Штамм бактерий Bacillus siamensis, осуществляющий биодеградацию перфтороктансульфоновой и перфтороктановой кислот Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/07 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно биоочистки окружающей среды от загрязнения перфтороктансульфоновой (ПФОС) и перфтороктановой (ПФОК) кислотами с помощью бактерий, и касается нового штамма, способного эффективно разлагать устойчивые токсичные соединения - ПФОС и ПФОК. Данные вещества внесены в Приложение В Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязняющим (СОЗ) веществам, что предусматривает принятие мер по минимизации и, по возможности, прекращению производства и использования, с последующим уничтожением [Report of the Conference of the Parties of the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants on the work of its fourth meeting, 4-8 May // UNEP /POPS/COP.4/38. Geneva: Stockholm Convention Secretariat, 2009. P. 66-69]. ПФОС и ПФОК будучи крайне устойчивыми к разложению, к настоящему времени обнаруживаются во многих объектах окружающей среды и живых организмах, являясь наиболее часто детектируемыми загрязнителями [Betts K. PFOS and PFOA in humans: new study links prenatal exposure to lower birth weight // Environmental Health Perspectives. - 2007. V. 115. - P. 550; Yamashita N., Kannan K., Taniyasu S., Horii Yu., Petrick G., Gamo T. A global survey of perfluorinated acids in oceans // Marine Pollution Bulletin. - 2005. V. 51. - Р. 658 - 668].

Известны способы разложения ПФОС и ПФОК - химическая переработка, сжигание при высокой температуре [Cheng J., Vecitis C.D., Park H., Mader B.T., Hoffmann M.R. Sonochemical degradation of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA) in landfill groundwater: environmental matrix effects // Environ. Sci. Technol. - 2008. V. 42. - P. 8057-8063; Wang F., Shih K., Lu X., Liu C. Mineralization behavior of fluorine inperfluorooctanesulfonate (PFOS) during thermal treatment of lime-conditioned sludge // Environ. Sci. Technol. - 2013. V. 47. - P. 2621-2627], но они являются высокозатратными.

Наиболее экологически безопасно применение способа утилизации ПФОС и ПФОК, основанного на их включении в естественный обмен веществ и энергии с участием микроорганизмов, способных к их разложению, минимизируя отрицательное влияние на окружающую среду.

Известно лишь единичное количество штаммов бактерий, способных к трансформации перфторкарбоновых кислот.

Известен штамм Pseudomonas parafulva YAB1, обладающий способностью к биодеградации ПФОК [Yi L.B., Chai L.Y., Xie Y., Peng Q.J., Peng Q.Z. Isolation, identification, and degradation performance of a PFOA-degrading strain // Genet. Mol. Res. 2016. V. 15. № 2: gmr. 15028043].

Недостатком данного штамма является то, что он медленно и недостаточно полно утилизирует ПФОК и не способен утилизировать ПФОС. Штамм Pseudomonas parafulva YAB1 утилизирует 32,2% ПФОК при ее начальной концентрации 500 мг/л.

Наиболее близким к предлагаемому штамму - прототипом, является штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D, способный к биологической деградации ПФОС [Патент РФ №2644206 опубл. 14.07.2017].

Недостатком прототипа является неспособность штамма бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D к утилизации ПФОК. Это ограничивает возможность его использования для биоочистки в промышленных масштабах при комбинированном загрязнении. А также штамм не способен к глубокой трансформации ПФОС, разлагая её только до перфторгептановой (перфторэнантовой) кислоты.

Целью изобретения является получение нового штамма микроорганизма, способного осуществлять эффективную биодеградацию ПФОС и ПФОК, расширение области применения биотехнологий для защиты окружающей среды.

Цели достигают применением штамма бактерий Bacillus siamensis MX3.

Штамм бактерий Bacillus siamensis MX3 выделен из образца грунта с полигона испытаний средств пожаротушений (г. Уфа, Республика Башкортостан, РФ) и хранится в Коллекции микроорганизмов Уфимского Института биологии Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

Полученный штамм микроорганизмов депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-3775D и характеризуется следующими признаками.

Характеристика штамма Bacillus siamensis MX3 (ВКМ B-3775D).

Грамположительные клетки палочковидной формы, размером 0.3-0.6 х 1.5-3.5 мм, подвижные с помощью перитрихозных жгутиков, образуют эндоспоры, факультативный аэроб. Колонии кремово-белые, слизистые, полупрозрачные, приподнятые, имеют цельный край и достигают 3-4 мм в диаметре после 2-дневной инкубации. Диапазон температур для роста составляет 4-55°C с оптимумом при 37°C. Оптимальное значение рН 6,0-7,0. Растет на агаре Макконки, но не на среде с желчными солями. Продуцирует каталазу, но не оксидазу. Положительный результат в тестах на гидролиз казеина, эскулина, желатина и крахмала, на восстановление нитратов и в реакции Фогеса-Проскауэра. Отрицательные результаты в тестах на гидролиз тирозина и Твин 80, выработке H₂S и индола, активностью уреазы и реакцией метил-красного. При концентрации 0-5% NaCl наблюдался интенсивный рост, при более высокой концентрации до 14% NaCl наблюдался слабый рост.

В качестве источников углерода использует D-глюкозу, D-маннозу, D-фруктозу; не использует D-ксилозу, L-рамнозу, D-галактозу, малонат, D-тартрат, бензоат, L-триптофан.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена кодирующего 16S рРНК с известными структурами из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) позволяет с высокой долей вероятности утверждать, что микроорганизм относится к виду Bacillus siamensis (обнаружено 99,93% сходства с типовым штаммом вида Bacillus siamensis KCTC 13613^T).

Предлагаемое изобретение поясняется следующими примерами применения штамма Bacillus siamensis MX3 (ВКМ B-3775D) для биодеградации ПФОС и ПФОК, устойчивых к разрушению биологическими способами.

Пример 1. Бактерии штамма Bacillus siamensis MX3 после ферментации на питательной среде Раймонда следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0.1; MgSO₄ × 7 H₂O - 0.2; FeSO₄ × 7 H₂O - 0.02; CaCl₂ - 0.01; MnSO₄ × 7 H₂O - 0.02; K₂HPO₄ × 3 H₂O - 1.0; NaH₂PO₄ × 3 H₂O - 1.5; NH₄Cl - 3.0; вода дистиллированная - 1000 мл, содержащей в качестве единственного источника углерода ПФОК (1000 мг/л) оставались жизнеспособными, титр микроорганизмов составлял 5,2·10⁸ клеток/мл.

Штамм по прототипу не способен к росту при такой концентрации ПФОК в среде.

Интенсивность роста культуры оценивали спектрофотометрически по оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм (ОП₅₉₀).

Для выделения и идентификации продуктов биотрансформации ПФОС и оценки ее концентрации в среде бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости методом ультрафильтрации на установке “Vivaflow 50” (“Sartorius AG”, Германия). Полученный ультрафильтрат (≤3 кДа) анализировали хромато-масс-спектрометрическим методом на жидкостном тандемном хромато-масс-спектрометре LCMS-IT-TOF (“Shimadzu”, Япония) с системой ввода образца электроспрей, квадрупольной ионной ловушкой и времяпролетным детектором. Масс-спектры регистрировали в интервале масс m/z 200-800 а.е.м. в режиме регистрации отрицательных ионов, напряжение на детекторе составляло 3.5 кВ. Для хроматографического разделения использовали колонку Shim-pak XR-ODS (75x2.0 мм) (“Shimadzu”, Япония) в изократическом режиме при соотношении растворителей 5 мМ ацетат аммония в воде:ацетонитрил - 56:44 со скоростью элюирования 0.2 мл/мин. Установление структуры полученных соединений проводили по совокупности данных анализа масс-спектров, основанных на распаде молекулярного иона, и сравнения с данными литературы.

Концентрацию фторид-иона в среде измеряли методом ионной хроматографии с использованием системы ВЭЖХ LC-20 Prominence с кондуктометрическим детектором CDD-10Avp (“Shimadzu”, Япония). Ионы фтора отделяли на колонке Shodex (“Shodex”, Нью-Йорк, США) при скорости потока 1 мл/мин. В качестве элюента использовали водный раствор карбоната натрия и бикарбоната натрия: 1,8 мм Na₂CO₃ + 1,7 мм NaHCO₃. Подавление элюента после колонки осуществляли с помощью подавителя Xenoic ® XAMS в сочетании с ASUREX-A100 (“Diduco AB”, Умео, Швеция).

Заявляемый штамм бактерий Bacillus siamensis MX3 способен к использованию ПФОК в качестве единственного источника углерода и энергии с полной ее утилизацией при начальной концентрации 1000 мг/л за 6 сут. Штамм бактерий Bacillus siamensis MX3 трансформирует ПФОК в перфторгексановую кислоту, высвобождая в среду свободные ионы фтора (рисунок 1).

Пример 2. Бактерии штамма Bacillus siamensis MX3 культивировали на питательной среде Раймонда следующего состава, г/л: Na₂CO₃ - 0.1; MgSO₄ × 7 H₂O - 0.2; FeSO₄ × 7 H₂O - 0.02; CaCl₂ - 0.01; MnSO₄ × 7 H₂O - 0.02; K₂HPO₄ × 3 H₂O - 1.0; NaH₂PO₄ × 3 H₂O - 1.5; NH₄Cl - 3.0; вода дистиллированная - 1000 мл, содержащей в качестве единственного источника углерода ПФОС (1000 мг/л). Культивирование проводили при температуре 28°С в термостатируемой установке при 160 об./мин.

Оценку интенсивности роста штамма и биотрансформацию субстрата проводили в условиях примера 1.

Заявляемый штамм бактерий Bacillus siamensis MX3 способен к использованию ПФОС в качестве единственного источника углерода и энергии с полной ее утилизацией при начальной концентрации 1000 мг/л за 6 сут. Штамм бактерий Bacillus siamensis MX3 трансформирует ПФОС в отличие от прототипа более полно до перфторгексановой кислоты, высвобождая в среду свободные ионы фтора (рисунок 2).

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как среди известных микроорганизмов не обнаружен штамм, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый штамм имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены микроорганизмы, характеризующиеся одинаковой способностью осуществлять биодеградацию перфторорганических ксенобиотиков ПФОС и ПФОК.

Таким образом, штамм бактерий Bacillus siamensis MX3 способен к полной биодеградации ПФОС и ПФОК в концентрации 1000 мг/л, является более активным деструктором, чем штамм - прототип и может служить основой для получения биопрепаратов при разработке биотехнологий трансформации (утилизации) фторорганических соединений для защиты окружающей среды.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм бактерий Bacillus siamensis ВКМ B-3775D, осуществляющий биодеградацию перфтороктансульфоновой и перфтороктановой кислот. Штамм бактерий Bacillus siamensis ВКМ B-3775D обеспечивает полную биодеградацию ПФОС и ПФОК в концентрации 1000 мг/л и может быть использован для получения биопрепаратов для утилизации фторорганических соединений. 2 ил., 2 пр.

Штамм бактерий Bacillus siamensis MX3, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-3775D, осуществляющий биодеградацию перфтороктансульфоновой и перфтороктановой кислот.