ПРЕПАРАТ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РАКА Российский патент 2024 года по МПК A61K39/00 A61K39/39 A61K47/69 A61P35/00 A61P37/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к препарату вакцины, предназначенному для применения для предупреждения и/или лечения рака, включающему комплекс производного гиалуроновой кислоты, содержащего введенную гидрофобную группу, и антиген.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Описан препарат вакцины, предназначенный для применения для предупреждения и/или лечения рака, который включает гидрофобизированный полисахарид, такой как несущий холестерин пуллулан (СНР) или несущий холестерин маннан (СМР), и антиген (патентная публикация 1). Также описан препарат вакцины, предназначенный для лечения рака, который включает комплекс гидрофобизированного полисахарида, такого как СНР, и синтезированный обладающий длинной цепью пептидный антиген, содержащий множество эпитопов, распознающихся Т-клетками, и иммуностимулирующее средство (патентные публикации 2 и 3).

Действие этих препаратов вакцин основано на таких принципах, что антигены, захваченные антигенпрезентирующими клетками, расщепляются внутриклеточными протеасомой, протеазой или пептидазой с образованием обладающих разной длиной пептидов и включаются в качестве антигенных эпитопных пептидов в молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I или молекулы ГКГ класса II на поверхности клеток с образованием комплексов, которые, в свою очередь, распознаются цитотоксическими Т-клетками (CTL, CD8⁺) или хелперными Т-клетками (CD4⁺), при этом происходит активация этих клеток (непатентная публикация 1).

Также сообщали, что производное гиалуроновой кислоты, полученное путем введения в гиалуроновую кислоту группы, содержащей холестерильную группу в качестве гидрофобной группы, образует мелкие частицы вследствие ассоциации в воде и образует комплекс с лекарственным средством (патентная публикация 4). Также сообщали, что производное гиалуроновой кислоты, полученное путем превращения карбоксигруппы фрагмента глюкуроновой кислоты, содержащегося в гиалуроновой кислоте, в амидную группу по реакции с определенной аминокислотой, и дополнительное введение стерильной группы, которая является гидрофобной группой, в оставшиеся карбоксигруппы, обеспечивает характеристики и биологической разлагаемости, и удерживания в крови, и комплекс производного гиалуроновой кислоты и лекарственного средства обладает характеристиками, благоприятными для его применения в качестве фармацевтической композиции (патентная публикация 5).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Патентная публикация 1: Международная публикация № WO 1998/009650,

Патентная публикация 2: Международная публикация № WO 2013/031882,

Патентная публикация 3: Международная публикация № WO 2015/050158,

Патентная публикация 4: Международная публикация № WO 2010/053140,

Патентная публикация 5: Международная публикация № WO 2014/038641.

НЕПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА

Непатентная публикация 1. ACS Nano Vol. 8, p. 9209-9218, 2014.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Необходим препарат вакцины, обладающий более высокой эффективностью, чем уже описанные препараты вакцин, содержащие СНР. В частности, необходимо разработать препарат вакцины против рака, обладающий способностью заметно индуцировать антиген-специфические цитотоксические Т-клетки (CTL) или противоопухолевым воздействием.

РЕШЕНИЕ ЗАДАЧИ

Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования, направленные на решение этих задач, и таким образом завершили настоящее изобретение путем обнаружения того, что препарат вакцины, включающий комплекс производного гиалуроновой кислоты, содержащего введенную гидрофобную группу, и антиген, заметно индуцирует антиген-специфические CTL и обладает высокой противоопухолевой активностью.

Точнее, настоящее изобретение относится к комплексу, который образован путем включения антигена посредством самопроизвольной ассоциации в водном растворе, улучшает накапливание антигена в лимфатическом узле и заметно индуцирует антиген-специфические CTL, комплекс, обладает высокой противоопухолевой активностью, к препарату вакцины, включающему комплекс, и к способам их получения. Настоящее изобретение также относится к комплексу, который образован путем включения антигена посредством лучшего диспергирования в воде, улучшает накапливание антигена в лимфатическом узле и заметно индуцирует антиген-специфические CTL, к препарату вакцины, включающему комплекс, и к способам их получения.

Одним объектом настоящего изобретения является препарат вакцины, предназначенный для применения для предупреждения и/или лечения рака, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[27], комплекс, предназначенный для применения в препарате вакцины, соответствующий любому из параграфов [14] и [28], и способ получения комплекса, соответствующий параграфу [29], описанные ниже.

[1] Препарат вакцины, предназначенный для применения для предупреждения или лечения рака, включающий производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, и антиген, где производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, является следующим:

производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно повторяющееся звено, описывающееся формулой (I):

в которой R¹, R², R³ и R⁴ все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R⁵ обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Z обозначает непосредственную связь или пептидный мостик, содержащий от 2 до 30 произвольных аминокислотных остатков;

X¹ обозначает гидрофобную группу, выбранную из числа групп, описывающихся следующими формулами:

-NR^b-R,

-NR^b-COO-R,

-NR^b-CO-R,

-NR^b-CO-NR^c-R,

-COO-R,

-O-COO-R,

-S-R,

-CO-Y^a-S-R,

-O-CO-Y^b-S-R,

-NR^b-CO-Y^b-S-R и

-S-S-R;

R^a, R^b и R^c все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил и гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NR^f-;

R^f выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₁₂-алкил, амино-С₂-С₁₂-алкил и гидрокси-С₂-С₁₂-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1 или 2 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-;

R обозначает стерильную группу;

Y обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(СН₂СН₂О)_m-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^g- и -S-S-;

R^g выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил или гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-;

Y^a обозначает С₁-С₅-алкилен;

Y^b обозначает С₂-С₈-алкилен или С₂-С₈-алкенилен; и

m обозначает целое число, выбранное от 1 до 100; или

производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено,

описывающееся формулой (II):

в которой R^1a, R^2a, R^3a и R^4a все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-C₆-алкил, формил и C₁-C₆-алкилкарбонил;

R^5a обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Х^1а обозначает гидроксигруппу, -О^-Q⁺, C₁-С₆-алкоксигруппу, -NR⁷R⁸ или -NR⁹- Z¹-Z²;

Q⁺ обозначает противокатион;

R^6a, R⁷, R⁸ и R⁹ все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода и C₁-C₆-алкил;

R^aa обозначает атом водорода или C₁-C₆-алкил, где алкил необязательно замещен одной или большим количеством групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей гидроксигруппу, карбоксигруппу, карбамоил, C₁-C₆-алкилтиогруппу, арил и гетероарил, где арил необязательно замещен одной или большим количеством гидроксигрупп;

Z¹ обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(СН₂СН₂О)_ma-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^ga- и -S-S-, и та обозначает целое число, выбранное от 1 до 100;

Z² выбран из числа групп, описывающихся следующими формулами:

-NR^ba-Z³,

-NR^ba-COO-Z³,

-NR^ba-CO-Z³,

-NR^ba-CO-NR^ca-Z³,

-COO-Z³,

-CO-NR^ca-Z³,

-O-CO-NR^ca-Z³,

-O-COO-Z³,

-S-Z³,

-CO-Z^a-S-Z³,

-O-CO-Z^b-S-Z³,

-NR^ba-CO-Zb-S-Z³ и

-S-S-Z³;

R^ba и R^ca все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил и гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NRf^a -;

R^fa независимо выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₁₂-алкил, амино-С₂-С₁₂-алкил и гидрокси-С₂-С₁₂-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1 или 2 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-;

R^ga независимо выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил и гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-;

Z³ обозначает стерильную группу;

Z^a обозначает C₁-С₅-алкилен; и

Z^b обозначает С₂-С₈-алкилен или С₂-С₈-алкенилен, производное гиалуроновой кислоты, которое, если не содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), в которое Х^1а обозначает -NR⁹-Z¹-Z², то дополнительно содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (III):

в которой R^1b, R^2b, R^3b и R^4b все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-C₆-алкил, формил и C₁-C₆-алкилкарбонил;

R^5b обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил; и

X² обозначает -NR⁹ -Z¹ -Z², где R⁹, Z¹ и Z² являются такими, как уже определено.

[2] Препарат вакцины, соответствующий параграфу [1], в котором производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, дополнительно содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (IIIc):

в которой R^1c, R^2c, R^3c и R^4c все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R^5c выбран из группы, включающей атом водорода, формил и C₁-C₆-алкилкарбонил; и

X^c выбран из группы, включающей гидроксигруппу и -О^-Q⁺, где Q⁺ обозначает противокатион.

[3] Препарат вакцины, соответствующий параграфу [1] или [2], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), где отношение количества повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (I), к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев составляет от 5 до 50%.

[4] Препарат вакцины, соответствующий параграфу [1] или [2], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), где отношение количества дисахаридных звеньев, содержащих группу -NR⁹ -Z¹ -Z², к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев составляет от 5 до 50%.

[5] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[3], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), в которой Z обозначает непосредственную связь, Y обозначает С₂-С₁₀-алкилен, X¹ обозначает -NH-COO-R и R обозначает холестерильную группу.

[6] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1], [2] и [4], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), в которой Z¹ обозначает С₂-С₁₀-алкилен, Z² обозначает -NH-COO-Z³ и Z³ обозначает холестерильную группу.

[7] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[6], где производное гиалуроновой кислоты получают с использованием гиалуроновой кислоты, состоящей только из дисахаридных звеньев, описывающихся формулой (IIIc), определенной в параграфе 2, где, если R^1c, R^2c, R^3c и R^4c все обозначают атомы водорода, R^5c обозначает ацетил и X^c обозначает -О^-Na⁺, то среднемассовая молекулярная масса равна от 5 до 200 кДа.

[8] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[7], в котором производное гиалуроновой кислоты и антиген образуют комплекс.

[9] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[8], предназначенный для введения в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа.

[10] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[9], в котором антигеном является антигенный пептид или антигенный белок.

[11] Препарат вакцины, соответствующий параграфу [10], в котором антигенный пептид содержит два или большее количество эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, или эпитопов, распознающихся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

[12] Препарат вакцины, соответствующий параграфу [11], в котором антигенный пептид содержит аминокислотный мостик, расположенный между эпитопами.

[13] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[12], предназначенный для введения в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака.

[14] Комплекс, образованный из производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I) или формулой (II), соответствующего любому из параграфов [1]-[7], и антигена, который применяют в вакцине, предназначенной для применения для предупреждения или лечения рака.

[15] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[3], [5] и [7]-[13], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), в которой Y обозначает -(СН₂)_n1 или -(СН₂СН₂О)_m1-СН₂СН₂-, n1 обозначает целое число, равное от 2 до 15, и m1 обозначает целое число, равное от 1 до 4.

[16] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[3], [5], [7]-[13] и [15], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), в которой Y обозначает -(СН₂)_n1.

[17] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[3], [5], [7]-[13], [15] и [16], где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), в которой Y обозначает -(CH₂)_n1 и n1 равно 2, 6, 8 или 12.

[18] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[17], предназначенный для введения в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа, где адъювантом является i) вещество, активирующее рецептор врожденного иммунитета (образ-распознающий рецептор), ii) вещество, стимулирующее антигенпрезентирующие клетки, или iii) вещество, оказывающее ингибирующее воздействие на приобретение антигенпрезентирующими клетками иммунодепрессивной активности.

[19] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[18], предназначенный для введения в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа, где адъювантом является CpG-олиго-ДНК, polyIC, Qui1A, QS21, Sting (стимулятор генов интерферона), монофосфориллипид, R848, имихимод или MPL.

[20] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[19], в котором антигеном является антигенный пептид и антигенный пептид содержит один или большее количество каждого из следующих: эпитопы, распознающиеся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы, распознающиеся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

[21] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[20], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 8 до 120.

[22] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[21], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 8 до 50.

[23] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[22], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 16 до 80.

[24] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[23], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 23 до 60.

[25] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[24], предназначенный для введения в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, где антителами являются антитела, ингибирующие иммунодепрессивный сигнал, поступающий от опухоли, или антитела по меньшей мере одного типа, активирующие костимулирующий сигнал иммуноцитов.

[26] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[25], предназначенный для введения в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, где антителами являются антитела к CTLA4, антитела к PD1, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 или антитела к 4-1ВВ.

[27] Препарат вакцины, соответствующий любому из параграфов [1]-[13] и [15]-[26], предназначенный для введения в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, где антителами являются антитела к PDL1.

[28] Комплекс, образованный из производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I) или формулой (II), соответствующего любому из параграфов [15]-[17], и антигена, который применяют в вакцине, предназначенной для применения для предупреждения или лечения рака.

[29] Способ получения комплекса производного гиалуроновой кислоты, содержащего введенную гидрофобную группу, и антигена, включающий стадию смешивания в растворе производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I) или формулой (II), соответствующего любому из параграфов [1]-[7] и [15]-[17], с антигенным пептидом, который применяют в вакцине, предназначенной для применения для предупреждения или лечения рака.

Другим объектом настоящего изобретения является способ предупреждения и/или лечения рака, соответствующий любому из параграфов [30]-[46], и применение, соответствующее любому из параграфов [47]-[63], описанные ниже.

[30] Способ предупреждения и/или лечения рака, включающий введение субъекту препарата вакцины, включающего производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I) или формулой (II), и антиген, соответствующего любому из параграфов [1]-[7] и [15]-[17].

[31] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором производное гиалуроновой кислоты и антиген образуют комплекс.

[32] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа.

[33] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором антигеном является антигенный пептид или антигенный белок.

[34] Способ, соответствующий параграфу [33], в котором антигенный пептид содержит два или большее количество эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, или эпитопов, распознающихся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

[35] Способ, соответствующий параграфу [34], в котором антигенный пептид содержит аминокислотный мостик, расположенный между эпитопами.

[36] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака.

[37] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа и адъювантом является i) вещество, активирующее рецептор врожденного иммунитета (образ-распознающий рецептор), ii) вещество, стимулирующее антигенпрезентирующие клетки, или iii) вещество, оказывающее ингибирующее воздействие на приобретение антигенпрезентирующими клетками иммунодепрессивной активности.

[38] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа и адъювантом является CpG-олиго-ДНК, polyIC, Qui1A, QS21, Sting, монофосфориллипид, R848, имихимод или MPL.

[39] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором антигеном является антигенный пептид и антигенный пептид содержит один или большее количество каждого из следующих: эпитопы, распознающиеся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы, распознающиеся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

[40] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 8 до 120.

[41] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 8 до 50.

[42] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 16 до 80.

[43] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 23 до 60.

[44] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, и антителами являются антитела, ингибирующие иммунодепрессивный сигнал, поступающий от опухоли, или антитела по меньшей мере одного типа, активирующие костимулирующий сигнал иммуноцитов.

[45] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, и антителами являются антитела к CTLA4, антитела к PD1, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 или антитела к 4-1ВВ.

[46] Способ, соответствующий параграфу [30], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, и антителами являются антитела к PDL1.

[47] Применение производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I) или формулой (II), и антигена, соответствующих любому из параграфов [1]-[7] и [15]-[17], для получения препарата вакцины, предназначенного для применения для предупреждения или лечения рака.

[48] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором производное гиалуроновой кислоты и антиген образуют комплекс.

[49] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа.

[50] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором антигеном является антигенный пептид или антигенный белок.

[51] Применение, соответствующее параграфу [50], в котором антигенный пептид содержит два или большее количество эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, или эпитопов, распознающихся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

[52] Применение, соответствующее параграфу [51], в котором антигенный пептид содержит аминокислотный мостик, расположенный между эпитопами.

[53] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака.

[54] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа и адъювантом является i) вещество, активирующее рецептор врожденного иммунитета (образ-распознающий рецептор), ii) вещество, стимулирующее антигенпрезентирующие клетки, или iii) вещество, оказывающее ингибирующее воздействие на приобретение антигенпрезентирующими клетками иммунодепрессивной активности.

[55] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа и адъювантом является CpG-олиго-ДНК, polyIC, Qui1A, QS21, Sting, монофосфориллипид, R848, имихимод или MPL.

[56] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором антигеном является антигенный пептид и антигенный пептид содержит один или большее количество каждого из следующих: эпитопы, распознающиеся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы, распознающиеся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

[57] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 8 до 120.

[58] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 8 до 50.

[59] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 16 до 80.

[60] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором антигеном является антигенный пептид и количество аминокислотных остатков, содержащихся в антигенном пептиде, составляет от 23 до 60.

[61] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, и антителами являются антитела, ингибирующие иммунодепрессивный сигнал, поступающий от опухоли, или антитела по меньшей мере одного типа, активирующие костимулирующий сигнал иммуноцитов.

[62] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, и антителами являются антитела к CTLA4, антитела к PD1, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 или антитела к 4-1ВВ.

[63] Применение, соответствующее параграфу [47], в котором препарат вакцины вводят в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака, и антителами являются антитела к PDL1.

ПРЕИМУЩЕСТВА НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Применение препарата вакцины, включающего комплекс производного гиалуроновой кислоты, содержащего введенную гидрофобную группу, и антиген, предлагаемого в настоящем изобретении, обеспечивает улучшение накопления антигена в лимфатическом узле, обеспечивает возможность заметного индуцирования антиген-специфических CTL и обеспечивает возможность усиления противоракового эффекта за счет обеспечения иммунитета. Комплекс и препарат вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, также обладают превосходными характеристиками безопасности, в особенности, безопасности при длительном введении, поскольку использующееся производное гиалуроновой кислоты также обладает превосходными характеристиками безопасности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали mERK2 р 121. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили антигенный пептид (mERK2 р 121) и CpG-олиго-ДНК, CHP+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс СНР (СНР-80Т; 80 к) и антигенного пептида, и CpG-олиго-ДНК, 99k41+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (гиалуроновая кислота) (99k НА-С₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.2-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали mERK2 р 121. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, 99к41: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (mERK2 р 121) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), 99k41+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, и CpG-олиго-ДНК, 99k41+polyIC: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, и polyIC, 99k41+QuilA: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, и QuilA, 99k41+Sting: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, и Sting.

На фиг.2-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали mERK2 р 121. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.2-1.

На фиг.3-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали mERK2 р 121. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, 99k41+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (mERK2 р 121) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК, 99k41+R848: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, и R848, 99k41+MPL: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, и MPL.

На фиг.3-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали mERK2 р 121. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.3-1.

На фиг.4 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали MAGE-A4 р265. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, пептид+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили антигенный пептид (MAGE-A4 р264) и CpG-олиго-ДНК, CHP/Wt+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс СНР (80 k) и антигенного пептида, и CpG-олиго-ДНК, 99k41/Wt+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.5 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали MAGE-A4 р265. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, CHP/Wt: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс СНР (80 k) и антигенного пептида (MAGE-А4 р264), 99k41/Wt: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%).

На фиг.6 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали MAGE-A4 р265. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, 99k41/Wt+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (MAGE-A4 р264) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК, 99k41/LLLL+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (MAGE-A4 p264-4L) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК, 99k41/WWWW+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (MAGE-A4 p264-4W) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.7-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей C57BL/6, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали TRP1. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, CHP/6Y+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6Y), и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6Y+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k НА-С₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.7-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей C57BL/6, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали TRP2. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.7-1.

На фиг.7-3 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей C57BL/6, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали gp 100. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.7-1.

На фиг.8-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей C57BL/6, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали TRP1. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, 99k43/6G+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6G) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6Y+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6Y) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК, 99k43/4L+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-4L) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6L+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6L) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.8-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей C57BL/6, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали TRP2. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.8-1.

На фиг.8-3 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей C57BL/6, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали gp 100. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.8-1.

На фиг.9-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали АН1. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, CHP/6Y+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида (AH1gp70-6Y), и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6Y+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k НА-С₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.9-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали gp 70. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.9-1.

На фиг.10-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали АН1. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, CHP/6L+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида (AH1gp70-6L), и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6L+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.10-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали gp 70. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.10-1.

На фиг.11-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали АН1. Все образцы являлись следующими: NT: клетки селезенки не подвергавшихся лечению мышей, 99k43/6G+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (AH1gp70-6G) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6Y+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (AH1gp70-6Y) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК, 99k43/4L+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (AH1gp70-4L) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК, 99k43/6L+CpG: клетки селезенки мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (AH1gp70-6L) и производного НА, и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.11-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺ (ордината), полученная при использовании клеток селезенки мышей BALB/c, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали gp 70. Все образцы являлись такими же, как в случае фиг.11-1.

На фиг.12-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей BALB/c, обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, пептид: группа мышей, которым вводили антигенный пептид (mERK2 р 121) и CpG-олиго-ДНК, эмульсия: группа мышей, которым вводили препарат эмульсии, полученный из антигенного пептида, и CpG-олиго-ДНК, СНР: группа мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида, и CpG-олиго-ДНК, 99k41: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k НА-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.12-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей BALB/c, обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.12-1.

На фиг.13-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей BALB/c (n=5), обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, CpG: группа мышей, которым вводили CpG-олиго-ДНК, СНР: группа мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида (mERK2 р121), и CpG-олиго-ДНК, 99k41: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.13-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей BALB/c (n=5), обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.13-1.

На фиг.14-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей BALB/c (n=5), обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, aCTLA4/aPD1/aPDL1: группа мышей, которым вводили антитела к CTLA4, антитела к PD1 и антитела к PDL1, 99k41: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (mERK2 р 121) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.14-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей BALB/c (n=5), обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.14-1.

На фиг.15-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей BALB/c (n=5), обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, aCTLA4/aPDL1/aOX40/a4-1ВВ: группа мышей, которым вводили антитела к CTLA4, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 и антитела к 4-1ВВ, 99k41: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (mERK2 р 121) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК, 99k41+aCTLA4/aPDL1/aOX40/a4-1ВВ: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА, CpG-олиго-ДНК и антитела к CTLA4, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 и антитела к 4-1ВВ.

На фиг.15-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей BALB/c (n=5), обладающих клетками CMS5a фибросаркомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.15-1.

На фиг.16-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей BALB/c, обладающих клетками СТ26 колоректального рака мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, эмульсия: группа мышей, которым вводили препарат эмульсии, полученный из антигенного пептида (AH1gp70-6L), и CpG-олиго-ДНК, СНР: группа мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида, и CpG-олиго-ДНК, 99k43: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.16-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей BALB/c, обладающих клетками СТ26 колоректального рака мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.16-1.

На фиг.17-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей C57BL/6, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, СНР: группа мышей, которым вводили комплекс СНР и антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6Y), и CpG-олиго-ДНК, 99k43: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.17-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей C57BL/6 (n=5), обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.17-1.

На фиг.18-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая полученные в исследовании перемещения в лимфатический узел результаты для интенсивности флуоресценции в пересчете на одну клетку в лимфатическом узле мышей BALB/c через 24 ч после введения образца. Все введенные образцы являлись следующими: NT: образец не вводили, LPA: антигенный пептид (содержащий флуоресцентную метку mERK2 р 121 (конъюгированный с флуоресцеином)), СНР: комплекс СНР и антигенного пептида, 10k17: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-C₆-Chol-17%), 10k25: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-C₆-Chol-25%), 10k42: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-C₆-Chol-42%), 50k23: комплекс антигенного пептида и производного НА (50k HA-C₆-Chol-23%), 50k43: комплекс антигенного пептида и производного НА (50k НА-C₆-Chol-43%), 99k24: комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-24%), 99k43: комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-43%).

На фиг.18-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая полученные в исследовании перемещения в лимфатический узел результаты для интенсивности флуоресценции в пересчете на одну клетку в лимфатическом узле мышей BALB/c через 74 ч после введения образца. Все введенные образцы являлись такими же, как в случае фиг.18-1.

На фиг.19 представлена диаграмма, иллюстрирующая полученные в исследовании перемещения в лимфатический узел результаты для интенсивности флуоресценции в пересчете на одну клетку в лимфатическом узле мышей BALB/c через 24 ч после введения образца. Все введенные образцы являлись следующими: NT: образец не вводили, пептид: антигенный пептид (содержащий флуоресцентную метку mERK2 р 121 (конъюгированный с флуоресцеином)), 99k41: комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), 10kHA-Ala-Cho130: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Ala-C₆-Chol-30%), 10kHA-Ser-Chol28: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Ser-C₆-Chol-28%), 10kHA-Gly-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Gly-C₆-Chol-32%), 10kHA-Thr-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Thr-C₆-Chol-32%), 10kHA-Asn-Chol20: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Asn-C₆-Chol-20%), 10kHA-Asp-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Asp-C₆-Chol-32%), 10kHA-Phe-Chol31: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Phe-С₆-Chol-31%), 10kHA-Tyr-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Tyr-C₆-Chol-32%), 10kHA-Ile-Chol28: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Ile-C₆-Chol-28%), 10kHA-Leu-Chol31: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Leu-C₆-Chol-31%), 10kHA-Val-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k НА-Val-C₆-Chol-32%), 10kHA-Trp-Chol24: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Trp-C₆-Chol-24%), 10kHA-Gln-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Gln-C₆-Chol-32%), 10kHA-Glu-Chol32: комплекс антигенного пептида и производного НА (10k HA-Glu-C₆-Chol-32%).

На фиг.20-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей C57BL/6, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, 99k42: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k НА-C₆-Chol-42%), и CpG-олиго-ДНК, 50k42: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (50k НА-С₆-Chol-42%), и CpG-олиго-ДНК, 10k43: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (10k НА-С₆-Chol-43%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.20-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей C57BL/6 (n=5), обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.20 1.

На фиг.21-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей C57BL/6, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, 10kHA-Ala-Chol30: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и модифицированного аминокислотой производного НА (10k НА-Ala-С₆-Chol-30%), и CpG-олиго-ДНК, 10kHA-Gln-Chol32: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и модифицированного аминокислотой производного НА (10k HA-Gln-C₆-Chol-32%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.21-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей C57BL/6 (n=5), обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.21-1.

На фиг.22-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей C57BL/6, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, 99k42+PolyIC: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-42%), и polyIC.

На фиг.22-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей C57BL/6 (n=5), обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.22-1.

На фиг.23-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей (ордината) у групп мышей C57BL/6, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись следующими: контроль: группа мышей, которым не вводили образец, 99k42+Sting: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-42%), и агонист Sting, 99k42+R848: группа мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида и производного НА (99k HA-C₆-Chol-42%), и R848.

На фиг.23-2 представлены полученные для разных групп зависимости, иллюстрирующие изменения объемов опухолей (ордината) у относящихся к одной группе всех отдельных мышей C57BL/6 (n=5), обладающих клетками B16F10 меланомы мышей. Все группы являлись такими же, как в случае фиг.23-1.

На фиг.24-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества специфичных по отношению к TRP2 клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината) в опухоли или лимфатическом узле мышей, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей, где в качестве тетрамера использовали Н-2K^b TRP-2 тетрамер-SVYDFFVWL-APC. Все образцы являлись следующими: NT: клетки обладающих раковыми клетками мышей, не подвергавшихся лечению, 99k41: клетки обладающих раковыми клетками мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6Y) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

На фиг.24-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества специфичных по отношению к gp 100 клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ (ордината) в опухоли или лимфатическом узле мышей, обладающих клетками B16F10 меланомы мышей, где в качестве тетрамера использовали Н-2D^b gp 100 тетрамер-EGSRNQDWL-PE. Все образцы являлись следующими: NT: клетки обладающих раковыми клетками мышей, не подвергавшихся лечению, 99k41: клетки обладающих раковыми клетками мышей, которым вводили комплекс антигенного пептида (TRP2TRP1gp100-6Y) и производного НА (99k HA-C₆-Chol-41%), и CpG-олиго-ДНК.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Ниже настоящее изобретение будет описано более конкретно.

Комплекс производного гиалуроновой кислоты, содержащей введенную гидрофобную группу, и антигена, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой комплекс производного гиалуроновой кислоты, содержащей по меньшей мере одно дисахаридное звено (которое также является повторяющимся звеном), описывающееся формулой (I), или производного гиалуроновой кислоты, содержащей по меньшей мере одно дисахаридное звено (которое также является повторяющимся звеном), описывающееся формулой (II), и антиген. Комплекс можно применять для получения препарата вакцины, предлагаемого в настоящем изобретении. В объем настоящей заявки также входит раскрытие способа получения комплекса производного гиалуроновой кислоты, содержащей введенную гидрофобную группу, и антигена, предлагаемого в настоящем изобретении.

Определения

На термин "стерильная группа", описанный в настоящем изобретении, не налагаются особые ограничения при условии, что группа содержит стероидный каркас. В этом контексте примеры стероида, в частности, включают холестерин, дегидрохолестерин, копростанол, копростерин, холестанол, кампестанол, эргостанол, стигмастанол, копростанол, стигмастерин, ситостерин, ланостерин, эргостерин, симиаренол, желчную кислоту (холановую кислоту, литохолевую кислоту, гиодезоксихолевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, урсодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, апохолевую кислоту, холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и таурохолевую кислоту), тестостерон, эстрадиол, прогестерон, кортизол, кортизон, альдостерон, кортикостерон и дезоксикортикостерон. Примеры стерильной группы включают холестерильную группу, стигмастерильную группу, ланостерильную группу, эргостерильную группу, холаноильную группу и холоильную группу, и предпочтительно, если они включают холестерильную группу (предпочтительно холест-5-ен-3β-ильную группу, описывающуюся приведенной ниже формулой) и холаноильную группу (предпочтительно 5β-холан-24-оильную группу, описывающуюся приведенной ниже формулой).

В этом контексте два знака звездочки означают положения присоединения.

Термин "С₁-С₂₀-алкил", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 20 атомов углерода. Его примеры включают "С₁-С4-алкил", такой как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, сим-бутил, изобутил и трет-бутил, и дополнительно включают н-пентил, 3-метилбутил, 2-метилбутил, 1-метилбутил, 1-этилпропил, н-гексил, 4-метилпентил, 3-метилпентил, 2-метилпентил, 1-метилпентил, 3-этилбутил и 2-этилбутил. С₁-С₂₀-Алкил также включает "С₁-С₁₂-алкил", содержащий от 1 до 12 атомов углерода, и "C₁-C₆-алкил", содержащий от 1 до 6 атомов углерода.

Термин "C₁-C₆-алкил", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 1 до 6 атомов углерода. Его примеры включают "С₁-С₄-алкил", такой как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, сим-бутил, изобутил и трет-бутил.

Термин "C₁-C₆-алкилкарбонил", описанный в настоящем изобретении, означает алкилкарбонильную группу, в которой алкильным фрагментом является уже описанный C₁-C₆-алкил. Его примеры включают "С₁-С₄-алкилкарбонил", такой как ацетил, пропионил, н-пропилкарбонил, изопропилкарбонил, н-бутилкарбонил, сим-бутилкарбонил, изобутилкарбонил и трет-бутилкарбонил.

Термин "С₁-С₆-алкоксигруппа", описанный в настоящем изобретении, означает алкилоксигруппу, в которой алкильным фрагментом является уже описанный C₁-C₆-алкил. Ее примеры включают "С₁-С₄-алкоксигруппу", такую как метоксигруппа (Н₃С-О-), этоксигруппа, н-пропоксигруппа, изопропоксигруппа, н-бутоксигруппа, сим-бутоксигруппа, изобутоксигруппа и трет-бутоксигруппа.

Термин "C₁-С₆-алкилтиогруппа", описанный в настоящем изобретении, означает алкилтиогруппу, в которой алкильным фрагментом является уже описанный C₁-С₆-алкил. Ее примеры включают метилтиогруппу (H₃C-S-), этилтиогруппу, н-пропилтиогруппу, изопропилтиогруппу, н-бутилтиогруппу, сим-бутилтиогруппу, изобутилтиогруппу и трет-бутилтиогруппу, и предпочтительно, если они включают метилтиогруппу.

Термин "амино-С₂-С₂₀-алкил", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, и содержащую аминогруппу в качестве заместителя. Аминогруппа может быть присоединена, например, к концевому атому углерода алкильной группы. Амино-С₂-С₂₀-алкил также включает "амино-С₂-С₁₂-алкил", содержащий от 2 до 12 атомов углерода.

Термин "гидрокси-С₂-С₂₀-алкил", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную алкильную группу, содержащую от 2 до 20 атомов углерода, и содержащую гидроксигруппу в качестве заместителя. Гидроксигруппа может быть присоединена, например, к концевому атому углерода алкильной группы. Гидрокси-С₂-С₂₀-алкил также включает "гидрокси-С₂-С₁₂-алкил", содержащий от 2 до 12 атомов углерода.

Термин "С₂-С₃₀-алкилен", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную, двухвалентную насыщенную углеводородную группу, содержащую от 2 до 30 атомов углерода. Его примеры включают этилен и пропилен, и включают С₂-С₂₀-алкилен, С₂-С₈-алкилен и группу -(СН₂)_n- (где n равно от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 20, более предпочтительно от 2 до 15).

Термин "С₁-С₅-алкилен", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную, двухвалентную насыщенную углеводородную группу, содержащую от 1 до 5 атомов углерода. Его примеры включают метилен, этилен (этан-1,2-диил и этан-1,1-диил), пропилен (пропан-1,1-диил и пропан- 1,2-диил), бутан-1,4-диил и пентан- 1,5-диил.

Термин "С₂-С₁₀-алкилен", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную, двухвалентную насыщенную углеводородную группу, содержащую от 2 до 10 атомов углерода. Его примеры включают этилен (этан-1,2-диил и этан-1,1-диил), пропилен (пропан-1,1-диил, пропан-1,2-диил и пропан- 1,3-диил), бутан-1,4-диил, пентан-1,5-диил, гексан-1,6-диил, гептан-1,7-диил и октан-1,8-диил. "С₂-С₁₀-Алкилен" включает "С₂-С₈-алкилен", содержащий от 2 до 8 атомов углерода, и "С₂-С₆-алкилен", содержащий от 2 до 6 атомов углерода.

Термин "С₂-С₈-алкилен", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную, двухвалентную насыщенную углеводородную группу, содержащую от 2 до 8 атомов углерода. Его примеры включают этилен (этан-1,2-диил и этан-1,1-диил), пропилен (пропан-1,1-диил, пропан-1,2-диил и пропан-1,3-диил), бутан-1,4-диил, пентан-1,5-диил, гексан-1,6-диил, гептан-1,7-диил и октан-1,8-диил.

Термин "С₂-С₈-алкенилен", описанный в настоящем изобретении, означает линейную или разветвленную, двухвалентную насыщенную углеводородную группу, содержащую от 2 до 8 атомов углерода, и содержащую одну или большее количество двойных связей. Его примеры включают -СН=СН-, -С(СН₃)=СН-, 2-бутен-1,4-диил, гепта-2,4-диен-1,6-диил и окта-2,4,6-триен-1,8-диил. Если возможна геометрическая изомерия, то также включены соответствующие изомеры и их смеси.

В настоящем изобретении термин "арил" означает ароматическую карбоциклическую группу, например, ароматическую карбоциклическую группу, содержащую от 6 до 14 атомов углерода. Примеры арила включают фенил и нафтил (1-нафтил и 2-нафтил). Примеры арила, замещенного одной или большим количеством гидроксигрупп, включают 4-гидроксифенил.

В настоящем изобретении термин "гетероарил" означает ароматическую циклическую группу, содержащую в качестве образующих кольцо атомов один или большее количество гетероатомов, выбранных из группы, включающей атом азота, атом кислорода и атом серы, и она может являться частично насыщенной. Кольцо может являться моноциклическим или бициклическим гетероарилом, сконденсированным с бензольным кольцом или моноциклическим гетероарильным кольцом. Количество образующих кольцо атомов составляет, например, от 4 до 15, предпочтительно от 5 до 14, более предпочтительно от 6 до 10. Примеры гетероарила включают фур ил, тиенил, пирролил, имидазолил, пиразолил, тиазолил, изотиазолил, оксазолил, изоксазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, триазолил, тетразолил, пиридил, пиримидил, пиридазинил, пиразинил, триазинил, бензофуранил, бензотиенил, бензотиадиазолил, бензотиазолил, бензоксазолил, бензоксадиазолил, бензимидазолил, индолил, изоиндолил, индазолил, хинолил, изохинолил, циннолинил, хиназолинил, хиноксалинил, бензодиоксолил, индолизинил, имидазопиридил и предпочтительно индол-2-ил.

Примеры "двухвалентной С₂-С₅₀-углеводородной группы", описанной в настоящем изобретении, включают, хотя и без наложения особых ограничений, линейные, разветвленные, циклические и частично циклические алкиленовые группы, алкениленовые группы и алкиниленовые группы, содержащие от 2 до 50 атомов углерода. Каждая из этих групп может представлять собой двухвалентное ароматическое кольцо или может содержать ароматическое кольцо в качестве фрагмента структуры.

На "двухвалентную С₂-С₅₀-полиалкиленоксигруппу", описанную в настоящем изобретении, не налагаются особые ограничения, и алкиленовая группа, содержащаяся в повторяющемся звене, может являться линейной или разветвленной. Примеры "двухвалентной С₂-С₅₀-полиалкиленоксигруппы" включают двухвалентную С₂-С₅₀-полиэтиленоксигруппу, С₃-С₄₈-полипропиленоксигруппу и С₃-С₄₈-полибутиленоксигруппу. Каждая из этих групп может быть связана с другой группой через атом кислорода или атом углерода. Примеры С₂-С₅₀-полиэтиленоксигруппы включают -О(CH₂CH₂O)_1-25-, -(CH₂CH₂O)_1-25-, -(OCH₂CH₂)_1-25- и -(CH₂CH₂O)_1-24-(CH₂CH₂)-.

На термин "соль", описанный в настоящем изобретении, не налагаются особые ограничения при условии, что соль представляет собой неорганическое вещество, растворимое в воде. Ее примеры включают: соли кальция, такие как хлорид кальция и фосфат кальция; соли магния, такие как сульфат магния и хлорид магния; соли алюминия, такие как сульфат алюминия и хлорид алюминия; соли калия, такие как сульфат калия, карбонат калия, нитрат калия, хлорид калия, бромид калия и йодид калия; соли натрия, такие как бикарбонат натрия, карбонат натрия, сульфат натрия, нитрат натрия, хлорид натрия, бромид натрия, йодид натрия, силикат натрия, тринатрийфосфат, динатрийфосфат, борат натрия, ацетат натрия и цитрат натрия; и соли лития, такие как хлорид лития, бромид лития, йодид лития, и карбонат лития, и предпочтительно, если они включают хлорид натрия, тринатрийфосфат, динатрийфосфат, хлорид калия, хлорид кальция и хлорид магния.

Термин "антиген", описанный в настоящем изобретении, означает вещество, которое стимулирует иммунный ответ. Антигеном, например, является вещество, которое индуцирует активацию лимфоцитов, таких как Т-клетки или В-клетки, путем представления антигенпрезентирующими клетками в лимфатическом узле или в селезенке. Термин "антигенный белок" означает антиген, который является белком. Термин "антигенный пептид" означает антиген, который является пептидом. Так, например, антигенный пептид представляет собой часть последовательности аминокислот, содержащейся в антигенном белке, и включает эпитоп, распознающийся Т-клетками. Может быть объединено несколько эпитопов, распознающихся Т-клетками.

Термин "адъювант", описанный в настоящем изобретении, означает вещество, которое стимулирует иммунный ответ у субъекта при введении субъекту в комбинации с вакциной, включающей антиген.

Производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I)

В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), в основном состоит из (1) повторяющегося звена формулы (I); или (2) повторяющихся звеньев формулы (I) и формулы (IIIc).

Если производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), содержит два или большее количество повторяющихся звеньев формулы (I), то повторяющиеся звенья могут быть одинаковыми или разными. Производное гиалуроновой кислоты может быть модифицировано в положении, отличающимся от повторяющегося звена формулы (I). Так, например, гидроксигруппу можно превратить в -O(C₁-C₆-алкил), -О(формил) или -O(С₁-С₆-алкилкарбонил) и т.п., и карбоксигруппу можно превратить в амидную группу или сложноэфирную группу, или можно получить соль.

В одном варианте осуществления в формуле (I) группа -Z-N(R^a)Y-X¹ выбрана из числа групп, описывающихся следующими формулами:

-NH-(CH₂)_mz-NH-R;

-NH-(CH₂)_mz-NH-COO-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-NH-COO-R;

-NH-(CH₂)_mz-COO-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-COO-R;

-NH-(CH₂)_mz-O-COO-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-O-COO-R;

-NH-(CH₂)_mz-S-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-S-R;

-NH-(CH₂)_mz-O-CO-CH(R¹⁰)-CH₂-S-R;

-NH-(CH₂)_mz-NHCO-CH(R¹⁰)-CH₂-S-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-NHCO-CH(R¹⁰)-CH₂-S-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-O-CO-CH(R¹⁰)-CH₂-S-R;

-NH-(CH₂)_mz-S-S-R и

-Z-NR^a-Y-NR^b-COO-R

где mz обозначает целое число, равное от 2 до 30, R¹⁰ обозначает атом водорода или метальную группу, и R и m являются такими, как уже определено в настоящем изобретении.

Предпочтительно, если группой, является группа, выбранная из числа следующих:

-NH-(CH₂)_mz-NH-COO-R;

-NH-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-NH-COO-R и

-NH-(CH₂)_mz-S-S-R

где mz, R, и m являются такими, как уже определено в настоящем изобретении.

В предпочтительном варианте осуществления Z в формуле (I) обозначает непосредственную связь. В одном варианте осуществления, если в Z формуле (I) обозначает пептидный мостик, то X¹ обозначает -NR^b-COO-R.

В формуле (I) конкретные примеры Y включают -CH₂CH₂O-CH₂CH₂-S-S-СН₂СН₂О-СН₂СН₂-, -(CH₂CH₂O)₂-CH₂CH₂-S-S-CH₂CH₂O-CH₂CH₂-, -СН₂СН₂О-CH₂CH₂-S-S-(CH₂CH₂O)₂-CH₂CH₂- и -(CH₂CH₂O)₂-CH₂CH₂-S-S-(CH₂CH₂O)₂- СН₂СН₂-.

Предпочтительно, если Y^a в формуле (I) обозначает -СН₂- и -СН₂-СН₂-.

Предпочтительно, если Y^b в формуле (I) обозначает -СН₂-СН₂-, -СН(СН₃)СН₂-, 2-бутен-1,4-диил, гепта-2,4-диен-1,6-диил или окта-2,4,6-триен-1,8-диил, более предпочтительно -СН₂-СН₂- или -СН(СН₃)СН₂-.

В одном варианте осуществления Z в формуле (I) обозначает пептидный мостик, описывающийся формулой -NH-[CH(-Z^a)-CONH]_n-1-CH(-Z^a)-CO-, в которой n обозначает целое число, равное от 2 до 30, и каждый Z^a независимо обозначает заместитель, содержащийся в α-аминокислоте, описывающейся формулой H₂N-CH(-Z^a)-СООН. N-Конец пептидного мостика соединен с карбоксигруппой, содержащейся во фрагменте глюкуроновой кислоты, и его С-конец соединен с группой -N(-R^a)-Y-X. Примеры аминокислот, которые можно использовать в качестве аминокислотных остатков, содержащихся в пептидном мостике, включают α-аминокислоты, например, природные (L)-аминокислоты, такие как аланин, аргинин, аспарагин (Asn), аспартовая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин (Gly), гистидин, изолейцин, лейцин (Leu), лизин, метионин, фенилаланин (Phe), пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валини их D-формы. Можно использовать любую α-аминокислоту, включая синтезированные аминокислоты. Точнее, примеры Z^a включают -СН₃, H₂NC(NH)NH(CH₂)₃- и H₂NCOCH₂-. Z могут быть одинаковыми или разными, n обозначает целое число, равное от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 4. Предпочтительные примеры пептидного мостика включают -Gly-Phe-Leu-Gly-, -Asn-Phe-Phe-, -Phe-Phe- и -Phe-Gly-.

В формуле (I) конкретные примеры группы -Z-N(R^a)Y-X¹ включают -NH-(СН₂)₂-NH-СО-холестерил, -NH-(CH₂)₄-NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₃-NH-COO-холестерил, -МН-(СН₂)₃-NH-(СН₂)₄-NH-(СН₂)₃-NH-СОО-холестерил, -NH-(СН₂)₄-NH-(СН₂)₃-NH-СОО-холестерил, -NH-(CH₂)₄-N(-(CH₂)₃-NH₂)-COO-холестерил, -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-N(-(CH₂)₃-NH₂)-COO-холестерил, -NH-(СН₂)₃-NH-(СН₂)₄-N(-(СН₂)₃-NH-(СН₂)₃-NH₂)-СОО-холестерил, -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-N(-(CH₂)₃-NH₂)-CO-NH-холестерил, -NH-(CH₂)₃-NH-(CH₂)₄-N(-(CH₂)₃-NH₂)-СО-холестерил и -NH-(СН₂)₃-NH-(СН₂)₄-N(-(СН₂)₃-NH₂)-холестерил. В предпочтительном варианте осуществления группы -Z-N(R^a)Y-X¹: R^a, R^b и R^c все обозначают атом водорода, Y обозначает линейный С₂-С₃₀-алкилен или - (CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂- и Y^a обозначает линейный С₁-С₅-алкилен, или Y^b обозначает линейный С₂-С₈-алкилен или линейный С₂-С₈-алкенилен.

В одном варианте осуществления в группе Z-N(R^a)Y-X¹: Z обозначает непосредственную связь, R^a обозначает атом водорода, Y обозначает, например, С₂-С₁₂-алкилен, предпочтительно С_2-6 алкилен, более предпочтительно С₆ алкилен, X¹ обозначает -NR^b-COO-R, R^b обозначает атом водорода и R обозначает холестерильную группу.

В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), дополнительно содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (IIIc). Если содержатся два или большее количество повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (IIIc), то повторяющиеся звенья могут быть одинаковыми или разными.

В формуле (IIIc) на Q⁺ не налагаются особые ограничения при условии, что Q⁺ обозначает противокатион, который в воде образует соль с карбоксигруппой. Двухвалентный или обладающий более высокой валентностью Q⁺ в соответствии с его валентностью образует соль со множеством карбоксигрупп. Примеры противокатиона включают: ионы металлов, такие как ионы лития, ионы натрия, ионы рубидия, ионы цезия, ионы магния и ионы кальция; и ионы аммония, описывающиеся формулой: N⁺R^jR^kR^lR^m (в которой R^j R^k, R^l и R^m все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода и С₁-C₆-алкил), и предпочтительно, если они включают ионы натрия, ионы калия и ионы тетраалкиламмония (например, ионы тетра-н-бутиламмония). R^j, R^k, R^l и R^m предпочтительно обозначают одинаковые группы, выбранные из числа C₁-C₆-алкилов, и предпочтительно, если они обозначают н-бутильные группы.

Предпочтительно, если в формуле (I) все группы R¹, R², R³ и R⁴, и в формуле (IIIc) R^1a, R^2a, R^3a и R^4a представляют собой атомы водорода.

Предпочтительно, если R^a и R^b оба обозначают атомы водорода.

Предпочтительно, если в формуле (I) группа R⁵ представляет собой ацетил.

В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), в основном состоит из повторяющихся звеньев формул (I) и (IIIc). В производном гиалуроновой кислоты, например, 80% или большее количество, предпочтительно 90% или большее количество, более предпочтительно 95% или большее количество дисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, содержащихся в производном, являются повторяющимися звеньями формулы (I) или (IIIc). В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты состоит только из повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (I) и формулой (IIIc).

Y, определенный в формуле (I), может обозначать, например, -(СН₂)_na- (где _na выбран из числа целых чисел, равных от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 15, более предпочтительно от 2 до 12), и предпочтительно, если он обозначает -(СН₂)₂-, -(СН₂)₆-, -(СН₂)₈- или -(CH₂)₁₂-, более предпочтительно -(СН₂)₆.- Такой Y является предпочтительным с точки зрения обеспечения образования осадка и стабильной дисперсии, описанных ниже.

В одном варианте осуществления в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), степень введения гидрофобной группы в дисахаридные повторяющиеся звенья, содержащиеся в производном, составляет, например, от 1 до 50%, предпочтительно от 7 до 50%, более предпочтительно от 17 до 50%, еще более предпочтительно от 20 до 45%. Если степень введения находится в диапазоне, описанном выше, то производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), может эффективно образовывать комплекс с антигеном в растворе.

В этом контексте степень введения гидрофобной группы рассчитывают в соответствии со следующим выражением:

В этом контексте "дисахаридные повторяющиеся звенья, содержащиеся в производном", включают повторяющиеся звенья формулы (I), в которые гидрофобная группа введена путем превращения карбоксигруппы в амидную группу, и повторяющиеся звенья формулы (IIIc), в которые не введена гидрофобная группа. Степень введения можно регулировать путем изменения условий проведения реакции, например, отношения количеств реагентов, и ее можно определить, например, путем исследования с помощью ЯМР (ядерный магнитный резонанс).

Предпочтительно, если производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), синтезируют с использованием в качестве исходного вещества гиалуроновой кислоты, состоящей только из повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (IIIc), или ее производного, где, если R^1c, R^2c, R^3c и R^4c все обозначают атомы водорода, R^5c обозначает ацетил и X^c обозначает -О^-Na⁺, то среднемассовая молекулярная масса равна, например, от 1 до 500 кДа, предпочтительно от 3 до 500 кДа, более предпочтительно от 5 до 200 кДа. В одном варианте осуществления с точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном предпочтительно, если среднемассовая молекулярная масса исходного вещества равна от 1 до 1000 кДа, более предпочтительно от 3 до 200 кДа. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу предпочтительно, если среднемассовая молекулярная масса исходного вещества равна от 1 до 1000 кДа, более предпочтительно от 3 до 500 кДа, еще более предпочтительно от 5 до 200 кДа, еще более предпочтительно от 5 до 150 кДа.

Гиалуроновую кислоту и ее производное обычно затруднительно получить в виде отдельных продуктов. Поэтому их молекулярные массы рассчитывают, как среднечисловые молекулярные массы или среднемассовые молекулярные массы. В настоящем изобретении рассчитывают среднемассовую молекулярную массу. В качестве методик определения среднемассовой молекулярной массы можно использовать различные методики, известные в данной области техники, например, методику с использованием светорассеяния, методику с использованием определения осмотического давления и методику с использованием определения вязкости, описанные в публикации Seiichi Nakahama, et al., "Essential Polymer Science" (опубликованной Kodansha Ltd., ISBN 4-06-153310-Х). Средневязкостную молекулярную массу, описанную в настоящем изобретении, также можно определить по методике, обычно использующейся в области техники, к которой относится настоящее изобретение, например, с использованием вискозиметра Уббелоде. В случае использования имеющихся в продаже гиалуроновой кислоты и ее производного, обладающих явно указанной молекулярной массой, явно указанной численное значение можно использовать в качестве молекулярной массы.

В производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено формулы (I), гидрофобную группу вводят путем превращения карбоксигруппы, содержащейся в глюкуроновой кислоте, представляющей собой один из сахаридов, входящих в состав дисахарида, образующего повторяющееся звено, в амидную группу. Кинетические характеристики препарата, получаемого с использованием производного гиалуроновой кислоты, in vivo можно регулировать путем изменения степени модификации производного гиалуроновой кислоты.

Если степень модификации карбоксигруппы, содержащейся во фрагменте глюкуроновой кислоты, входящем с состав производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено формулы (I), является высокой, то подавляется связывание с рецептором гиалуроновой кислоты, включая CD44, при этом производное гиалуроновой кислоты выступает в роли носителя лекарственного средства (включая вакцину), которое остается в организме в течение длительного времени. Кроме того, можно направленно воздействовать на каждый орган, включая лимфатический узел, и клетки путем введения направленно действующего элемента в производное гиалуроновой кислоты. Примеры направленно действующего элемента включают направленно действующие тканеспецифичные пептиды, антитела, фрагменты антител, аптамеры, пептиды, обладающие последовательностью RGD, эффективные по отношению к раковым клеткам, фолиевую кислоту, анисамид, трансферрин, галактозу для печени и токоферол.

С точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном степень модификации карбоксигруппы с помощью гидрофобной группы, т.е. степень введения гидрофобной группы во фрагмент глюкуроновой кислоты, входящем с состав производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено формулы (I), предпочтительно составляет от 4 до 60%, более предпочтительно от 5 до 50%, еще более предпочтительно от 7 до 50%, еще более предпочтительно от 7 до 45%. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу степень введения предпочтительно составляет от 6 до 60%, более предпочтительно от 17 до 50%, еще более предпочтительно от 20 до 50%, еще более предпочтительно от 20 до 45%.

С точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном комбинация значений молекулярной массы исходного вещества и степени введения гидрофобной группы в производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), предпочтительно составляет от 3 до 500 кДа и от 4 до 60%, более предпочтительно от 3 до 200 кДа и от 6 до 50%, еще более предпочтительно от 5 до 200 кДа и от 6 до 50%, еще более предпочтительно от 5 до 150 кДа и от 6 до 45%. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу комбинация значений предпочтительно составляет от 3 до 500 кДа и от 4 до 60%, более предпочтительно от 3 до 200 кДа и от 6 до 50%, еще более предпочтительно от 5 до 200 кДа и от 6 до 50%, еще более предпочтительно от 5 до 150 кДа и от 20 до 45%. С точки зрения обеспечения образования стабильной дисперсии комбинация значений предпочтительно составляет от 3 до 200 кДа и от 4 до 60%, более предпочтительно от 3 до 200 кДа и от 6 до 50%, еще более предпочтительно от 5 до 200 кДа и от 6 до 50%, еще более предпочтительно от 5 до 150 кДа и от 17 до 45%. С точки зрения обеспечения улучшения удерживание в крови комбинация значений предпочтительно составляет от 5 до 27 кДа и от 2 до 50%, более предпочтительно от 5 до 27 кДа и от 8 до 35%, еще более предпочтительно от 5 до 18 кДа и от 8 до 35%, еще более предпочтительно от 5 до 18 кДа и от 8 до 35%, еще более предпочтительно от 5 до 18 кДа и от 15 до 22%. С точки зрения обеспечения гелеобразования комбинация значений предпочтительно составляет от 5 до 300 кДа и от 2 до 30%, более предпочтительно от 5 до 50 кДа и от 2 до 22%, еще более предпочтительно от 5 до 27 кДа и от 2 до 22%, еще более предпочтительно от 5 до 27 кДа и от 7 до 22%.

Производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II)

В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), в основном состоит из (1) повторяющегося звена формулы (II); (2) повторяющихся звеньев формулы (II) и формулы (III); (3) повторяющихся звеньев формулы (II) и формулы (IIIc); или (4) повторяющихся звеньев формулы (II), формулы (III) и формулы (IIIc). В производном гиалуроновой кислоты, например, 80% или большее количество, предпочтительно 90% или большее количество, более предпочтительно 95% или большее количество дисахаридных повторяющихся звеньев, состоящих из D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, содержащихся в производном, являются повторяющимися звеньями формулы (II), (III) или (IIIc). В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты состоит только из (1) повторяющегося звена формулы (II); (2) повторяющихся звеньев формулы (II) и формулы (III); (3) повторяющихся звеньев формулы (II) и формулы (IIIc); или (4) повторяющихся звеньев формулы (II), формулы (III) и формулы (IIIc).

Отношение количества конкретных дисахаридных звеньев к количеству дисахаридных повторяющихся звеньев, содержащихся в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), означает отношение количества конкретных дисахаридных звеньев к количеству всех дисахаридных звеньев, содержащихся в заданном количестве производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), которое является полисахаридом, содержащим в качестве повторяющихся звеньев дисахаридные звенья.

В формуле (II), которая описывает дисахаридное звено, содержащееся в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), все R^1a, R^2a, R^3a и R^4a предпочтительно обозначают атомы водорода. R^5a предпочтительно обозначает атом водорода или C₁-C₆-алкилкарбонил, более предпочтительно атом водорода или ацетил, еще более предпочтительно ацетил. В формулах (III) и (IIIc), которые описывают дисахаридные звенья, содержащиеся в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), все R^1b, R^2b, R^3b и R4^b, и R^1c, R^2c, R^3c и R^4c предпочтительно обозначают атомы водорода. Каждый из R^5b и R^5c предпочтительно обозначает атом водорода или C₁-C₆-алкилкарбонил, более предпочтительно атом водорода или ацетил. Еще более предпочтительно, если оба эти фрагмента представляют собой ацетил.

Конкретные примеры R^aa, содержащегося в формуле (II), включают атом водорода, метил, гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, карбамоилметил, карбоксиметил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, изопропил, 2-карбоксиэтил, 2-метилтиоэтил, 2-карбамоилэтил, фенилметил, (4-гидроксифенил)метил и индол-3-илметил.

Если группа -CHR^aa- представляет собой асимметрический центр, то в объем настоящего изобретения также входят соответствующие оптические изомеры и их смеси. Предпочтительно, если H₂N-CHR^aa-СООН (аминокислота) находится в L-конфигурации (природная).

R^6a, R⁷, R⁸ и R⁹ в формуле (II) все независимо обозначают, например, атом водорода или метил. Предпочтительно, если все эти фрагменты представляют собой атомы водорода.

В формуле (II) одной формой группы -CHR^aa-CO-X^1a является, например, группа -CHR^aa-COOH. Конкретные примеры группы включают следующие группы.

В этом контексте каждый знак звездочки означает положение присоединения к -NR^6a- (это также справедливо для приведенного ниже описания).

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-COOH включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-COOH включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-COOH включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-COOH включают следующие группы.

С точки зрения обеспечения доставки комплекса к лимфатическому узлу предпочтительные примеры группы -CHR^aa -СООН включают следующие группы.

Более предпочтительные примеры группы включают следующие группы.

Еще более предпочтительные примеры группы включают следующие группы.

Все группы -CHR^aa -СООН, указанные выше, можно полностью или частично превратить в группу -CHR^aa -CONH-Z¹ -Z². Примерами группы -Z¹-Z² являются указанные ниже.

В формуле (II) другой формой группы -CHR^aa-CO-X^1a является, например, группа -CHR^aa-CONH₂. Конкретные примеры группы включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ включают следующие группы.

Эти группы также являются предпочтительными группами с точки зрения обеспечения характеристик и биологической разлагаемости, и удерживания в крови.

С точки зрения обеспечения характеристик и биологической разлагаемости, и удерживания в крови предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ также включают следующие группы.

С точки зрения обеспечения характеристик и биологической разлагаемости, и удерживания в крови более предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ также включают следующие группы.

С точки зрения обеспечения более подходящей диспергируемости в чистой воде предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ включают следующие группы.

Эти две группы также являются предпочтительными примерами с точки зрения обеспечения возможности использования в качестве материала-основы для препарата для инъекции, предназначенного для непрерывного подкожного введения.

С точки зрения обеспечения возможности использования в качестве материала-основы для препарата для инъекции, предназначенного для непрерывного подкожного введения, предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH₂ включают следующую группу.

Более предпочтительно, если R⁷ обозначает атом водорода или метил, еще более предпочтительно атом водорода.

Карбоксигруппа, определенная в формулах (II), (III) и (IIIc), может образовывать соль, описывающуюся формулой -COO^-Q⁺. В этом контексте на Q⁺ не налагаются особые ограничения при условии, что Q⁺ обозначает противокатион, который в воде образует соль с карбоксигруппой. Двухвалентный или обладающий более высокой валентностью Q⁺ в соответствии с его валентностью образует соль со множеством карбоксигрупп. Примеры противокатиона включают: ионы металлов, такие как ионы лития, ионы натрия, ионы рубидия, ионы цезия, ионы магния и ионы кальция; и ионы аммония, описывающиеся формулой: N⁺R^jR^kR^lR^m (в которой R^j, R^k, R^l и R^m все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода и С₁-C₆-алкил), и предпочтительно, если они включают ионы натрия, ионы калия и ионы тетраалкиламмония (например, ионы тетра-н-бутиламмония). R^j, R^k, R^l и R^m предпочтительно обозначают одинаковые группы, выбранные из числа C₁-С₆-алкилов, и предпочтительно, если они обозначают н-бутильные группы.

В формуле (II) альтернативной формой группы -CHR^aa-CO-X^1a является, например, группа -CHR^aa -CONH-Z¹-Z². Конкретные примеры группы включают следующие группы.

Другие конкретные примеры группы включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH-Z¹-Z² включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa-CONH-Z¹-Z² включают следующие группы.

Предпочтительные примеры группы -CHR^aa -CONH-Z¹-Z² включают следующие группы.

С точки зрения обеспечения доставки комплекса к лимфатическому узлу предпочтительные примеры группы -CHR^aa -CONH-Z¹-Z² включают следующие группы.

Более предпочтительные примеры группы включают следующие группы.

Еще более предпочтительные примеры группы включают следующие группы.

С точки зрения обеспечения характеристик и биологической разлагаемости, и удерживания в крови предпочтительные примеры группы -CHR^aa -CONH-Z¹-Z² включают следующие группы.

Примеры группы-Z¹-Z² включают группу -(С₂-С₁₀-алкилен)-NH-COOZ³. Ее примеры также включают группу -(С₂-С₁₂-алкилен)-NH-COOZ³. В этом контексте примеры С₂-С₁₂-алкилена предпочтительно включают -(СН₂)₂-, -(СН₂)₆-, -(СН₂)₈-, -(СН₂)₁₀- и -(CH₂)₁₂- и более предпочтительно, если они включают -(СН₂)₂- и -(СН₂)₆- Примеры группы -Z¹-Z² включают группу -(CH₂CH₂O)_ma-CH₂CH₂-NH-Z³. В этом контексте та предпочтительно равно от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, еще более предпочтительно от 1 до 3. Конкретные примеры предпочтительных значений та включают 2. Примеры группы -Z¹ -Z² предпочтительно включают группу -(гексан-1,6-диил)-NH-СОО-Z³, группу -(этан-1,2-диил)-NH-СОО-Z³ и группу -(CH₂CH₂O)₂-CH₂CH₂-NH-Z³, более предпочтительно, если они включают группу -(гексан-1,6-диил)-NH-СОО-холестерил, группу -(этан-1,2-диил)-NH-СОО-холестерил и группу -(СН₂СН₂О)₂-СН₂СН₂-NH-холаноил, и еще более предпочтительно, если они включают группу -(гексан-1,6-диил)-NH-СОО-холестерил. В производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), примеры Z¹, Z² и группы -Z¹-Z² также включают соответствующие Y, X¹ и группе -Y-X¹ соответственно. Примеры группы -CO-NR^ca -Z³ и группы -O-CO-NR^ca -Z³ включают соответствующие группы, в которых R^ca обозначает атом водорода.

В одном варианте осуществления в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), группа X^1a представляет собой -NR⁹ -Z¹ -Z², R⁹ обозначает атом водорода, Z¹ обозначает, например, С₂-С₁₂-алкилен, предпочтительно С₂-С₁₂-алкилен, более предпочтительно C₆-алкилен, Z² обозначает -NR^ba -COO-Z³, R^ba обозначает атом водорода и Z³ обозначает стерильную группу; и группа R^aa представляет собой атом водорода или C₁-C₆-алкил, где алкил необязательно замещен одной или большим количеством групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей гидроксигруппу, карбоксигруппу, карбамоил, C₁-C₆-алкилтиогруппу, арил и гетероарил, где арил необязательно замещен одной или большим количеством гидроксигрупп.

С точки зрения обеспечения доставки комплекса к лимфатическому узлу R^aa предпочтительно включают метил, гидроксиметил, атом водорода, 1-гидроксиэтил, карбамоилметил, карбоксиметил, бензил, (4-гидроксифенил)метил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, изопропил, индол-3-илметил, 2-карбамоилэтил и 2-карбоксиэтил, более предпочтительно, если они включают метил, гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, 1-метилпропил и 2-карбамоилэтил, еще более предпочтительно, если они включают метил и 2-карбамоилэтил.

В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), предпочтительно также содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (III). В более предпочтительном варианте осуществления X^1a в формуле (II) и X² в формуле (III) являются одинаковыми. В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), может содержать повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), повторяющееся звено, описывающееся формулой (III), и повторяющееся звено, описывающееся формулой (IIIc), в которой X^1a обозначает -NR⁹ -Z¹-Z².

В другом альтернативном варианте осуществления в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), отношение количество повторяющихся звеньев формулы (II) и/или формулы (III), содержащих группу -NR⁹ -Z¹-Z² (ниже в настоящем изобретении также называющуюся гидрофобной группой), к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев (степень введения гидрофобной группы) может составлять от 3 до 50%.

В этом контексте степень введения гидрофобной группы рассчитывают в соответствии со следующим выражением:

В этом контексте "дисахаридные повторяющиеся звенья, содержащиеся в производном", включают повторяющиеся звенья формулы (II) и формулы (III), и повторяющееся звено формулы (IIIc). Степень введения можно регулировать путем изменения условий проведения реакции, например, отношения количеств реагентов, и ее можно определить, например, путем исследования с помощью ЯМР.

Степень введения гидрофобной группы в производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), составляет, например, от 3 до 50%, предпочтительно от 5 до 40%, более предпочтительно от 5 до 35%, еще более предпочтительно от 5 до 25%, еще более предпочтительно от 5 до 20%, еще более предпочтительно от 5 до 10%. С точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном степень введения предпочтительно составляет от 3 до 60%, более предпочтительно от 7 до 50%, еще более предпочтительно от 18 до 45%, еще более предпочтительно от 20 до 35%. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу степень введения предпочтительно составляет от 3 до 60%, более предпочтительно от 7 до 50%, еще более предпочтительно от 18 до 45%, еще более предпочтительно от 20 до 35%.

В одном варианте осуществления в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), X^1a в формуле (II) обозначает -NR⁹ -Z¹-Z². В этом случае с точки зрения обеспечения характеристик и биологической разлагаемости, и удерживания в крови отношение количества дисахаридных звеньев формулы (II) к количеству дисахаридных повторяющиеся звеньев, содержащихся в производном гиалуроновой кислоты, составляет, например, 70% или более, предпочтительно 75% или более, более предпочтительно 90% или более. Верхнее предельное значение может составлять 100% или менее. Диапазон значений отношения составляет, например, от 70 до 100%, предпочтительно от 75 до 100%, более предпочтительно от 90 до 100%. С точки зрения обеспечения характеристик образования комплекса с антигеном значение отношения составляет, например, 10% или более, предпочтительно 20% или более, более предпочтительно 50% или более, еще более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 90% или более. Верхнее предельное значение может составлять 100% или менее. Диапазон значений отношения составляет, например, от 10 до 100%, предпочтительно от 20 до 100%, более предпочтительно от 50 до 100%, еще более предпочтительно от 70 до 100%, еще более предпочтительно от 90 до 100%. С точки зрения обеспечения характеристик переноса комплекса к лимфатическому узлу значение отношения составляет, например, 10% или более, предпочтительно 20% или более, более предпочтительно 50% или более, еще более предпочтительно 70% или более, еще более предпочтительно 90% или более. Верхнее предельное значение может составлять 100% или менее. Диапазон значений отношения составляет, например, от 10 до 100%, предпочтительно от 20 до 100%, более предпочтительно от 50 до 100%, еще более предпочтительно от 70 до 100%, еще более предпочтительно от 90 до 100%. Производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), может дополнительно содержать повторяющееся звено, описывающееся формулой (III).

В одном варианте осуществления производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), не содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), в которой X¹ обозначает - NR⁹ -Z¹ -Z². В этом случае сумма отношения количества повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (II), к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев и отношения количества повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (III), к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев составляет, например, от 70 до 100%, предпочтительно от 80 до 100%, более предпочтительно от 90 до 100%. С точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном сумма составляет, например, от 7 до 100%, предпочтительно от 20 до 100%, более предпочтительно от 30 до 100%. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу сумма составляет, например, от 20 до 100%, предпочтительно от 30 до 100%, более предпочтительно от 70 до 100%.

В этом контексте в производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), отношение количества повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (III), к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев предпочтительно составляет от 3 до 50%, более предпочтительно от 5 до 40%, еще более предпочтительно от 5 до 35%, еще более предпочтительно от 5 до 25%, еще более предпочтительно от 5 до 20%, еще более предпочтительно от 5 до 10%. С точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном значение отношения предпочтительно составляет от 3 до 60%, более предпочтительно от 7 до 50%, еще более предпочтительно от 18 до 45%, еще более предпочтительно от 20 до 35%. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу значение отношения предпочтительно составляет от 3 до 60%, более предпочтительно от 7 до 50%, еще более предпочтительно от 18 до 45%, еще более предпочтительно от 20 до 35%.

В производном гиалуроновой кислоты, содержащем повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), отношение количества повторяющихся звеньев, описывающихся формулой (II), к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев предпочтительно составляет от 20 до 97%, более предпочтительно от 30 до 95%, еще более предпочтительно от 35 до 95%, еще более предпочтительно от 45 до 95%, еще более предпочтительно от 50 до 95%, еще более предпочтительно от 60 до 95%. С точки зрения обеспечения образования комплекса с антигеном значение отношения составляет, например, от 7 до 100%, предпочтительно от 20 до 100%, более предпочтительно от 30 до 100%. С точки зрения обеспечения переноса комплекса к лимфатическому узлу значение отношения составляет, например, от 20 до 100%, предпочтительно от 30 до 100%, более предпочтительно от 70 до 100%.

Примеры способов получения производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), и производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), включают способы, описанные в Международных публикациях №№ WO 2010/053140 и WO 2014/038641.

В одном варианте осуществления особенностью производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), является то, что производное гиалуроновой кислоты образует мелкие частицы вследствие ассоциации молекул в воде. Считается, хотя и без наложения особых ограничений, что самопроизвольная ассоциация в воде происходит вследствие гидрофобного взаимодействия введенных гидрофобных групп, при котором образуются мелкие частицы. Вследствие наличия таких характеристик производное гиалуроновой кислоты можно применять в качестве носителя для вакцины, носителя для доставки к лимфатическому узлу, носителя для замедленного высвобождения в кровь или носителя для направленно действующего элемента. На размер мелких частиц не налагаются особые ограничения и он составляет, например, 1 мкм или менее, предпочтительно 500 нм или менее, более предпочтительно 200 нм или менее, еще более предпочтительно 100 нм или менее, еще более предпочтительно 50 нм или менее. Примеры способов получения мелких частиц производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), и производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), включают способы, описанные в Международных публикациях №№ WO 2010/053140 и WO 2014/038641.

Гиалуроновую кислоту или ее соль, или ее производное можно использовать в качестве исходного вещества для получения производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), и производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II). Примеры солей гиалуроновой кислоты могут включать соли, образованные с щелочными металлами, например натриевые соли, калиевые соли и литиевые соли. Особенно предпочтительно, если солью является натриевая соль, которую часто используют в качестве лекарственного средства. Гиалуроновую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль можно получить с использованием различных методик, известных в данной области техники, например, по методике получения извлеченных из организма экстрактов из петушиного гребня, из свиной кожи и т.п., и по методике биологической ферментации, или их можно приобрести в виде имеющегося в продаже продукта (например, выпускающегося фирмами Denka Co., Ltd., Shiseido Co., Ltd., Seikagaku Corp. и R&D Systems, Inc.).

Антиген, содержащийся в комплексе, образованном с мелкими частицами производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), может высвобождаться из комплекса после происходящих после введения распада или разрушения мелких частиц производного гиалуроновой кислоты, и замены антигена на биологический компонент, такой как альбумин. Скорость этого высвобождения можно регулировать путем изменения степени введения гидрофобной группы в производное гиалуроновой кислоты, молекулярной массы производного гиалуроновой кислоты или степени включения аминокислоты в производное гиалуроновой кислоты. Скорость высвобождения антигена можно регулировать путем химической сшивки и получения геля производного гиалуроновой кислоты в соответствии со способом, описанным в Международной публикации № WO 2010/053140. Кроме того, скорость высвобождения антигена можно регулировать путем конъюгирования производного гиалуроновой кислоты с антигеном в соответствии со способом, описанным в Международной публикации № WO 2010/053140.

Антиген

Примеры антигена, который применяют для получения препарата вакцины, проводимого посредством образования комплекса с производным гиалуроновой кислоты, содержащим повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производным гиалуроновой кислоты, содержащим повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), включают антигенные пептиды и антигенные белки, и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота), кодирующие любую из этих последовательностей антигена. Предпочтительно, если антигеном является антигенный пептид или антигенный белок, более предпочтительно, если им является антигенный пептид.

Антигеном может являться опухолевый антиген. Опухолевый антиген представляет собой антиген, часто экспрессирующийся в раковых клетках, и в некоторых случаях экспрессирующийся только в раковых клетках. Опухолевый антиген может экспрессироваться внутри раковых клеток или на поверхности раковых клеток.

Антигенный белок, который можно применять в настоящем изобретении, без наложения ограничений может быть выбран из группы, включающей MART-1/Melan-A, gp 100, связывающийся с аденозиндезаминазой белок (ADAbp), FAP, циклофилин b, связанный с колоректальным раком антитген (CRC)-C017-1A/GA733, карциноэмбриональный антиген (КЭА), САР-1, САР-2, etv6, AML1, специфический антиген простаты (САП), САП-1, САП-2, САП-3, специфический мембранный антиген простаты (СМАП), рецептор Т-клеток/цепь CD3-дзета, CD20, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-А3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Хр2 (MAGE-B2), MAGE-Хр3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8 и GAGE-9, BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, тирозиназу, p53, семейство MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-фетопротеин, Е-кадгерин, α-катенин, β-катенин, γ-катенин, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, аденоматозный полипозный белок coli (АРС), фодрин, коннексин 37, идиотип Ig, р15, gp75, ганглиозид GM2, ганглиозид GD2, белок вируса папилломы человека, опухолевый антиген семейства Smad, lmp-1, Р1А, ядерный антиген, кодируемый с помощью EBV (EBNA)-1, гликогенфосфорилазу головного мозга, SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-4O), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, СТ-7, CD20 и с-erbB-2.

Можно использовать полную последовательность антигенного белка или можно использовать его последовательность, содержащую частичную делецию.

Антигенным пептидом является антигенный пептид, содержащий в последовательности антигенных белков один или большее количество эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и/или эпитопов, распознающихся CD4-позитивными хелперными Т-клетками. В одном варианте осуществления с точки зрения обеспечения включения в молекулу ГКГ класса I или молекулу ГКГ класса II при разложении в антигенпрезентирующих клетках антигенным пептидом предпочтительно является антигенный пептид, содержащий два или большее количество эпитопов. Точнее, примеры антигенного пептида включают антигенные пептиды, содержащие эпитопы антигенного белка опухолевых клеток.

В одном варианте осуществления антигенный пептид содержит, например, от 8 до 120 аминокислот, предпочтительно от 8 до 80 аминокислот, более предпочтительно от 15 до 80 аминокислот, еще более предпочтительно от 16 до 80 аминокислот, еще более предпочтительно от 23 до 80 аминокислот, еще более предпочтительно от 23 до 60 аминокислот, еще более предпочтительно от 23 до 50 аминокислот.

В одном варианте осуществления с точки зрения обеспечения индуцирования активации цитотоксических Т-клеток (CTL) хелперными Т-клетками антигенный пептидом является антигенный пептид, содержащий один или большее количество каждого из следующих: эпитопы, распознающиеся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы, распознающиеся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

В одном варианте осуществления, если содержатся два или большее количество эпитопов, то аминокислотный мостик может быть расположен между эпитопами. Мостик содержит, например, от 2 до 10 аминокислот, предпочтительно от 4 до 10 аминокислот, более предпочтительно от 4 до 8 аминокислот. Примерами аминокислот, предназначенных для использования в мостике, включают глицин (G), тирозин (Y), лейцин (L) и триптофан (W). Предпочтительно, если аминокислотами являются тирозин (Y), лейцин (L) или триптофан (W). Конкретные примеры аминокислотного мостика включают -YYYY- (4Y), -LLLL- (4L), -WWWW- (4W), -GGGGGG- (6G), -YYYYYY- (6Y), -LLLLLL- (6L), -WWWWWW- (6W), -YYYYYYYY- (8Y), -LLLLLLLL- (8L) и -WWWWWWWW- (8W). Предпочтительными являются 6Y, 6L и 6W. Комплекс

Комплекс производного гиалуроновой кислоты, содержащего введенную гидрофобную группу, и антигена, предлагаемый в настоящем изобретении, можно получить путем проводимого в подходящем растворе смешивания производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), с антигеном. Примеры использующегося раствора включают воду, физиологический раствор, различные буферные растворы, растворы сахара, ДМСО (диметилсульфоксид), этанол, ДМФ (N,N-диметилформамид) и их комбинации. Замену растворителя или буферного раствора можно провести по такой методике, как диализ.

Комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно получить, например, путем смешивания мелких частиц производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), с антигеном. Мелкие частицы производного гиалуроновой кислоты и антиген образуют комплекс, который, хотя и без наложения особых ограничений, можно применять в виде комплекса производного гиалуроновой кислоты и антигена. Альтернативно, комплекс производного гиалуроновой кислоты и антигена можно получить путем включения антигена в мелкие частицы производного гиалуроновой кислоты. Комплекс содержит антиген, включенный в мелкие частицы производного гиалуроновой кислоты. Если в комплекс включают антитела, то на антиген наносят покрытие из производного гиалуроновой кислоты.

Примеры способа получения комплекса включают способ добавления раствора антигена к заранее приготовленным мелким частицам производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производного гиалуроновой кислоты, содержащего повторяющееся звено, описывающееся формулой (II). В этом способе приготовленные частицы производного гиалуроновой кислоты и антиген образуют комплекс вследствие таких взаимодействий, как гидрофобное взаимодействие, электростатическое взаимодействие, или вследствие образования водородной связи. Взаимодействие происходит на поверхности мелких частиц или внутри мелких частиц. На условия, такие как растворитель, концентрация соли, значение рН, температура, продолжительность и добавление денатурирующего агента, не налагаются особые ограничения и их можно выбрать соответствующим образом так, чтобы антиген образовывал стабильный комплекс с высокими выходами. В зависимости, например, от концентрации соли или значения рН в момент образования комплекса меняется степень набухания или плотность мелких частиц производного гиалуроновой кислоты, а также меняется состояние ионизации антигена. Поэтому соответствующим образом можно использовать подходящие условия, соответствующие их комбинации. Если комплекс получают при условиях низкой концентрации соли, то можно уменьшить плотность мелких частиц и можно увеличить количество образующегося комплекса вследствие электростатического отталкивания между карбоксигруппами, содержащимися в производных гиалуроновой кислоты, или можно получить комплекс с обладающим более высокой молекулярной массой антигеном. После образования комплекса электростатическое отталкивание ослабляют путем увеличения концентрации соли. Таким образом, плотность мелких частиц увеличивается, при этом размер гелевых сеток меньше, чем размер антигена. В результате этого антиген прочно удерживается и его высвобождение можно замедлить. В этом отношении концентрацию соли можно установить равной физиологической концентрации соли. Для уменьшения размера частиц или для обеспечения однородного размера можно провести обработку ультразвуком с использованием ультразвукового гомогенизатора или аппарата для обработки ультразвуком, сфокусированным в одной точке. Обработку ультразвуком можно провести после смешивания производного гиалуроновой кислоты с антигеном или можно обработать только производное гиалуроновой кислоты. Свободные не образовавшие комплекс антигены можно отделить и удалить по методике диализа или с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭКХ).

В другом способе получения комплекса производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), или производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), можно растворить в подходящем полярном органическом растворителе, таком как ДМСО или ДМФ, и смешать с антигеном, затем заменить растворитель на воду, водный раствор соли или любой из различных водных буферных растворов для обеспечения одновременного образования мелких частиц и образования комплекса. Замену растворителя можно провести, например, путем диализа. Для уменьшения размера частиц или для обеспечения однородного размера можно провести обработку ультразвуком с использованием ультразвукового гомогенизатора или аппарата для обработки ультразвуком, сфокусированным в одной точке. Обработку ультразвуком можно провести после смешивания производного гиалуроновой кислоты с антигеном или можно обработать только производное гиалуроновой кислоты. Обработку ультразвуком также можно провести до или после диализа. Высвобождение из комплекса антигена, образовавшего комплекс с производным гиалуроновой кислоты с использованием такого способа, является менее вероятным. На условия проведения смешивания производного гиалуроновой кислоты с антигеном, такие как природа растворителя, концентрация соли, значение рН, температура, продолжительность и добавление денатурирующего агента, концентрация производного гиалуроновой кислоты, концентрация антигена и отношение количеств производного гиалуроновой кислоты и антигена, не налагаются особые ограничения не налагаются особые ограничения и их можно выбрать соответствующим образом так, чтобы антиген образовывал стабильный комплекс с высокими выходами. На условия замены растворителя на воду, водный раствор соли или любой из различных водных буферных растворов, такие как природа растворителя, концентрация соли, значение рН, температура, продолжительность, количество проведений замены, добавление или отсутствие добавления денатурирующего агента, концентрация производного гиалуроновой кислоты, концентрация антигена и отношение количеств производного гиалуроновой кислоты и антигена, не налагаются особые ограничения и их можно выбрать соответствующим образом так, чтобы антиген образовывал стабильный комплекс с высокими выходами. Путем соответствующего выбора этих условий также можно обеспечить необходимый размер мелких частиц. Свободные не образовавшие комплекс антигены можно отделить и удалить по методике диализа или с помощью эксклюзионной хроматографии (ЭКХ).

Если комплекс представляет собой частицу, но на размер частицы не налагаются особые ограничения и с точки зрения обеспечения переноса к лимфатическому узлу ее размер составляет, например, от 20 до 200 нм, предпочтительно от 20 до 100 нм, более предпочтительно от 20 до 50 нм.

Препарат вакцины

Комплекс можно применять для получения препарата вакцины, предлагаемого в настоящем изобретении, точнее, препарата вакцины, предназначенного для применения для предупреждения и/или лечения рака.

Препарат вакцины, предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить пероральным, внекишечным, назальным, интравагинальным, внутриглазным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрикожным, внутрибрюшинным путем, в полость сустава, внутримозговым или внутриротовым путем. Предпочтительно, если препарат вакцины можно вводить подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрикожно.

Препарат вакцины, предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить в виде фармацевтической композиции, содержащей один или большее количество фармацевтически приемлемых добавок, таких как разбавитель, смачивающий агент, эмульгатор, диспергирующее средство, вспомогательное средство, антисептик, буфер, связующее и/или стабилизатор, находящейся в любой форме, подходящей для назначенного пути введения. Путем введения может являться парентеральный путь или им может являться пероральный путь.

Препарат вакцины, предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа. Применяющимся адъювантом может являться вещество, оказывающее потенциирующее воздействие на активность антигенпрезентирующих клеток и, точнее, выбранное из группы, включающей вещество, активирующее рецептор врожденного иммунитета (образ-распознающий рецептор) и другие вещества, стимулирующие антигенпрезентирующие клетки, и вещество, оказывающее ингибирующее воздействие на приобретение антигенпрезентирующими клетками иммунодепрессивной активности. Рецептор врожденного иммунитета разделяют на Toll-подобный рецептор (TLR), рецептор лектина типа С (CLR), NOD-подобный рецептор (NLR), RIG-I-подобный рецептор (RLR) и сенсор цитоплазматической ДНК. Адъювант, который является агонистом рецептора врожденного иммунитета, может быть выбран из группы, включающей инактивированные клетки микробов, экстракт из клеток микробов, нуклеиновую кислоту, липополисахарид, липопептид, синтетическое низкомолекулярное соединение и т.п. Предпочтительно, если применяют CpG-олиго-ДНК, polyIC-РНК, имидазохинолин (например, R848 и имихимод), сапонин (например, QuilA и QS21), агонист STING (например, циклический ди-ГМФ (гуанозинмонофосфат)), монофосфориллипид, липопептид и т.п.В качестве адъюванта, который является средством, стимулирующим антигенпрезентирующие клетки, можно применять содержащее таксан лекарственное средство или содержащее антрациклин лекарственное средство. Адъювант, который является средством, оказывающим ингибирующее воздействие на приобретение антигенпрезентирующими клетками иммунодепрессивной активности, выбран из группы, включающей вещество, ингибирующее JAK/STAT, вещество, ингибирующее индолдиоксигеназу (ИДО), вещество, ингибирующее триптофандиоксигеназу (ТДО) и т.п. Эти ингибирующие вещества включают соединения, оказывающие антагонистическое воздействие на факторы, а также нейтрализующие антитела, малую интерферирующую РНК (миРНК) и антисмысловую ДНК, воздействующую на факторы.

Адъювантом, который применяют для препарата вакцины, предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно является адъювант, который представляет собой агонист рецептора врожденного иммунитета, более предпочтительно агонист Toll-подобного рецептора (TLR) или сенсор цитоплазматической ДНК. Предпочтительно, если агонистом TLR является CpG-олиго-ДНК, polyIC-PHK, имидазохинолин, такой как R848 или имихимод, сапонин, такой как QuilA или QS21, агонист STING или монофосфориллипид.

Адъювант и препарат вакцины можно вводить в виде отдельных препаратов или их можно вводить в виде одного препарата. Для применения с производным гиалуроновой кислоты, содержащим повторяющееся звено, описывающееся формулой (I), адъювант может быть с ним конъюгирован по методике, описанной в Международной публикации № WO 2010/053140. В случае введения в комбинации количество вводимого препарата вакцины, предлагаемого в настоящем изобретении, составляет, например, от 0,01 до 100 мг/доза, предпочтительно от 0,1 до 50 мг/доза, более предпочтительно, например, от 0,1 до 20 мг/доза, и количество вводимого адъюванта составляет, например, от 0,01 до 100 мг/(кг массы тела), предпочтительно от 0,1 до 50 мг/(кг массы тела), более предпочтительно от 0,1 до 10 мг/(кг массы тела). Адъювант можно вводить одновременно с препаратом вакцины, предлагаемым в настоящем изобретении (включая случай, в котором адъювант включен в препарат вакцины), или адъювант и препарат вакцины можно вводить в разные моменты времени. В случае введения в разные моменты времени, предпочтительно, если вводят один из следующих: адъювант и препарат вакцины, и затем вводят другой, например, в течение промежутка времени, составляющего от 1 мин до 5 ч, предпочтительно от 1 мин до 1 ч.

Препарат вакцины, предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа, предназначенными для применения для лечения рака. Антителами являются, например, антитела, ингибирующие иммунодепрессивный сигнал, поступающий от опухоли, или антитела по меньшей мере одного типа, активирующие костимулирующий сигнал иммуноцитов, предпочтительно, если ими являются антитела, ингибирующие иммунодепрессивный сигнал, поступающий от опухоли, или антитела, активирующие костимулирующий сигнал иммуноцитов. Точнее, антителами являются антитела по меньшей мере одного типа, выбранные из группы, включающей антитела к CTLA4, антитела к PD1, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 и антитела к 4-1ВВ. В случае введения в комбинации количество вводимого препарата вакцины, предлагаемого в настоящем изобретении, составляет, например, от 0,01 до 100 мг/доза, предпочтительно от 0,1 до 50 мг/доза, более предпочтительно, например, от 0,1 до 20 мг/доза, и количество вводимых антител составляет, например, от 0,01 до 200 мг/ (кг массы тела), предпочтительно от 0,1 до 100 мг/(кг массы тела), более предпочтительно от 1 до 40 мг/(кг массы тела). Антитела можно вводить одновременно с препаратом вакцины, предлагаемым в настоящем изобретении (включая случай, в котором антитела включены в препарат вакцины), или антитела и препарат вакцины можно вводить в разные моменты времени. В случае введения в разные моменты времени, предпочтительно, если вводят один из следующих: антитела и препарат вакцины, и затем вводят другой, например, в течение промежутка времени, составляющего от 1 мин до 24 ч, предпочтительно от 1 мин до 5 ч.

Препарат вакцины, предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации и с адъювантом, и с антигеном. В этом случае количество вводимого препарата вакцины, предлагаемого в настоящем изобретении, составляет, например, от 0,01 до 100 мг/доза, предпочтительно от 0,1 до 50 мг/доза, более предпочтительно, например, от 0,1 до 20 мг/доза, количество вводимого адъюванта составляет, например, от 0,01 до 100 мг/(кг массы тела), предпочтительно от 0,1 до 50 мг/(кг массы тела), более предпочтительно от 0,1 до 10 мг/(кг массы тела), и количество вводимых антител составляет, например, от 0,01 до 200 мг/(кг массы тела), предпочтительно от 0,1 до 100 мг/(кг массы тела), более предпочтительно от 1 до 40 мг/(кг массы тела). Адъювант и антитела можно вводить одновременно с препаратом вакцины, предлагаемым в настоящем изобретении (включая случай, в котором адъювант и антитела включены в препарат вакцины), или адъювант и антитела, и препарат вакцины можно вводить в разные моменты времени. В случае введения в разные моменты времени, предпочтительно, если препарат вакцины, адъювант и антитела все вводят, например, в течение промежутка времени, составляющего от 1 мин до 24 ч, предпочтительно от 1 мин до 5 ч.

ПРИМЕРЫ

Ниже в настоящем изобретении в виде примеров описаны предпочтительные конкретные варианты осуществления настоящего изобретения.

Пример 1. Синтез производного гиалуроновой кислоты (НА)

Производные НА синтезировали по методике, описанной в Международной публикации № WO 2010/053140 или WO 2014/038641.

Пример 2. Получение антигена

Антигенные пептиды приобретали у фирмы Sigma-Genosys LP.

mERK2 p 121 (аминокислотная последовательность: NDHIAYFLYQILRGLQYIHSANVLHRDLKPSNLLLNT (SEQ ID NO: 1))

Последовательность включала последовательность из 9 аминокислот (SEQ ID NO: 2: QYIHSANVL), от Q в положении 16 до L в положении 24, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и последовательность из 17 аминокислот (SEQ ID NO: 3: RGLQYIHSANVLHRDLK), от R в положении 13 до K в положении 29, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

MAGE-A4 р264 (аминокислотная последовательность: GSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 4))

Последовательность включала последовательность из 9 аминокислот (SEQ ID NO: 5: SNPARYEFL), от S в положении 2 до L в положении 10, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CDs-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и последовательность из 16 аминокислот (SEQ ID NO: 6: VKVLEHVVRVNARVRI), от V в положении 22 до I в положении 37, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

MAGE-A4 р265 (аминокислотная последовательность: SNPARYEFL (SEQ ID NO: 7)).

MAGE-A4 p285 (аминокислотная последовательность: VKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 8)).

TRP2TRP1gp100-6G (аминокислотная последовательность:SVYDFFVWLGGGGGGTWHRYHLLGGGGGGEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 9)).

Последовательность включала приведенные ниже TRP2 (аминокислотная последовательность: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (аминокислотная последовательность: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)) и gp100 (аминокислотная последовательность: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) в качестве аминокислотных последовательностей эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 6G.

TRP2TRP1gp100-6Y (аминокислотная последовательность :SVYDFFVWLYYYYYYWHRYHLLYYYYYYEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 10)).

Последовательность включала приведенные ниже TRP2 (аминокислотная последовательность: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (аминокислотная последовательность: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)) и gp100 (аминокислотная последовательность: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) в качестве аминокислотных последовательностей эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 6Y.

TRP2TRP1gp100-4L (аминокислотная последовательность:SVYDFFVWLLLLLTWHRYHLLLLLLLEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 11)).

Последовательность включала приведенные ниже TRP2 (аминокислотная последовательность: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (аминокислотная последовательность: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)) и gp100 (аминокислотная последовательность: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) в качестве аминокислотных последовательностей эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 4L.

TRP2TRP1gp100-6L (аминокислотная последовательность:SVYDFFVWLLLLLLLTWHRYHLLLLLLLLEGSRNQDWL (SEQ ID NO: 12)).

Последовательность включала приведенные ниже TRP2 (аминокислотная последовательность: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)), TRP1 (аминокислотная последовательность: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)) и gp100 (аминокислотная последовательность: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)) в качестве аминокислотных последовательностей эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 6L.

TRP2 (аминокислотная последовательность: SVYDFFVWL (SEQ ID NO: 13)).

TRP1 (аминокислотная последовательность: TWHRYHLL (SEQ ID NO: 14)). gp100 (аминокислотная последовательность: EGSRNQDWL (SEQ ID NO: 15)).

AH1gp70-6G (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQAGGGGGGSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 16)).

Последовательность включала приведенную ниже gp70 (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками, и приведенную ниже АН1 (аминокислотная последовательность: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 6G.

AH1gp70-6Y (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQAYYYYYYSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 17)).

Последовательность включала приведенную ниже gp70 (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками, и приведенную ниже АН1 (аминокислотная последовательность: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 6Y.

AH1gp70-4L (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQALLLLSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 18)).

Последовательность включала приведенную ниже gp70 (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками, и приведенную ниже АН1 (аминокислотная последовательность: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 4L.

AH1gp70-6L (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQALLLLLLSPSYVYHQF (SEQ ID NO: 19)).

Последовательность включала приведенную ниже gp70 (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками, и приведенную ниже АН1 (аминокислотная последовательность: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)) в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 6L.

АН1 (аминокислотная последовательность: SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 20)). gp70 (аминокислотная последовательность: LVQFIKDRISVVQA (SEQ ID NO: 21)).

MAGE-A4 p264-4L (аминокислотная последовательность: GSNPARYEFLWGPRALLLLLYVKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 22)).

Последовательность включала последовательность из 9 аминокислот (SEQ ID NO: 5: SNPARYEFL), от S в положении 2 до L в положении 10, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и последовательность из 16 аминокислот (SEQ ID NO: 6: VKVLEHVVRVNARVRI), от V в положении 22 до I в положении 37, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 4L.

MAGE-A4 p264-4W (аминокислотная последовательность: GSNPARYEFLWGPRALWWWWYVKVLEHVVRVNARVRIAYP (SEQ ID NO: 23)).

Последовательность включала последовательность из 9 аминокислот (SEQ ID NO: 5: SNPARYEFL), от S в положении 2 до L в положении 10, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, и последовательность из 16 аминокислот (SEQ ID NO: 6: VKVLEHVVRVNARVRI), от V в положении 22 до I в положении 37, в качестве аминокислотной последовательности эпитопа, распознающегося CD4-позитивными хелперными Т-клетками, и эпитопы были соединены посредством 4W.

Пример 3. Получение комплекса производного НА и антигена Пример 3-1. Получение комплекса антигена и производного НА Каждое производное НА (99k HA-C₆-Chol-42% и т.п.) растворяли в воде сверхвысокой чистоты при концентрации, равной 12 мг/мл, и проводили обработку ультразвуком (устройство Е220Х, выпускающееся фирмой Covaris Inc.). Каждый антигенный пептид растворяли в ДМСО при концентрации, равной 50 мг/мл. Раствор антигенного пептида в ДМСО добавляли к водному раствору производного НА и смесь обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин в ультразвуковом аппарате типа ванны. Полученную смесь переносили в устройство для диализа (Slide-A-Lyzer, отсечение по молекулярной массе: 3500) и проводили диализ относительно 5 мМ раствора карбонатного буфера (рН 9), 10 мМ раствора фосфатного буфера (рН 7) и 10 мМ раствора фосфатного буфера (рН 7), содержащего 10% сахарозы, в указанном порядке. Концентрацию антигенного пептида определяли путем анализа с помощью хроматографии с обращенной фазой при условиях, приведенных ниже. Для приготовления раствора для введения концентрацию устанавливали равной от 250 до 500 мкг/мл. Если концентрация не соответствовала необходимой, то раствор концентрировали с помощью устройства для концентрирования ультрафильтрованием (Vivaspin 6, 5000 MwCO, Sartorius AG). Производное НА синтезировали так, как это описано в примерах 1 и 2, приведенных в Международной публикации № WO 2010/053140 А1. Так, например, 99k НА-С₆-Chol-42%, приведенное в таблице 1, относящейся к примеру 4-1, означает производное НА формулы (I), в которой Z обозначает непосредственную связь, R^a обозначает атом водорода, Y обозначает C₆ алкилен, X¹ обозначает -NR^b -COO-R, R^b обозначает атом водорода и R обозначает холестерильную группу (т.е. вводили холестерил-6-аминогексилкарбамат); среднемассовая молекулярная масса равна 99 кДа и степень введения холестерильной группы составляет 42%. Аналогичным образом, производное НА, в котором степень введения холестерильной группы составляет 41%, обозначено, как 99k HA-C₆-Chol-41%, и производное НА, в котором степень введения холестерильной группы составляет 43%, обозначено, как 99k HA-C₆-Chol-43%.

Условия проведения анализа с помощью хроматографии с обращенной фазой:

Аналитическая колонка: PLRP-S, 1000 Å (Agilent Technologies, Inc.)

Температура колонки: 40°С

Подвижная фаза А: 0,1% раствор ТФК (трифторуксусная кислота) в воде

Подвижная фаза В: 0,1% раствор ТФК в ацетонитриле

Скорость потока: 2 мл/мин

Детектирование: УФ, при 254 нм

Инжектируемый объем: 50 мкл

Сравнительный пример 1. Получение комплекса СНР и антигена

Комплекс получали в соответствии с Международной публикацией № WO 2015/050158. Модифицированный холестерином пуллулан (аббревиатура: СНР) (СНР-80Т; вводили от 1 до 2 молекул холестерина в пересчете на 100 молекул моносахаридов) приобретали у фирмы NOF Corp.СНР растворяли в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФФ), содержащем 6 М мочевины, при концентрации, равной 10 мг/мл. Раствор антигенного пептида в ДМСО добавляли к раствору СНР и смесь выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение ночи. Смешанный раствор переносили в диализную мембрану (отсечение по молекулярной массе: 3500, Thermo Fisher Scientific Inc.) и проводили диализ при 4°С в течение от 2 ч до ночи относительно ЗФФ, содержащего 0,6 М мочевины, использующегося в качестве внешнего раствора, при объеме, в 100 или большее количество раз превышающем объем внешнего раствора в диализной мембране. Затем проводили диализ полученного раствора при 4°С в течение от 2 ч до ночи относительно ЗФФ, содержащего 0,06 М мочевины, использующегося в качестве внешнего раствора, при объеме, в 100 или большее количество раз превышающем объем внешнего раствора в диализной мембране. Затем повторно проводили диализ полученного раствора при 4°С в течение от 2 ч до ночи относительно ЗФФ, использующегося в качестве внешнего раствора, при объеме, в 100 или большее количество раз превышающем объем внешнего раствора в диализной мембране. После извлечения внутреннего раствора, находящегося в диализной мембране, определяли концентрацию антигена по методике, описанной в примере 3-1. Концентрацию регулировали для получения раствора для введения. Если концентрация не соответствовала необходимой, то раствор концентрировали с помощью устройства для концентрирования ультрафильтрованием (Vivaspin 6, 5000 MwCO, Sartorius AG).

Пример 4. Исследование индуцирования антиген-специфических Т-клеток

Экспериментальная методика

Комплекс антигенного пептида и производного НА, полученный в примере 3-1, или комплекс СНР и антигенного пептида, полученный в сравнительном примере 1, в количестве, соответствующем от 0,05 до 0,1 мг антигена, вводили подкожно в правую сторону спины каждой мыши BALB/c (самки, Japan SLC, Inc.; масса тела: от 15 до 25 г) или мыши C57BL/6 (самки, Japan SLC, Inc.; масса тела: от 15 до 25 г). В случае введения адъюванта (CpG-олиго-ДНК (ODN1668, выпускается фирмой InvivoGen), 0,05 мг) адъювант затем вводили вблизи положения введения. Количество доз составляло 2 и интервал между дозами составлял 1 неделю. Через 1 неделю после заключительного введения у мышей-реципиентов извлекали клетки селезенки по следующей методике: у мышей извлекали селезенку и промывали средой RPMI1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), и кровь удаляли. Селезенку измельчали и затем свободные клетки извлекали с помощью среды RPMI1640, содержащей ФБС. После центрифугирования (300 × g, 5 мин, 4°С) надосадочную жидкость удаляли и к клеткам добавляли от 1 до 2 мл раствора АСК (лизирующий буфер аммоний-хлорид-калий, выпускается фирмой Sigma-Aldrich Co. LLC). Через 1 мин добавляли 30 мл среды RPMI1640, содержащей ФБС, и смесь центрифугировали (300 × g, 5 мин, 4°С). Надосадочную жидкость удаляли и к клеткам добавляли 10 мл среды RPMI1640, содержащей ФБС, затем фильтровали через устройство для просеивания клеток с отверстиями размером 40 мкм и центрифугировали (300 × g, 5 мин, 4°С). Надосадочную жидкость удаляли и к клеткам добавляли 20 мл среды RPMI1640, содержащей ФБС, затем центрифугировали (300 × g, 5 мин, 4°С). Надосадочную жидкость удаляли и клетки суспендировали в соответствующем количестве среды RPMI1640, содержащей ФБС. Подсчитывали количество клеток и затем клетки суспендировали в среде RPMI1640, содержащей ФБС, при плотности клеток, равной 2×10⁷ клеток/мл.

Клетки селезенки мышей при концентрации, равной 5×10⁶ клеток/0,4 мл, добавляли в каждую лунку 24-луночного планшета для исследования культур (Nunc). В каждую лунку добавляли 50 мкл пептида для стимуляции Т-клеток, обладающего концентрацией, равной 100 мкг/мл, и клетки культивировали в атмосфере, содержащей 5% СО2, при 37°С в течение 30 мин. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл GolgiPlug (BD Biosciences), разведенного в 100 раз средой RPMI1640, содержащей ФБС, и клетки культивировали в атмосфере, содержащей 5% СО₂, при 37°С в течение 5 ч. Клетки извлекали и переносили в 96-луночный обладающий V-образным дном микропланшет (Nunc). Надосадочную жидкость удаляли центрифугированием (2000 об/мин, 2 мин, 4°С; такие же условия использовали ниже). Затем клетки суспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания (ЗФФ, содержащий 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА)), добавленного в каждую лунку. Надосадочную жидкость удаляли центрифугированием. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора, включающего содержащие флуоресцентную метку антитела к CD8 (выпускаются фирмой Invitrogen Corp.) и содержащие флуоресцентную метку антитела к CD4 (BD Biosciences), и перемешивали и затем планшет выдерживали в темноте при 4°С в течение 15 мин. В каждую лунку добавляли 150 мкл буфера для окрашивания. Надосадочную жидкость удаляли центрифугированием и затем клетки дополнительно промывали с помощью 200 мкл буфера для окрашивания. В каждую лунку добавляли 100 мкл буфера Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) и осторожно перемешивали. Планшет выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин и затем клетки дополнительно дважды промывали буфером для окрашивания. В каждую лунку добавляли 200 мкл буфера для окрашивания и охлаждали в защищенном от света месте течение ночи. Надосадочную жидкость удаляли центрифугированием. Затем в каждую лунку добавляли 200 мкл буфера Perm/Wash (BD Biosciences) и планшет выдерживали в защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 3 мин. Надосадочную жидкость удаляли центрифугированием. Затем для проведения осторожного суспендирования к клеткам добавляли 50 мкл буфера Perm/Wash, содержащим все антитела к цитокину, и затем планшет выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин. Клетки промывали с помощью 150 мкл буфера Perm/Wash, затем повторно суспендировали в 200 мкл буфера для окрашивания и переносили в изготовленную из полистирола круглодонную пробирку (BD Biosciences). Клетки анализировали с помощью проточного цитометра (FACS Canto II, BD Biosciences) с использованием прилагаемого предназначенного для анализа программного обеспечения (FACSDiva).

Пример 4-1. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида mERK2

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 1. Использовавшимся адъювантом являлся CpG-олиго-ДНК (ODN1668, выпускается фирмой InvivoGen). На фиг.1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали mERK2 р121.

Подтверждено, что использование производного НА в качестве носителя обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток.

Пример 4-2. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида mERK2 (воздействие адъюванта - 1)

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 2. Использовавшимся адъювантом являлся CpG-олиго-ДНК (ODN1668, выпускается фирмой InvivoGen), polyIC (HMW VacciGrade, выпускается фирмой InvivoGen), QuilA (выпускается фирмой InvivoGen) или агонист Sting (2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp), выпускается фирмой InvivoGen). На фиг.2-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали mERK2 р 121. На фиг.2-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали mERK2 р 121.

Подтверждено, что использование любого из адъювантов обеспечивает индуцирование Т-клеток.

Пример 4-3. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида mERK2 (воздействие адъюванта - 2)

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 3. Использовавшимся адъювантом являлся CpG-олиго-ДНК (ODN1668, выпускается фирмой InvivoGen), R848 (VacciGrade, VacciGrade, выпускается фирмой InvivoGen) или MPL (MPLAs VacciGrade, выпускается фирмой InvivoGen). На фиг.3-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали mERK2 р 121. На фиг.3-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали mERK2 р 121.

Подтверждено, что использование любого из адъювантов обеспечивает индуцирование Т-клеток.

Пример 4-4. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида MAGE-A4 р264

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 4. На фиг.4 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали MAGE-A4 р265.

Подтверждено, что использование производного НА обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток.

Пример 4-5. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида MAGE-A4 р264 (без использования адъюванта)

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 5. На фиг.5 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали MAGE-A4 р265.

Подтверждено, что использование производного НА в качестве носителя обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток, даже, если не используют адъювант.

Пример 4-6. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида MAGE-A4 р264

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 6. На фиг.6 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали MAGE-A4 р265.

Установлено, что использование пептида, содержащего любой из аминокислотных мостиков, обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток.

Пример 4-7. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида TRP2TRP1gp100

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей C57BL/6 и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 7. На фиг.7-1, 7-2 и 7-3 представлены диаграммы, иллюстрирующие отношения количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8, где в качестве пептидов для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали TRP1, TRP2 и gp100 соответственно.

Подтверждено, что использование производного НА в качестве носителя обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток в случае каждого из TRP1, TRP2 и gp100.

Пример 4-8. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида TRP2TRP1gpl00

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей C57BL/6 и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 8. На фиг.8-1, 8-2 и 8-3 представлены диаграммы, иллюстрирующие отношения количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8, где в качестве пептидов для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали TRP1, TRP2 и gp100 соответственно.

Установлено, что использование любого из пептидных мостиков обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток.

Пример 4-9. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида AH1gp70

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 9. На фиг.9-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали АН1. На фиг.9-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали gp70.

Подтверждено, что использование производного НА обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток в случае каждого из АН1 и gp70.

Пример 4-10. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида AH1gp70

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 10. На фиг.10-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали АН1. На фиг.10-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4⁺, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали gp70.

Подтверждено, что использование производного НА обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток в случае каждого из АН1 и gp70.

Пример 4-11. Исследование индуцирования Т-клеток с использованием пептида AH1gp70

Исследование проводили в соответствии с методикой, описанной в примере 4, с использованием мышей BALB/c и проводимого дважды введения каждого образца, приведенного в таблице 11. На фиг.11-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ , где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD8⁺ использовали АН1. На фиг.11-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества продуцирующих интерферон гамма клеток CD4⁺ к количеству всех клеток CD4, где в качестве пептида для стимуляции Т-клеток CD4⁺ использовали gp70.

Установлено, что использование пептидов, содержащих любой из аминокислотных мостиков, обеспечивает высокую степень индуцирования Т-клеток.

Пример 5. Исследование роста опухоли у мышей Экспериментальная методика

Проводили подкожную трансплантацию клеток линии CMS5a фибросаркомы мышей, экспрессирующих mERK2, клеток линии СТ26 колоректального рака мышей, экспрессирующих АН1 и gp70, или клеток линии B16F10 меланомы мышей, экспрессирующих TRP2, TRP1 и gp100. Подкожную трансплантацию линии клеток CMS5a и линии клеток СТ26 каждой мыши BALB/c (самки; масса тела: от 15 до 25 г) проводили в количестве, составляющем 1×10⁶ культивированных клеток/100 мкл/особь. Подкожную трансплантацию линии клеток B16F10 каждой мыши C57BL/6 (самки; масса тела: от 15 до 25 г) проводили в количестве, составляющем 2×10⁵ культивированных клеток/100 мкл/особь. Затем определяли изменение объемов опухолей с течением времени.

Сравнительный пример 5-1. Получение препарата эмульсии

Эмульсию получали из антигенного пептида, 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (выпускается фирмой InvivoGen) и 0,5 мл физиологического раствора с использованием двух изготовленных из твердого стекла шприцев, снабженных запирающим устройством, соединенными с помощью устройства для соединения шприцев. Концентрацию антигенного пептида устанавливали равной 0,5 мг/мл.

Пример 5-1. Клетки CMS5a фибросаркомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 12, с частотой, указанной в таблице 12, мышам, обладающим клетками CMS5a фибросаркомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.12-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.12-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

В группе, которой вводили производное НА (99k41), наблюдалось более существенное подавление роста опухоли, чем в группе, которой вводили пептид, в группе, которой вводили эмульсию, и в группе, которой вводили СНР.

Пример 5-2. Клетки CMS5a фибросаркомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 13, с частотой, указанной в таблице

13, мышам, обладающим клетками CMS5a фибросаркомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.13-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.13-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

В группе, которой вводили производное НА (99k41), наблюдалось более существенное подавление роста опухоли, чем в группе, которой вводили только CpG, и в группе, которой вводили СНР.

Пример 5-3. Клетки CMS5a фибросаркомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 14, с частотой, указанной в таблице

14, мышам, обладающим клетками CMS5a фибросаркомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. Антитела вводили внутрибрюшинно. На фиг.14-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.14-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи. Антитела к CTLA4, антитела к PD1 и антитела к PDL1 приобретали у фирмы Bio X Cell.

В группе, которой вводили производное НА (99k41), наблюдалось существенное подавление роста опухоли, даже при введении, проводимом начиная с дня 7, и показано, что степень подавления является более высокой, чем в случае использования антител.

Пример 5-4. Клетки CMS5a фибросаркомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 15, с частотой, указанной в таблице 15, мышам, обладающим клетками CMS5a фибросаркомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. Антитела вводили внутрибрюшинно. На фиг.15-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.15-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи. Антитела к CTLA4, антитела к PDL1, антитела к ОХ40 и антитела к 4-1ВВ приобретали у фирмы Bio X Cell.

В группе, которой вводили производное НА (99к41), наблюдалось более существенное подавление роста опухоли, чем в группе, которой вводили пептид mERK2 в комбинации с антителами (aCTLA4/aPDL1/aOX40/a4-1BB). Пример 5-5. Клетки СТ26 колоректального рака мышей Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 16, с частотой, указанной в таблице 16, мышам, обладающим клетками СТ26 колоректального рака мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.16-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.16-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

В группе, которой вводили производное НА (99k43), наблюдалось более существенное подавление роста опухоли, чем в группе, которой вводили эмульсию, и в группе, которой вводили СНР.

Пример 5-6. Клетки B16F10 меланомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 17, с частотой, указанной в таблице 17, мышам, обладающим клетками B16F10 меланомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.17-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.17-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

В группе, которой вводили производное НА (99k43), наблюдалось более существенное подавление роста опухоли, чем в группе, которой вводили СНР. Пример 6. Доставка в лимфатический узел Экспериментальная методика

Каждый образец, полученный по методике, описанной в примере 3, вводили подкожно в правую сторону спины каждой мыши BALB/c (масса тела: от 15 до 25 г) с использованием содержащего флуоресцентную метку mERK2 р 121 (конъюгированный с флуоресцеином). Через 24 ч и через 72 ч правый паховый лимфатический узел извлекали, окрашивали с помощью антител к CD11b и антител к F4/80, и затем анализировали для определения абсорбции содержащего флуоресцентную метку пептида в клетках F4/80⁺CD11b⁺ с помощью проточной цитометрии. Клетки анализировали с помощью проточного цитометра (FACS Canto II, BD Biosciences) с использованием прилагаемого предназначенного для анализа программного обеспечения (FACSDiva).

Пример 6-1. Доставка в лимфатический узел различных производных НА Для исследования перемещения в лимфатический узел каждый образец, приведенный в таблице 18, вводили и анализировали по методике, описанной в примере 6. На фиг.18-1 представлены результаты для интенсивности флуоресценции в пересчете на одну клетку, полученные через 24 ч, и на фиг.18-2 представлены результаты для интенсивности флуоресценции в пересчете на одну клетку, полученные через 72 ч.

В группе, которой вводили производное НА, наблюдался перенос к лимфатическому узлу большего количества mERK2, чем в группе, которой вводили пептид, и в группе, которой вводили СНР.

Пример 6-2. Доставка в лимфатический узел модифицированных различными аминокислотами производных производное НА

Для исследования переноса в лимфатический узел каждый образец, приведенный в таблице 19, вводили и анализировали по методике, описанной в примере 6. На фиг.19 представлены результаты для интенсивности флуоресценции в пересчете на одну клетку через 24 ч. Модифицированные аминокислотами производные НА синтезировали так, как это описано в примере 1, приведенном в Международной публикации № WO 2014/038641. Так, например, 10kHA-Ala-С₆-Chol-30%, приведенное в представленной ниже таблице 19, означает производное НА формулы (II), в которой R^aa обозначает метил (C₁ алкил), R^6a обозначает атом водорода, Х^1а обозначает -NR⁹-Z¹-Z², R⁹ обозначает атом водорода, Z¹ обозначает C₆ алкилен, Z² обозначает -NR^ba-COO-Z³, R^ba обозначает атом водорода и Z³ обозначает холестерильную группу (т.е. вводили аланин холестерил-6-аминогексилкарбамат); среднемассовая молекулярная масса равна 10 кДа и степень введения холестерильной группы составляет 30%. Синтезированные модифицированные аминокислотами производные НА описаны в примере 3-8, приведенном в Международной публикации № WO 2014/038641.

В группе, которой вводили модифицированное аминокислотой производное НА, наблюдался перенос mERK2 в лимфатический узел.

Пример 7. Исследование роста опухоли у мышей

Пример 7-1. Клетки B16F10 меланомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 20, с частотой, указанной в таблице 20, мышам, обладающим клетками B16F10 меланомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.20-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.20-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

В группе, которой вводили производное НА (50k42), и в группе, которой вводили производное НА (10k43), которые отличались от группы, которой вводили производное НА (99k42), по молекулярной массе НА, также наблюдалось существенное подавление роста опухоли, как и в случае группы, которой вводили производное НА (99k42).

Пример 7-2. Клетки B16F10 меланомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 21, с частотой, указанной в таблице 21, мышам, обладающим клетками B16F10 меланомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.21-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.21-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

В группах, которым вводили модифицированное аминокислотой производное НА (10kHA-Ala-Chol30 и 10kHA-Gln-Chol32) также наблюдалось существенное подавление роста опухоли.

Пример 7-3. Клетки B16F10 меланомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 22, с частотой, указанной в таблице 22, мышам, обладающим клетками B16F10 меланомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.22-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.22-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

Использование polyIC в качестве адъюванта также обеспечивало существенное подавление роста опухоли.

Пример 7-4. Клетки B16F10 меланомы мышей

Для исследования роста опухоли у мышей проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 23, с частотой, указанной в таблице 23, мышам, обладающим клетками B16F10 меланомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. На фиг.23-1 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения средних объемов опухолей, и на фиг.23-2 представлены зависимости, иллюстрирующие изменения у каждой особи.

Использование Sting или R848 в качестве адъюванта также обеспечивало существенное подавление роста опухоли.

Пример 8. Анализ опухоли и лимфатического узла

Проводили подкожное введение каждого образца, приведенного в таблице 24, с частотой, указанной в таблице 24, мышам, обладающим клетками B16F10 меланомы мышей, подготовленных по методике, описанной в примере 5. В дни 12, 14 и 18 после трансплантации опухоль и лимфатический узел (всего из 4 положений правой и левой подпазушных частей и правой и левой паховых частей) извлекали для проведения исследования с использованием тетрамера (описанное ниже). Извлеченные опухоль и лимфатический узел, полученные от 2 животных, объединяли, и для каждой группы анализировали 2 образца (полученные от 4 животных). На фиг.24-1 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества антиген-специфических по отношению к TRP2 клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺, и на фиг.24-2 представлена диаграмма, иллюстрирующая отношение количества антиген-специфических по отношению к gp100 клеток CD8⁺ к количеству всех клеток CD8⁺ .

Показано, что антиген-специфические по отношению к TRP2 клетки CD8⁺ и антиген-специфические по отношению к gp100 клетки CD8⁺ проникают в опухоль и в лимфатический узел. Это указывает на то, что противоопухолевое воздействие, обусловленное производным НА, вызвано антиген-специфическими клетками CD8.

Исследование с использованием тетрамера

Каждый извлеченный образец опухоли помещали в 6-луночный планшет, содержащий среду RPMI-1640 в количестве, составляющем 1 мл/лунка, разрезали ножницами на квадраты размером 2 мм или менее и затем помещали в пробирки gentleMACS C-tube (Miltenyi Biotech). После добавления Enzyme Mix (Miltenyi Biotech) планшет помещали в диссоциатор gentleMACS (Miltenyi Biotech) и образец разрушали. Затем планшет инкубировали при 37°С в течение 40 мин и повторно помещали в диссоциатор gentleMACS и образец разрушали. Полученную суспензию клеток пропускали через устройство для просеивания клеток и затем центрифугировали (300 × g, 5 мин, 4°С) и пеллеты суспендировали в буфере MACS (Miltenyi Biotech) и получали суспензию клеток.

Извлеченный лимфатический узел раздавливали с использованием задней части внутреннего цилиндра шприца и получали суспензию клеток.

В 96-луночный обладающий V-образным дном микропланшет добавляли суспензию клеток опухоли или суспензию клеток лимфатического узла при концентрации, равной 5×10⁷ клеток/мл, в количестве, составляющем 20 мкл/лунка. Добавляли блокирующий реагент FcR для клеток мышей, разведенный в 50 раз, в количестве, составляющем 10 мкл/лунка, и проводили реакцию при 4°С в течение 5 мин. Добавляли H-2K^b TRP-2 тетрамер-SVYDFFVWL-APC (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. (MBL)) или H-2D^b gp100 тетрамер-EGSRNQDWL-PE (MBL) в количестве, составляющем 10 мкл/лунка, и проводили реакцию в защищенном от света месте при 4°С в течение 30 мин. Добавляли буфер MACS в количестве, составляющем 200 мкл/лунка, и надосадочную жидкость удаляли центрифугированием (от 310 × g до 400 × g, 5 мин, 4°С). Эту процедуру повторяли дважды. Затем добавляли раствор содержащих флуоресцентную метку антител к CD8 (MBL) в количестве, составляющем 20 мкл/лунка, и проводили реакцию в защищенном от света месте при 4°С в течение 30 мин. Добавляли буфер MACS в количестве, составляющем 200 мкл/лунка, и надосадочную жидкость удаляли центрифугированием (от 310 × g до 400 × g, 5 мин, 4°С). Эту процедуру повторяли дважды. Клетки суспендировали путем добавления буфера MACS в количестве, составляющем 200 мкл/лунка, и анализировали с помощью проточного цитометра (BD LSRFortessa Х-20, BD Biosciences) с использованием прилагаемого предназначенного для анализа программного обеспечения (FACSDiva).

Предложенная группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована в медицине. Раскрываются применения препарата вакцины против рака, включающего комплекс антигена и производного гиалуроновой кислоты, в который введена гидрофобная группа, в иммунотерапии различных раковых заболеваний. Препарат вакцины по настоящему изобретению обладает высокой противоопухолевой активностью за счет того, что антиген препарата вакцины способен индуцировать антигенспецифические повреждающие клетки Т-клетки (CTL) в лимфатических узлах. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 24 ил., 24 табл., 8 пр.

1. Применение препарата вакцины для предупреждения или лечения рака, где препарат вакцины включает

производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, и

антиген,

где производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, является следующим:

производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно звено, описывающееся формулой (I)

в которой R¹, R², R³ и R⁴ - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R⁵ обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Z обозначает непосредственную связь;

X¹ обозначает -NH-COO-R,

R^a выбран из группы, включающей атом водорода, C₁-C₂₀-алкил, амино-C₂-C₂₀-алкил и гидрокси-C₂-C₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -O- и -NR^f-;

R^f выбран из группы, включающей атом водорода, C₁-C₁₂-алкил, амино-C₂-C₁₂-алкил и гидрокси-C₂-C₁₂-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1 или 2 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -O- и -NH-;

R обозначает холестерильную группу;

Y обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(СН₂СН₂О)_m-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^g - и -S-S-;

R^g выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил или гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-; и

m обозначает целое число, выбранное от 1 до 100; или

производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II)

в которой R^1a, R^2a, R^3a и R^4a - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R^5a обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Х^1а обозначает -NR⁹ -Z¹-Z²;

R^6a и R⁹ - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода и C₁-C₆-алкил;

R^aa обозначает атом водорода или C₁-C₆-алкил, где алкил необязательно замещен одной или большим количеством групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей гидроксигруппу, карбоксигруппу, карбамоил, C₁-C₆-алкилтиогруппу, арил и гетероарил, где арил необязательно замещен одной или большим количеством гидроксигрупп;

Z¹ обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(CH₂CH₂O)_ma-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^ga- и -S-S-, и

ma обозначает целое число, выбранное от 1 до 100;

Z² обозначает -NH-COO-Z³;

R^ga независимо выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил и гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-; и

Z³ обозначает холестерильную группу.

2. Применение по п. 1, в котором производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, дополнительно содержит повторяющееся звено, описывающееся формулой (IIIc)

в которой R^1c, R^2c, R^3c и R^4c - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R^5c выбран из группы, включающей атом водорода, формил и C₁-C₆-алкилкарбонил; и

X^c выбран из группы, включающей гидроксигруппу и -О^-Q⁺, где Q⁺ обозначает противокатион.

3. Применение по п. 1 или 2, где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее звено, описывающееся формулой (I), где отношение количества звеньев, описывающихся формулой (I), к количеству содержащихся дисахаридных звеньев составляет от 5 до 50%.

4. Применение по п. 1 или 2, где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), где отношение количества дисахаридных звеньев, содержащих группу -NR⁹-Z¹-Z², к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев составляет от 5 до 50%.

5. Применение по любому из пп. 1-3, где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее звено, описывающееся формулой (I), в которой Y обозначает C₂-C₁₀-алкилен.

6. Применение по любому из пп. 1, 2 и 4, где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), в которой Z¹ обозначает С₂-С₁₀-алкилен.

7. Применение по любому из пп. 1-6, где производное гиалуроновой кислоты получают с использованием гиалуроновой кислоты, состоящей только из дисахаридных звеньев, описывающихся формулой (IIIc), определенной в п. 2, где, если R^1c, R^2c, R^3c и R^4c - все обозначают атомы водорода, R^5c обозначает ацетил и X^c обозначает -О^-Na⁺, то среднемассовая молекулярная масса равна от 5 до 200 кДа.

8. Применение по любому из пп. 1-7, в котором производное гиалуроновой кислоты и антиген образуют комплекс.

9. Применение по любому из пп. 1-8 для введения в комбинации с адъювантом по меньшей мере одного типа.

10. Применение по любому из пп. 1-9, в котором антигеном является антигенный пептид или антигенный белок.

11. Применение по п. 10, в котором антигенный пептид содержит два или большее количество эпитопов, распознающихся CD8-позитивными цитотоксическими Т-клетками, или эпитопов, распознающихся CD4-позитивными хелперными Т-клетками.

12. Применение по п. 11, в котором антигенный пептид содержит аминокислотный мостик между эпитопами.

13. Применение по любому из пп. 1-12 для введения в комбинации с антителами по меньшей мере одного типа для лечения рака.

14. Применение по п. 1, где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее звено, описывающееся формулой (I), в которой Y обозначает C₂-C₁₀-алкилен, и где отношение количества звеньев, описывающихся формулой (I), к количеству содержащихся дисахаридных звеньев, присутствующих в производном, составляет от 5 до 50%.

15. Применение по п. 1, где препарат вакцины включает производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II), в которой Z¹ обозначает C₂-C₁₀-алкилен, и где отношение количества дисахаридных звеньев, содержащих группу -NR⁹-Z¹-Z², к количеству содержащихся дисахаридных повторяющихся звеньев, присутствующих в производном, составляет от 5 до 50%.

16. Применение препарата вакцины для предупреждения или лечения фибросаркомы, колоректального рака или меланомы, где препарат вакцины включает

производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, и

антиген,

где производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, является следующим:

производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно звено, описывающееся формулой (I)

в которой R¹, R², R³ и R⁴ - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R⁵ обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Z обозначает непосредственную связь;

X¹ обозначает -NH-COO-R,

R^a выбран из группы, включающей атом водорода, C₁-C₂₀-алкил, амино-C₂-C₂₀-алкил и гидрокси-C₂-C₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -O- и -NR^f-;

R^f выбран из группы, включающей атом водорода, C₁-C₁₂-алкил, амино-C₂-C₁₂-алкил и гидрокси-C₂-C₁₂-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1 или 2 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -O- и -NH-;

R обозначает холестерильную группу;

Y обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(СН₂СН₂О)_m-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^g - и -S-S-;

R^g выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил или гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-; и

m обозначает целое число, выбранное от 1 до 100; или

производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II)

в которой R^1a, R^2a, R^3a и R^4a - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R^5a обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Х^1а обозначает -NR⁹ -Z¹-Z²;

R^6a и R⁹ - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода и C₁-C₆-алкил;

R^aa обозначает атом водорода или C₁-C₆-алкил, где алкил необязательно замещен одной или большим количеством групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей гидроксигруппу, карбоксигруппу, карбамоил, C₁-C₆-алкилтиогруппу, арил и гетероарил, где арил необязательно замещен одной или большим количеством гидроксигрупп;

Z¹ обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(CH₂CH₂O)_ma-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^ga- и -S-S-, и

ma обозначает целое число, выбранное от 1 до 100;

Z² обозначает -NH-COO-Z³;

R^ga независимо выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил и гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-; и

Z³ обозначает холестерильную группу.

17. Применение препарата вакцины для накопления антигена в лимфатических узлах с целью индуцирования антиген-специфических повреждающих клетки Т-клеток для предупреждения или лечения рака, где препарат вакцины включает

производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную группу, и

антиген,

где производное гиалуроновой кислоты, содержащее введенную гидрофобную

группу, является следующим:

производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно звено, описывающееся формулой (I)

в которой R¹, R², R³ и R⁴ - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R⁵ обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Z обозначает непосредственную связь;

X¹ обозначает -NH-COO-R,

R^a выбран из группы, включающей атом водорода, C₁-C₂₀-алкил, амино-C₂-C₂₀-алкил и гидрокси-C₂-C₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -O- и -NR^f-;

R^f выбран из группы, включающей атом водорода, C₁-C₁₂-алкил, амино-C₂-C₁₂-алкил и гидрокси-C₂-C₁₂-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1 или 2 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -O- и -NH-;

R обозначает холестерильную группу;

Y обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(СН₂СН₂О)_m-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^g - и -S-S-;

R^g выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил или гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-; и

m обозначает целое число, выбранное от 1 до 100; или

производное гиалуроновой кислоты, содержащее повторяющееся звено, описывающееся формулой (II)

в которой R^1a, R^2a, R^3a и R^4a - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода, C₁-С₆-алкил, формил и C₁-С₆-алкилкарбонил;

R^5a обозначает атом водорода, формил или C₁-C₆-алкилкарбонил;

Х^1а обозначает -NR⁹ -Z¹-Z²;

R^6a и R⁹ - все независимо выбраны из группы, включающей атом водорода и C₁-C₆-алкил;

R^aa обозначает атом водорода или C₁-C₆-алкил, где алкил необязательно замещен одной или большим количеством групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей гидроксигруппу, карбоксигруппу, карбамоил, C₁-C₆-алкилтиогруппу, арил и гетероарил, где арил необязательно замещен одной или большим количеством гидроксигрупп;

Z¹ обозначает С₂-С₃₀-алкилен или -(CH₂CH₂O)_ma-СН₂СН₂-, где в алкилен необязательно введены 1-5 групп, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О-, -NR^ga- и -S-S-, и

ma обозначает целое число, выбранное от 1 до 100;

Z² обозначает -NH-COO-Z³;

R^ga независимо выбран из группы, включающей атом водорода, С₁-С₂₀-алкил, амино-С₂-С₂₀-алкил и гидрокси-С₂-С₂₀-алкил, где в алкильный фрагмент, содержащийся в каждой из групп, необязательно введены 1-3 группы, каждая из которых независимо выбрана из группы, включающей -О- и -NH-; и

Z³ обозначает холестерильную группу.