СПОСОБ ОЦЕНКИ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ ПО КОНЦЕНТРАЦИИ L-КАРНИТИНА В СПЕРМОПЛАЗМЕ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к области животноводства, в частности к коневодству и может быть использовано для отбора жеребцов с высоким качеством спермы.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Между процессами образования активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантной системой защиты в организме поддерживается равновесие, нарушение которого приводит к окислительному стрессу. Одним из антиоксидантов, которые защищают клетки, в том числе сперматозоиды, от окислительного стресса, является L-карнитин. Формы L-карнитина в высоких концентрациях найдены в эпидидимисе, где они выступают в качестве антиокислителей, защищая сперматозоиды от действия АФК (Оценка влияния L-карнитина на репродуктивную функцию мужчин с идиопатической патоспермией / В.Н. Павлов, Э.Ф. Галимова, К.С. Мочалов, И.В. Петрова, Ю.Л. Баймурзина, P.M. Зарипова, Ш.Н. Галимов // Медицинский вестник Башкортостана. 2012. Т. 7, №4. С. 36-40).

Ближайшим аналогом (прототипом) заявляемого способа является способ оценки качества спермы жеребцов по уровню активности супероксиддисмутазы в спермоплазме (Пат. 2783975 Российская Федерация, МПК G01N 33/50 Способ оценки качества спермы жеребцов по уровню активности супероксиддисмутазы в спермоплазме / А.И. Романова, М.М. Атрощенко, A.M. Шитикова, М.Г. Енгалычева, О.В. Широкова, Н.А. Фролова; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства". - №2021128712; заявл. 30.09.2021; опубл. 21.04.2022, Бюл. №12), включающий отбор образцов спермы, получение спермоплазмы, определение в ней уровня активности супероксиддисмутазы. При уровне активности супероксиддисмутазы в спермоплазме выше 47 ЕД/мл жеребца относят к группе животных с высоким качеством спермы, а при уровне активности супероксиддисмутазы в спермоплазме ниже 47 ЕД/мл, соответственно, к группе с низким качеством спермы. Изобретение позволяет оценить качество спермы, не затрачивая время на оценку семени по его показателям.

Недостатком этого способа является то, что он не дает возможности оценить качество спермы жеребцов по концентрации L-карнитина в спермоплазме, так как влияние этого показателя на криоустойчивость спермы неизвестно.

Мы поставили задачу количественно оценить значение предельно допустимой концентрации (ПДК) L-карнитина в спермоплазме жеребцов, что позволит оценить криоустойчивость спермы.

Предлагаемый нами способ оценки спермы жеребцов с высокой криоустойчивостью в зависимости от концентрации L-карнитина в спермоплазме позволит оценить это качество, не прибегая к оценке самой спермы. Другими словами, мы сможем оценить некоторые качества спермы, не затрачивая время на оценку семени по его показателям.

Следовательно, заявленный нами способ соответствует условию патентоспособности изобретения «новизна». Изобретение является применимым, так как оно может быть использовано в коневодстве для отбора жеребцов с высокой криоустойчивостью спермы по концентрации L-карнитина в спермоплазме.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Образцы спермы, предназначенной для исследования (n равно 21), отбирают, используя ранее разработанную методику (Науменкова В.А. Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов / Дивово: «Изд-во «ВНИИ коневодства», 2006. 23 с.) (далее - Рекомендации). После получения спермы, каждый эякулят оценивают по следующим показателям: объем эякулята, общее количество сперматозоидов в эякуляте, их прогрессивную подвижность (ПП) после оттаивания. Для разбавления спермы используют лактозо-хелато-цитратно-желточную (ЛХЦЖ) среду в объемном соотношении 1:3 (Инструкция по искусственному осеменению и трансплантации эмбрионов лошадей. - Дивово, 2012. - 72 с.).

Замораживание спермы проводят в парах жидкого азота по технологии, разработанной ФГБНУ «ВНИИ коневодства» (Рекомендации). Хранят замороженную сперму в жидком азоте при температуре -196°С. Оттаивание криоконсервированной спермы проводят на водяной бане при температуре 40°С в течение 60 секунд. После оттаивания криоконсервированной спермы определяют прогрессивную подвижность сперматозоидов при температуре (Т) 2-4°С.

Для получения спермоплазмы часть эякулята сразу же после получения спермы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин с помощью центрифуги ELMI СМ-6М (SIA ELMI, Латвия). Концентрация L-карнитина в спермоплазме была определена при помощи анализатора StatFax 3200 IE (Awareness Technology Inc., США).

На основании полученных результатов, согласно ранее разработанным рекомендациям (Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / М.: Медицина, 2002. 544 с), была рассчитана ПДК L-карнитина в спермоплазме жеребцов в границах 50 процента для репрезентативной выборки: ПДК L-карнитина оказалась равна 103 мкмоль/л.

Затем мы распределили животных по двум группам в зависимости от концентрации L-карнитина в спермоплазме каждого. В первой группе оказались жеребцы со значением концентрации L-карнитина в спермоплазме выше 103 мкмоль/л, во второй группе, соответственно, ниже 103 мкмоль/л.

Как видно из полученных данных, жеребцы с концентрацией L-карнитина в спермоплазме выше 103 мкмоль/л превосходят по прогрессивной подвижности сперматозоидов в криоконсервированной сперме на 74,07% аналогов из группы с меньшим значением данного показателя (Р не больше 0,01).

При этом мы учли выводы Рекомендаций, где указаны требования к качеству спермы жеребцов: прогрессивная подвижность сперматозоидов в криоконсервированной сперме должна быть не менее 2,5 балла, что в переводе на проценты означает 25%. Следовательно, сперму, в которой показатель прогрессивной подвижности сперматозоидов равен этому значению или больше его, можно смело относить к группе с высокой криоустойчивостью.

Сам собой напрашивается вывод: на основании результатов эксперимента можно сделать следующее заключение - при концентрации L-карнитина в спермоплазме выше 103 мкмоль/л, отмечается высокий уровень прогрессивной подвижности сперматозоидов в криоконсервированной сперме, т.е. сперма является качественной. В связи с этим, предложенный способ является достоверным.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применимость предлагаемого способа была проверена на жеребцах Терского племенного конного завода №169 Ставропольского края и экспериментальной конюшне Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства" (поселок Дивово).

Отобранные образцы спермы жеребцов оценивали по следующим показателям: объем эякулята, общее количество сперматозоидов в эякуляте, их прогрессивная подвижность после оттаивания. Для получения спермоплазмы часть эякулята сразу же после получения спермы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин с помощью центрифуги ELMI СМ-6М (SIA ELMI, Латвия). Концентрацию L-карнитина в спермоплазме каждого жеребца определяли на анализаторе StatFax 3200 IE (Awareness Technology Inc., США).

Вывод: при концентрации L-карнитина в спермоплазме выше 103 мкмоль/л жеребца следует относить к группе с высокой криоустойчивостью спермы, а при концентрации L-карнитина в спермоплазме ниже 103 мкмоль/л, соответственно, к группе с низкой.

Таким образом, при практическом использовании предлагаемого способа, для определения криоустойчивости спермы жеребцов, не нужно знать прогрессивную подвижность сперматозоидов в криоконсервированной сперме, а достаточно знать концентрацию L-карнитина в спермоплазме.

Изобретение относится к животноводству, в частности к коневодству. В спермоплазме определяют концентрацию L-карнитина, и при концентрации L-карнитина выше 103 мкмоль/л жеребца относят к группе с высокой криоустойчивостью спермы. При концентрации L-карнитина ниже 103 мкмоль/л - к группе с низкой криоустойчивостью спермы. Способ позволяет отбирать жеребцов с высокой криоустойчивостью спермы. 2 табл.

Способ оценки криоустойчивости спермы жеребцов, включающий определение показателя спермоплазмы животного, отличающийся тем, что в спермоплазме определяют концентрацию L-карнитина, и при концентрации L-карнитина выше 103 мкмоль/л жеребца относят к группе с высокой криоустойчивостью спермы, при концентрации L-карнитина ниже 103 мкмоль/л - к группе с низкой криоустойчивостью спермы.