Способ получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов для электрода биосенсорного аналитического устройства и биосенсорное аналитическое устройство для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/02 C12M1/40 

[01] Область техники

[02] Группа изобретений относится к области экологии, а именно к биосенсорным аналитическим устройствам. Заявленные устройство и способ могут быть использованы для детекции (определения) уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями на основе измерения биохимического потребления кислорода в образцах воды различного происхождения, в том числе поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах.

[03] Уровень техники

[04] В настоящее время для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями применяют такой показатель, как биохимическое потребление кислорода (БПК), то есть количество кислорода (в мг), требуемое для окисления находящихся в 1 дм³ воды органических веществ в аэробных условиях, в частности БПК₅ - это количество кислорода, использованное микроорганизмами для окисления всех растворенных органических веществ в изолированном сосуде с образцом в течение 5 суток, БПК₂₀ - соответственно до 20 суток. Таким образом, существующий стандартный способ определения БПК, широко используемый производственными предприятиями, санитарными службами и водоочистными сооружениями, основан на тестах, минимальная продолжительность которых составляет не менее 5-ти суток [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПК_полн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997. 25 с.]. При этом указанная длительность стандартного способа определения БПК может стать причиной экологически опасных ситуаций вследствие поступления на водоочистные сооружения загрязненных вод или их недоочистки в процессе регенерации.

[05] Для оперативного определения уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями применяют метод оценки БПК с использованием биосенсорных аналитических устройств (БПК-биосенсоров). В указанных устройствах в качестве распознающих элементов использованы микроорганизмы, способные окислять определенный спектр органических соединений.

[06] Известно устройство для экспресс-определения биохимического потребления кислорода, который представляет собой биосенсорную систему с ассоциацией микроорганизмов Blastobotrys adeninivorans ВКМ Y-2677 и Paracoccus yeei ВКМ В-3302. [Мурсалова, С.А. Формирование биосенсора для определения загрязненности воды / С.А. Мурсалова, А.С. Харькова // Наставничество и экология: Сборник научных трудов Международной научно-практической конференции студентов, аспирантов, молодых ученых, преподавателей, приуроченной к IX Ежегодному молодежному фестивалю в области устойчивого развития ВУЗЭКОФЕСТ, Ульяновск, 16-18 марта 2023 года / Отв. за выпуск ЕМ. Ерофеева. - Ульяновск: Ульяновский государственный технический университет, 2023. - С.51-55.]. Устройство состоит из магнитной мешалки, измерительной кюветы 5 мл и рабочего графито-пастового электрода, который включает в себя графитовую пудру, минеральное масло, медиатор ферроцен. Биорецепторный элемент состоит из ассоциации иммобилизованных клеток на основе ассоциации P. yeei и В. adeninivorans, в качестве электрода сравнения использовался хлоридсеребряный электрод. Диапазон определяемых концентраций составляет от 40,9 мг/дм³ до 286,9 мг/дм³, субстратная специфичность используемого биосенсора составляет 12 субстратов. Долговременная стабильность составляет 5 суток, операционная стабильность - 12%. Существенным недостатком устройства является высокая нижняя граница определяемых концентрация (40,9 мг/дм³), не позволяющая проводить анализ проб с содержанием биохимического потребления кислорода на уровне предельно-допустимых концентраций [СанПиН 2.1.5.980-00 Водоотведение населенных мест, санитарная охрана водных объектов. Гигиенические требования к охране поверхностных вод].

[07] Известно также биосенсорное аналитическое устройство для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями, описанное в работе [В.А. Арляпов, А.С. Харькова, А.С. Илюхина. Кинетический подход к формированию двухмедиаторных систем для создания микробных биосенсоров на примере экспресс-анализа индекса биохимического потребления кислорода // Актуальная биотехнология. - 2021. - №1. - С.224-228]. Устройство содержит измерительную кювету с буферным раствором, магнитную мешалку, хлоридсеребряный электрод сравнения и графито-пастовый электрод, на рабочей поверхности которого размещен биорецепторный элемент с иммобилизованными микроорганизмами Blastobotrys adeninivorans ВКМ Y-2677 в виде суспензии. При этом способ получения биорецепторного элемента для электрода данного устройства представляет собой стандартный процесс, включающий предварительное выращивание микроорганизмов в инкубаторе, которые затем центрифугируют, промывают буферным раствором, ресуспендируют, наносят на рабочую поверхность электрода в виде суспензии и фиксируют с помощью диализной мембраны и пластикового кольца. Данные устройство и способ позволяют определить индекс биохимического потребления кислорода в концентрациях от 14,5 до 71 мгО₂/дм³, при этом время анализа одной пробы составляет 5 минут, долговременная стабильность биосенсорной системы составляет 31 суток, относительное стандартное отклонение - 7,6%, коэфициент чувствительности - 5±1 нА⋅дм³/мгО₂.

[08] Наиболее близким аналогом заявленной группы изобретений является способ получения биорецепторного элемента для электрода биосенсорного аналитического устройства и биосенсорное аналитическое устройство для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями, описанные в работе [В.А. Арляпое, А.С. Харькова, А.С. Илюхина. Формирование биопленок микроорганизмов активного ила на поверхности электрода как основа высокочувствительного бпк-биосенсора// Физико-химическая биология. - 2023. - №1. - С.63-80]. Для формирования биорецепторного элемента в виде биопленки рабочую поверхность графито-пастового электрода помещали в стерильную пробирку с питательной средой LB и микроорганизмами активного ила, отобранными в очистных сооружениях завода по производству химических удобрений, с последующей выдержкой при температуре 29°С в течение 53 часов. Для фиксации биопленки на поверхности электрода использовали диализную мембрану, которую закрепляли при помощи пластикового кольца. Данные устройство и способ позволяют определить индекс биохимического потребления кислорода в концентрациях от 0,87 до 31 мгO₂/дм³, при этом время анализа одной пробы составляет 5 минут, долговременная стабильность биосенсорной системы составляет 52 суток.

[09] Недостатком ближайшего аналога является ограниченный диапазон определяемых значений БПК при недостаточно высокой долговременной стабильности используемой биосенсорной системы.

[010] Таким образом, технической проблемой, на решение которой направлена заявленная группа изобретений, является недостаточно высокие рабочие характеристики известных биосенсорных аналитических устройств для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями, содержащих биорецепторный элемент в виде биопленки на основе микроорганизмов.

[011] Раскрытие сущности изобретения

[012] Техническим результатом группы изобретений является увеличение диапазона определяемых значений биохимического потребления кислорода (БПК) от 0,61 до 130 мгO₂/дм³, а также увеличение долговременной стабильности биосенсорной системы, включающей биорецепторный элемент в виде биопленки на основе микроорганизмов, до 151 суток.

[013] Указанный технический результат достигается в биосенсорном аналитическом устройстве для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями за счет того, что оно содержит измерительную кювету с буферным раствором, магнитную мешалку, хлоридсеребряный электрод и биосенсорную систему, включающую графитовый электрод, содержащий медиатор электронного транспорта и биорецепторный элемент в виде биопленки на основе микроорганизмов, при этом в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835.

[014] Кроме того, согласно частным случаям реализации заявленного устройства:

[017] - в качестве медиатора электронного транспорта графитового электрода используют ферроцен,

[018] - графитовый электрод представляет собой графито-пастовый электрод или графитовый печатный электрод.

[019] Указанный технический результат достигается также в способе получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями, включающем погружение рабочей поверхности графитового электрода, содержащего медиатор электронного транспорта, в питательную среду, в которую помещены микроорганизмы, последующую выдержку в инкубаторе, при этом в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835.

[020] Кроме того, согласно частным случаям реализации заявленного способа:

[021] - в качестве питательной среды используют среду LB (lysogeny broth), содержащую следующие компоненты: триптон, дрожжевой экстракт, натрия хлорид,

[022] - в качестве графитового электрода используют графитово-пастовый электрод или графитовый печатный электрод.

[023] - выдержку осуществляют в течение 7 суток при температуре 28±3°С.

[024] В отличие от ближайшего аналога в заявленной группе изобретений использован биорецепторный элемент в виде биопленки на основе микроорганизмов, таких как штамм бактерий Pseudomonas veronii ВКМ В-3835, то есть чистой культуры конкретного вида бактерий, в то время как в ближайшем аналоге использована биопленка активного ила, который представляет собой большое неидентифицированное сообщество микроорганизмов различного вида.

[025] Использование биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов в виде штамма бактерий Pseudomonas veronii ВКМ В-3835 позволяет увеличить диапазон определяемых значений биохимического потребления кислорода (БПК), поскольку бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835 выделены из активного ила очистных сооружений, который уже приспособлен для снижения индекса биохимического потребления кислорода, а также за счет способа иммобилизации указанных микроорганизмов на рабочую поверхность электрода в виде биопленки, поскольку при формировании биопленки бактерии выделяют внеклеточные вещества, которые участвуют в переносе электронов с данных бактерий на графитовый электрод и медиатор электронного транспорта.

[026] Увеличение долговременной стабильности биосенсорной системы заявленного устройства, полученной в соответствии с заявленным способом, также связано с тем, что микроорганизмы, представляющие собой бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835, выращены на рабочей поверхности графитового электрода в виде биопленки, что приводит к формированию полисахаридного матрикса, который защищает микроорганизмы от воздействия негативных факторов окружающей среды и не детерминирует обновление микрофлоры непосредственно в предэлектродном пространстве.

[027] Использование графитового электрода обусловлено тем, что данный тип электродов обладает развитой поверхностью, что позволяет надежно удерживать биоматериал на поверхности.

[028] В частном случае реализации заявленных устройства и способа получения биорецепторного элемента для электрода устройства в качестве медиатора электронного переноса использован ферроцен, поскольку электрохимическая реакция с его участием не зависит от рН среды, что позволяет использовать оптимальный рН рабочего электролита для соответствующего микроорганизма, а также малая растворимость ферроцена в воде позволяет модифицировать графитовую пасту, иммобилизуя медиатор на поверхности графитового электрода.

[029] Условия выдержки рабочей поверхности графитового электрода в питательной среде, в которую помещены микроорганизмы, в частности, время выдержки (7 суток) и температура (28±3°С), обеспечивают наиболее однородное и равномерное формирование биопленки на поверхности электрода в количестве, полностью покрывающем рабочую поверхность электрода. При формировании биопленки за более короткий промежуток времени может наблюдаться увеличение сопротивления системы. При более длительном сроке выдержки в инкубаторе формируется более толстый слой полисахаридного матрикса, который может затруднить диффузию субстратов к микроорганизмам, что приведет к снижению селективности и чувствительности биосенсорной системы. При температуре выдержки менее или более указанного оптимума может произойти замедление роста микроорганизмов.

[030] Краткое описание чертежей

[031] Группа изобретений поясняется фигурами, где:

[032] На фиг.1 показан общий схематический вид заявленного биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями.

[033] На фиг.2 показан общий схематический вид заявленного способа получения биорецепторного элемента для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями.

[034] На фиг.3 представлен пример типичногоответа заявленного биосенсорного аналитического устройства, регистрируемого при анализе образца загрязненной воды, представляющий собой график зависимости силы тока от времени.

[035] На фиг.4 показана градуировочная зависимость заявленного биосенсорного аналитического устройства в координатах ответ сенсора от концентрации БПК5.

[036] На фиг.5 представлены микроскопические исследования образования биопленок бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835 на поверхности графитового электрода.

[037] Элементы обозначены на фигурах следующими позициями:

1 - графитовый электрод,

2 - биорецепторный элемент,

3 - хлоридсеребряный электрод,

4 - измерительная кювета,

5 - магнитная мешалка,

6 - питательная среда,

7 - инкубатор.

[038] Осуществление изобретения

[039] Заявленное биосенсорное аналитическое устройство включает измерительную кювету (5) с буферным раствором, магнитную мешалку (4), хлоридсеребряный электрод (3) и биосенсорную систему, включающую графитовый электрод (1) и сформированный на его рабочей поверхности биорецепторный элемент (2) в виде биопленки, включающий микроорганизмы в виде штамма бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835 (фиг.1).

[040] Бактерии Pseudomonas veronii выделены из активного ила очистных сооружений г. Тула и депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-3835.

[041] Графитовый электрод (1), содержащий медиатор электронного транспорта, может представлять собой графитовый рабочий электрод или графито-пастовый электрод. В качестве медиатора электронного транспорта используют, преимущественно, ферроцен.

[042] Графито-пастовый электрод содержит корпус, платиновый проводник и графитовую пасту, которая может включать следующие компоненты: графитовая пудра, ферроцен, ацетон, минеральное масло. Содержание компонентов в графитовой пасте может быть следующим: графитовая пудра - 90 мг, ферроцен - 10 мг, ацетон - 500 мкл, минеральное масло - 40 мкл. Для получения графито-пастового электрода графитовой пастой заполняют пластмассовый корпус, после чего платиновый проводник погружают в графитовую пасту.

[043] Заявленный способ получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе бактерий Pseudomonas veronii ВКМ В-3835, используемого в заявленном устройстве, включает следующие основные этапы (фиг.2):

[044] - погружение рабочей поверхности графитового электрода (1), содержащего медиатор электронного транспорта, преимущественно, ферроцен, в питательную среду (6), преимущественно, LB (lysogeny broth), состоящую из следующих компонентов: триптон, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, в которую помещены бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835,

[045] - последующую выдержку рабочей поверхности графитового электрода (1) в указанной питательной среде (6) с бактериями Pseudomonas veronii ВКМ В-3835 в инкубаторе (7). Предпочтительные условия выдержки: длительность - 7 суток, температура - 28±3°С.

[046] Содержание компонентов в используемой для формирования биорецепторного элемента (2) питательной среде (6) LB (lysogeny broth) может быть следующим: триптон - 10 г/дм³, дрожжевой экстракт - 5 г/дм³, а натрия хлорида - 10 г/дм³. Бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835, формирующие на рабочей поверхности графитового электрода (1) биорецепторный элемент (2) в виде биопленки, предварительно заносят в питательную среду (6) при помощи шпателя. В процессе деления указанных микроорганизмов в питательной среде (6), в которую погружена рабочая поверхность графитового электрода (1), микроорганизмы, попавшие на данную поверхность, закрепляются на ней и постепенно образуют биопленку на границе «электрод-питательная среда».

[047] Контроль физиологической активности микроорганизмов в составе биопленки на поверхности чувствительного элемента в in vitro эксперименте определяли при помощи дыхательного МТТ-теста. Формирование биопленки фиксировали по нарастанию интенсивности окрашивания микроорганизмов в пурпурный цвет, в результате чего была построена зависимость оптической плотности от времени роста биопленки. Рост оптической плотности указывает на процесс увеличения физиологической активности биомассы, обусловленный размножением микроорганизмов, образованием и ростом биопленки. Время максимальной физиологической активности для микроорганизмов составило 7 ч, после чего наступало ее постепенное снижение. Образование биопленки в период максимальной физиологической активности клеток было подтверждено методом оптической микроскопии с фазовым контрастом (фиг.5).

[048] Ниже описан пример определения БПК образца воды с помощью заявленного устройства, содержащего биорецепторный элемент (2), полученный заявленным способом, отображающий принцип его работы.

[049] Для определения индекса БПК в анализируемом образце воды используют измерительную кювету (4) объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буферный раствор (рН=6,8). В измерительную кювету (4) погружают хлоридсеребряный электрод (3) и графито-пастовый электрод (1), таким образом, чтобы калий-натрий фосфатный буферный раствор контактировал с рецепторным элементом (2). Графито-пастовый электрод (1) посредством платинового проводника подключают к потенциостату, регистрирующему зависимость силы тока от времени, например, торговой марки Contest. К данному потенциостату подключают также хлоридсеребряный электрод (3). Измерения проводят при постоянном потенциале +250 мВ и непрерывном перемешивании раствора с помощью магнитной мешалки (5) (300 об/мин) при комнатной температуре.

[050] После установления стабильного уровня тока в измерительную кювету (4) микропипеткой вводят необходимое количество раствора анализируемого вещества (пробы). После каждого измерения производят промывку измерительной кюветы (4) калий-натрий фосфатным буферным раствором. Далее рассчитывают скорость биоразложения органических соединений по амплитуде силы тока (ответ сенсора, ΔI, мкА) и определяют значение биохимического потребления кислорода по предварительно построенной с помощью модельного глюкозо-глутаматного раствора калибровочной кривой в соответствии с ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. В соответствии с указанным нормативным документом принимают, что БПК5, равное 205 мг/дм³, соответствует раствору, содержащему суммарно 300 мг/дм³ глюкозы и глутаминовой кислоты [ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Количественному химическому анализу вод. Способ выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПКполн) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. - М: 1997. - 25 с.].

[051] Линейный диапазон зависимости ответа биосенсорной системы от БПК₅ лежит в диапазоне 0,61-130 мг/дм³ (без разбавления пробы). Длительность единичного измерения не превышает 5 минут. Долговременная стабильность, то есть период времени стабильной работы биосенсорной системы, на протяжении которого падение активности микроорганизмов в количестве не более 25%, составляет не менее 151 суток.

[052] В таблице 1 представлены сравнительные характеристики заявленного устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями и ближайшего аналога.

[053] Заявленное устройство обладает чувствительностью к широкому спектру биоразлагаемых органических соединений, таких как фруктоза, глюкоза, галактоза, манноза, этанол, 2-метилпропанол-1, бутанол-1, этандиовая кислота, глутаминовая кислота, сорбит, серии, глутамин.

[054] Таким образом, заявленные устройство и способ обеспечивают расширение диапазона определяемого значения БПК, а также увеличение долговременной стабильности биосенсорной системы.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биосенсорному аналитическому устройству для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями. Указанное устройство содержит измерительную кювету (4) c буферным раствором, магнитную мешалку (5), хлоридсеребряный электрод (3) и биосенсорную систему, включающую графитовый электрод (1), содержащий медиатор электронного транспорта и биорецепторный элемент (2) в виде биопленки на основе микроорганизмов, отличающееся тем, что в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835. Изобретение также относится к биорецепторному элементу для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями в виде биопленки на основе микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835, а также к способу его получения. Настоящее изобретение обеспечивает увеличение диапазона определяемых значений биохимического потребления кислорода (БПК) и чувствительность к широкому спектру биоразлагаемых органических соединений. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл.

1. Биосенсорное аналитическое устройство для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями, содержащее измерительную кювету (4) c буферным раствором, магнитную мешалку (5), хлоридсеребряный электрод (3) и биосенсорную систему, включающую графитовый электрод (1), содержащий медиатор электронного транспорта и биорецепторный элемент (2) в виде биопленки на основе микроорганизмов, отличающееся тем, что в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835.

2. Биосенсорное аналитическое устройство для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями по п. 1, отличающееся тем, что в качестве медиатора электронного транспорта используют ферроцен.

3. Биосенсорное аналитическое устройство для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями по п. 1, отличающееся тем, что в качестве графитового электрода (1) используют графитово-пастовый электрод или графитовый печатный электрод.

4. Способ получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями, включающий погружение рабочей поверхности графитового электрода (1), содержащего медиатор электронного транспорта, в питательную среду (6), в которую помещены микроорганизмы, последующую выдержку в инкубаторе (7), отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835.

5. Способ получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями по п. 4, отличающийся тем, что в качестве питательной среды (6) используют среду LB (lysogeny broth), содержащую следующие компоненты: триптон, дрожжевой экстракт, натрия хлорид.

6. Способ получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями по п. 4, отличающийся тем, что в качестве графитового электрода (1) используют графитово-пастовый электрод или графитовый печатный электрод.

7. Способ получения биорецепторного элемента в виде биопленки на основе микроорганизмов для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями по п. 4, отличающийся тем, что выдержку осуществляют в течение 7 суток при температуре 28±3°С.

8. Биорецепторный элемент для электрода биосенсорного аналитического устройства для детекции уровня загрязнения воды биоразлагаемыми органическими соединениями в виде биопленки на основе микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов использованы бактерии Pseudomonas veronii ВКМ В-3835.