Способ получения биологического рецепторного элемента для экспресс-определения биохимического потребления кислорода Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12M1/00 C12Q1/02 G01N33/18 

[01] Область техники

[02] Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биокатализаторам на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов в матрицу синтетического носителя и может быть использовано в сочетании с приборами для определения биохимического потребления кислорода (БПК), например с анализатором жидкости «ЭКСПЕРТ-009».

[03] Уровень техники

[04] Разработки последнего десятилетия в области биорецепторных элементов направлены на получение методик формирования гибридных структур, в которых живые клетки окружены синтетическими защитными оболочками, в частности из неорганических материалов, например, из оксида кремния. Достоинствами оксида кремния как материала, окружающего клетку, является инертность, пористость, мягкие условия получения. Такие искусственные структуры имитируют природные одноклеточные микроорганизмы - диатомовые водоросли, которые формируют защитный силикатный экзоскелет.

[05] Одним из подходов для создания искусственной силикатной оболочки вокруг клеток является применение методов золь-гель технологий. Для направленного регулирования характеристик кремнеземных материалов предложено использовать гидрофильные полимеры, в частности, поливиниловый спирт (ПВС), который способен формировать гидрогели, участвовать в золь-гель процессах образования силикатных и органосиликатных материалов и, как следствие, влиять на архитектуру конечного материала [Грибанов И.А., Лаврова Д.Г., Алферов В.А. Инкапсулированные в органосиликатные матрицы дрожжи как биокатализаторы при разработке биофильтров // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2022. - №. 1. - С. 3-8.].

[06] Известна композиция на основе тетраметоксисилана и клеток Escherichia coli, которая используется для формирования биорецепторных элементов в люминесцентных биосенсорах [Е. Sagi, N. Never, R. Rosen, A.J. Bartolome, J.R. Premkumar, R. Ulber, O. Lev, T. Scheper, S. Belkin. Fluorescence and bioluminescence reporter functions in genetically modified bacterial sensor strains. // Sensors and Actuators 90, p. 2-8, 2003]. Активность иммобилизованной таким образом биомассы существенно снижается по сравнению с активностью не иммобилизованных клеток, что связано с отсутствием структурообразующего агента в процессе получения такой матрицы. Сенсоры на основе клеток, иммобилизованных в такую матрицу, не обладают стабильным аналитическим сигналом и имеют узкий диапазон определяемых концентраций.

[07] Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ получения кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах, раскрытый в патенте РФ на изобретение RU 2492236, 10.09.2013. Композиция матрицы состоит из 20%-ного раствора полиэтиленгликоля в фосфатном буферном растворе, тетраэтоксисилана и 0,2 моль/дм³ раствора катализатора NaF, гидрофобной добавки метилтриэтоксисилана, при этом компоненты взяты в объемном соотношении ПЭГ:ТЭС:МТЭС:NaF 4:(18-3,4):(2-16,6):1. Для приготовления такой кремнийорганической матрицы и иммобилизации микроорганизмов (с последующим использованием в биосенсорных анализаторах) в микропробирку отбирают 0,1 мл 20% раствора полиэтиленгликоля в фосфатном буферном растворе (рН=6,8) и добавляют в него 0,25 мл суспензии клеток микроорганизмов дрожжей Pichia angusta в фосфатном буферном растворе с концентрацией 150 мг/см³, перемешивают смесь в течение 3 мин, затем добавляют 0-0,45 мл тетраэтоксисилана и 0,05-0,5 мл метилтриэтоксисилана, после чего перемешивают смесь в течение 3 мин. Затем вносят 0,025 мл-0,2 моль/дм³ раствора NaF, перемешивают в течение 15 мин. Полученный гель (10 мкл) переносили на стекловолоконный фильтр подсушивали в течение 5 минут при комнатной температуре на воздухе. Подготовленный биорецепторный элемент помещали под колпачок кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.

[08] Основной недостаток такого способа получения биорецепторного элемента заключается во внесении основного катализатора NaF в микропробирку на этапе получении геля, что приводит к длительному перемешиванию компонентов (15 мин) и в последствии требует дополнительного времени на высыхание геля, нанесенного из автоматической пипетки. Такие композиции изделия обладают хрупкостью из-за использования в качестве подложки стекловолоконного фильтра и невозможностью хранения биорецепторного элемента в готовом виде отдельно от датчика, и как следствие невозможность транспортировки, например для проведения полевых исследований.

[09] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено заявленное изобретение, являются увеличенные затраты времени на изготовление биорецепторных элементов, а также их низкие прочностные характеристики.

[010] Раскрытие сущности изобретения

[011] Техническим результатом изобретения является снижение временных затрат и повышение производительности изготовления биологического рецепторного элемента, снижение хрупкости элемента, а также увеличение его долговременной стабильности и срока хранения отдельно от датчика.

[012] Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения биологического рецепторного элемента на основе микроорганизмов, иммобилизованных в ксерогель матрицу, включает последовательное смешивание биомассы микроорганизмов с фосфатным буферным раствором, тетраэтоксисиланом и поливиниловым спиртом с получением суспензии, содержащей микроорганизмы. При этом используют подложку на основе нитроцеллюлозы, которую предварительно смачивают раствором NaF, затем пропускают через подложку полученную суспензию, содержащую микроорганизмы, а после иммобилизации микроорганизмов полученную матрицу высушивают и разрезают на фрагменты.

[013] Указанный технический результат достигается также в частных формах реализации изобретения за счет того, что:

[014] - используют буферный раствор с рН=6,8, содержащий 3 mM KH₂PO₄+33 mМ Na₂HPO₄, и в количестве, обеспечивающем титр клеток 150 мг/см³;

[015] - тетраэтоксисилан вводят в суспензию в объемном соотношении 1:1;

[016] - поливиниловый спирт вводят в суспензию в соотношении суспензия/спирт 75:25 об.%;

[017] - используют 5-10%-ный раствор NaF.

[018] - суспензию, содержащую микроорганизмы, пропускают через подложку в количестве 5-10 мл;

[019] - используют микроорганизмы Paracoccus yeei.

[020] Используемая в заявленном изобретении нитроцеллюлозная подложка, лишена недостатков стекловолоконного фильтра, применяемого в ближайшем аналоге. Она обладает улучшенными прочностными характеристиками (пониженной хрупкостью) и позволяет производить сразу нескольких готовых к использованию или хранению биорецепторных элементов, что повышает производительность изготовления элементов и срок их хранения отдельно от датчика. При этом нитроцеллюлозная подложка в сочетании с составом для получения матрицы обеспечивает улучшенную долговременную стабильность элементов. Кроме того, применение подложки, предварительно смоченной катализатором (фторид натрия, NaF), позволяет значительно сократить время на перемешивание композиции.

[021] Краткое описание чертежей

[022] Изобретение поясняется чертежами, где:

на фигуре 1 показана схема биорецепторного элемента на основе микроорганизмов, иммобилизованных в ксерогель матрицу на нитроцеллюлозной подложке,

на фигуре 2 показана схема способа получения биорецепторного элемента [023] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 - нитроцеллюлозная подложка,

2 - иммобилизованные микроорганизмы в матрицу, получаемую в результате золь-гель синтеза.

[024] Осуществление изобретения

[025] Способ получения биорецепторного элемента реализуется следующим образом. К биомассе микроорганизмов, в частности, Paracoccus yeei, добавляют калий-натрий фосфатный буферный раствор с рН=6,8, содержащий 33 mМ (ммоль/дм³) KH₂PO₄ и 33 mМ Na₂HPO₄. Буфер вводят таким образом, чтобы титр клеток составлял 150 мг/дм³. Полученную смесь перемешивают с использованием магнитной мешалки в течение 5 минут. К получившейся суспензии добавляют равный объем (1:1) тетраэтоксисилана (ТЭОС) и затем поливиниловый спирт (ПВС) в соотношении суспензия/ПВС 75:25 об.%.

[026] Подложку на основе нитроцеллюлозы предварительно смачивают в 5-10%-ном растворе катализатора (NaF) и помещают в пластиковое устройство для фильтрации. Пластиковый шприц объемом 5-10 см³ заполняют суспензией (золем), содержащей микроорганизмы, которую пропускают через подложку. После формирования геля и иммобилизации микроорганизмов элемент извлекают, высушивают и разрезают на фрагменты заданного размера для получения готовых биорецепторных элементов. Полученные матрицы хранят в пробирках типа «Эппендорф» при температуре от -20°С до +5°С.

[027] Таким образом, получаемый продукт имеет две составляющие: микроорганизмы (2), иммобилизованные в ксерогель матрицу, и нитроцеллюлозную подложку (1) (см. фиг. 1). В процессе работы нитроцеллюлозная подложка не размокает, а ксерогель матрица успешно защищает микроорганизмы от действия тяжелых металлов и ультрафиолета.

[028] В таблице представлены характеристики биорецепторных элементов, полученных согласно способам по ближайшему аналогу и по заявленному изобретению.

[029]

[030] Относительное стандартное отклонение серии 15 последовательных аналитических сигналов было улучшено с 0,6% до 0,4% за счет использования микроорганизмов, выделенных из активного ила. Увеличена долговременная стабильность с 27 суток (ближайший аналог) до 30 суток. Кроме того, заявляемый биорецепторный элемент позволяет измерять широкий диапазон определяемых концентраций БПК5 (от 0,5 до 35 мгО₂/дм³). Временные затраты на изготовление таких биорецепторных элементов снижены на 25-30 минут, за счет предварительного смачивания подложки катализатором и пропускании золя через нее.

[031] Данные биорецепторные элементы могут использоваться для экспресс-анализа БПК-датчиками и совместимы с биосенсорами первого поколения.

[032] Несмотря на то, что изобретение иллюстрировано на примере микроорганизмов Paracoccus yeei, оно может успешно применяться и при использовании других микроорганизмов, поскольку их тип не оказывает существенного влияния на производительность изготовления, механические свойства и стабильность биорецепторных элементов. Так, могут применяться, например, микроорганизмы Debaryomyces hansenii, Blastobotrys adeninivorans.

[033] Приведенные концентрации и характеристики компонентов формирующие ксерогель матрицу, также могут варьироваться с учетом знаний специалиста в данной области техники, что не будет оказывать негативного влияния на достижение технического результата.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения биологического рецепторного элемента на основе микроорганизмов, иммобилизованных в ксерогель матрицу. Указанный способ включает последовательное смешивание биомассы микроорганизмов с фосфатным буферным раствором, тетраэтоксисиланом и поливиниловым спиртом с получением суспензии, содержащей микроорганизмы, а затем полученную суспензию пропускают через подложку на основе нитроцеллюлозы, предварительно смоченную NaF, и после иммобилизации микроорганизмов полученную матрицу высушивают и разрезают на фрагменты. Настоящее изобретение обеспечивает повышение производительности изготовления биологического рецепторного элемента, снижение хрупкости элемента, а также увеличение его долговременной стабильности и срока хранения отдельно от датчика. 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ получения биологического рецепторного элемента на основе микроорганизмов, иммобилизованных в ксерогель матрицу, включающий последовательное смешивание биомассы микроорганизмов с фосфатным буферным раствором, тетраэтоксисиланом и поливиниловым спиртом с получением суспензии, содержащей микроорганизмы, отличающийся тем, что используют подложку на основе нитроцеллюлозы, которую предварительно смачивают раствором NaF, затем пропускают через подложку полученную суспензию, содержащую микроорганизмы, и после иммобилизации микроорганизмов полученную матрицу высушивают и разрезают на фрагменты.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют буферный раствор с pH=6,8, содержащий 3 mM KH₂PO₄ + 33 mM Na₂HPO₄, и в количестве, обеспечивающем титр клеток 150 мг/см³.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что тетраэтоксисилан вводят в суспензию в объемном соотношении 1:1.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что поливиниловый спирт вводят в суспензию в соотношении суспензия/спирт 75:25 об.%.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют 5-10%-ный раствор NaF.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что суспензию, содержащую микроорганизмы, пропускают через подложку в количестве 5-10 мл.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют микроорганизмы Paracoccus yeei.