Способ клинико-лабораторного прогнозирования цитокинового шторма у пациента с установленным диагнозом "COVID-19" Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/49 G01N33/566 G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-лабораторной диагностике, и может быть использовано для клинико-лабораторного прогнозирования развития COVID-19-индуцированного цитокинового шторма (ЦШ). Пандемия COVID-19, развернувшаяся в начале 2020 года, явилась одним из самых больших вызов для всемирного здравоохранения за долгие годы. Источник COVID-19 - SARS-CoV-2 - характеризуется высокой контагиозностью и летальностью около 2%, однако с увеличением возраста пациента риск смерти возрастает экспоненциально [1]. По оценкам исследователей к концу 2022 года COVID-19 вызвал от 13,23 до 16,58 миллионов избыточных смертей [2]. Одной из причин летального исхода COVID-19 является цитокиновый шторм - нерегулируемое гипервоспаление, вызывающее острый респираторный дистресс-синдром, отек легких и полиорганную недостаточность [3]. На данный момент для терапии ЦШ используются антицитокиновые препараты, но эффективность их применения зависит от оптимального времени назначения [4]. Стандартным способом определения ЦШ в современной клинической практике является детекция по повышению показателей стандартный лабораторных тестов: содержание С-реактивного белка, интерлейкина-6, D-димера и др. Несмотря на простоту и удобство использования стандартного способа, он не позволяет предсказать риск наступления ЦШ и своевременно назначить соответствующую терапию.

Известен способ комплексного предсказания тяжести течения и исхода заболевания [5 - Патент WO 2022/223642 А1; 2021], который заключается в измерении соотношения между уровнем концентрации одного или более избранных цитокинов (интерлекин-6, интерлейкин-8, интерлейки-10, фактор некроза опухоли альфа) и уровнем концентрации интерферона-бета или интерферона альфа. По соотношению аналитов возможно определить риск развития тяжелой или крайне тяжелой формы течения заболевания, также способ предсказывает исход заболевания. Однако способ не предполагает возможности предсказать развитие цитокинового шторма, т.к. данное состояние не обязательно сопутствует тяжелой или крайне тяжелой форме заболевания, а также летальному исходу.

Известен способ предсказания тяжелого и крайне тяжелого течения заболевания у пациентов с легким или среднетяжелым течением инфекции COVID-19 [6 - Патент WO 2022/028917 А2; 2021], который заключается в измерении более чем 300 биомаркеров для комплексного оценивания и предикции состояния пациента. Достоинством метода является углубленный анализ протеома пациента для детализации его состояния, но это же является недостатком: использование метода несет с собой большую финансовую нагрузку. Способ позволяет оценить особенности иммунного ответа индуцированного COVID-19, однако не позволяет по малому количеству биомаркеров предсказать развитие цитокинового шторма.

Известен способ диагностики синдрома активации макрофагов при новой коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS - CoV-2 [7 - Патент RU 2778779; 2022], который позволяет диагностировать синдром активации макрофагов по значениям концентрации провоспалительных биомаркеров крови (интерлекин-6, С-реактивный белок, лактатдегидрогеназа, ферритин). Однако известный способ не позволяет спрогнозировать развития иммунопатологического состояния, а также обладает статистическим аппаратом, показывающим его эффективность.

Известен способ прогноза исхода острого заболевания, вызванного COVID-19 на основании уровня концентрации цитокинов, ассоциированных с развитием ЦШ [8 - Патент RU 2766347; 2021], наиболее близкий по своей сути заявляемому изобретению, сущность которого состоит в измерении концентрации цитокинов интерлейкина-6 и интрелейкина-18 в плазме крови пациентов до начала терапии, и принятый в качестве прототипа. На основании полученных условий из дерева решений прогнозируется исход заболевания.

Недостатками известного способа являются невысокая точность и низкая надежность прогноза, за счет отсутствия проведения апробации на тестовой выборке. Вместе с этим возможность применения способа ограничена малой транспортабельностью плазмы крови. Кроме того, известный способ имеет ограниченную область прогноза, ассоциированную только с гипервоспалением и прогнозированием летального исхода, что не позволяет своевременно подобрать наиболее оптимальную схему лечения пациента.

Заявляемый способ лишен указанных в прототипе недостатков, и его целью является повышение точности и надежности полученной информации о течении заболевания COVID-19 у пациента.

Заявляемое изобретение позволяет с высокой точностью спрогнозировать развитие ЦШ у пациентов с диагнозом «коронавирусная инфекция COVID-19» до того, как стандартные клинико-лабораторные исследования смогут выявить наличие ЦШ.

Для достижения указанной цели была разработана библиотека на основании языка программирования Python, для оптимизации параметров обучения интерпретируемой модели машинного обучения. Выбор параметров, используемых при обучении модели, осуществлялся с использованием вложенных генетических алгоритмов; выбор метода для селекции, скрещивания и частоты мутации также определялся на основании результатов работы начальной популяции генетических алгоритмов. В качестве методов селекции использовались турнирная селекция, рулеточный отбор, сигма-отсечение, стратегия элитизма. Частота случайных мутаций и характер наследования признаков (параметра модели) также были вариабельны. В качестве хорошо интерпретируемой и доступной для применения в клинической практике модели были выбраны деревья классификации. Применимость модели была проверена на тестовом наборе данных.

Для определения наличия цитокинового шторма были определены и проанализированы широко используемые лабораторные показатели, указывающие на развитие провоспалительного процесса: интерлейкин-6, С-реактивный белок, Д-димер, абсолютное количество лимфоцитов в крови, ферритин. Исследуемые показатели использовались для «классического» способа выявления ЦШ у пациента в день проведения анализа. Критерии для выявления цитокинового шторма определены на основании предыдущих наработок [9]. Наличие ЦШ на определенный день заболевания определялось при соответствии результатов клинико-лабораторных тестов критериям, приведенным таблице 1. При выполнении 80% из имеющихся на данный день заболевания критериев пациент определялся как пациент с ЦШ.

Лабораторные исследования крови проводились, начиная с первого до последнего дня госпитализации пациента, что позволяет определить день начала ЦШ. Всего из 1646 пациентов было отобрано 80 пациентов с отсутствием ЦШ на момент госпитализации. В качестве потенциальных биомаркеров использовались следующие белки: интерферон γ индуцированный протеин 10, (IP-10), CD40L в растворимой форме, факторы роста эндотелия сосудов (VEGF). Образцы крови были получены на первые или вторые сутки госпитализации, до начала лечения, которое могло бы оказать влияние на концентрацию биомаркеров: антицитокиновая терапия, гемосорбция, переливание плазмы реконвалесцентов и др. Определение концентрации аналитов в биообразцах осуществляли с использованием панелей реагентов для одновременного определения 38 человеческих цитокинов, хемокинов и факторов роста MILLIPLEX Human Cytokine / Chemokine / Growth Factor Panel A Magnetic Bead Panel (Merck, США) согласно инструкции производителя. Для детекции концентрации использовали оборудование для мультиплексного анализа MAGPIX (Luminex, США).

Заявленный способ обучения модели на полученных данных позволил построить модель, с высокой точностью предсказывающую развитие ЦШ у пациента во время госпитализации.

Построенная модель дерева классификации позволяет с высокой точностью предсказать развитие ЦШ при истинности одного из нижеперечисленных логических выражений (фиг. 1.).

1) IP-10 от 2146 пг/мл до 4289 пг/мл включительно

2) IP-10 более 6710 пг/мл

3) IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L менее или равно 8029 пг/мл

4) IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L более 8029 пг/мл, и VEGF менее или равно 66 пг/мл

При выполнении одного из условий у пациента с высокой вероятностью разовьется ЦШ во время госпитализации. Для оценки качества работы модели было использовано несколько классических метрик (Таблица 2). Для модели построены ROC кривые (фиг. 2.).

Пример 1. Пациент Ш., мужчина в возрасте 41 года, поступил с подозрением на COVID-19. Диагноз коронавирусной инфекции был подтвержден положительным результатом теста на наличие РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При поступлении пациента в стационар лабораторные тесты имели следующие показатели: абсолютное количество лимфоцитов - 1.45; уровень С-реактивного белка в сыворотке крови - 2 мкг/л; уровень D-димера в плазме крови - 0,16 мкг/мл; уровень интерлейкина-6 в сыворотке крови - 10,91 пг/мл. В течение госпитализации пациент имел положительную динамику по шкале NEWS. Пациент был определен как пациент без ЦШ на момент поступления. Были определены концентрации потенциальных биомаркеров: концентрация MDC - 1363.63 пг/мл; концентрация sCD40L более 10000 пг/мл; концентрация IP-10 - 1738.96 пг/мл; концентрация VEGF - 48.84 пг/мл.

Если пациент не соответствует ни одному из выведенных критериев, модель определяет, что у пациента не разовьется ЦШ, и действительно, максимальные значения, за все время госпитализации, СРБ - 5 мг/л, интрелейкин-6 - 17 пг/мл. Тяжелое течение заболевания, пациент выписан на 13-е сутки стационарного лечения.

Пример 2. Пациентка Б., женщина в возрасте 25 лет, поступила с подозрением на COVID-19. Диагноз коронавирусной инфекции был подтвержден положительным результатом теста на наличие РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При поступлении пациентки в станционар лабораторные тесты имели следующие показатели: абсолютное количество лимфоцитов - 1.96; уровень С-реактивного белка в сыворотке крови - 15 мкг/л; уровень D-димера в плазме крови - 0.27 мкг/мл; уровень Интерлейкина-6 в сыворотке крови - 11.15 пг/мл. Пациент был определен как пациент без ЦШ на момент поступления. Были определены концентрации потенциальных биомаркеров: концентрация MDC - 578.24 пг/мл; концентрация sCD40L - 1505.4 пг/мл; концентрация IP-10 - 824.34 пг/мл; концентрация VEGF - 61.31 пг/мл.

Результаты тестов пациентки соответствуют третьему критерию (IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L менее или равно 8029 пг/мл), модель определяет, что у пациентки разовьется ЦШ. На пятые сутки от госпитализации значения СРБ пациентки достигают 71 мкг/л, концентрация интрелейкина-6 возрастает до 81.6 пг/мл, абсолютное количество лимфоцитов подает до 0.61. На фоне терапии наступает быстрое улучшение состояния, пациентка выписана после 8 суток госпитального лечения.

Пример 3. Пациент М., мужчина в возрасте 40 лет, поступил с подозрением на COVID-19. Диагноз коронавирусной инфекции был подтвержден положительным результатом теста на наличие РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При поступлении пациента в станционар лабораторные тесты имели следующие показатели: абсолютное количество лимфоцитов - 1.13; уровень С-реактивного белка в сыворотке крови - 48 мг/л; уровень D-димера в плазме крови - 0.45 мкг/мл; уровень ИЛ-6 в сыворотке крови - 11.33 пг/мл. В течение госпитализации пациент имел положительную динамику по шкале NEWS. Пациент был определен как пациент без ЦШ на момент поступления. Были определены концентрации потенциальных биомаркеров: концентрация MDC - 106.94 пг/мл; концентрация sCD40L - 2600 пг/мл; концентрация IP-10 - 3263.47 пг/мл; концентрация VEGF - 279.3 пг/мл.

Пациент соответствует первому критерию (IP-10 от 2146 пг/мл до 4289 пг/мл включительно), модель определяет, что у пациента разовьется ЦШ. На 5 день с момента госпитализации СРБ - 226 мг/л, концентрации интерлекин-6 - 204.4 пг/мл, абсолютное количество лимфоцитов - 0.99. Среднетяжелое течение заболевания, пациент выписан на 10-е сутки стационарного лечения.

Пример 4. Пациент Л., мужчина в возрасте 60 лет, поступил с диагнозом COVID-19. Диагноз коронавирусной инфекции был подтвержден положительным результатом теста на наличие РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При поступлении пациента в стационар лабораторные тесты имели следующие показатели: абсолютное количество лимфоцитов - 0.4; уровень D-димера в плазме крови - 0.83 мкг/мл; уровень интерлейкина-6 в сыворотке крови - 14.45 пг/мл. Пациент был определен как пациент без ЦШ на момент поступления. Были определены концентрации потенциальных биомаркеров: концентрация MDC - 769.4 пг/мл; концентрация sCD40L - 4036.9 пг/мл; концентрация IP-10 - 9941.5 пг/мл; концентрация VEGF - 278.5 пг/мл.

Результаты тестов пациентов соответствуют четвертому критерию (IP-10 более 6710 пг/мл), следовательно, прогнозируется, что у пациента разовьется ЦШ. На 3 сутки от госпитализации (и измерения концентрации биомаркеров) значения СРБ пациентки равно 61 мг/л, концентрация интрелейкина-6 достигает 144.4 пг/мл, D-димера в плазме крови возрастает до 9.17 мкг/мл. У пациента был определен цитокиновый шторм. На 11 день госпитализации наступил летальный исход.

Пример 5. Пациент М., женщина в возрасте 50 лет, поступила с подозрением на COVID-19. Диагноз коронавирусной инфекции был подтвержден положительным результатом теста на наличие РНК SARS-CoV-2 методом амплификации нуклеиновых кислот в полимеразной цепной реакции (ПЦР). При поступлении пациента в стационар лабораторные тесты имели следующие показатели: абсолютное количество лимфоцитов - 0.95; уровень ферритина в плазме крови - 96 мкг/мл; уровень интерлейкина-6 в сыворотке крови - 5.8 пг/мл; уровень СРБ - 16 мг/л. Пациентка был определен как пациент без ЦШ на момент поступления. Были определены концентрации потенциальных биомаркеров: концентрация MDC - 796 пг/мл; концентрация sCD40L - 2721.2 пг/мл; концентрация IP-10 - 1282.8 пг/мл; концентрация VEGF - 380.7 пг/мл.

Результаты тестов пациентов соответствуют второму критерию (IP-10 более 6710 пг/мл), следовательно, прогнозируется, что у пациента разовьется ЦШ. На 4 сутки от госпитализации после измерения биомаркеров значения СРБ пациентки равно 53 мг/л, концентрация интрелейкина-6 достигает 24 пг/мл, согласно лабораторным показателям был определен ЦШ. Пациентка выписана с улучшением на 11 сутки после госпитализации.

Как показывают результаты анализа, проведенного на примерах конкретной реализации в условиях инфекционного стационара, заявленное изобретение подтверждает достижение указанного технического результата и наглядно демонстрирует возможности эффективного прогнозирования развития ЦШ, вызванного новой коронавирусной инфекцией. Изобретение применимо для широкого использования в медицинских стационарах инфекционного профиля для лечения новой коронавирусной инфекции, в том числе в отделениях реанимации и интенсивной терапии, врачами-инфекционистами, реаниматологами, терапевтами и т.д.

Практическая значимость заявляемого способа клинико-лабораторного прогнозирования развития COVID-19-индуцированного ЦШ заключается в высокой точности модели (чувствительность - 92%, специфичность - 88.5%). Значения используемых переменных (MDC, sCD40L, IP-10, VEGF) независимы относительно других клинико-лабораторных показателей, что позволяет составить прогноз о развитии/не развитии ЦШ у пациента безотносительно других переменных.

Преимуществом заявляемого способа прогнозирования развития COVID-ассоциированного ЦШ является его возможность выявить высокий риск (чувствительность 92%) развития у пациента ЦШ, даже в тех случаях, когда классические клинико-лабораторные показатели (концентрация интерлейкин-6, СРБ, D-димера) не показывают характерную для ЦШ картину.

Список использованных источников информации.

1. Michaelson J. Counting Cases and Deaths by Age Tells Us About COVID-19 Infectious and Lethal Components. medRxiv, 2023. DOI: 10.1101/2023.01.05.23284239

2. Msemburi, W., Karlinsky, A., Knutson, V., Aleshin-Guendel, S., Chatterji, S., Wakefield, J. The WHO estimates of excess mortality associated with the COVID-19 pandemic. Nature, 2023:613:130-137. DOI: 10.1038/s41586-022-05522-2

3. De la Rica R., Borges M., Gonzalez-Freire M. COVID-19: in the eye of the cytokine storm. Frontiers in immunology, 2020, Т. 11. DOI: 10.3389/fimmu.2020.558898

4. De Stefano L, Bobbio-Pallavicini F, Manzo A, Montecucco C, Bugatti S. A "Window of Therapeutic Opportunity" for Anti-Cytokine Therapy in Patients With Coronavirus Disease 2019. Front Immunol., 2020 Oct 6;11:572635. DOI: 10.3389/fimmu.2020.572635. PMID: 33123149

5. Патент Methods for prognosis stratification and monitoring of the severity of coronavirus disease (WO 2022/223642 A1; 2021

6. Патент Methods for the determination of the predisposition for a severe of critical course of a COVID-19-disease from a mild or moderate course of a COVID-19-disease in a subject (WO 2022/028917 A2); 2021

7. Патент Способ диагностики синдрома активации макрофагов при новой коронавирусной инфекции, вызванной вирусом SARS - CoV-2 (RU 2778779); 2022

8. Патент Способ прогнозирования исхода острого заболевания, вызванного новой коронавирусной инфекцией (RU 2766347); 2021 (прототип)

9. Анисенкова А.Ю. и др. Основные прогностические факторы риска цитокинового шторма у пациентов с COVID-19. Клиническая практика, Апрель 2021 г, том 12, №1, с. 5-15, DOI: 10.17816/clinpract63552.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинико-лабораторной диагностике, инфекционным болезням, и может быть использовано для клинико-лабораторного прогнозирования цитокинового шторма в течение госпитализации в стационаре у пациента с диагнозом «COVID-19». Осуществляют идентифицирование вируса без признаков цитокинового шторма на момент госпитализации путем измерения концентрации сигнальных белков в сыворотке крови пациента, полученной предварительно до назначения терапии. В сыворотке крови пациента измеряют концентрацию интерферон γ индуцированного протеина 10 (IP-10), лиганда CD40 в растворимой форме (sCD40L), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). По одному из полученных критериев: (1) IP-10 от 2146 до 4289 пг/мл включительно; (2) IP-10 более 6710 пг/мл; (3) IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L менее или равно 8029 пг/мл; (4) IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L более 8029 пг/мл, и VEGF менее или равно 66 пг/мл; где: IP-10 – интерферон γ индуцированный протеин 10; sCD40L - лиганд CD40 в растворимой форме; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов; пг/мл - пикограмм на миллилитр, прогнозируют у госпитализированного пациента развитие цитокинового шторма. Способ обеспечивает возможность с высокой точностью спрогнозировать развитие цитокинового шторма у пациентов с диагнозом «коронавирусная инфекция COVID-19» до того, как стандартные клинико-лабораторные исследования смогут выявить наличие цитокинового шторма, за счет определения в крови пациентов концентрации IP-10, sCD40L и VEGF. 2 ил., 2 табл., 5 пр.

Способ клинико-лабораторного прогнозирования цитокинового шторма в течение госпитализации в стационаре у пациента с диагнозом «COVID-19», заключающийся в идентифицировании вируса без признаков цитокинового шторма на момент госпитализации путем измерения концентрации сигнальных белков в сыворотке крови пациента, полученной предварительно до назначения терапии, отличающийся тем, что в сыворотке крови пациента измеряют концентрацию интерферон γ индуцированного протеина 10 (IP-10), лиганда CD40 в растворимой форме (sCD40L), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF),

и по одному из полученных критериев:

(1) IP-10 от 2146 до 4289 пг/мл включительно;

(2) IP-10 более 6710 пг/мл;

(3) IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L менее или равно 8029 пг/мл;

(4) IP-10 от 475 до 1487 пг/мл включительно, и sCD40L более 8029 пг/мл, и VEGF менее или равно 66 пг/мл;

где:

IP-10 - интерферон γ индуцированный протеин 10,

sCD40L - лиганд CD40 в растворимой форме,

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов,

пг/мл - пикограмм на миллилитр,

прогнозируют у госпитализированного пациента развитие цитокинового шторма.