Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII Российский патент 2023 года по МПК C12N7/00 A61K39/135 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур является особо опасным высококонтагиозным вирусным заболеванием, которое причиняет серьезный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства. На сегодняшний день система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает стемпинг-аут, а также массовую иммунизацию восприимчивых животных, и далее контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1].

Возбудителем является безоболочечный вирус рода Aphthovirus семейства Picornaviridae. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов вируса ящура имеют одинаковую длину около 8400-8500 и.о., кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ [2]. Вирус ящура серотипа SAT-2 имеет большую изменчивость последовательности в гене белка VP₁ по сравнению с вирусами серотипов О, А и С [2, 3], для которых он рассматривается как широкий антигенный вариант, поэтому в случае SAT-2 требуется тщательный отбор иммунодоминантного вакцинного штамма [3].

Изменчивость вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3].

Белок VP₁ является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [3, 4]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [4, 5]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательностей, хотя VP₁ значительно более вариабелен. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа. Филогенетический анализ на основе последовательности VP₁ широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [5].

Наблюдаемая генетическая вариация в геноме вируса ящура является результатом двух процессов. Во-первых, это ошибки, которые возникают в результате репликации вирусной РНК и отсутствия репарации кодируемой РНК-зависимой РНК-полимеразы. Во-вторых, конкурентный отбор, который воздействует на геном. В природной среде в результате будут преобладать изоляты новых генетических линий, которые включают в свой геном требуемые для данной среды характеристики [4, 5].

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [5]. Рекомбинации в нуклеиновой кислоте вируса ящура происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации могут привести к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые зачастую приводят к изменениям тропизма клеток. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус может приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [4, 5].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и факторов клеток-хозяев. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [5, 6].

Для выявления генетических связей между различными изолятами и штаммами обычно применяют нуклеотидное секвенирование. Следовательно, в условиях вспышки можно проследить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [4, 6].

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 14 топотипов (I-XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2.

На территории Африканского континента регистрируются вспышки ящура серотипа SAT-2. Неблагополучная эпизоотическая ситуация связана с генотипом SAT-2/VII, который распространен в странах Северной Африки, в частности, в Египте, где вспышки отмечают в период с 2012 по 2022 гг. и Либии (2012 г.). На территории Западной Африки, в частности в Камеруне (2014 г.), Нигерии (2019-2021 гг.), также распространены изоляты вируса ящура данного генотипа. Соответственно, в указанных странах проводились мероприятия по ликвидации и борьбе с ящуром указанного генотипа. При этом появляются новые представители данного генотипа, которые имеют геномные и аминокислотные замены, что приводит к появлению новых свойств. В связи с этим имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации и других стран. Степень изменчивости внутри одного топотипа VII высокая, поэтому возникает острая необходимость в изучении свойств появляющихся штаммов вируса ящура и изготовления на его основе вакцинных препаратов и диагностических тест-систем.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-2, с I по XIV.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/ВОТ/Р3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/ША/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9»1) (генотип SAT-2/XIV).

Изолят «SAT-2/Eritrea» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории государства Эритрея в 1998 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта для проведения научных исследований в 2020 г. По результатам исследований данной лаборатории современные циркулирующие изоляты в странах Африки и странах Закавказья, куда в настоящее время агрессивно проникает вирус ящура данного генотипа, близки по данным серологических и молекулярно-биологических исследований именно с изолятом «SAT-2/Eritrea» и, соответственно, штаммом «SAT-2/Eritrea/1998».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу VII серотипа SAT-2 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-2, в том числе и от штамма «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII), который широко применяется в настоящее время [1].

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа SAT-2.

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №459 - деп / 23-9 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/VII.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-2 Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура серотипа SAT-2;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура серотипа SAT-2.

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура серотипа SAT-2 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 21-22 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой и не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена, кодирующего белок VP₁, штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/VII (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/ША/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9»1) (генотип SAT-2/XIV).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение i₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/Eritrea/1998» составили r₁ от 0,01 до 0,20 а именно для штамма «SAT-2/ZIM/14/2002» - 0,05, для «SAT-2/ZIM/5/81» - 0,07, для «SAT-2/BOT/P3/98» - 0,06, для «SAT-2/ETH/1/90» - 0,01, для «SAT-2/GHA/2/90» - 0,09, для «SAT-2/GAM/8/79» - 0,08, для «SAT-2/SAU/6/2000» - 0,20, для «SAT-2/RWO/1/00» -0,17, для «SAT-2/KEN/2/84» - 0,11, для «SAT-2/UGA/19/98» - 0,13, для «SAT-2/ANG/4/74» - 0,11, для «SAT-2/UGA/51/75» - 0,12, для «SAT-2/ETH/2/2007» -0,19, для «SAT-2/ETH/2/9»1 - 0,18.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура является РНК(+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,42 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,7. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,0°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята «SAT-2/Eritrea» вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в культуре клеток и адаптацию вируса ящура к перевиваемым клеточным линиям.

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью рабочей поверхности 25 см², освобождали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре.

Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором трихлорметана. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,5°С во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100%) ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята «SAT-2/Eritrea» к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности определяли с помощью разработанной ранее методики [10].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята «SAT-2/Eritrea» вируса ящура к использованным клеточным культурам. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 24 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/СМ³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 22 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/СМ³. В итоге получен штамм «SAT-2/Eritrea/1998» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура на КРС проводили в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе 2 пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения на 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998». Титр инфекционной активности на КРС штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 4,25 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-2/Eritrea/1998» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 5,00 lg ИД₅₀ 0,1 см³.

Пример 3. Оценка биологических свойств штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт 2 пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 4,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARPJAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) при рН среды 7,5-7,7. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,100 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения цитопатического действия вируса, соответствующего 95-100%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность, а также определяли концентрацию 146S компонента (иммуногенный компонент) и общего вирусного белка (ОВБ). Концентрация ОВБ в суспензии составляла 1,91±0,31 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,11±0,14 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл. и продолжительности репродукции вируса 14,83±0,56 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 8,41±0,21 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 1,34±0,22 мкг/см³ (69,54±0,40%).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на штаммы вируса ящура «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2/SAU/6/2000», «А/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96», «SAT-3/Bech/65» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «SAT-2/Eritrea/1998», «SAT-2/SAU/6/2000», «А/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96», «SAT-3/Bech/65».

Результаты исследования отражены в таблице 3, из которой следует, что штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа SAT-2 и активен в РСК в разведении 1:32.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2022. - Ch. 3.1.8

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

4. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф... дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С.Р. Кременчугская; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель ФГБУ "ВНИИЗЖ".

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV SAT-2 Eritrea

1998_1678255673402.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-03-08">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-08</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>491</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-03-08</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса

ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для

диагностики и специфической профилактики ящура генотипа

SAT-2/VII</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>648</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..648</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctcggcgggagaaggcgcggatgtcgtcaccacggacccgtcta

cacacggcgggaacgtgcaagagggccgacgcaagcacactgaagtcgccttccttcttgaccgcagtac

acatgtccacacaaacaaaacatcattcgttgtggacctcatggacacaaagggaaaagcactcgtaggt

gcgatcctgcgggcttccacttactacttttgtgaccttgagattgcatgtgtgggtgaccacactaggg

tcttttggcagcctaacggggcgccgcggactacccaacttggtgacaaccccatggtttacgccaaggg

cggtgtgacccgctttgctatcccgttcacggccccacacaggctgctgtccactgtctacaatggcgag

tgcacctacgcaaaaaccgccaccgccattcgtggagaccgcgcagcactcgcggcgaagtacgctgcca

gcgtgcacactctaccgcaaaccttcaacttcgggttcgtgaccgtcgacaaaccagtcgatgtttacta

ccggatgaagagggctgagttgtactgtccacgcccactgctgccagcctacgaccacgcaagcagagac

agattcgacgcgcccattggcgtcgaaaggcagaccctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>216</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..216</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTTDPSTHGGNVQEGRRKHTEVAFLLDRSTHVHTNKTSF

VVDLMDTKGKALVGAILRASTYYFCDLEIACVGDHTRVFWQPNGAPRTTQLGDNPMVYAKGGVTRFAIPF

TAPHRLLSTVYNGECTYAKTATAIRGDRAALAAKYAASVHTLPQTFNFGFVTVDKPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYDHASRDRFDAPIGVERQTL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен новый штамм вируса ящура Aphtae epizooticae под регистрационным номером №459 - деп / 23-9 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изобретение может быть использовано для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 3 табл., 5 пр.

Штамм «SAT-2/Eritrea/1998» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/VII семейства Picornaviridae рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №459 - деп / 23-9 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII.