СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ТРАНСПЛАНТАТОВ ИЗ ТВЁРДОЙ МОЗГОВОЙ ОБОЛОЧКИ Российский патент 2024 года по МПК A01N1/02 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для восстановления целостности радужки.

Известен способ получения трупной твердой мозговой оболочки, включающий обработку биологического материала раствором и измельчением, и отличающийся тем, что трупную мозговую оболочку трехкратно замораживают и размораживают, после этого в ней делают сквозные отверстия 0,2-2 мм, промывают водой, измельчение производят до пластин размером 1*2 см, обрабатывают в 6%-ном растворе перекиси водорода, затем последовательно обрабатывают раствором этанола в концентрациях 30%, 50%, 70%, упаковывают и стерилизуют ионизирующим излучением при низких температурах дозой 15-25 кГр (Патент РФ №2089200, МПК A61K 35/30, A01N 1/02, A61F 9/00, опубл. 10.09.1997).

Недостатками данного способа являются использование замораживающих сред (углекислота -50°C или жидкий азот в сосуде Дюара до -170°C), последующего механического измельчения до фрагментов разных размеров, из которых делают выборку размером 1*2 см, также формирование сквозных отверстий ограниченных размеров (0,2-2 мм) и стерилизация ионизирующим излучением дозой 15-25 кГр - достигается в специализированных учреждениях с ограниченным доступом - на ускорителях.

Известен способ получения аллотрансплантатов для склеропластики, которые изготовляют из следующих кадаверных тканей: твердой оболочки головного мозга (ТМО) и широкой фасции бедра (ФБ). Донорские ткани обрабатывают по технологии Аллоплант. Данная технология заключается в многоступенчатой физико-химической обработке тканей, которая приводит к мембранолизу и экстракции наиболее иммуногенных компонентов тканей, с сохранением их коллагенового каркаса, а так же пластических свойств. Затем обработанные ткани распределяют на две группы. В первой группе трансплантаты ТМО и ФБ консервируют 70% раствором этанола. Во второй группе трансплантаты консервируют методом лиофилизации, при этом ткани замораживают в криогенной камере до 45°С и высушивают под вакуумом (Булгакова Л.А., Шангина О.Р. Сравнительная характеристика аллотрансплантатов для склеропластики, изготовленных разными способами // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2012. - №12 (148). - С. 23-25).

Недостатками данного способа являются использование сложного дорогостоящего оборудования, основанного на лиофилизации - способ сушки веществ, при котором высушиваемый препарат первоначально замораживают, а потом помещают в вакуумную камеру, где происходит возгонка (сублимация) растворителя, в итоге получают трансплантаты в сухом виде, помещенные в стерильные флаконы, кроме того требуется использование стерильных блоков для исключения инфицирования.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по совокупности существенных признаков является «Способ подготовки трансплантатов для реконструктивной хирургии» (патент РФ №2280361, МПК A01N 1/02, опубл. 27.07.2006), который заключается в том, что твердую мозговую оболочку после проверки на инфицирование сифилисом, вирусом гепатита и ВИЧ-инфекций, и отмывания дистиллированной водой подвергают обработке раствором щелочи, бикарбонатом натрия, раствором щавелевой кислоты (лимонной кислоты), щавелево-кислым натрием и помещают в этиловый спирт.

Недостатком данного способа является слабовыраженное явление васкуляризации трансплантата, замещение трансплантата по задней поверхности, также сложность регулирования формирования вновь образованной ткани на месте трансплантата со слабовыраженной дифференцировкой и специализацией клеток в планируемые сроки.

Задача изобретения - получение модифицированного материала аллогенного происхождения с низкой себестоимостью, обладающего слабовыраженной антигенной активностью, позволяющей формированию вновь образованной ткани на месте коллагенового каркаса трансплантата.

Техническим результатом является создание оптимальных условий для репаративной регенерации за счет разрыхления волокнистого каркаса ткани, улучшающего миграцию клеток, что позволяет приблизить формирующуюся структуру к тканям ложа реципиента.

Указанный технический результат достигается способом подготовки аллотрансплантатов из твердой мозговой оболочки, включающий отмывку в воде, проведение кислотно-щелочного гидролиза, консервацию в растворе этилового спирта, в котором в отличие от прототипа ткань помещают в раствор 0,3-0,5 масс.% НС1 объемом 250 мл, затем материал подвергают обработке ультразвуком в течение 1-5 мин, при интенсивности воздействия 1-10 Вт/см², после этого материал промывают водой в течение 3-7 мин под действием ультразвука при интенсивности воздействия 1-10 Вт/см², после чего материал обрабатывают в растворе ацидин-пепсина, из расчета одна таблетка ацидин-пепсина, имеющая состав - 200 мг бетаин гидрохлорида + 0,5 мг пепсина свиного, на 50-100 мл воды, причем обработку осуществляют в трех сменах раствора под действием ультразвука в течение 1-3 мин, при интенсивности воздействия 1-3 Вт/см², затем материал промывают в трех сменах воды по 5-9 мин под действием ультразвука при интенсивности воздействия 1-5 Вт/см² при комнатной температуре 21-23°С, после этого материал помещают в раствор 0,15-0,37 масс.% щелочи КОН объемом 175- 225 мл при комнатной температуре 21-23°С, причем обработку осуществляют в условиях действия ультразвуком по 3-5,5 мин, при интенсивности воздействия 1-6 Вт/см², далее материал помещают в бидистиллированную воду, в которой его отмывают от химического реагента щелочи в трех сменах воды по 8-15 мин на магнитной мешалке, после этого материал переносят в чистую бидистиллированную воду и подвергают действию ультразвуком в течение 3-5 мин, при интенсивности воздействия 1-3 Вт/см², затем материал после обработки помещают в 90% раствор этилового спирта - две смены раствора, далее переносят в 76% раствор этилового спирта, где хранят до использования.

Технический результат достигается благодаря технологии, основанной на кислотно-щелочном гидролизе, при котором происходит разрушение всех клеточных элементов и удаление цитоплазматического матрикса из тканей. Удаляются те компоненты, которые влияют на выраженность воспалительной реакции, иммунологические проявления, реакцию отторжения трансплантата, процессы заместительной регенерации. Это позволяет сохранить необходимые качества трансплантационного материала в виде его волокнистого остова.

Суть подготовки трансплантатов состоит в следующем: осуществляют забор кадаверных тканей - твердой мозговой оболочки с основания черепа. Твердая мозговая оболочка в основном представлена коллагеном 1-го типа. Забор материала осуществляют толщиной 0,15-0,25 мм. По своей толщине этот материал тоньше радужки приблизительно в 1,3-1,7 раза. Однако прочность на разрыв и прорезывание швов намного выше радужки.

Твердую мозговую оболочку помещают в раствор 0,3 - 0,5 масс.% HCl объемом 250 мл.

Далее материал подвергают обработке ультразвуком с помощью устройства - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1-10 Вт/см²). Обработку продолжают в течение 1-5 мин.

После этого материал промывают водой в течение 3-7 мин под действием ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1-10 Вт/см²).

Для повышения качества обработки трансплантационного материала используют ацидин-пепсин в виде раствора, из расчета одна таблетка на 50-100 мл воды. Используют ацидин-пепсин производства РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь. Состав одной таблетки: активное вещество бетаин гидрохлорид - 200 мг, пепсин свиной (в перерасчете на 100% пепсин) - 0,5 мг. Обработку осуществляют в 3 сменах раствора, в течение 1-3 мин, под действием ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1-3 Вт/см²) при комнатной температуре (21-23°C).

Затем материал промывают в 3 сменах воды по 5-9 мин под действием ультразвука (при интенсивности воздействия 1-5 Вт/см²) при комнатной температуре (21-23°C).

После этого материал помещают в раствор объемом 175-225 мл 0,15- 0,37 масс.% KOH при комнатной температуре (21-23°C), обработку осуществляют по 3-5,5 мин, в условиях действия ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1-6 Вт/см²).

Далее материал помещают в бидистиллированную воду, в которой его отмывают от химического реагента щелочи, в 3 сменах воды по 8-15 мин на магнитной мешалке (магнитная мешалка с нагревателем ПЭ-6110). Далее материал переносят в чистую бидистиллированную воду и в течение 3-5 мин подвергают действию ультразвуком - ультразвуковым технологическим аппаратом серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1-3 Вт/см²) при комнатной температуре (21-23°C).

Материал после обработки помещают в 90% раствор этилового спирта - 2 смены, затем его переносят в 76% раствор этилового спирта, где хранят до использования.

Применение изобретения дает возможность получения модифицированного трансплантата с относительно рыхлым коллагеновым каркасом, позволяющим формировать вновь образованную ткань близкую к реципиенту.

Разработанный нами способ подготовки трансплантатов позволяет регулировать процесс поэтапного постепенного удаления клеток, различных компонентов межклеточного матрикса, влияющих на качество замещения трансплантата. Из тканей удаляют липопротеины и протеолипиды, гликопротеины, белковые молекулы неколлагеновой природы. В процессе кислотно-щелочного гидролиза под влиянием ультразвука происходит разрушение всех клеточных элементов и удаление цитоплазматического матрикса из тканей. Это позволяет сохранить необходимые качества трансплантационного материала в виде его волокнистого остова.

Пример 1. Осуществляют забор кадаверных тканей - твердой мозговой оболочки с основания черепа. Твердая мозговая оболочка в основном представлена коллагеном 1-го типа. Забор материала осуществляют толщиной 0,15 мм. По своей толщине этот материал тоньше радужки приблизительно в 1,3 раза. Однако прочность на разрыв и прорезывание швов намного выше радужки.

Твердую мозговую оболочку помещают в раствор 0,3 масс.% HCI объемом 250 мл.

Далее материал подвергают обработке ультразвуком с помощью устройства - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1 Вт/см²). Обработку продолжают в течение 1 мин.

После этого материал промывают водой в течение 3 мин, под действием ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1 Вт/см²).

Для повышения качества обработки трансплантационного материала используют ацидин-пепсин в виде раствора, из расчета одна таблетка на 50 мл воды. Используют ацидин-пепсин производство РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь. Состав одной таблетки: активное вещество бетаин гидрохлорид - 200 мг, пепсин свиной (в перерасчете на 100% пепсин) - 0,5 мг. Обработку осуществляют в 3 сменах раствора, в течение 1 мин, под действием ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1 Вт/см²) при комнатной температуре (21°C).

Затем материал промывают в 3 сменах воды по 5 мин, под действием ультразвука (при интенсивности воздействия 1 Вт/см²) при комнатной температуре (21°C).

После этого материал помещают в раствор 0,15 масс.% KOH объемом 175 мл при комнатной температуре (21°C), обработку осуществляют по 3 мин в условиях действия ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1 Вт/см²).

Далее материал помещают в бидистиллированную воду, в которой его отмывают от химического реагента щелочи, в 3 сменах воды по 8 мин на магнитной мешалке (магнитная мешалка с нагревателем ПЭ-6110). Далее материал переносят в чистую бидистиллированную воду и в течение 3 мин подвергают действию ультразвуком - ультразвуковым технологическим аппаратом серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 1 Вт/см²) при комнатной температуре (21°C).

Материал после обработки помещают в 90% раствор этилового спирта - 2 смены, затем переносят в 76% раствор этилового спирта, где хранят до использования.

Пример 2. Осуществляют забор кадаверных тканей - твердой мозговой оболочки с основания черепа. Твердая мозговая оболочка в основном представлена коллагеном 1-го типа. Забор материала осуществляют толщиной 0,25 мм. По своей толщине этот материал тоньше радужки приблизительно в 1,7 раза. Однако прочность на разрыв и прорезывание швов намного выше радужки.

Твердую мозговую оболочку помещают в раствор 0,5 масс.% HCI объемом 250 мл.

Далее материал подвергают обработке ультразвуком с помощью устройства - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 10 Вт/см²). Обработку продолжают в течение 5 мин.

После этого материал промывают водой в течение 7 мин, под действием ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 10 Вт/см²).

Для повышения качества обработки трансплантационного материала используют ацидин-пепсин в виде раствора, из расчета одна таблетка на 100 мл воды. Используют ацидин-пепсин производство РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь. Состав одной таблетки: активное вещество бетаин гидрохлорид - 200 мг, пепсин свиной (в перерасчете на 100% пепсин) - 0,5 мг. Обработку осуществляют в 3 сменах раствора в течение 3 мин, под действием ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 3 Вт/см²) при комнатной температуре (23°C).

Затем материал промывают в 3 сменах воды по 9 мин под действием ультразвука (при интенсивности воздействия 5 Вт/см²) при комнатной температуре (23°C).

После этого материал помещают в раствор 0,37 масс.% KOH объемом 225 мл при комнатной температуре (23°C), обработку осуществляют в течение 5,5 мин в условиях действия ультразвука - ультразвукового технологического аппарата серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 6 Вт/см²).

Далее материал помещают в бидистиллированную воду, в которой его отмывают от химического реагента щелочи в 3 сменах воды по 15 мин на магнитной мешалке (магнитная мешалка с нагревателем ПЭ-6110). Далее материал переносят в чистую бидистиллированную воду и в течение 5 мин подвергают действию ультразвуком - ультразвуковым технологическим аппаратом серии «Волна», модель УЗТА-0,4/22-ОМ (при интенсивности воздействия 3 Вт/см²) при комнатной температуре (23°C).

Материал после обработки помещают в 90% раствор этилового спирта - 2 смены, затем переносят в 76% раствор этилового спирта, где хранят до использования.

Преимуществом нашего способа является подготовка аллотрансплантата с явлениями разрыхления коллагенового каркаса, позволяющего удалить из этого материала липопротеины и протеолипиды, гликопротеины, белковые молекулы неколлагенновой природы. В процессе кислотно-щелочного гидролиза под влиянием ультразвука происходит разрушение всех клеточных элементов и удаление цитоплазматического матрикса из тканей. Удаляются те компоненты, которые влияют на выраженность воспалительной реакции, иммунологические проявления, реакцию отторжения трансплантата и процессы заместительной регенерации. Это позволяет сохранить необходимые качества трансплантационного материала в виде его волокнистого остова.

Таким образом, предложенное изобретение позволяет повысить эффективность операций с достижением оптимального уровня биопластичности и созданием достаточного объема пластического материала.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу подготовки трансплантатов из твердой мозговой оболочки. Указанный способ основан на кислотно-щелочном гидролизе, при котором происходит разрушение всех клеточных элементов и удаление цитоплазматического матрикса из тканей. Удаляются те компоненты, которые влияют на выраженность воспалительной реакции, иммунологические проявления, реакцию отторжения трансплантата, процессы заместительной регенерации, что позволяет сохранить необходимые качества трансплантационного материала в виде его волокнистого остова. Настоящее изобретение обеспечивает создание оптимальных условий для репаративной регенерации за счет разрыхления волокнистого каркаса ткани, улучшающего миграцию клеток, что позволяет приблизить формирующуюся структуру к тканям ложа реципиента. 2 пр.

Способ подготовки трансплантатов из твердой мозговой оболочки, включающий отмывку в воде, проведение кислотно-щелочного гидролиза, консервацию в растворе этилового спирта, отличающийся тем, что ткань помещают в раствор 0,3-0,5 масс.% HCl объемом 250 мл, затем материал подвергают обработке ультразвуком в течение 1-5 мин, при интенсивности воздействия 1-10 Вт/см², после этого материал промывают водой в течение 3-7 мин под действием ультразвука при интенсивности воздействия 1-10 Вт/см², после чего материал обрабатывают в растворе ацидин-пепсина, из расчета одна таблетка ацидин-пепсина, имеющая состав - 200 мг бетаин гидрохлорида + 0,5 мг пепсина свиного, на 50-100 мл воды, причем обработку осуществляют в трех сменах раствора под действием ультразвука в течение 1-3 мин, при интенсивности воздействия 1-3 Вт/см², затем материал промывают в трех сменах воды по 5-9 мин под действием ультразвука при интенсивности воздействия 1-5 Вт/см² при комнатной температуре 21-23°С, после этого материал помещают в раствор 0,15-0,37 масс.% щелочи КОН объемом 175-225 мл при комнатной температуре 21-23°С, причем обработку осуществляют в условиях действия ультразвуком по 3-5,5 мин, при интенсивности воздействия 1-6 Вт/см², далее материал помещают в бидистиллированную воду, в которой его отмывают от химического реагента щелочи в трех сменах воды по 8-15 мин на магнитной мешалке, после этого материал переносят в чистую бидистиллированную воду и подвергают действию ультразвуком в течение 3-5 мин, при интенсивности воздействия 1-3 Вт/см², затем материал после обработки помещают в 90% раствор этилового спирта - две смены раствора, далее переносят в 76% раствор этилового спирта, где хранят до использования.