ШТАММ БАКТЕРИЙ Pseudomonas mosselii, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ БИОДЕГРАДАЦИЮ ПЕРФТОРОКТАНСУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12R1/38 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно биоочистке окружающей среды от загрязнения перфтороктансульфоновой (ПФОС) кислотой с помощью бактерий, и касается нового штамма, способного эффективно разлагать устойчивое токсичное соединение – ПФОС. Данное вещество внесено в Приложение В Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязняющим (СОЗ) веществам, что предусматривает принятие мер по минимизации и, по возможности, прекращению производства и использования, с последующим уничтожением [Report of the Conference of the Parties of the Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants on the work of its fourth meeting, 4-8 May // UNEP /POPS/COP.4/38. Geneva: Stockholm Convention Secretariat, 2009. P. 66–69]. ПФОС будучи крайне устойчивой к разложению, к настоящему времени обнаруживаются во многих объектах окружающей среды и живых организмах, являясь наиболее часто детектируемым загрязнителем [Betts K. PFOS and PFOA in humans: new study links prenatal exposure to lower birth weight // Environmental Health Perspectives. - 2007. V. 115. - P. 550; Yamashita N., Kannan K., Taniyasu S., Horii Yu., Petrick G., Gamo T. A global survey of perfluorinated acids in oceans // Marine Pollution Bulletin. - 2005. V. 51. - Р. 658–668].

Известны способы разложения перфторорганических соединений - химическая переработка, сжигание при высокой температуре [Cheng J., Vecitis C.D., Park H., Mader B.T., Hoffmann M.R. Sonochemical degradation of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA) in landfill groundwater: environmental matrix effects // Environ. Sci. Technol. – 2008. V. 42. – P. 8057–8063; Wang F., Shih K., Lu X., Liu C. Mineralization behavior of fluorine inperfluorooctanesulfonate (PFOS) during thermal treatment of lime-conditioned sludge // Environ. Sci. Technol. - 2013. V. 47. – P. 2621–2627], но они являются высокозатратными.

Наиболее экологически безопасно применение способа утилизации ПФОС, основанного на её включении в естественный обмен веществ и энергии с участием микроорганизмов, способных к её разложению, минимизируя отрицательное влияние на окружающую среду.

Известно лишь единичное количество штаммов бактерий, способных к трансформации перфторкарбоновых и перфторкарбонсульфоновых кислот.

Известен штамм Pseudomonas parafulva YAB1, обладающий способностью к биодеградации перфтороктановой кислоты [Yi L.B., Chai L.Y., Xie Y., Peng Q.J., Peng Q.Z. Isolation, identification, and degradation performance of a PFOA-degrading strain // Genet. Mol. Res. 2016. V. 15. № 2: gmr. 15028043].

Недостатком данного штамма является то, что он медленно и недостаточно полно утилизирует перфтороктановую кислоту и не способен утилизировать ПФОС. Штамм Pseudomonas parafulva YAB1 утилизирует 32,2% ПФОК при ее начальной концентрации 500 мг/л.

Наиболее близким к предлагаемому штамму – прототипом, является штамм бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D, способный к биологической деградации ПФОС [Патент РФ №2644206 опубл. 14.07.2017].

Недостатком прототипа является неспособность штамма бактерий Pseudomonas plecoglossicida 2,4-D к глубокой трансформации ПФОС, он разлагает её только до перфторгептановой (перфторэнантовой) кислоты.

Целью изобретения является получение нового штамма микроорганизма, способного осуществлять эффективную биодеградацию ПФОС, расширение области применения биотехнологий для защиты окружающей среды.

Цели достигают применением штамма бактерий Pseudomonas mosselii 5(3).

Штамм бактерий Pseudomonas mosselii 5(3) выделен из образца почвы, загрязненной пестицидами (Янаульский район, Республика Башкортостан, РФ), и хранится в Коллекции микроорганизмов Уфимского Института биологии Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук.

Полученный штамм микроорганизмов депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ b-3774d и характеризуется следующими признаками.

Характеристика штамма Pseudomonas mosselii 5(3) (ВКМ b-3774d).

Клетки размером 0.6 × 1.6 мкм. Грамотрицательные, подвижные с помощью единственного полярного жгутика, аспорогенные, палочковидной формы, аэробные. Клетки продуцируют флуоресцентный пигмент на среде King B. Колонии на питательном агаре круглые с гладкой поверхностью и непигментированные. Диапазон температур для роста составляет 10-36°C; с оптимумом в диапазоне 26-30°C. Оптимальное значение рН 6,8-8,0. Не восстанавливают нитраты до нитритов. Образуются аргининдигидролаза, каталаза и цитохромоксидаза. Отрицательная реакция Фогеса–Проскауэра. Не гидролизуют лецитин и крахмал, гидролизуют желатин. Не способны расти на среде с твин-80, при концентрации 0-5% NaCl - интенсивный рост.

В качестве источников углерода использует D-рибозу, D-глюкозу, D-маннозу, D-маннит, кетоглюконат, L-гистидин, гистамин и D-сорбит. Не использует D-ксилозу, L-рамнозу, D-галактозу, малонат, D-тартрат, бензоат, L-триптофан.

Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена кодирующего 16S рРНК с известными структурами из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) позволяет с высокой долей вероятности утверждать, что микроорганизм относится к виду Pseudomonas mosselii (обнаружено 99,93% сходства с типовым штаммом вида Pseudomonas mosselii CIP 105259^T).

Предлагаемое изобретение поясняется следующим примером применения штамма Pseudomonas mosselii 5(3) (ВКМ b-3774d) для биодеградации ПФОС, устойчивого к разрушению биологическими способами.

Пример 1. Бактерии штамма Pseudomonas mosselii 5(3) культивировали на питательной среде Раймонда следующего состава, г/л: Na₂CO₃ – 0.1; MgSO₄ × 7 H₂0 – 0.2; FeSO₄ × 7 H₂O – 0.02; CaCl₂ – 0.01; MnSO₄ × 7 H₂O – 0.02; K₂HPO₄ × 3 H₂O – 1.0; NaH₂PO₄ × 3 H₂O – 1.5; NH₄Cl – 3.0; вода дистиллированная – 1000 мл, содержащей в качестве единственного источника углерода ПФОС (1000 мг/л). Культивирование проводили при температуре 28°С в термостатируемой установке при 160 об/мин.

Интенсивность роста культуры оценивали спектрофотометрически по оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 590 нм (ОП₅₉₀).

Для выделения и идентификации продуктов биотрансформации ПФОС и оценки ее концентрации в среде бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости методом ультрафильтрации на установке “Vivaflow 50” (“Sartorius AG”, Германия). Полученный ультрафильтрат (≤ 3 кДа) анализировали хромато–масс-спектрометрическим методом на жидкостном тандемном хромато-масс-спектрометре LCMS-IT-TOF (“Shimadzu”, Япония) с системой ввода образца электроспрей, квадрупольной ионной ловушкой и времяпролетным детектором. Масс-спектры регистрировали в интервале масс m/z 200–800 а.е.м. в режиме регистрации отрицательных ионов, напряжение на детекторе составляло 3.5 кВ. Для хроматографического разделения использовали колонку Shim-pak XR-ODS (75×2.0 мм) (“Shimadzu”, Япония) в изократическом режиме при соотношении растворителей 5 мM ацетат аммония в воде:ацетонитрил - 56:44 со скоростью элюирования 0.2 мл/мин. Установление структуры полученных соединений проводили по совокупности данных анализа масс-спектров, основанных на распаде молекулярного иона, и сравнения с данными литературы.

Концентрацию фторид-иона в среде измеряли методом ионной хроматографии с использованием системы ВЭЖХ LC-20 Prominence с кондуктометрическим детектором CDD-10Avp (“Shimadzu”, Япония). Ионы фтора отделяли на колонке Shodex (“Shodex”, Нью-Йорк, США) при скорости потока 1 мл/мин. В качестве элюента использовали водный раствор карбоната натрия и бикарбоната натрия: 1,8 мм Na₂CO₃ + 1,7 мм NaHCO₃. Подавление элюента после колонки осуществляли с помощью подавителя Xenoic ® XAMS в сочетании с ASUREX-A100 (“Diduco AB”, Умео, Швеция).

Заявляемый штамм бактерий Pseudomonas mosselii 5(3) способен к использованию ПФОС в качестве единственного источника углерода и энергии с полной ее утилизацией при начальной концентрации 1000 мг/л за 6 сут. Штамм бактерий Pseudomonas mosselii 5(3) трансформирует ПФОС в отличие от прототипа более полно до перфторгексановой кислоты, высвобождая в среду свободные ионы фтора (рисунок 1).

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как среди известных микроорганизмов не обнаружен штамм, которому присущи признаки, идентичные всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый штамм имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены микроорганизмы, характеризующиеся способностью осуществлять такого уровня полноты (до перфторгексановой кислоты) биодеградацию перфторорганического ксенобиотика ПФОС.

Таким образом, штамм бактерий Pseudomonas mosselii 5(3) способен к полной биодеградации ПФОС в концентрации 1000 мг/л, является более активным деструктором, чем штамм – прототип и может служить основой для получения биопрепаратов при разработке биотехнологий трансформации (утилизации) фторорганических соединений для защиты окружающей среды.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение штамма бактерий Pseudomonas mosselii ВКМ B-3774D для биодеградации перфтороктансульфоновой кислоты (ПФОС). Изобретение обеспечивает биодеградацию ПФОС с начальной концентрацией 1000 мг/л до перфторгексановой кислоты за 6 сут. 1 ил., 1 пр.

Применение штамма бактерий Pseudomonas mosselii, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-3774D, для биодеградации перфтороктансульфоновой кислоты.