ПРИМЕНЕНИЕ АНТИСЕПТИЧЕСКОГО И ДЕЗИНФИЦИРУЮЩЕГО СРЕДСТВА Российский патент 2023 года по МПК A61L2/16 A61L2/18 A61L101/42 A01N55/02 A61K31/155 A61K31/315 A61P31/02 A61P33/10 C07F3/06 

Изобретение относится к санитарии и медицине, в частности, к дезинфицирующим средствам.

Необходимость дезинфекции существует во многих отраслях промышленности: в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве. Дезинфекция подразумевает уничтожение условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Дезинфицирующие средства повсеместно используются в медицинской практике, в быту и многих других областях человеческой деятельности. Особенно важна роль мероприятий по дезинфекции в условиях эпидемий или при угрозе распространения опасных инфекций, в связи с чем обеспечение медицинских организаций и населения эффективными антисептическими средствами относится к задачам государственной важности.

Общими требованиями, предъявляемыми к таким средствам, являются эффективность подавления всех типов патогенной микрофлоры, включая возбудителей микробных, грибковых и вирусных инфекций, а также безопасность для человека и окружающей среды. Существующие препараты лишь частично удовлетворяют этим требованиям, и поэтому разработка новых антисептических средств остается актуальной.

Большинство дезинфицирующих средств нельзя использовать долго, а именно, более четырех месяцев, поскольку возникает привыкание. Практически все дезинфицирующие средства содержат поверхностно активные вещества (ПАВ), отдушки, четвертичные аминные соединения (ЧАС), относятся к 3 классу токсичности (опасности), не обладают длительным действием, требуют смывания водой.

Многие дезинфектанты являются опасными и с их помощью невозможно проведение дезинфекции в присутствии людей и животных. Кроме того, растворы многих дезинфектантов являются электролитами, вызывающими коррозию металлических поверхностей.

К числу наиболее известных антисептиков относится хлоргексидин (1,6-ди-[бис-(4-хлорфенилбигуанидо]гексанабиглюконат), который уже более 60 лет применяется в медицинской, ветеринарной и бытовой практике, оставаясь до настоящего времени одним из самых востребованных антисептических агентов. Этот препарат приобрел популярность благодаря своей высокой бактерицидной активности в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включая грибы, а также за счет способности сохранять высокую активность при соприкосновении с различными биологическими субстратами (кровь, слюна, гной и т.п.)

Механизм антимикробного действия хлоргексидина реализуется на уровне клеточной мембраны - он взаимодействует с мембранообразующими протеинами, фосфолипидами и полисахаридами, что приводит к гибелимикробов. Хлоргексидин служит активным началом различных дезинфицирующих средств местного назначения,используется дляобработки ран, ожогов, для стерилизации операционного поля, кожных покровов, но он обладает рядом существенных недостатков. В частности, при комнатной температуре он практически не действует на бактериальные споры и поэтому малоэффективен против спорообразующих патогенов. Малочувствительны к хлоргексидину и кислотоустойчивые микроорганизмы, к числу которых относятся возбудители туберкулеза и проказы. Также, серьезным недостатком хлоргексидина является отсутствие у него выраженной вирулицидной активности.

Из документа US 20060094777 A1 04.05.2006 известно совместное применение комплекса ZnEDTA и хлоргексидина. Данный комплекс предотвращает возникновение мастита у животных. Однако эффективность такого комплекса не достаточно высока.

Sivaranjani M, LiuF, WhiteAP, Synergistic activity of tetrasodium EDTA, ethanol and chlorhexidine hydrochloride against planktonic and biofilm cells of clinically relevant pathogens, Journal of Global Antimicrobial Resistance (2020), doi:https://doi.org/10.1016/j.jgar.2020.12.002 раскрывают смесь хлоргексидина и тетранатрия ЭДТА. Однако в спиртовой среде активные компоненты не создают хелатного комплекса и не обладают достаточной бактерицидной активностью.

Задачей настоящего изобретения является разработка эффективного средства пролонгированного действия, предназначенного в качестве антисептика и дезинфектанта.

Техническим результатом настоящего изобретения является высокая эффективность дезифицирующего и антисептического средства при наличии выраженного бактерицидного, туберкулоцидного, фунгицидного, вирусовидного и противогельминтного действия, а также его безопасность.

Изобретение представляет собой антисептическое и дезинфицирующее средство, содержащее в качестве действующего вещества водорастворимый хелатный трехкомпонентный комплекс хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетат (1,6-ди-[бис-(4-хлорфенилбигуанидо]гексана-цинка этилендиаминтетраацетат) следующей формулы:

Изобретение касается также применения заявляемого средства в качестве безопасного комплексного средства, обладающего бактерицидным, туберкулоцидным, фунгицидным, противогельминтным действием и вирулицидным действием.

Средство, названное как «ТРИГЕКСИЛОН», предназначено в качестве кожного антисептика пролонгированного действия для обработки рук хирургов, кожи операционного и инъекционного полей, гигиенической обработки рук медицинского персонала лечебно-профилактических учреждений, а также гигиенической обработки рук медицинских работников детских дошкольных и школьных учреждений, учреждений соцобеспечения (дома престарелых, инвалидов и др.), рук работников парфюмерно-косметических предприятий (в т.ч. косметических салонах), общественного питания, предприятиях пищевой, молочной и птицеперерабатывающей промышленности, объектов коммунальных служб.

Средство предназначено также для дезинфекции помещений, жесткой мебели, санитарно-технического оборудования (ванны, раковины, унитазы), белья, предметов ухода за больными, изделий медицинского назначения, в том числе стоматологических инструментов и эндоскопов, уборочного материала, столовой и лабораторной посуды, при инфекциях бактериальной (включая туберкулез) и грибковой (включая кандидозы и дерматофитии) этиологии в лечебных, детских учреждениях, на коммунальных объектах и предприятиях общественного питания, а также для предстерилизационной очистки, в том числе совмещенной с дезинфекцией изделий медицинского назначения (включая стоматологические инструменты, эндоскопы).

Средство обладает следующими характеристиками:

Бесцветная или со слегка желтоватым оттенком, прозрачная или слегка опалесцирующая жидкость без запаха.

Средство «ТРИГЕКСИЛОН» по параметрам острой токсичности по ГОСТ 12.1.007-76 относится к 4 классу малоопасных веществ при нанесении на кожу, к 4 классу малоопасных веществ при введении в желудок, при ингаляционном воздействии в виде паров по степени летучести (С₂₀) средство малоопасно. Средство относится к 4 классу малотоксичных веществ при введении в брюшину согласно классификации К.К. Сидорова. Рабочие растворы средства не оказывают сенсибилизирующего и раздражающего действия на кожу. В виде аэрозоля рабочие растворы не обладают раздражающим эффектом на слизистых оболочек глаз и дыхательных путей.

«ТРИГЕКСИЛОН» содержит в качестве действующего вещества водорастворимый хелатный трехкомпонентный комплекс хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетат 0,36 %, а также воду очищенную 99,64 %.

На фигурах изображено:

Фиг. 1 - Изменение интенсивности роста тест-штамма M. tuberculosisH₃₇Rv при воздействии ТРИГЕКСИЛОН. По оси абсцисс - концентрация препарата, по оси ординат - усредненная интенсивность флуоресценции в усл.ед.

Фиг. 2 - Спектр отдельных компонентов и хелатного тройного комплекса Хлоргексидин-ЭДТА-цинк в интервале от 0 до 1000 m/z. Обозначения: Пик ХГ(Н)+- 505,222 (хлоргексидин); пик (ХГ+Zn)(H)+--567,144; пик (ЭДТА+Zn)H+-353,183; пик (ХГ+ЭДТА+Zn)(H)+ - 859,3.

Фиг. 3 - Спектр МАЛДИ-МС ТРИГЕКСИЛОН m/z 500-900.

Фиг. 4 - Спектр МАЛДИ-МС ТРИГЕКСИЛОН m/z 800-900.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Путь синтеза комплекса включает растворение в водном растворе хлоргексидина основания, динатриевой соли ЭДТА и хлорид цинка. При этом образуется хелатный трехкомпонентный комплекс [ХГ-ЭДТА-Zn].

Например, для получения комплекса в мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют трилон Б 0,3г , ZnCI₂ 0,12 г и хлоргексидин основание 0,2 г, перемешивают, после чего доводят объем до метки водой. В результате синтезируется комплекс.

Данный хелатный трехкомпонентный комплекс получен впервые.

Получение такого комплекса привело к резкому усилению биоцидного эффекта и расширению спектра активности. Биоцидный эффект обусловлен образованием хелатного комплексного соединения хлоргексидина.

Элементный состав комплекса хлоргексидин-ЭДТА-Zn устанавливали с CHN анализом и методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой с использованием спектрометра Optima 2100DV (PerkinElmer).

В водном растворе хлоргексидина основания, динатриевая соль ЭДТА и хлорид цинка образуют хелатное комплексное соединение, которое было зарегистрировано методом МАЛДИ-МС в виде протонированного иона с массой m/z МН⁺ 859.3 Да. В качестве матрицы использовался - 3,4-дигидроксиацетофенон. Режим анализа: рефлектрон, регистрация положительных ионов.

Результаты представлены на рис. 2, 3, 4.

В структуре данного комплекса содержится центральный четырехкоординированный двухзарядный катион цинка, двухзарядный катион хлоргексидиния и четырехзарядный анион полностью депротонированной молекулы ЭДТА. Судя по относительной интенсивности массового иона m/z МН+ в масс-спектрах МАЛДИ, а также по характеру фрагментации этого иона, получаемый комплекс отличается высокой стабильностью, сопоставимой с устойчивостью бинарного комплекса ЭДТА-Zn. Стабильность хелатного трехкомпонентного комплекса хлоргексидин-ЭДТА-Zn объясняется внутримолекулярным хелатообразованием, в результате чего катионные и анионные фрагменты в данной системе стехиометрически уравновешивают друг друга, образуя в сумме электронейтральную молекулу.

Данные масс-спектров доказывают включение хлоргексидина в состав прочного тройного комплекса с участием ЭДТА и цинка, что позволяет объяснить повышенную биоцидную активность антисептика «Тригексилон». «Тригексилон» обладает бактерицидным, туберкулоцидным, фунгицидным, вирулицидным и противогельминтным действием.

Спектр МАЛДИ-МС Тригексилона m/z 500-900, подтверждает, что он содержится в приведенных образцах №1-2.

Пример 1.

Определение антимикробной активности «ТРИГЕКСИЛОН».

В настоящее время одним из наиболее распространенных дезинфицирующих растворов является хлоргексидинбиглюконат.

По уровню биоцидной активности и широте спектра действия «ТРИГЕКСИЛОН» значительно превосходит хлоргексидин. Биоцидная активность комплекса «ТРИГЕКСИЛОН» подтверждена в экспериментах invitro на бактериальных и вирусных штаммах, и invivo на животных в лабораторных клинических условиях. Сравнительное изучение активности водорастворимого хелатного комплекса хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетата («ТРИГЕКСИЛОН») in vitro на серии стандартных микроорганизмов, показало, что он обладает более высокой антимикробной активностью, чем индивидуальный биглюконат хлоргексидина в соответствующей концентрации. Для исследований использовали водные растворы с содержанием 0.05% активного вещества в пересчете на хлоргексидин.

Оценку антимикробной активности проводили по площади зоны отсутствия роста культур на чашках Петри, результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Антимикробная активность комплекса ХГ-ЭДТА-Zn («ТРИГЕКСИЛОН») в сравнении с биглюконатом хлоргексидина (ХГБ) Антисептик Культуры Bac. subtilis E. coli Bac. mycoides Sac. cerevisiae P.
iumbreri-compactum Asp. niger Площадь зоны, свободной от роста, см² «ТРИГЕКСИЛОН» 16.8 13.7 15.2 16.8 19.4 18.5 ХГБ 3.6 4.1 4.1 4.0 4.4 3.6 Индексактивности ТРИГЕКСИЛОН/ХГБ 4.7 3.3 3.7 4.2 4.4 5.1

Таким образом, в отношении указанных бактериальных и грибковых штаммов, «ТРИГЕКСИЛОН» в 4-5 раз более активен, чем биглюконат хлоргексидина.

Пример 2.

Противогельминтное действие «ТРИГЕКСИЛОНа».

Исследования, проведенные в различных регионах, показывают высокую степень контаминации внешней среды яйцами гельминтов плотоядных от 33,98 до 40,9%. Преобладающим видом гельминта является Toxocaracanis, чьи яйца выявлены в 37,45% положительных проб. Также достаточно часто в образцах почв выявляются яйца гельминтов подотряда Strongylata (Ancylostomacaninum, Uncinariastenocephala). Суммарно яйца гельминтов данного подотряда выявлялись в 40,54% -54,28% положительных проб почвы. Из группы биогельминтов в почве чаще всего выявляются яйца представителей семейства Taeniidae.

Яйца всех этих групп гельминтов являются потенциально опасными для человека.

«ТРИГЕКСИЛОН» при экспозиции в течение 24 часов приводил к разрушению наружной оболочки у 66,8% яиц токсакар (Toxocaracanis) и 98,23% яиц тениид (Taeniahydatigena), что повышало их чувствительность к воздействию факторов внешней среды и приводило к 100% гибели спустя 1 час при повышении или понижении температуры внешней среды.

При этом необходимо отметить, что в яйцах токсакар (Toxocaracanis) визуально сохранивших целостность оболочек, увеличилась ее проницаемость, внесении раствора метиленового синего во взвесь яиц привело к прокрашиванию оболочки у всех не разрушившихся яиц. Инкубирование яиц токсакар, подвергавшихся воздействию раствора «ТРИГЕКСИЛОН», не привело к развитию личиночной стадии.

Яйца стронгилят (Strongylatasp.) во взвеси с фекальными массами при нахождении в растворе ТРИГЕКСИЛОН останавливались в развитии. Наблюдение в течении 12 дней показало, что личиночной стадии развития достигали не более 3,0±1,64% яиц гельминтов. Тогда как, в контроле выход личинок установлен в 92,30±0,88% яиц.

Яйца всех этих групп гельминтов являются потенциально опасными для человека, при обработке ТРИГЕКСИЛОН развитие яиц стронгилят останавливается на личиночной стадии.

Пример 3.

Противотуберкулезная активность комплекса «ТРИГЕКСИЛОН».

Комплекс «ТРИГЕКСИЛОН» проявил заметную противотуберкулезную активность в экспериментах in vitro и in vivo, что было весьма неожиданно, поскольку индивидуальный хлоргексидин сам по себе обладает очень слабым действием на микобактерии туберкулеза (МБТ). Для приготовления бактериальной взвеси культуру смывали с агара стерильной питьевой водой. Полученную взвесь микробов разводили стерильной питьевой водой до концентрации, соответствующей по мутности оптическому стандарту мутности ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора» №20, что соответствует 2x10⁹ КОЕ/мл.

Рабочие растворы ДС по 4,5 мл разливали в стерильные пробирки. «ТРИГЕКСИЛОН» на обеих моделях туберкулеза оказывал протективное действие, предотвращая гибель инфицированных мышей, На модели лекарственно чувствительного штамма M. tuberculosisH37Rv «ТРИГЕКСИЛОН» достоверно снижал величину всех тестируемых параметров по сравнению с группой контроля. В дозе 14 мг/кг действие «ТРИГЕКСИЛОН» было достоверно более выраженным, чем в дозе 7.0 мг/кг, то есть наблюдаемый эффект был дозозависимым. По снижению показателей пораженности легких «ТРИГЕКСИЛОН» в дозе 14 мг/кг на обеих моделях туберкулеза был практически так же активен, как моксифлоксацин в дозе 7 мг/кг.

Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) препарата определяли флуоресцентным методом REMA на культурах лабораторного тест-штамма М. tuberculosisH37Rv, и клинического изолята 5582 с множественной лекарственной устойчивостью к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и пиразинамиду. Значением МИК считали концентрацию препарата, при которой средний уровень флуоресценции значимо не превышал среднего уровня 1% контроля роста и/или точку выхода кривой на «плато».

Результаты тестирования «ТРИГЕКСИЛОН» в отношении штамма M. tuberculosis в диапазоне концентраций 100.0 - 0.4 мкг/мл представлены в виде графика на Фиг. 1.

По результатам тестирования in vitro на модели M. Tuberculosis H₃₇Rv, «ТРИГЕКСИЛОН» обладал выраженной противотуберкулезной активностью (значение МИК составило 6,2 мкг/мл). Аналогично, «ТРИГЕКСИЛОН» был эффективен против лекарственно устойчивого штамма 5582, при этом значение МИК составило 3.1 мгк/мл, то есть активность была в 2 раза выше, чем на стандартном штамме M. tuberculosisH₃₇Rv.

Пример 4.

Вирулицидная активность комплекса «ТРИГЕКСИЛОН».

Тест-вирус, используемый при испытаниях:

Вирус полиомиелита, вакцинный штамм, тип 1, получен из ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. Титр вируса 6,5 lg ТЦИД50.

Аденовирус человека, тип 5, получен из Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского» ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Титр вируса 5,5 lg ТЦИД50 Клетки. Для работы с вирусом полиомиелита использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленых мартышек Vero, для работы с аденовирусом - перевиваемую линию клеток НЕр-2.

Результаты испытаний представлены в таблицах 2-5 ниже. Исследование вирулицидного действия средства показало, что при времени обработки от 1,0 до 5,0 минут методом «протирание» средство инактивирует полиовирус на 4,0 - 5,0 lg ТЦИД50 (табл.2). Режимы дезинфекции объектов, контаминированных полиовирусом, средством представлены в таблице 3. Аденовирус на контаминированных объектах ингибировался на 4,0 - 4,5 lg ТЦИД50 при времени обработки в течение 3 минут (табл. 4), что позволяет рекомендовать режимы дезинфекции, представленные в таблице 5.

Таблица 2. Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест- объектов, контаминированных вирусом полиомиелита Объект Время обеззараживания, минуты Степень инактивации вируса, lgТЦИД₅₀ Способ обработки Суспензионный тест in vitro 5,0 3,5 Смешивание вирус: средство 1:9 Искусственная кожа 1.0 4,0 Протирание 1,5x2 4,5 Двукратное протирание Латекс 5,0 4,0 Протирание Металл 5,0 4,5 Протирание Стекло 5,0 4,0 Пластик 5,0 4,0

Таблица 3. Режимы дезинфекции средством объектов, контаминированных полиовирусом Объект Время обеззараживания, минуты Способ обработки Искусственная кожа 1.0 Протирание 1,5x2 Двукратное протирание Латекс 5,0 Протирание Металл 5,0 Протирание Стекло 5,0 Пластик 5,0

Таблица 4. Исследование вирулицидной активности средства при обработке тест- объектов, контаминированных аденовирусом Объект Время обеззараживания, минуты Степень инактивации вируса,
lgтцид₅₀ Способ обработки Суспензионный тест in vitro 5,0 4,0 Смешивание
вирус:средство
1:9 Искусственная кожа 1.0 4,0 Протирание 1,5x2 4,0 Двукратное протирание Латекс 3,0 4,0 Протирание Металл 3,0 4,5 Протирание стекло 3,0 4,0 пластик 3,0 4,0

Таблица 5. Режимы дезинфекции средством объектов, контаминированных аденовирусом Объект Время обеззараживания, минуты Способ обработки Искусственная кожа 1.0 Протирание 1,5x2 Двукратное протирание Латекс 3,0 Протирание Металл 3,0 Протирание Стекло 3,0 Пластик 3,0

Пример 5. Исследование влияния средства «ТРИГЕКСИЛОН» в отношении Н. pylori.

В соответствии с нормативным документом, регламентирующим объем лабораторных исследований и их оценку: руководство Р 4.2.2643-10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности», изучение влияния средства «ТРИГЕКСИЛОН» на рост Н. pylori осуществляли с помощью суспензионного метода. Исследования проводили согласно методике, описанной в Р 4.2.2643-10 п. 5.1. «Методы изучения и оценки бактерицидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций». Исследовали влияние антисептического средства «ТРИГЕКСИЛОН» без разведения на рост Н. pylori при времени экспозиции 5 и 30 минут. Контролями роста микроба служили изоляты Helicobacter pylori, высеваемые на стандартные для бактерий этого рода среды. Результаты исследований оценивали по наличию или отсутствию роста микроорганизмов на твердой питательной среде (таблица 6).

Таблица 6. Изучение влияния «ТРИГЕКСИЛОНа» на бактерии H.pilori Штамм H.pilori Исследуемое вещество ТРИГЕКСИЛОН Стерильная вода 5 мин 30 мин 5 мин 30 мин №231 Нет роста Нет роста рост рост №247 Нет роста Нет роста рост рост

Таким образом, «ТРИГЕКСИЛОН» оказывает ингибирующее влияние на рост штаммов H.pilori.

Проведенные исследования показали следующее:

Средство «ТРИГЕКСИЛОН» рекомендуется применять при бактериальных, вирусных и грибковых инфекциях в качестве кожного антисептика пролонгированного действия для обработки рук хирургов, кожи операционного и инъекционного полей, гигиенической обработки рук медицинского персонала лечебно-профилактических учреждений, а также гигиенической обработки рук медицинских работников детских дошкольных и школьных учреждений, учреждений соцобеспечения (дома престарелых, инвалидов и др.), рук работников парфюмерно-косметических предприятий (в т.ч. косметических салонах), общественного питания, предприятиях пищевой, молочной и птицеперерабатывающей промышленности, объектов коммунальных служб.

«ТРИГЕКСИЛОН» обладает выраженным биоцидным эффектом в отношении болезнетворных бактерий, грибков, микобактерий туберкулеза и вирусов.

На моделях экспериментального туберкулеза «ТРИГЕКСИЛОН» при системном введении проявляет лечебный эффект, сопоставимый с моксифлоксацином. Это позволяет рекомендовать «ТРИГЕКСИЛОН» для дальнейшего изучения в качестве возможного средства при лечении лекарственно устойчивых форм туберкулеза.

Разработанный состав позволяет использовать средство для совмещения дезинфекции и предстерилизационной обработки различных изделий медицинского назначения.

Таким образом, новый трехкомпонентный хлоргексидин-ЭДТА-Zn комплекс «ТРИГЕКСИЛОН» обладает выраженным биоцидным эффектом в отношении болезнетворных бактерий, грибков, микобактерий туберкулеза. По уровню биоцидной активности и широте спектра действия «ТРИГЕКСИЛОН» значительно превосходит хлоргексидин.

Проведенные исследования позволяют рассматривать комплекс «ТРИГЕКСИЛОН» не только как средство дезинфекции, но и как антисептический препарат, который может быть использован при лечении лекарственно устойчивых форм туберкулеза и инвазионного начала возбудителей гельминтозов человека и животных в окружающей среде.

Изобретение относится к медицине, в частности к применению средства, содержащего в качестве действующего вещества водорастворимый трихелатный комплекс хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетат следующей формулы:

для ингибирования роста H. pilori. Техническим результатом настоящего изобретения является высокая эффективность средства при наличии выраженного ингибирующего действия на рост штаммов H. pilori, а также его безопасность. 4 ил., 6 табл., 5 пр.

Применение средства, содержащего в качестве действующего вещества водорастворимый трихелатный комплекс хлоргексидиния-цинка этилендиаминтетраацетат следующей формулы:

для ингибирования роста H. pilori.