Композиция для получения органосиликатной золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов при создании гетерогенных биокатализаторов Российский патент 2023 года по МПК C12N11/98 C12Q1/02 

Техническое решение относится к биотехнологии, а именно к системам на основе микроорганизмов, иммобилизованных в матрицу синтетического носителя.

Известна золь-гель матрица на основе тетраметоксисилана для иммобилизации клеток Escherichia coli, которая используется для формирования биорецепторных элементов в люминесцентных биосенсорах [Е. Sagi, N. Hever, R. Rosen, A.J. Bartolome, J.R. Premkumar, R. Ulber, O. Lev, T. Scheper, S. Belkin. Fluorescence and bioluminescence reporter functions in genetically modified bacterial sensor strains. // Sensors and Actuators 90, p. 2-8, 2003]. Процесс приготовления золь-гель матрицы по описанному способу является трудозатратным, требует ультразвуковой обработки, что негативно сказывается на живых клетках микроорганизмов. Активность иммобилизованной таким образом биомассы существенно снижается по сравнению с активностью неиммобилизованных клеток, что связано с негативным воздействием компонентов матрицы на ферментные системы микроорганизмов. Биосенсоры на основе клеток, иммобилизованных в такую золь-гель матрицу, не обладают высокой чувствительностью и стабильностью.

Наиболее близкой по своим признакам, принятой за прототип, является композиция для получения органосиликатной золь-гель матрицы на основе тетраэтоксисилана (ТЭОС), метилтриэтоксисилана (МТЭС) и полиэтиленгликоля (ПЭГ). [Патент РФ на изобретение №2492236 от 5.06.2012. Опубликовано: 10.09.2013, Бюл. №25]. Для включения микроорганизмов Pichia angusta ВКМ Y-2559 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Пущино) в такую матрицу использовали следующий порядок смешивания прекурсоров: в микропробирку отбирали 0,1 мл 20% раствора полиэтиленгликоля (с молярной массой 3000) в фосфатном буферном растворе (рН=6,8) и добавляли в него 0,25 мл суспензии клеток микроорганизмов дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2559 в фосфатном буферном растворе с концентрацией 150 мг/см³, перемешивали смесь в течение 3 мин, затем добавляли 0 - 0,45 мл тетраэтоксисилана и 0,05-0,5 мл метилтриэтоксисилана (в заданном соотношении), после чего перемешивали смесь в течение 3 мин. Вносили 0,025 мл 0,2 моль/дм³ раствора NaF, перемешивали в течение 15 мин. Полученный гель переносили на стекловолоконный фильтр Whatman GF/A подсушивали в течение 5 минут при комнатной температуре на воздухе. Подготовленный биорецепторный элемент помещали под колпачок кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.

Недостатком полученной кремнийорганической золь-гель матрицы является ее невысокая механическая прочность и, как следствие, недостаточная долговременная стабильность биорецепторных элементов биосенсора на основе. Значительная полярность кремнийсодержащей матрицы на основе тетраэтоксисилана приводит к значительному воздействию матрицы на ферментные системы микроорганизмов, что приводит к падению активности клеток и, как следствие, к уменьшению чувствительности биосенсора. Поскольку гидролиз и поликонденсация тетраэтоксисилана проходит по всем четырем силоксановым связям, то формируется жесткая матрица, которая снижает активность иммобилизованного биоматериала. Использование силанового прекурсора с несколькими связями, которые не подвергаются гидролизу позволят увеличить активность иммобилизованного биоматериала за счет создания более гибкой структуры.

Задачей технического решения является повышение стабильности гетерогенного биокатализатора, путем получения органосиликатной золь-гель матрицы на основе тетраэтоксисилана и диметилдиэтоксисилана (ДМДЭС) и поливинилового спирта (ПВС) для иммобилизации клеток микроорганизмов, обеспечивающей снижение токсичного действия матрицы на биоматериал и повышение ее гибкости.

Технический результат, который может быть получен при применении заявляемой органосиликатной золь-гель матрицы, заключается в том, что полученная не растворимая в воде золь-гель матрица может быть использована для иммобилизации микроорганизмов при создании гетерогенных биокатализаторов.

Сущность технического решения заключается в том, что композиция для получения органосиликатной золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов при создании гетерогенных биокатализаторов, состоящая из тетраэтоксисилана, 0,2 моль/дм³ раствора катализатора NaF и гидрофобной добавки, причем в качестве гидрофобной добавки использован диметилдиэтоксисилан, в качестве органического компонента - поливиниловый спирт, при этом компоненты взяты в объемном соотношении ПВС:ТЭОС:ДМДЭС:NaF 4:10:10:1.

Уменьшение полярности кремнийсодержащей матрицы за счет введения гидрофобной добавки способствует увеличению активности иммобилизованных в нее клеток. Кроме того, введение расчетного количества гидрофобной добавки уменьшает способность объемных молекул субстратов проникать через поры матрицы к биокатализатору, что позволяет повышать эффективность гетерогенного биокатализатора. Введение расчетного количества гидрофобной добавки увеличивает пластичность матрицы, что приводит к увеличению времени функционирования гетерогенного биокатализатора за счет того, что микроорганизмы находятся в комфортном окружении. Использование поливинилового спирта позволит получить гетерогенный биокатализатор без применения стекловолоконный фильтр Whatman GF/A, это значительно расширит область применения получаемых на основе иммобилизованных в органисиликатные матрицы микроорганизмов гетерогенные биокатализаторы.

Пример.

Для приготовления кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов в микропробирку отбирали 20 мкл 5% раствора поливинилового спирта (марка 16/9) в фосфатном буферном растворе (рН=6,8) и добавляли в него 0,25 мл суспензии клеток микроорганизмов бактерий Paracoccus yeei ВКМ В-3302 (Всероссийская коллекция микроорганизмов, г. Пущино) в фосфатном буферном растворе с концентрацией 150 мг/см³, перемешивали смесь в течение 5 мин, затем добавляли смесь силановых компонентов 50 мкл тетраэтоксисилана и 50 мкл диметилдиэтоксисилана, после чего перемешивали смесь в течение 5 мин. Вносили 5 мкл 0,2 моль/дм³ раствора NaF, перемешивали в течение 15 мин. Полученный гель далее использовали как гетерогенный биокатализатор в биосенсорных устройствах для определения интегральной характеристики степени загрязнения воды и в качестве неподвижной фазы в биофильтре проточного типа для очистки сточных вод.

Сравнение параметров биосенсора для определения интегральной характеристики степени загрязнения биохимического потребления кислорода (БПК) проводили на основе разработанного гетерогенного биокатализатора с использованием кислородного электрода Кларка и описанного в статье [Lavrova D.G. et al. Impact of hydrophilic polymers in organosilica matrices on structure, stability, and biocatalytic activity of immobilized methylotrophic yeast used as biofilter bed // Enzyme Microb. Technol. 2021. Vol. 150. P. 109879]. Долговременная стабильность 68 суток наблюдается для разработанного гетерогенного биокатализатора, что в 2,2 раза выше по сравнению с прототипом. Нижняя граница определяемых содержаний в 1,3 раза ниже, а коэффициент чувствительности в 35 раз выше.

Таким образом, введение в качестве прекурсора расчетного количества диметилдиэтоксисилана и использование поливинилового спирта при формировании органосиликатной золь-гель матриц на основе, приводит к значительному улучшению параметров функционирования гетерогенного биокатализатора по сравнению с прототипом (матрицей, содержащей полиэтиленгликоль и гидрофобную добавку метилтриэтоксислан).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к системам на основе микроорганизмов, иммобилизованных в матрицу синтетического носителя. Предложена композиция для получения органосиликатной золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов. Композиция состоит из тетраэтоксисилана, 0,2 моль/дм³ раствора катализатора NaF, диметилдиэтоксисилана и поливинилового спирта в качестве органического компонента. Компоненты взяты в объемном соотношении ПВС:ТЭОС:ДМДЭС:NaF 4:10:10:1. Полученная органосиликатная золь-гель матрица может быть использована для иммобилизации микроорганизмов при создании гетерогенных биокатализаторов, обладает высокой чувствительностью и стабильностью. 1 пр.

Композиция для получения органосиликатной золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов при создании гетерогенных биокатализаторов, состоящая из тетраэтоксисилана, 0,2 моль/дм³ раствора катализатора NaF и гидрофобной добавки, отличающаяся тем, что в качестве гидрофобной добавки использован диметилдиэтоксисилан, в качестве органического компонента - поливиниловый спирт, при этом компоненты взяты в объемном соотношении ПВС:ТЭОС:ДМДЭС:NaF 4:10:10:1.