение 1 мин.

Полученные значения показывают (таблица 2), что по сравнению с контрольным образцом, содержащим культуру Escherichia coli без добавления соли лития, присутствие пирувата лития в концентрации от 5 до 20 ммоль/дм³ в питательной среде Гисса приводит к уменьшению времени ферментации лактозы на 30 с изменением окраски культуральной среды с соломенно-желтой в желтую. Кислотность культуральной среды снижается в 1,4 раза.

Пример 3. Ферментация сорбита

Способ осуществляли аналогично примеру 2, но в качестве углевода в питательную среду Гисса был добавлен сорбит, а культивирование бактерий Escherichia coli проводили в термостате-шейкере WiseCube при температуре 37°С со скоростью вращения 100 об/мин в течение 24 часов.

Полученные значения показывают, что добавление пирувата лития приводит к уменьшению времени ферментации сорбита, изменению окраски культуральной жидкости и водородного показателя по сравнению с контрольным образцом, содержащим культуру Escherichia coli без добавления соли лития.

Присутствие пирувата лития в концентрации 5-20 ммоль/дм³ в питательной среде Гисса приводит к уменьшению времени ферментации сорбита до 8-6 с изменением окраски культуральной среды с соломенно-желтой в ярко-оранжевую (кислотность среды снижается в 1,4 раза).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ ферментации углеводов бактериями Escherichia coli, включающий посев чистой культуры Escherichia coli на стерильную питательную среду, в которую до стерилизации вносят навеску порошка пирувата лития в количестве 5-20 ммоль/дм³, инкубирование; учет ферментации углеводов проводят по изменению цвета и рН культуральной среды. Изобретение обеспечивает ускорение ферментации углеводов бактериями Escherichia coli. 6 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Способ ферментации углеводов бактериями Escherichia coli, включающий посев чистой культуры Escherichia coli на стерильную питательную среду, инкубирование, учет ферментации по изменению цвета культуральной среды, отличающийся тем, что до стерилизации питательной среды в нее вносят навеску порошка пирувата лития в количестве 5-20 ммоль/дм³, а учет ферментации дополнительно проводят по изменению рН.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве углевода используют глюкозу.

3. Способ по пп. 1, 2, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют среду Кларка.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве углевода используют лактозу.

5. Способ по пп. 1, 4, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют среду Гисса.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве углевода используют сорбит.

7. Способ по пп. 1, 6, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют среду Гисса.