Штамм Rhodococcus fascians ВКМ Ac-2996 биорецепторный элемент биосенсора для определения биохимического потребления кислорода Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 C12M1/00 C12Q1/02 G01N33/18 

[01] Область техники

[02] Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к новому штамму Rhodococcus fascians, используемому в качестве биорецепторного элемента для определения биохимического потребления кислорода (БПК), в частности для экспресс-анализа БПК₅ с целью оценки загрязненности водного объекта.

[03] Уровень техники

[04] Известен штамм Rhodococcus fascians 4-Г депонированный под номером RCAM01140 (патент РФ RU 2489483, 10.08.2013). Штамм применяется для очистки загрязненных нефтью почв. При этом возможность его применения в качестве биорецепторного элемента для анализа загрязненности воды не исследована.

[05] Наиболее близким аналогом изобретения является штамм Rhodococcus fascians LMG 3623 (Khilyas I.V. et al. Genomic and metabolomic profiling of endolithic Rhodococcus fascians strain S11 isolated from an arid serpentine environment //Archives of Microbiology. - 2022. - T. 204. - №.6. - С. 336), выделенный из выветренной змеевидной породы засушливого Халиловского массива, Россия. Штамм рассматривается как инструмент для исследований органоминеральных взаимодействий и биоремедиации тяжелых металлов. Однако в настоящее время также не описано использование данного штамма для анализа загрязненности водных объектов.

[06] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлено заявленное изобретение является обеспечение возможности применения штамма Rhodococcus fascians в БПК-сенсорах для анализа загрязненности водных объектов.

[07] Раскрытие сущности изобретения

[08] Техническим результатом изобретения является расширение возможности применения штамма Rhodococcus fascians в части анализа загрязненности воды, повышение операционной стабильности биосенсора и расширение диапазона определяемых концентраций.

[09] Для решения поставленной технической проблемы и достижения указанного технического результата предлагается штамм Rhodococcus fascians ВКМ Ас-2996 как биорецепторный элемент биосенсора для определения биохимического потребления кислорода.

[010] Краткое описание чертежей

[011] Изобретение поясняется фигурой, где показан градуировочный график зависимости ответа биосенсора от концентрации глюкозо-глутаматной смеси, пересчитанной на БПК5.

[012] Осуществление изобретения

[013] Штамм Rhodococcus fascians депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ Ас-2996.

[014] Штамм Rhodococcus fascians ВКМ Ас-2996 характеризуется следующими признаками.

[015] Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует желтые, гладкие, блестящие, выпуклые, круглые колонии. В жидкой питательной среде со встряхиванием образует гомогенную муть. По морфологии клетки являются палочками размером 2,5-3 мкм. Спор не образуют. Грамположительные.

[016] Физиолого-биохимические признаки. Аэробы. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Растут при температуре от 25 до 30°С, при рН от 6,6 до 7,0. Устойчивы к содержанию NaCl до 5%.

[017] Предлагаемый штамм выделен из активного ила очистных сооружений Тульской области. Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств, а также с помощью секвенирования гена 16S рРНК и определителю бактерий Берджи.

[019] Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в питательной среде ЛБ (твердая агаризованная / жидкая).

[020] Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10. Культивирование проводят при 28°C с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.

[021] Изобретение иллюстрируется примерами конкретной реализации.

[022] Выращивание штамма

[023] Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 10000 об/мин при 25°С.

[024] Создание биорецепторного элемента

[025] К биомассе микроорганизмов Rhodococcus fascians ВКМ Ас-2996 добавляют калий-натрий фосфатный буфер с рН=6,8, таким образом, чтобы титр клеток составлял 150 мг/см³. Полученную смесь перемешивают в магнитной мешалке в течение 5 минут. К суспензии микроорганизмов добавляют равный объем тетраэтоксисилана. В полученную смесь вносят поливиниловый спирт в соотношении 75:25 об.%. Подложку на основе нитроцеллюлозы предварительно смачивают в 5-10% растворе NaF и помещают в пластиковое устройство для фильтрации, после чего пластиковый шприц объемом 5-10 см³ заполняют смесью, содержащей микроорганизмы и данную смесь пропускают через подложку. После иммобилизации микроорганизмов биорецепторный элемент извлекают, высушивают и разрезают. Все полученные матрицы хранят в пробирках типа «Эппендорф» при температуре от -20°С до +5°С.

[026] Анализ загрязненности водных объектов с помощью БПК-биосенсора

[027] Для определения индекса БПК₅ (показателя окисления за пять суток) используют стационарный прибор. Конструкция прибора предусматривает применение модифицированных микробных электродов и микроорганизмов различного типа. В качестве растворов для калибровки БПК-датчика используют ГСО (государственный стандартный образец) состава ХПК (химическое потребление кислорода) и БПК или смеси органических соединений (синтетические сточные воды).

[028] Для количественного определения индекса БПК в пробе применяют метод абсолютной градуировки, для этого строят зависимость ответа биорецептора от концентрации субстрата.

[029] Различные объемы глюкозо-глутаматной смеси (ГГС) вносят в кювету с 4 мл калий-натрий фосфатного буферного раствора (рН=6,8). За ответ сенсора принимают уменьшение уровня кислорода в кювете. Далее строят градуировочный график (см. фиг.) зависимости ответа сенсора от концентрации ГГС, пересчитанной на БПК5 по уравнению:

[030] БПК=0,68 * С(ГГС),

[031] где С(ГГС) - концентрация ГГС в кювете; 0,68 - коэффициент пересчета.

[032] Затем в кювету вносят образец исследуемой воды и регистрируют ответ сенсора. По градуировочной прямой рассчитывают концентрацию БПК в образце.

[033] Полученный биорецепторный элемент характеризуется параметрами, показанными в таблице 1.

[035] Таким образом, получен штамм Rhodococcus fascians ВКМ Ас-2996, который может успешно использоваться в качестве биорецепторного элемента для экспресс-анализа загрязненности водных объектов.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к штамму Rhodococcus fascians ВКМ Ac-2996. Указанный штамм предназначен для получения биорецепторного элемента биосенсора для определения биохимического потребления кислорода. Изобретение обеспечивает применение штамма Rhodococcus fascians для анализа загрязненности воды, повышение операционной стабильности биосенсора и расширение диапазона определяемых концентраций. 1 ил., 1 табл.

Штамм Rhodococcus fascians ВКМ Ac-2996 для получения биорецепторного элемента биосенсора для определения биохимического потребления кислорода.