Тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод Российский патент 2024 года по МПК G01N33/24 G01N1/28 A61L2/28 

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, паразитологии, а именно к средствам и способам определения овицидной эффективности химических соединений и дезинфектантов для обеззараживания различных сред окружающей среды, контаминированных яйцами гельминтов, цистами и ооцистами простейших.

На территории России встречается около 70 видов гельминтов и большое число видов патогенных простейших. Активно распространены гельминтозоонозы − заболевания общие для человека и сельскохозяйственных животных. У крупного рогатого скота некоторые гельминты резко снижают прибавку веса, молочность, ухудшают качество шерсти овец и коз, сокращают плодовитость птицы. Многие гельминты вызывают массовые падежи домашних животных, особенно молодняка. Неправильная утилизация отходов животноводства, а также погибших животных приводит к заражению яйцами гельминтов воды и почвы. В результате ежегодно при употреблении ягод, фруктов, овощей, зелени, рыбы и мяса миллионы людей заражаются такими инвазиями как аскаридоз, трихоцефалез, токсокароз, стронгилоидоз.

Использование эффективных дезинфицирующих средств для промышленной дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод, контаминированных яйцами гельминтов, цистами и ооцистами простейших, с различными структурными и физико-химическими характеристиками на различную глубину при различных климатических условиях, разработка технологии дезинвазии промышленных объемов грунта и других сред окружающей среды являются важными и актуальными проблемами современной паразитологии, дезинфектологии, медицины и ветеринарии. Учитывая, что процесс оценки качества дезинвазии является достаточно длительным и трудоёмким, весьма важно и актуально разработать техническое устройство для экспрессной оценки качества дезинвазионной эффективности химических соединений и дезинфицирующих средств.

Цель исследования: разработка технического устройства для экспрессного контроля качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод, контаминированных яйцами гельминтов, цистами и ооцистами простейших, в лабораторных условиях и в средах различных экосистем.

Наиболее близким техническим решением к экспрессной оценки качества дезинвазионной эффективности химических соединений и дезинфицирующих средств является исследование почвы на наличие яиц гельминтов до и после дезинвазии почвы − метод Романенко (МУК 4.2.2661-10, «Методы санитарно-паразитологических исследований». – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011.− С. 16-18). Из объединенной пробы берут на исследование 4 порции по 25 г почвы, помещают их в центрифужные пробирки объемом 250 мл и заливают 3% раствором натриевой или калиевой щелочи (в соотношении 1:1). После этого содержимое пробирок тщательно размешивают, отстаивают в течение 20-30 мин, центрифугируют 5 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а почву промывают водой (1-5 раз в зависимости от типа почвы: для песчаных и супесчаных – достаточно одной промывки, для глинистых, суглинистых, черноземных – от 2 до 5) до получения прозрачной надосадочной жидкости. После добавления очередной порции промывочной воды осадок на дне центрифужной пробирки тщательно перемешивают при каждом промывании. После промывки к почве добавляют насыщенный раствор нитрата натрия (плотность 1,38-1,40). Объем насыщенного раствора зависит от величины стакана (пробирки): в 250 мл стаканы добавляют по 150 мл насыщенного раствора, в более мелкие пробирки, например, объемом 80-100 мл соответственно 45-50 мл насыщенного раствора. Почву тщательно размешивают, полученную смесь центрифугируют. Пробирки устанавливают в штатив, доливают тем же насыщенным раствором соли до уровня на 2-3 мм ниже краев пробирок и накрывают предметными стеклами. Яйца гельминтов всплывают и концентрируются в поверхностной пленке насыщенного раствора. Через 20-30 мин отстаивания стекла снимают, переворачивая нижней поверхностью вверх, а на их место ставят другие (при необходимости и третьи). На предметные стекла с поверхностной пленкой наносят 1-2 капли 30% раствора глицерина, накрывают их покровными стеклами, а затем микроскопируют.

Для обнаружения в почве яиц гельминтов, имеющих более высокую плотность (яйца описторхов, клонорхов), чем яйца аскарид и властоглавов, следует использовать насыщенный раствор хлорида цинка (плотность 1,78); яйца токсокар лучше выявляются при обработке почвы насыщенным раствором сульфата цинка или сульфата магния в смеси с 5% раствором йодата калия.

Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.

Яйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, содержимое мутное, разрыхленное. У нежизнеспособных яиц, содержащих шары дробления (бластомеры) разного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. Для определения яиц и личинок гельминтов используют метод окрашивания. Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью. Живые яйца окраску не воспринимают: окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц.

После определенной экспозиции в растворе, яйца отмывают водой в чашках Петри не менее пяти раз или с помощью центрифугирования не менее двух раз. Затем культуру яиц помещают в термостат (24-26°С) для культивирования. Через 15-20 дней определяют жизнеспособность яиц в каждом варианте опыта методом культивирования в термостате, а также методами обычной и вторичной люминесцентной микроскопии. Если в яйцах нет личинок, то их считают погибшими.

У яиц, взятых в опыт на стадии инвазионной личинки, определяют жизнеспособность оптической микроскопией по деформации зародыша и скорлупы, а методом флуоресценции по характеру свечения при обработке акридиновым оранжевым в разведении 1:10-500000, с экспозицией 120 мин.

Для объективной оценки в каждом варианте опыта подсчитывают не менее 3200 яиц, в том числе живых и погибших, а затем высчитывают процент погибших. На основе выявленной жизнеспособности яиц определяют эффективность препарата.

Основными недостатками известного способа являются:

– высокая погрешность результатов оценки обеззараживающей (дезивазионной) эффективности исследуемых химических средств и дезинфектантов;

– трудоемкость способа, из-за многочисленных технически несовершенных стадий подготовки, отмывки и препарирования образцов яиц к термостатированию и исследованию в оптическом и люминесцентном микроскопах;

– отсутствие стадии нейтрализации остатков химических средств, дезинфектантов после воздействия ими на яйца гельминтов, часто является источником возникновения различных артефактов и искажений на стадии визуализации и определения в микроскопе количества живых и мертвых яиц в образцах;

– из-за отсутствия стадии нейтрализации химических средств, дезинфектантов после воздействия на яйца гельминтов, действие следов (молекул) химических реагентов на яйца не прерывается, что не позволяет объективно оценить овоцидный эффект химических средств и дезинфектантов;

– высокие потери поврежденных, разрушенных и лизированных яиц (всплывших яиц с более низкой плотностью в водной суспензии образца) на стадиях центрифугирования и многократных отмывок биоматериала от химического реагента, нейтрализатора, красителя в чашке Петри, или на предметном стекле, или в маленькие бюксики путем сливания или отсасывания жидкости с поверхности осадка биообразца значительно искажают результаты определения числа живых и мертвых яиц после воздействия овоцидами;

– высокие трудовые и материальные затраты при выполнении препаративных работ по известному способу;

– техническое несовершенство способа может являться источником нарушения требований биологической безопасности персоналом паразитологических лаборатории и д.р.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является использование, тест-биоиндикатора, позволяющего повысить эффективность испытания и отбора овоцидных химических соединений для обеззараживания почвы, грунта, осадка сточных вод в различных экосистемах, повысить достоверность результатов определения эффективности обеззараживания исследуемых средств и препаратов.

Технический результат достигается за счет использования тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод представляет собой пенал-держатель кассеты из двух тест-полосок биоиндикатора, выполненный в стреловидной форме длиной 345 мм и шириной 40 мм, который состоит из двух наружных листов пластика толщиной 3 мм каждая, имеющего окно-просвет шириной 15 мм и длиной 300 мм, между наружными листами пластика установлен внутренний лист пластика толщиной 3 мм, длиной 300 мм и шириной 8-9 мм, все листы пластика пенала-держателя скрепляют между собой 13 болтами с потаенной головкой М3×6, в верхней части пенала-держателя предусмотрена ручка-держатель, а каждая тест-полоска кассеты из органического стекла длиной 300 мм, шириной 20 мм и толщиной 1-1,5 мм содержит по два отверстия диаметром 7-10 мм через каждые 50 мм и на внутренней поверхности на всю ширину и длину тест полоски клеящуюся трековую фильтрующую мембрану с диаметром пор d₃-4,2 мкм, на уровне каждого отверстия, между фильтрующими мембранами, размещают суспензию с яйцами биоагента.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Корпус тест-биоиндикатора экспресной оценки качества дезивазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод. А, Б – наружные пластинки корпуса; В – окно-просвет по центру корпуса-биоиндикатора.

Фиг.2. Тест-полоска биоиндикатора экспрессной оценки качества дезивазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод. А – отверстия на тест-полоске для микрокамер биоагента.

Фиг.3. Ручка тест-биоиндикатора экспрессной оценки качества дезивазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод.

Тест-биоиндикатор представляет собой пенал-держатель диагностических тест-полосок стреловидной формы, который состоит из двух наружных листов пластика толщиной 3 мм каждая, длиной 350 мм и шириной 40 мм, выполненных из листового пластика. Для контакта с почвой и доступа дезинфицирующего раствора к поверхности тест-полосок корпус биоиндикатора имеет окно-просвет шириной 15 мм и длинной 300 мм. Для фиксации тест-полосок внутри корпуса биоиндикатора между наружными листами пластика пенал-держателя установлен внутренний лист пластика толщиной 3 мм, длиной 300 мм и шириной 8-9 мм для образования удерживающего паза между наружными листами для диагностических тест-полосок. Все листы пластика пенала-держателя скрепляют между собой 13 болтами с потаенной головкой М3×6. В верхней части пенала-держателя предусмотрена ручка из такого же материала, что и основание, а конец пенала-держателя заострен, длина острого конца составляет 50 мм.

В пенал-держатель заправляют кассету с тест-полосками биоиндикатора длинной 300 мм и шириной 20 мм, которая состоит из двух полосок органического стекла длиной 300 мм, шириной 20 мм и толщиной 1-1,3 мм. На тест-полосках через каждые 50 мм просверлены по два отверстия диаметром 7-10 мм. На внутреннею поверхность каждой тест-полоски на всю ширину и длину приклеивают трековую фильтрующую мембрану с диаметром пор d₃-4,2 мкм, на фильтрующей мембране одной из полосок на уровне каждого отверстия наносят по одной капле (100-150 мкл) суспензии яиц свиной аскариды или яиц возбудителя токсакароза примерно по 300-500 яиц. Затем к поверхности полоски с яйцами биоагента приклеивают вторую тест-полоску. Полученную кассету тест-полосок заправляют в пенал-держатель для испытаний овицидной эффективности дезинфектантов в почве или в других средах различных экосистем.

Таким образом, между тест-полосками внутри кассеты предусмотрена двойная улавливающая мембрана (трековая мембрана) с диаметром пор d-4,2 мм. Фильтрующая мембрана необходима для исключения межоперационных потерь биоматериала, при отмывке кассеты тест-полосок от почвы и от дезинфицирующего средства, на стадии нейтрализации химического средства после завершения воздействия на яйца гельминтов, на стадии отмывки образцов от нейтрализатора, на стадии окрашивания флурохромом и отмывки биообразца от красителя, на стадии культивирования яиц и просмотра в микроскопе. Для сохранения номинального количества яиц биоагента на всех стадиях способа, выполнено крепление улавливающей мембраны к тест-полоскам методом сплавления или методом прикрепления с использованием химических составов.

Пример 1. В испытаниях тест-биоиндикатора для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод использовали дезинфицирующее средство «Фармадез», а в качестве биоагента использовали неинвазионные яйца свиной аскариды Ascaris suum (далее A. suum), выделенных из гонад самок.

Для испытания тест-биоиндикатора для экспрессной оценки качества дезинвазии грунта в рабочую емкость устройства для масштабированного испытания дезинфектантов насыпают 1,0-1,1 м³ грунта. В грунт втыкают (устанавливают) вертикально на глубину до 300 мм тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии грунта с яйцами биоагента A. suum. Затем приступают к выполнению работ по дезинвазии грунта дезинфектантом. С помощью гидропульта грунт заливают раствором средства в соотношении 1:2 (объем раствора дезинфектанта / объем грунта) и оставляют на 48 ч при температуре окружающей среды (8±3)°С.

В качестве контроля другой тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии грунта с яйцами биоагента A. suum устанавливают вертикально в грунт на глубину до 300 мм. Грунт заливают водопроводной водой из расчета 1:2 (объем воды / объем грунта) и оставляют на 48 ч при температуре окружающей среды (8±3)°С.

После воздействия дезинфектантом тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы отмывают от почвы водопроводной водой, затем дистиллированной водой. Для удаления остатков дезинфектанта тест-биоиндикатор выдерживают 3-5 мин в растворе универсального нейтрализатора для удаления остатков дезинфектанта, затем его отмывают от нейтрализатора в дистиллированной воде. После истечения времени воздействия дезинфектанта на почву из тест-биоиндикатора вынимают кассету с тест-полосками, в микрокамерах которых находятся яйца биоагента и просматривают в оптическом микроскопе с окраской и без окраски. В микроскопе определяют количество яиц в каждой микрокамере и их морфо-функциональное состояние. Было установлено, что количество яиц в микрокамерах совпадают с количеством яиц в микрокамерах до воздействия дезинфектантом. Форма и морфологические характеристики яиц не претерпели видимых изменений.

Затем кассету с тест-полосками тест-биоиндикатора для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы помещают во влажной камере и термостатируют в течение 7-14 дней для оценки количества жизнеспособных яиц биоагента в каждой микрокамере и на разной глубине грунта.

После завершения термостатирования образцов в каждой микрокамере кассеты с тест-полосками вносят по 0,1-0,2 мл водного раствора акридинового оранжевого в разведении от 1:10000 и выдерживают 120 мин при комнатной температуре (19±2)°С. После обработки флурохромом биообразцов кассету с тест-полосками отмывают стерильной дистиллированной водой. В люминисцентном микроскопе проводят просмотр непосредственно в микрокамерах кассеты тест-полосок.

Жизнеспособность яиц определяют по свечению зародыша. Живая личинка всегда излучает тусклый зеленый свет: от серо-зеленого до темно-зеленого, а погибшая − светится яркими цветами: светло-зеленым, зеленым, желтым, оранжевым, красным. Скорлупа как живых, так и погибших яиц бывает окрашена одинаково в зеленый.

Просмотр и подсчет живых и мертвых яиц гельминтов в образцах с помощью люминисцентного микроскопа показал, что в контрольных микрокамерах число живых яиц составляло не более 93% от общего числа яиц в пробе. В микрокамерах кассеты с тест-полосками, где обработку почвы проводили 5,0% раствором дезинфицирующего средства «Фармадез» в течение 24 ч была установлена примерно 87% гибель яиц на глубине грунта 50 мм и 100 мм; 67% гибель на глубине 150 мм; 33% и 13% на глубине 200 и 250 мм соответственно.

Пример 2. В испытаниях тест-биоиндикатора для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод использовали дезинфицирующее средство «Тиазон», а в качестве биоагента использовали неинвазионные яйца возбудителя токсакароза Toxocara canis (далее Т. canis), выделенных из гонад самок.

Для испытания тест-биоиндикатора для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы в рабочую емкость для масштабированного испытания дезинфектантов насыпают 1,0-1,1 м³ почвы. В почву втыкают на глубину 250 мм тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы с яйцами биоагента Т. canis. С помощью гидропульта почву заливают 4,0% раствором средства «Тиазон» в соотношении 1:2 (объем раствора дезинфектанта / объем почвы) и оставляют на 72 ч при температуре окружающей среды от (13±4)°С.

В контрольных испытаниях грунт заливали водопроводной тводой.

После воздействия дезинфектантом тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы отмывают от почвы водопроводной водой, а затем дистиллированной водой. Для удаления остатков дезинфектанта тест-биоиндикатор выдерживают 3-5 мин в растворе универсального нейтрализатора для удаления остатков дезинфектанта, затем его отмывают от нейтрализатора в дистиллированной воде. После истечения времени воздействия дезинфектанта на почву из тест-биоиндикатора вынимают кассету с тест-полосками, в микрокамерах которых находятся яйца биоагента и просматривают в оптическом микроскопе с окраской и без окраски для определения схранности яиц биоагента в микрокамерах и их морфо-функциональное состояние. Затем кассету с тест-полосками помещают во влажную камеру и термостатируют в течение 7-14 дней для оценки количества жизнеспособных яиц биоагента в каждой опытной пробе и на разной глубине грунта.

После завершения термостатирования в каждой микрокамере кассеты вносят по 0,1-0,2 мл водного раствора акридинового оранжевого в разведении от 1:10000 и выдерживают 120 мин при комнатной температуре (19±2)°С. После обработки флурохромом биообразцов кассету с тест-полосками отмывают стерильной дистиллированной водой. Просмотр в люминисцентном микроскопе проводят непосредственно в микрокамерах кассеты тест-полосок.

Просмотр и подсчет живых и мертвых яиц гельминтов в образцах с помощью люминисцентного микроскопа показал, что в контрольных микрокамерах тест-биоиндикатора число живых яиц составляло не более 87% от общего числа яиц в пробе. В микрокамерах кассеты с тест-полосками, где обработку почвы проводили 4,0% раствором дезинфицирующего средства «Тиазон» в течение 72 ч была установлена примерно 100% гибель яиц на глубине грунта 50 и 150 мм; 79% гибель яиц наблюдали на глубине 200 мм и 45% на глубине 250 мм.

Таким образом, полученные результаты испытаний свидетельствуют о том, что предлагаемое новое техническое решение − «Тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод», позволило повысить эффективность испытаний и отбора овоцидных химических соединений для дезинвазии почвы, грунта, осадка сточных вод, донных отложений, повысить уровень достоверности результатов определения овоцидной активности дезинфицирующих средств и препаратов, снизить трудоемкость процесса реализации способа путем уменьшения числа стадий и их продолжительности при выполнении испытаний препаратов, уменьшить количество артефактов на стадии определения количества живых и мертвых яиц, сохранить в экспериментальных пробах биоматериала всех видов яиц, включая интактные, поврежденные, разрушенные и лизированные яйца, повысить уровень биологической безопасности при реализации способа, а также снизить трудовые и материальные затраты при испытаниях.

Положительный технический эффект при использовании предлагаемого технического устройства − Тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод» достигается за счет того, что такие стадии, как отбор объединенной пробы почвы, грунта и др., заливка пробы почвы 3% раствором натриевой или калиевой щелочи, размешивание, отстаивание, многократная промывка проб почвы водой и центрифугированием, добавление в пробы почвы насыщенного раствора нитрата натрия, сбор с поверхности насыщенного раствора образца почвы пленки с яйцами гельминтов на предметных стеклах, подготовка препаратов яиц гельминтов для микроскопирования полностью исключаются. Предлагаемое техническое устройство − Тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод» за счет наличия в микрокамерах кассеты тест-полосок интактных яиц гельминтов позволяет сразу приступить к испытаниям дезинвазионной эффективности дезинфицирующего средства в почве или в других средах, затем после обработки почвы дезинфектантом извлечь из Тест-биоиндикатора для экспрессной оценки качества дезинвазии грунта кассету с тест-полосками для определения количества живых и мертвых яиц в каждой микрокамере путем визуализации в оптическом или люминесцентном микроскопе, и/или путем термостатирования биообъектов непосредственно в кассетах тест-полосок и определения в микроскопе число живых и мертвых яиц гельминтов.

Проведенные испытания показали, что оптимальные форма, размеры, светопрозрачность и объем микрокамер на тест-полосках позволяют проводить все процедуры отмывки биообъектов от почвы, дезинфектанта и нейтрализатора, термостатирование яиц биоагента и их обработку раствором флурохромом, включая стадии исследования в оптическом и люминесцентном микроскопах, в микрокамерах одной тест-кассеты.

Предлагаемый тест-индикатор позволяет снизить трудоемкость исследований путем уменьшения числа стадий выполнения испытаний, снижение числа артефактов на стадии определения количества живых и мертвых яиц, сохранения в образцах исследования всех видов яиц, включая интактные, поврежденные, разрушенные и лизированные яйца, после воздействия исследуемыми овоцидами; повышение биологической безопасности персонала и окружающей среды при выполнении лабораторных работ, а также снижение трудовых и материальных затрат при осуществлении способа.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод, представляющий собой пенал-держатель кассеты из двух тест-полосок биоиндикатора, выполненный в стреловидной форме длиной 345 мм и шириной 40 мм, который состоит из двух наружных листов пластика толщиной 3 мм каждая, имеющего окно-просвет шириной 15 мм и длиной 300 мм, между наружными листами пластика установлен внутренний лист пластика толщиной 3 мм, длиной 300 мм и шириной 8-9 мм, все листы пластика пенала-держателя скрепляют между собой 13 болтами с потаенной головкой М3×6, в верхней части пенала-держателя предусмотрена ручка-держатель, а каждая тест-полоска кассеты из органического стекла длиной 300 мм, шириной 20 мм и толщиной 1-1,5 мм содержит по два отверстия диаметром 7-10 мм через каждые 50 мм и на внутренней поверхности на всю ширину и длину тест полоски клеящуюся трековую фильтрующую мембрану с диаметром пор d₃-4,2 мкм, на уровне каждого отверстия, между фильтрующими мембранами, размещают суспензию с яйцами биоагента. Изобретение обеспечивает уменьшение числа стадий выполнения испытаний. 3 ил., 2 пр.

Тест-биоиндикатор для экспрессной оценки качества дезинвазии почвы, грунта, донных отложений, осадка сточных вод представляет собой пенал-держатель кассеты из двух тест-полосок биоиндикатора, выполненный в стреловидной форме длиной 345 мм и шириной 40 мм, который состоит из двух наружных листов пластика толщиной 3 мм каждая, имеющего окно-просвет шириной 15 мм и длиной 300 мм, между наружными листами пластика установлен внутренний лист пластика толщиной 3 мм, длиной 300 мм и шириной 8-9 мм, все листы пластика пенала-держателя скрепляют между собой 13 болтами с потаенной головкой М3×6, в верхней части пенала-держателя предусмотрена ручка-держатель, а каждая тест-полоска кассеты из органического стекла длиной 300 мм, шириной 20 мм и толщиной 1-1,5 мм содержит по два отверстия диаметром 7-10 мм через каждые 50 мм и на внутренней поверхности на всю ширину и длину тест полоски клеящуюся трековую фильтрующую мембрану с диаметром пор d₃-4,2 мкм, на уровне каждого отверстия, между фильтрующими мембранами, размещают суспензию с яйцами биоагента.