СПОСОБ ОЦЕНКИ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПОЧЕК Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к клинической медицине а именно к нефрологии и кардиологии и предназначено для ранней диагностики и оценки риска сердечно-сосудистых осложнений у больных с хронической болезнью почек (ХБП) на всех стадиях заболевания.

Распространенность ХБП растет, однако смертность по данным статистики относительно низкая и это связанно не только с успешным развитием заместительной почечной терапии, а также с тем, что непосредственной причиной смерти становятся сердечно-сосудистые осложнения, такие как острые нарушения мозгового кровообращения, инфаркт миокарда, тяжелая хроническая сердечная недостаточность. В основе этих осложнений лежит кальцификация сосудов и фиброз кардиомиоцитов приводящий к ремоделированию сосудов и гипертрофии миокарда. Помимо традиционных факторов риска сердечно-сосудистых осложнений, таких как дислипидемия, артериальная гипертензия и др. на данный момент изучено влияние уремического токсинов, а именно индоксил сульфата.

Дисфункция почек у больных с ХБП ведет к прогрессированию двух разных, но взаимосвязанных патологических процессов - атеросклеротическому и артериосклеротическому ремоделированию артериальных сосудов. Первый из них вызывает нарастающее нарушение проводящей функции сосудов с развитием ишемического повреждения сердца, почек и других органов, а второй первично нарушает демпфирующую функцию аорты, других крупных артерий, способствуя перегрузке левого желудочка, его дисфункции и развитию сердечной недостаточности. Индоксил сульфат образуется в результате метаболизма триптофана и, связываясь с альбумином, может элиминироваться из организма только через почки. При прогрессировании почечной недостаточности его концентрация в крови многократно возрастает. Действуя как эндотелио-токсин индоксил сульфат стимулирует пролиферацию и остеобластную трансформацию клеток гладкой мускулатуры сосудов (КГМС). Индоксил сульфат усиливает процессы поддержания системного воспаления и оксидативного стресса, наряду с провоспалительными медиаторами (интерлейкин1, интерлейкин 6, фактор некроза опухоли-а), что является одним из ведущих механизмов в развитии и прогрессировании кальцификации сосудов.[BergA. H. etal. Indoxyl sulfate in uremia: an old idea with updated concepts //The Journal of Clinical Investigation. - 2022.-Т. 132. - №. 1].

Это играет принципиально важную роль в дальнейшей разработке и внедрении новых подходов в ранней диагностике, комплексном лечении, что в перспективе вероятно приведет к регрессу кальцификации сосудов у пациентов с ХБП.

В сыворотки крови пациентов с хронической болезнью почек определяют уровень индоксил сульфата с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Повышенные уровни индоксил сульфата свидетельствуют о высоком риске кардиоваскулярных осложнений, что позволяет оценить степень выраженности изменений сердечно-сосудистой системы.

Известен способ диагностики хронической сердечной недостаточности (ХСН) при помощи количественного определения в крови натрийуретического пропептида - NT-proBNP при помощи ИФА (Российские национальные рекомендации ВНОК и ОССН по диагностике и лечению ХСН Москва, 2007 г.).

Недостатками данного способа, являются: более позднее появление высокого титра NT-proBNP, худшая достоверность в сравнении с заявляемым методом, в связи с лабильностью уровня NT-proBNP в крови.

Кроме того, высокий уровень мНУПне отражает поражения сосудистой стенки, соответственно.

Известен способ определения поражения сердечно-сосудистой системы (Ван, К.-Х.; Лай, Ю.-Х.; Куо, К.-Х.; Линь, Ю.-Л.; Цай, Ж.-.; Сюй, Б.-Г. Связь между уровнями индоксилсульфата в сыворотке и функцией эндотелия при хронической болезни почек без диализа. Токсины 2019, 11, 589). В данном способе так же определяют уровень индоксил сульфата в крови у пациентов с ТПН.

Недостатком данного способа, является то, что он не включает исследование пациентов с более ранними стадиями ХБП, а также не проводится оценка показателей сердечно-сосудистой системы: индекс массы миокарда левого желудочка и пиковой систолической скорости в дуге аорты (ИММЛЖ и Vps в дуге аорты), отражающих состояние миокарда и стенки аорты.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ стратификации риска поражения сердечно-сосудистой системы у пациентов с хронической болезнью почек с помощью количественного определения в крови фактора роста фибробластов - 23 (FGF-23) посредством ИФА. (Патент RU 2634573). Способа заключается в том, что производят забор крови пациентов в количестве не менее 5 мл. Далее образцы крови отстаивают в течение двух часов при комнатной температуре, затем центрифугируют 20 минут при скорости в 1000 оборотов. Для хранения образцы сыворотки аликвотируют немедленно после получения и хранят замороженными при температуре -20°С. Стандарты и образцы вносят в соответствующие лунки микропланшета, покрытые специфическими антителами к FGF-23, конъюгированными с биотином. На следующем этапе в лунки вносят авидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (HRP), и инкубируют в течение необходимого времени. Затем в лунки вносят субстратный раствор. Изменение окрашивания в лунках, обусловленное связыванием антител, конъюгированных с биотином, и авидина, конъюгированного с ферментом, наблюдается только в лунках, содержащих FGF-23. Ферментную реакцию останавливают добавлением серной кислоты, а интенсивность окрашивания измеряют с помощью микропланшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм ± 10 нм. Далее строят калибровочную кривую, на логарифмической бумаге откладывая полученное среднее значение оптической плотности (ОП) каждого стандарта по оси X и Y, и проводят оптимальную кривую через полученные точки. Для обработки данных используют соответствующее программное обеспечение. Нормальный уровень FGF-23 составляет 10-79 пг/мл. Значения FGF-23 от 80 до 150 пг/мл соответствуют низкому риску развития неблагоприятных кардиоваскулярных исходов в ближайшие пять лет;от 150 до 250 пг/мл - умеренному риску; от 250 до 500 пг/мл - высокому риску;от 500 же и более пг/мл - крайне высокому риску неблагоприятных кардиоваскулярных исходов.

Общим для прототипа и предлагаемого способа является определение исследуемых показателей с помощью ИФА;

Недостатками прототипа являются: более позднее появление высокого титра FGF-23 в сравнении с заявляемым методом.

Цель изобретения - оценка раннего риска развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов на всех стадиях хронической болезни почек различной этиологии.

Поставленная цель достигается следующим образом. Для получения и подготовки материала для исследования проводят забор крови пациентов в количестве 5 мл. Далее образцы крови отстаивают в течение двух часов при комнатной температуре, затем центрифугируют 20 минут при скорости в 1000 оборотов. Для хранения образцы сыворотки аликвотируют после получения и хранят замороженными при -20°С. Образцы и буфер инкубируют с ферментным конъюгатом в планшете в течение 1 часа. Затем не связавшиеся компоненты отмывают. Добавляют раствор стоп-реагента. Затем фотометрическим методом на длине волны 450 нм при помощи микропланшетного ридера измеряют оптическую плотность (ОП). Интенсивность окрашивания в лунках обратно пропорциональна концентрации индоскилсульфата. Так как количество сайтов связывания ограничено, следовательно, чем больше сайтов занято индоксил сульфатом из образца, тем меньше сайтов занято индоксил сульфвтом c пероксидазой хрена. Концентрация индоксил сульфата в образцах рассчитывают в соответствии со стандартной (калибровочной) кривой.

Минимально определяемая концентрация индоксил сульфата равна 1,0 мкмоль/л. Референсными значениями нормального уровня индоксил сульфата являются ≤ 1-2 мкмоль/л.

Часть триптофана под действием триптофаназы - фермента кишечной микробиоты, в частности Escherichiacoli, - превращается в индол. Далее часть индола удаляется вместе с каловыми массами, а часть всасывается и с током крови попадает в печень, где после окисления и сульфатирования превращается в индоксил сульфат (ИС). Часть из них циркулируют в свободном состоянии, а другая часть связывается с белками сыворотки крови, в частности с альбумином. В исследованиях индоксил сульфат выступает в качестве эндогенного лигандаарил-углеводородного рецептора (AhR). AhR действует как активированный лигандом транскрипционный фактор, который регулирует процессы детоксикации, канцерогенеза и воспаления. А также AhR участвует в регуляции функций подоцитов. Однако при дисбиозе кишечника он хронически активирован интенсивным воздействием индоксил сульфата, что приводит к экспрессии провоспалительных цитокинов и хемокинов, снижению уровня дифференциации подоцитов и белков цитоскелета, прогрессирующему повреждению подоцитов что приводит в конечном итоге к гломерулосклерозу [ChaoCT, LinSH. Uremic Vascular Calcification: The Pathogenic Roles and Gastrointestinal Decontamination of Uremic Toxins. Toxins (Basel). 2020 Dec 21;12(12):812].

Неблагоприятные эффекты повышения уровня индоксил сульфата в крови связаны с активацией оксидативного стресса в сосудистом эндотелии, мезангии, подоцитах, эпителии канальцев, активации передачи сигналов NFkB, снижении экспрессии белка Klotho, усилении апоптоза. Так как подоциты являются важным компонентом клубочкового фильтрационного барьера, и в отличие от эпителиоцитов они практически не способны к регенерации, поэтому любые повреждения подоцитов сопровождаются протеинурией. В одном из экспериментов введение индоксил сульфата сопровождается повреждением подоцитов, что ускоряет прогрессирование ХБП, в то время как введение индоксил сульфат-связывающего перорального абсорбента AST-120 (КРЕМЕЗИН) замедляет этот процесс.

Один из возможных механизмов действия AST-120 заключается в том, что он абсорбирует уремические токсины и их предшественников в желудочно-кишечном тракте, позволяя им выводиться с фекалиями до того, как они смогут всосаться в кровоток. Например, индол, предшественник ИС, который образуется в результате метаболизма триптофана бактериями в желудочно-кишечном тракте, адсорбируется AST-120, тем самым ослабляя накопление ИС у пациентов с ХБП.[BlackAP, CardozoLF, MafraD. Effects of Uremic Toxins from the Gut Microbiota on Bone: ABrief Look at Chronic Kidney Disease. Ther Apher Dial. 2015 Oct;19(5):436-40.]

У пациентов с ХБП концентрация ИС в плазме крови коррелирует с сердечно-сосудистыми событиями и смертностью, с кальцификацией сосудов и атеросклеротическими маркерами. Кроме того, ИС индуцирует протромботическое состояние и нарушение неоваскуляризации.

Barretoetal. сообщили, что уровни ИИ в сыворотке крови не только достоверно положительно связаны с кальцификацией аорты и скоростью пульсовой волны, но также предсказывают общую смертность и смертность от сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с ХБП. Исследования показали, что сывороточный ИИ является ценным маркером для прогнозирования сердечно-сосудистых и диализных событий у пациентов с прогрессирующей ХБП и событий сердечной недостаточности у пациентов с ТПН[Баррето, Ф.К.; Баррето, Д.В.; Лиабеф, С.; Мирт, Н.; Глорье, Г.; Теммар, М.; Шукрун, Г.; Ванхолдер, Р.; Масси, З.А.; Европейская рабочая группа по уремическому токсину. Сывороточный индоксил сульфат связан с сосудистыми заболеваниями и смертностью у пациентов с хронической болезнью почек. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2009, 4, 1551-1558.]

Таким образом, результатом предлагаемого изобретения является оценка риска развития кардиоваскулярных осложнений у пациентов с ХБП на всех стадиях. Выявленный повышенный уровень индоксил сульфата от умеренных до высоких значений свидетельствует о большом риске морфофункциональных изменений сердечно-сосудистой системы при исходном отсутствии Эхо-кг признаков (гипертрофии левого желудочка, увеличения скорости пульсовой волны в дуге аорты (Vps), а также в условиях компенсации иных факторов риска: артериальной гипертензии, уремии, вторичного гиперпаратиреоза (ВГПТ). Определение повышенных значений индоксил сульфата в качестве ранней диагностики отдаленных кардиоваскулярных катастроф обеспечивает своевременное воздействие на патогенетические механизмы прогрессирования ХБП и поражения сердечно-сосудистой системы, что, в свою очередь, увеличит длительность и улучшит качество жизни пациентов с ХБП на всех стадиях, а так же может выступать в качестве терапевтической мишени и использован для динамического наблюдения за данными больными [ElChamiehC, LiabeufS, MassyZ. UremicToxinsandCardiovascularRiskinChronicKidneyDisease: WhatHaveWeLearnedRecentlybeyondthePastFindings? Toxins (Basel).2022 Apr 14;14(4):280].

Пример конкретного выполнения.

Исследовали когорту из 104 человек с ХБП 1-5Д ст различной этиологии.Процедура включала несколько этапов, сыворотку и реагенты поместили в комнатные условия (20-25^оС) до использования. Внеслив лунку по 100 мкл стандартов или образцов. Внесли в контрольную лунку 100 мкл ФСБ (рН 7.0-7.2). В каждую лунку обавили по 50 мклконъюгата с пероксидазой хрена и перемешали. Накрыли планшет крышкой и инкубировали 1 час при температуре 37°С. Затем промыли планшет 5 раз рабочим промывающим раствором с помощью автоматическоговошера. Затем в каждую лунку добавили 50 мкл Субстрата А и 50 мкл Субстрата В. Закрыли крышкой и инкубировали планшет 15-20 минут при 37°С. Добавили 50 мкл Стоп-реагента в каждую лунку. Поместили планшет в ридер и измерили ОП на длине волны 450нм. Для обработки данных использовали специальное программное обеспечение. Далее построили калибровочную кривую на логарифмической бумаге, откладывая полученные среднее значения оптической плотности (ОП) каждого стандарта по оси X, против соответствующей концентрации индоксил сульфата по оси Y, и провели оптимальную кривую через полученные точки. Концентрацию индоксил сульфата в образцах определяли сравнением полученной оптической плотности образцов с построенной калибровочной кривой.

В зависимости от тяжести поражения, определяемой параметрами сердечно-сосудистой системы (ИММЛЖ и Vps), исследуемых больных разделили на 2 группы: 1-я - с невыраженными изменениями ИММЛЖ и Vps, 2-я - с умеренными и тяжелыми изменениями.

Показатель индоксил сульфат связанный с ИММЛЖ или Vps , был разделен на 3 части (тертиля): 1-й тертиль - умеренно выраженные изменения, 2-й тертиль - средневыраженные изменения, 3-й тертиль - высокий уровень изменений данных показателей. Таким образом был проведен анализ.

Уровни индоскил сульфата в двух группах выделенных в зависимости от уровня Vps в 1,2,3 - тертилях представленны на Фиг.1.

А также кривая линейной регрессии. Взаимосвязь между сывороточным индоксил сульфатом и показателем сердечно-сосудистой системы ИММЛЖ (r=0,6491, p=0,0001) (Фиг. 2.).

Интерпретация результатов:

индоксил сульфат ≤4,65 мкмоль/л- низкий риск развития ССО;

индоксил сульфат 4.65-12.5 мкмоль/л - умеренный риск ССО;

индоксил сульфат ≥12,5 мкмоль/л - высокий риск ССО.

Заявленный способ является клинически значимым, может служить маркером сердечно- сосудистых осложнений у больных с ХБП для динамического наблюдения.

Список используемых сокращений:

AhR- арил-углеводородный рецептор

ВГПТ - вторичный гиперпаратиреоз

ИФА - иммуноферментный анализ

ИММЛЖ-индекс массы миокарда левого желудочка

КГМС-клеток гладкой мускулатуры сосудов

мНУП - мозговой натрийуретический пептид

НУП - натрийуретический пептид

ОП- оптическая плотность

ХБП - хроническая болезнь почек

ТПН - терминальная почечная недостаточность

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЭХО-кг - эхокардиография

FGF-23 - фибропластический фактор роста-23

NF-kB - ядерный фактор каппа Б

NT-proBNP - N-терминальный неактивный фрагмент мозгового натрийуретического пептида

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии и кардиологии, и может быть использовано для оценки риска развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с хронической болезнью почек на всех стадиях. Проводят определение индоксил сульфата в сыворотке крови посредством иммуноферментного анализа. При значении до 4,65 мкмоль/л определяют низкий риск, от 4,65 до 12,5 мкмоль/л - умеренный риск, от 12,5 мкмоль/л и более - высокий риск. Способ обеспечивает возможность оценки раннего риска развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов на всех стадиях хронической болезни почек различной этиологии за счет определения уровня индоксил сульфата в крови пациентов, повышение которого свидетельствует о высоком риске поражения сердца и сосудов. 2 ил., 1 пр.

Способ оценки риска развития сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с хронической болезнью почек на всех стадиях, включающий определение индоксил сульфата в сыворотке крови посредством иммуноферментного анализа, и при значении до 4,65 мкмоль/л определяют низкий риск, от 4,65 до 12,5 мкмоль/л - умеренный риск, от 12,5 мкмоль/л и более - высокий риск.