Штамм Arthrobacter halodurans ВКМ Ac-2997 биорецепторный элемент биосенсора для определения биохимического потребления кислорода Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12M1/00 C12Q1/02 G01N33/18 

[01] Область техники

[02] Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новому штамму Arthrobacter halodurans, используемому в качестве биорецепторного элемента для определения биохимического потребления кислорода (БПК), в частности для экспресс-анализа БПК₅ с целью оценки загрязненности водного объекта.

[03] Уровень техники

[04] Наиболее близким аналогом изобретения является штамм Arthrobacter halodurans JSM 078085^T (Chen Y.G. et al. Arthrobacter halodurans sp. nov., a new halotolerant bacterium isolated from sea water // Antonie van Leeuwenhoek. 2009. T. 96. C. 63-70), выделенный из морской воды, собранной в Южно-Китайском море. Однако в настоящее время не описано использование данного штамма для анализа загрязненности водных объектов.

[05] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено заявленное изобретение, является обеспечение возможности применения штамма Arthrobacter halodurans в БПК-сенсорах для анализа загрязненности водных объектов.

[06] Раскрытие сущности изобретения

[07] Техническим результатом изобретения является расширение возможности применения штамма Arthrobacter halodurans в части анализа загрязненности воды, повышение операционной стабильности биосенсора и расширение диапазона определяемых концентраций.

[08] Для решения поставленной технической проблемы и достижения указанного технического результата предлагается штамм Arthrobacter halodurans ВКМ Ас-2997 как биорецепторный элемент биосенсора для определения биохимического потребления кислорода.

[09] Краткое описание чертежей

[010] Изобретение поясняется чертежом, где показан градуировочный график зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозо-глутаматной смеси, пересчитанной на БПК5.

[011] Осуществление изобретения

[012] Полученный штамм Arthrobacter halodurans депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ Ас-2997.

[013] Штамм Arthrobacter halodurans ВКМ Ас-2997 характеризуется следующими признаками.

[014] Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует желтые, гладкие, блестящие, выпуклые, круглые колонии. В жидкой питательной среде со встряхиванием образует гомогенную муть. По морфологии клетки являются кокками размером 0,5-1 мкм в диаметре. Спор не образуют. Грамположительные.

[015] Физиолого-биохимические признаки. Аэробы. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Растут при температуре от 25 до 30°С, при рН от 6,6 до 7,0. Устойчивы к содержанию NaCl до 10%.

[016] Штамм выделен из активного ила очистных сооружений Тульской области. Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств, а также с помощью секвенирования гена 16S рРНК и определителю бактерий Берджи.

[018] Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в питательной среде ЛБ (твердая агаризованная / жидкая).

[019] Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10. Культивирование проводят при 28°C с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.

[020] Изобретение иллюстрируется примерами конкретной реализации.

[021] Выращивание штамма

[022] Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин при 25°С.

[023] Создание биорецепторного элемента

[024] К биомассе микроорганизмов Arthrobacter halodurans ВКМ Ас-2997 добавляют калий-натрий фосфатный буфер с рН=6,8, таким образом, чтобы титр клеток составлял 150 мг/см³. Полученную смесь перемешивают в магнитной мешалке в течение 5 минут. К суспензии микроорганизмов добавляют равный объем тетраэтоксисилана и в полученную смесь вносят поливиниловый спирт в соотношении 75:25 об.%. Подложку на основе нитроцеллюлозы предварительно смачивают в 5-10% растворе NaF и помещают в пластиковое устройство для фильтрации, после чего пластиковый шприц объемом 5-10 см³ заполняют смесью, содержащей микроорганизмы и данную смесь пропускают через подложку. После иммобилизации микроорганизмов биорецепторный элемент извлекают, высушивают и разрезают. Все полученные матрицы хранят в пробирках типа «Эппендорф» при температуре от -20°С до +5°С.

[025] Анализ загрязненности водных объектов с помощью БПК-биосенсора

[026] Для определения индекса БПК₅ используется стационарный прибор. Конструкция прибора предусматривает применение модифицированных микробных электродов и микроорганизмов различного типа. В качестве растворов для калибровки БПК-датчика используют ГСО (государственный стандарный образец) состава ХПК (химической потребление кислорода) и БПК либо смеси органических соединений (синтетические сточные воды).

[027] Для количественного определения индекса БПК(показателя окисления за пять суток) в пробе применяют метод абсолютной градуировки, для этого строят зависимость ответа биорецептора от концентрации субстрата.

[028] Различные объемы глюкозо-глутаматной смеси (ГГС) вносят в кювету с 4 мл калий-натрий фосфатного буферного раствора (рН=6,8). За ответ сенсора принимают уменьшение уровня кислорода в кювете. Далее строят градуировочный график (см. чертеж) зависимости ответа сенсора от концентрации ГГС, пересчитанной на БПК₅ по уравнению:

[029] БПК=0,68 * С(ГТС),

[030] где С(ГГС) - концентрация ГГС в кювете; 0,68 - коэффициент пересчета.

[031] Затем в кювету вносят образец исследуемой воды и регистрируют ответ сенсора. По градуировочной прямой рассчитывают концентрацию БПК в образце.

[032] Полученный биорецепторный элемент характеризуется следующими параметрами, показанными в таблице 1.

[034] Таким образом, получен штамм Arthrobacter halodurans ВКМ Ас-2997, который может использоваться в качестве биорецепторного элемента для экспресс-анализа загрязненности водных объектов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штамму Arthrobacter halodurans ВКМ Ac-2997. Указанный штамм предназначен для получения биорецепторного элемента биосенсора для определения биохимического потребления кислорода. Изобретение обеспечивает применение штамма Arthrobacter halodurans для анализа загрязненности воды, повышение операционной стабильности биосенсора и расширение диапазона определяемых концентраций. 1 ил., 1 табл.

Штамм Arthrobacter halodurans ВКМ Ac-2997 для получения биорецепторного элемента биосенсора для определения биохимического потребления кислорода.