B-КЛЕТКИ, ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДЛЯ СЕКРЕЦИИ ФОЛЛИСТАТИНА, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С ФОЛЛИСТАТИНОМ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОСТОЯНИЙ, НАРУШЕНИЙ И ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ РОСТА И СИЛЫ МЫШЦ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/781 C12N5/10 C12N15/64 C07K14/47 A61K35/17 A61P21/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет временной заявки США No. 62/644362, поданной 16 марта 2018 г., и временной заявки 62/644356, поданной 16 марта 2018 г., полное содержание каждой из заявок приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

ПОЛОЖЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Список последовательностей, ассоциированный с этой заявкой, представлен в текстовом формате вместо бумажной копии, и его содержание, таким образом, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Наименование текстового файла, содержащего список последовательностей, представляет собой IMCO-008_01WO_ST25.txt. Текстовый файл составляет 12 КБ, создан 18 марта 2019 г. и принят в электронной форме через EFS-Web.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область техники

[0003] Настоящее изобретение относится к применению B-клеток для долгосрочной доставки in vivo лекарственного средства, такого как фоллистатин и, в частности, к введению однократных и множественных доз B-клеток субъекту (например, человеку).

Описание связанной области

[0004] Мышечные дистрофии (MD) представляют собой прогрессирующие наследственные нейромышечные нарушения, характеризующиеся истощением мышечной ткани и слабостью мышц (Emery (2002) The Lancet, 359:687-695). Многие формы мышечных дистрофий являются летальными и в настоящее время неизлечимыми.

[0005] Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) является наиболее распространенным X-сцепленным нейромышечным заболеванием. Это заболевание вызвано мутациями в гене DMD, кодирующем дистрофин. Изменение или отсутствие этого белка приводит к аномальному образованию разрывов в сарколеммальной мембране. Аномальная изменчивость диаметра мышечных волокон (атрофические и гипертрофические волокна) в проксимальных мышцах и постоянное повреждение мышц являются характерными признаками заболевания. Поврежденная мышца высвобождает внутриклеточный фермент креатинкиназу (CK). В результате, уровни сывороточной CK у пациентов с DMD являются характерно высокими (вплоть до 10 раз выше нормы). Патофизиологический каскад объединяет воспаление ткани, некроз мышечных волокон и замещение мышцы фиброзно-жировой тканью.

[0006] Другой аллельный вариант гена DMD вызывает более мягкую форму MD, известную как мышечная дистрофия Беккера (BMD). BMD является клинически сходной с DMD, но начало симптомов возникает в более поздний период жизни.

[0007] Множество фармакологических средств было испробовано при MD, но ни для одного не доказана эффективность для остановки течения заболевания. Современный способ терапии все еще находится в сфере физической медицины и реабилитации.

[0008] В ряде исследований с использованием кортикостероидов (например, преднизона и/или его производных) показано улучшение у индивидуумов с MD, в частности, краткосрочное. Хотя точный механизм, посредством которого кортикостероиды облегчают фенотип заболевания, является неясным, считают, что кортикостероиды действуют посредством уменьшения воспаления, супрессии иммунной системы, улучшения гомеостаза кальция, повышающей регуляции экспрессии компенсирующих белков и увеличения пролиферации миобластов (Khurana et al. (2003) Nat. Rev. Drug Discovery 2:279-386). Однако, кортикостероиды, вводимые с течением времени, могут индуцировать атрофию мышц, в первую очередь поражающую проксимальные мышцы - те же самые мышцы, которые поражены при DMD и BMD. Индуцированные кортикостероидами мышечные и другие побочные эффекты могут ограничивать долгосрочную эффективность кортикостероидной терапии.

[0009] Суперсемейство трансформирующего фактора роста-бета (TGF-бета) содержит множество факторов роста, разделяющих общие элементы последовательности и структурные мотивы. Известно, что эти белки оказывают биологические эффекты на большое разнообразие типов клеток как у позвоночных, так и у беспозвоночных. Члены суперсемейства осуществляют важные функции в ходе эмбрионального развития в формировании структур и спецификации ткани, и могут влиять на множество процессов дифференцировки, включая адипогенез, миогенез, хондрогенез, кардиогенез, гематопоэз, нейрогенез и дифференцировку эпителиальных клеток. Семейство разделено на две основные ветви: ветви BMP/GDF и TGF-бета/активина/BMP10, члены которых оказывают разнообразные, часто комплементарные эффекты. Посредством манипуляции с активностью члена семейства TGF-бета, часто является возможным вызывать значительные физиологические изменения в организме. Например, пьемонтская и бельгийская голубая породы крупного рогатого скота несут мутацию с потерей функции в гене GDF8 (также называемом миостатином), вызывающую заметное увеличение мышечной массы Grobet et al., Nat. Genet. 1997, 17(l):71-4. Кроме того, у человека, неактивные аллели GDF8 ассоциированы с увеличением мышечной массы и, по сообщениям, с необычайной силой. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8. Кроме того, мыши, генетически модифицированные либо для экспрессии доминантно отрицательного рецептора активина IIB (ActRIIB), либо для экспрессии фоллистатина, имеют необычайную мышечную массу (Lee, SJ и McPherron, AC, Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Jul 31;98(16):9306-11), и сверхэкспрессия фоллистатина у нечеловекообразных приматов увеличивает рост и силу мышц. Kota J, et al., Sci Transl Med. 2009 Nov 11;1(6).

[0010] Таким образом, существует необходимость в способах доставки средств, функционирующих как сильные регуляторы передачи сигналов TGF-бета.

[0011] Современные способы лечения хронических заболеваний и нарушений включают прямую инфузию лекарственного средства (например, терапевтического полипептида), генотерапию посредством вирусного вектора и адоптивный перенос стволовых клеток (например, перенос гематопоэтических стволовых клеток). Однако, каждый из этих способов имеет недостатки. Инъекция рекомбинантного терапевтического белка страдает недостатком конечного времени полужизни белка, и все три способа обеспечивают субоптимальное проникновение лекарственного средства в ткани. Изменение эндогенных тканей для продукции лекарственного средства, например, посредством инъекции рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV) и лентивирусных векторов, как правило, приводит к продукции лекарственного средства из централизованной локализации. Продукция лекарственного средства из одной локализации увеличивает шансы локализованной токсичности в продуцирующих тканях. Кроме того, поскольку рекомбинантные вирусы рассматриваются как чужеродные, маловероятно, что вирусные векторы можно вводить множество раз, не вызывая неблагоприятную реакцию, что означает, что существует возможность однократной инъекции для достижения правильной дозы лекарственного средства. Принимая во внимание биологическую изменчивость, присущую такому способу, как введение in vivo нуклеиновых кислот в клетки с использованием вируса, может являться очень неустойчивым достижение желательной дозы при ограничении однократной инъекцией.

[0012] Соответственно, в данной области все еще сохраняется необходимость в длительном лечении многих хронических заболеваний и нарушений, связанных с передачей сигналов TGF-бета.

СУЩНОСТЬ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0013] Настоящее изобретение относится, в общем, к композициям и способам для введения и дозирования композиций генетически модифицированных В-клеток для лечения хронических заболеваний и нарушений. В различных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам для введения и дозирования В-клеток, генетически модифицированных для экспрессии полипептида, способного модулировать передачу сигналов TGF-бета (например, полипептида фоллистатина). В некоторых конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам для введения и дозирования В-клеток, генетически модифицированных для экспрессии полипептида фоллистатина. В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к композициям и способам для введения и дозирования В-клеток, генетически модифицированных для экспрессии полипептида фоллистатина, имеющего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Такие В-клетки можно использовать в различных вариантах осуществления, например, для увеличения размера или силы мышц у субъекта (например, человека). Настоящее изобретение обеспечивает эти и другие преимущества, как описано в подробном описании.

[0014] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к рекомбинантной В-клетке, содержащей ген фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, ген фоллистатина является функционально связанным с промотором. В некоторых вариантах осуществления, ген фоллистатина представляет собой ген фоллистатина человека. В некоторых вариантах осуществления, ген фоллистатина представляет собой вариант участка сплайсинга FST-344 фоллистатина человека. В некоторых вариантах осуществления, В-клетка представляет собой В-клетку человека. В некоторых вариантах осуществления, В-клетка была трансдуцирована геном фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, В-клетка содержит ген фоллистатина, поскольку она была трансдуцирована геном фоллистатина с использованием системы транспозона sleeping beauty. В некоторых вариантах осуществления, В-клетка экспрессирует ген фоллистатина благодаря трансдукции вирусом, несущим ген фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, В-клетка содержит ген фоллистатина, поскольку она была трансдуцирована ретровирусом, лентивирусом, аденовирусом или аденоассоциированным вирусом, содержащим ген фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, В-клетку модифицируют для содержания гена фоллистатина с использованием способа направленной интеграции. В некоторых вариантах осуществления, в направленной интеграции используют одну или несколько нуклеаз с цинковыми пальцами, подобных активаторам транскрипции эффекторных нуклеаз (TALEN) и/или систем CRISPR/Cas, включая, но без ограничения, системы CRISPR/Cas9. В некоторых вариантах осуществления, В-клетку модифицируют для содержания гена фоллистатина посредством введения кодирующей фоллистатин нуклеиновой кислоты с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из введения ретровирусных векторов, лентивирусных векторов, аденоассоциированных вирусных векторов, аденовирусных векторов, любых других РНК- или ДНК-вирусных векторов, невирусной ДНК и/или РНК, кодирующей фоллистатин, с использованием химических или физических способов, таких как липофекция, образование комплексов с поликатионами, электропорация и т.п. В некоторых вариантах осуществления, ген фоллистатина секретируется рекомбинантной В-клеткой. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантная В-клетка происходит из В-клетки, полученной от субъекта, или В-клетки, происходящей из клетки, полученной от субъекта. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантная В-клетка происходит из предшественника В-клетки, полученного от субъекта. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантная В-клетка происходит из клетки, полученной от субъекта, дифференцированной в В-клетку или предшественник В-клетки. В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантную В-клетку модифицируют посредством

(a) сбора и выделения иммуноцитов из крови субъекта;

(b) трансдукции клеток ДНК, кодирующей фоллистатин;

(c) размножения отобранных клеток ex vivo; и

(d) дифференцировки размноженных клеток ex vivo в плазматические клетки и/или плазмабласты.

[0015] В некоторых вариантах осуществления, выделенные иммуноциты со стадии a представляют собой положительные по CD19 клетки. В некоторых вариантах осуществления, трансдукцию на стадии b проводят посредством электропорации. В некоторых вариантах осуществления, в электропорации используют систему транспозона sleeping beauty. В некоторых вариантах осуществления, дифференцированные клетки представляют собой CD38(+) и CD20(-). В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу, включающему введение такой рекомбинантной В-клетки субъекту.

[0016] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу доставки фоллистатина нуждающемуся в этом субъекту, включающему введение рекомбинантной В-клетки, содержащей ген фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу доставки фоллистатина нуждающемуся в этом субъекту, включающему введение субъекту любой из рекомбинантных В-клеток, описанных в настоящем описании, экпрессирующих полипептид фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, субъект представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления, субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления, субъект имеет мышечное нарушение. В некоторых вариантах осуществления, мышечное нарушение представляет собой мышечные дистрофии. В некоторых вариантах осуществления, мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Дюшенна, мышечной дистрофии Беккера и лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии. В некоторых вариантах осуществления, мышечное нарушение представляет собой воспалительные мышечные нарушения. В некоторых вариантах осуществления, воспалительное мышечное нарушение представляет собой миозит с тельцами включения. В некоторых вариантах осуществления, мышечное нарушение представляет собой повреждение или травму мышцы. В некоторых вариантах осуществления, мышечное нарушение представляет собой бездействие мышцы. В некоторых вариантах осуществления, бездействие мышцы возникает после длительного постельного режима или иммобилизации конечности. В некоторых вариантах осуществления, мышечное нарушение представляет собой атрофию или ослабление мышцы. В некоторых вариантах осуществления, атрофия или ослабление мышцы вызваны старением, злокачественной опухолью или хроническими заболеваниями. В некоторых вариантах осуществления, атрофия или ослабление мышцы обусловлены саркопенией. В некоторых вариантах осуществления, атрофия или ослабление мышцы обусловлены спинальной мышечной атрофией (SMA). В некоторых вариантах осуществления, атрофия или ослабление мышцы обусловлены боковым амиотрофическим склерозом (ALS). В некоторых вариантах осуществления, атрофия или ослабление мышцы обусловлены болезнью Помпе. В некоторых вариантах осуществления, субъект имеет здоровую мышцу. В некоторых вариантах осуществления, введение В-клетки, экспрессирующей полипептид фоллистатина, субъекту, имеющему здоровую мышцу, увеличивает размер или силу мышц субъекта.

[0017] В некоторых конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечной дистрофии, включающему введение субъекту с мышечной дистрофией В-клетки, экспрессирующей полипептид фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, субъект имеет мышечную дистрофию Беккера. В некоторых вариантах осуществления, введение рекомбинантной В-клетки субъекту обеспечивает лечение заболевания, нарушения или состояния субъекта. В некоторых вариантах осуществления, введение рекомбинантной В-клетки субъекту обеспечивает лечение мышечной дистрофии. В некоторых вариантах осуществления, введение рекомбинантной В-клетки субъекту вызывает увеличение массы субъекта. В некоторых вариантах осуществления, масса тела субъекта увеличивается по меньшей мере приблизительно на 4%. В некоторых вариантах осуществления, значительное увеличение массы тела возникает в пределах 30 суток. В некоторых вариантах осуществления, значительное увеличение массы тела возникает за приблизительно 30 суток. В некоторых вариантах осуществления, введение рекомбинантной В-клетки субъекту вызывает увеличение мышечной массы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, введение рекомбинантной В-клетки субъекту вызывает увеличение силы субъекта. В некоторых вариантах осуществления, введение рекомбинантной В-клетки вызывает увеличение уровней фоллистатина в плазме субъекта.

[0018] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения, предотвращения или облегчения мышечной дистрофии посредством введения рекомбинантной В-клетки, содержащей ген фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, способ лечения, предотвращения или облегчения мышечной дистрофии включает введение любой из рекомбинантных В-клеток, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, способ включает введение двух или более последовательных доз генетически модифицированных В-клеток субъекту. В некоторых вариантах осуществления, введение включает две или более дозы генетически модифицированных В-клеток в субоптимальных концентрациях однократных доз. В некоторых вариантах осуществления, введение включает три или более дозы генетически модифицированных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки являются аутологичными для субъекта. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки являются аллогенными для субъекта. В некоторых вариантах осуществления, субъект представляет собой человека. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки являются CD20-, CD38- и CD138-. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки являются CD20-, CD38+ и CD138+. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки являются CD20-, CD38+ и CD138-. В некоторых вариантах осуществления, введение включает внутривенную, внутрибрюшинную, подкожную или внутримышечную инъекцию. В некоторых вариантах осуществления, введение включает внутривенную инъекцию. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки модифицируют на сутки 2 или сутки 3 после культивирования. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки модифицируют с использованием способа, включающего электропорацию. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки 4, сутки 5, сутки 6 или сутки 7 в культуре после модификации. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки 8 или позже в культуре после модификации. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки 10 или ранее в культуре после модификации. В некоторых вариантах осуществления, собранные генетически модифицированные В-клетки не продуцируют значительных уровней провоспалительных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки собирают во временной точке в культуре, в которой определено, что они не продуцируют значительных уровней провоспалительных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки выращивают в системе культивирования, содержащей каждый из IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-31 и мультимеризованного лиганда CD40, на протяжении всего периода культивирования, до и после модификации. В некоторых вариантах осуществления, мультимеризованный лиганд CD40 представляет собой меченный HIS лиганд CD40, мультимеризованный с использованием антитела к his. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает размножение генетически модифицированных В-клеток до введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления, для конечной популяции размноженных генетически модифицированных В-клеток показана высокая степень поликлональности. В некоторых вариантах осуществления, любой конкретный клон В-клеток в конечной популяции размноженных генетически модифицированных В-клеток составляет менее 0,2% общей популяции В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, любой конкретный клон В-клеток в конечной популяции размноженных генетически модифицированных В-клеток составляет менее 0,05% общей популяции В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки содержит полинуклеотид, кодирующий ген DHFR человека с увеличенной устойчивостью к метотрексату. В некоторых вариантах осуществления, ген DHFR человека с увеличенной устойчивостью к метотрексату содержит мутации замены лейцина на тирозин в положении аминокислоты 22 и фенилаланина на серин в положении аминокислоты 31. В некоторых вариантах осуществления, способ включает обработку генетически модифицированных В-клеток метотрексатом до сбора для введения. В некоторых вариантах осуществления, обработку метотрексатом проводят между 100 нМ и 300 нМ. В некоторых вариантах осуществления, обработку метотрексатом проводят при 200 нМ. В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки мигрируют к различным тканям при введении субъекту. В некоторых вариантах осуществления способа, по меньшей мере одна генетически модифицированная В-клетка из популяции генетически модифицированных В-клеток, которые вводят субъекту, мигрирует в одну или несколько тканей, выбранных из группы, состоящей из костного мозга, кишечника, мышцы, селезенки, почки, сердца, печени, легкого и головного мозга. В некоторых вариантах осуществления способа, по меньшей мере одна генетически модифицированная В-клетка из популяции генетически модифицированных В-клеток, которые вводят субъекту, мигрирует в костный мозг, кишечник, мышцу, селезенку, почку, сердце, печень, легкое и головной мозг субъекта.

[0019] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к модифицированной В-клетке, трансдуцированной для экспрессии как гена фоллистатина, так и гена дигидрофолатредуктазы (DHFR).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0020] На фигуре 1 показано, что обработка с использованием экспрессирующих фоллистатин В-клеток приводит к увеличенным уровням фоллистатина в плазме мыши. Слева направо в каждой из контрольных групп и обработанных групп: столбцы соответствуют суткам 21, 28 и 35, соответственно.

[0021] На фигуре 2 показано, что уровни фоллистатина в плазме мышей, обработанных с использованием экспрессирующих фоллистатин В-клеток, коррелируют с уровнями IgG человека, представляющими собой суррогатный маркер для приживления. На ФИГ. 2A-2D показаны уровни фоллистатина в плазме у четырех отдельных мышей, обработанных с использованием экспрессирующих фоллистатин В-клеток.

[0022] На фигуре 3 показан процент изменения массы у мышей, обработанных или не обработанных с использованием экспрессирующих фоллистатин В-клеток.

[0023] На фигуре 4 показаны оценки силы у мышей, обработанных или не обработанных с использованием экспрессирующих фоллистатин В-клеток. На ФИГ. 4A показана сила, как оценено посредством теста прогулки по приподнятой перекладине для передних лап. На ФИГ. 4B показана сила, как оценено посредством теста прогулки по приподнятой перекладине для четырех лап. На ФИГ. 4C показана сила, как оценено посредством теста подвешивания. Проценты улучшения, представленные под графиками, показывают средний процент улучшения в обработанной группе по сравнению с необработанной группой.

[0024] На фигуре 5 показана экспрессия фоллистатина in vitro в экспрессирующих фоллистатин В-клетках. На ФИГ. 5A показана экспрессия белка фоллистатина, как определено посредством ELISA. На ФИГ. 5B показана экспрессия мРНК фоллистатина, как определено посредством RT-ПЦР.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0025] В практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать, если конкретно не указано обратное, обычные способы молекулярной биологии, способы рекомбинантной ДНК, экспрессии белка и химии белков/пептидов/углеводов, в пределах компетенции специалиста в данной области, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие способы полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2000); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (P. Herdewijn, ed., 2004); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Nucleic Acid Hybridization: Modern Applications (Buzdin and Lukyanov, eds., 2009); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Freshney, R.I. (2005) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 5th Ed. Hoboken NJ, John Wiley & Sons; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (3rd Edition 2010); Farrell, R., RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (3rd Edition 2005). Публикации, обсуждаемые выше, предоставлены только для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничего в настоящем описании не следует истолковывать как допущение того, что авторы изобретения не имеют права датировать такое описание задним числом из-за предшествующего изобретения.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

[0026] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. В описании и в прилагаемой формуле изобретения, если не указано обратное, следующие термины имеют указанное значение. Применительно к описанию, каждый раз, когда определение термина, как определено в настоящем описании, отличается от определения, приведенного для того же термина в включенной ссылке, определение, явно определенное в настоящем описании, является правильным определением этого термина.

[0027] Формы единственного числа обозначают один или несколько, если конкретно не указано иное.

[0028] Под «приблизительно» понимают количество, уровень, величину, число, частоту, процент, измерение, размер, значение, массу или длину, отличающееся на вплоть до 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от эталонного количества, уровня, величины, числа, частоты, процента, измерения, размера, значения, массы или длины. В любом варианте осуществления, обсуждаемом в контексте числового значения, используемого в сочетании с термином «приблизительно», конкретно предусмотрено, что термин приблизительно может быть опущен.

[0029] «Композиция» может содержать действующее вещество и носитель, инертный или активный, например, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. В конкретных вариантах осуществления, композиции являются стерильными, в основном свободными от эндотоксинов или нетоксичными для реципиентов в используемой дозе или концентрации.

[0030] Если контекст не требует иного, на протяжении настоящего описания и формулы изобретения, слово «содержать» и его варианты, такие как «содержит» и «содержащий», следует понимать в открытом и включительном смысле, т.е., как «включающий, но без ограничения».

[0031] Под «состоящий из» понимают включающий и ограниченный тем, что следует после выражения «состоящий из». Таким образом, выражение «состоящий из» указывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, и что никакие другие элементы не могут присутствовать. Под «в основном состоящий из» понимают включающий любые элементы, перечисленные после выражения, и ограниченный другими элементами, не создающими помех или не вносящими вклад в активность или действие, указанные в описании для перечисленных элементов. Таким образом, выражение «в основном состоящий из» указывает, что перечисленные элементы являются необходимыми или обязательными, но при этом другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать, в зависимости от того, влияют ли они на активность или действие перечисленных элементов.

[0032] Ссылка на протяжении настоящего описания на «биологическую активность» или «биоактивность» относится к любому ответу, индуцируемому в анализе in vitro или в клетке, ткани, органе или организме, (например, животного или млекопитающего, или человека) в результате введения любого соединения, средства, полипептида, конъюгата, фармацевтической композиции, предусмотренных в настоящем описании. Биологическая активность может относиться к агонистическим действиям или антагонистическим действиям. Биологическая активность может представлять собой благоприятный эффект; или биологическая активность может не является благоприятной, т.е. токсичность. В некоторых вариантах осуществления, биологическая активность может относиться к положительным или отрицательным эффектам, которые лекарственное средство или фармацевтическая композиция оказывают на живого субъекта, например, млекопитающее, такое как человек. Соответственно, термин «биологически активный» предназначен для описания любого соединения, имеющего биологическую активность, как описано в настоящем описании. Биологическую активность можно оценивать любыми подходящими способами, в настоящее время известными специалисту в данной области. Такие анализы могут являться качественными или количественными. Специалисту в данной области хорошо понятна необходимость использования различных анализов для оценки активности различных полипептидов; эта задача является повседневной для обычного исследователя. Такие анализы часто легко осуществляют в лабораторных условиях с небольшой необходимостью оптимизации, и в большинстве случаев, доступны коммерческие наборы, обеспечивающие простые, надежные и воспроизводимые показания биологической активности для широкого диапазона полипептидов с использованием различных технологий, общепринятых для лабораторий. Когда такие наборы недоступны, обычные исследователи могут легко разрабатывать и оптимизировать для внутреннего пользования анализы биоактивности для полипептидов-мишеней, без излишнего экспериментирования; поскольку это является повседневным аспектом научного процесса.

[0033] Ссылка на термин «например» предназначена для обозначения «например, но без ограничения», и таким образом, следует понимать, что все, что за этим следует, является только примером конкретного варианта осуществления, но его никаким образом не следует рассматривать как ограничивающий пример. Если не указано иное, использование «например» предназначено для явного указания на то, что другие варианты осуществления предусмотрены по настоящему изобретению и включены в него.

[0034] Ссылка на протяжении настоящего описания на «вариант осуществления» или «один вариант осуществления», или «вариант осуществления», или «некоторые варианты осуществления», или «конкретные варианты осуществления» означает, что конкретные признак, структура или характеристика, описанные в связи с вариантом осуществления, включены по меньшей мере в один вариант осуществления настоящего изобретения. Таким образом, появление выражений «в одном варианте осуществления» или «в варианте осуществления», или «в конкретных вариантах осуществления» в различных местах на протяжении настоящего описания, не обязательно во всех случаях относится к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, конкретные признаки, структуры или характеристики можно комбинировать любым подходящим образом в одном или нескольких вариантах осуществления.

[0035] «Увеличенное» или «повышенное» количество, как правило, представляет собой «статистически значимое» количество, и может включать увеличение, составляющее увеличение в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50, или более раз (например, 100, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные доли между ними и выше 1, например, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 и т.д.) количества или уровня, описанного в настоящем описании. Подобным образом, «уменьшенное» или «сниженное», или «меньшее» количество, как правило, представляет собой «статистически значимое» количество, и может включать уменьшение, составляющее уменьшение приблизительно в 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 или 50, или более раз (например, 100, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные доли между ними и выше 1, например, 1,5, 1,6, 1,7. 1,8 и т.д.) количества или уровня, описанного в настоящем описании.

[0036] Термины «in vitro», «ex vivo» и «in vivo» предназначены в настоящем описании, чтобы иметь свои нормальные научные значения. Соответственно, например, «in vitro» предназначено для обозначения экспериментов или реакций, происходящих с выделенными клеточными компонентами, например, таких как ферментная реакция, проводимая в пробирке с использованием соответствующего субстрата, фермента, донора и необязательно буферов/кофакторов. «Ex vivo» предназначено для обозначения экспериментов или реакций, проводимых с использованием функциональных органов или клеток, удаленных из организма или размноженных независимо от организма. «In vivo» предназначено для обозначения экспериментов или реакций, проводимых внутри живого организма в его нормальном интактном состоянии.

[0037] «Млекопитающее» включает человека и как домашних животных, таких как лабораторные животные и домашние питомцы (например, кошки, собаки, свиньи, крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади и кролики), так и недомашних животных, таких как дикие животные и т.п.

[0038] «Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное затем событие или условие, может возникать или может не возникать, и что описание включает случаи, когда указанное событие или условие возникает, и случаи, в которых оно не возникает.

[0039] «Фармацевтическая композиция» относится к составу соединения (например, терапевтически полезного полипептида) и среды, общепринятой в данной области для доставки соединения животному, например, человеку. Такая среда, таким образом, может включать любые фармацевтически приемлемые носители, разбавители или наполнители.

[0040] «Фармацевтически эффективные наполнители» и «фармацевтически эффективные носители» хорошо известны специалисту в данной области, и способы их получения также ясно очевидны специалисту в данной области. Такие композиции и способы их получения можно обнаружить, например, в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки).

[0041] Термины «полинуклеотид», «нуклеотид», «нуклеотидная последовательность» и «нуклеиновая кислота» используют взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотидов, либо рибонуклеотидов, или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут осуществлять любую функцию, известную или неизвестную. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локус(ы), определенные из анализа сцепления, экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомальная РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды и праймеры на основе нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Если они присутствуют, модификации нуклеотидной структуры можно вводить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов может включать ненуклеотидные компоненты. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, например, посредством конъюгации с метящим компонентом.

[0042] «Субъект», в рамках изобретения, включает любое животное, у которого проявляется заболевание или симптом, или которое подвержено риску проявления заболевания или симптома, которые можно лечить с использованием средства по изобретению. Подходящие субъекты включают лабораторных животных (таких как мышь, крыса, кролик или морская свинка), сельскохозяйственных животных и домашних животных или питомцев (таких как кошка или собака). Включены также нечеловекообразные приматы и, предпочтительно, пациенты-люди.

[0043] «В основном» или «по существу» обозначает более, чем достаточные или значительные число, количество, размер; почти тотальные или полные; например, 95% или более от некоторого данного количества.

[0044] «Лекарственное средство» относится к любому соединению, которое, при введении субъекту, (например, предпочтительно, млекопитающему, более предпочтительно, человеку) в терапевтически эффективном количестве, является способным к эффективному лечению заболевания или состояния, как определено ниже.

[0045] «Терапевтически эффективное количество» или «терапевтически эффективная доза» относится к количеству соединения по изобретению, которое, при введении субъекту (например, предпочтительно, млекопитающему, более предпочтительно, человеку), является достаточным для обеспечения лечения, как определено ниже, заболевания или состояния у животного. Количество соединения по изобретению, составляющее «терапевтически эффективное количество», может меняться в зависимости от соединения, состояния и его тяжести, способа введения и возраста животного, подлежащего лечению, но его может определять общепринятым способом специалист в данной области, исходя из его собственных знаний и этого описания.

[0046] «Лечение» или «обработка», в рамках изобретения, включает лечение представляющего интерес заболевания или состояния у субъекта, предпочтительно, человека, имеющего представляющее интерес заболевание или состояние, и включает: (i) предотвращение или ингибирование возникновения заболевания или состояния у субъекта, в частности, когда такой субъект имеет предрасположенность к состоянию, но еще не имеет диагноза его наличия; (ii) ингибирование заболевания или состояния, т.е., остановку его развития; (iii) облегчение заболевания или состояния, т.е., вызов регрессии заболевания или состояния; или (iv) облегчение симптомов, возникающих в результате заболевания или состояния. В рамках изобретения, термины «заболевание», «нарушение» и «состояние» можно использовать взаимозаменяемо, или они могут отличаться в том, что конкретная болезнь, повреждение или состояние может не иметь известного этиологического агента (так что этиология еще не разработана), и они, таким образом, еще не являются признанными в качестве повреждения или заболевания, но только в качестве нежелательного состояния или синдрома, где более или менее специфический набор симптомов идентифицирован клиницистами.

ОБЗОР

[0047] Настоящее изобретение относится, среди прочего, к аутологичным и/или аллогенным В-клеткам, измененным посредством введения нуклеиновых кислот для продукции фоллистатина, а также относится к способам введения модифицированных В-клеток (например, для лечения заболевания, нарушения или состояния, например, мышечного нарушения, такого как мышечная дистрофия). В некоторых вариантах осуществления, термины «сконструированная В-клетка», «полученная способом генной инженерии В-клетка», «модифицированная В-клетка» и «генетически модифицированная В-клетка» используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения таких измененных В-клеток, содержащих одну или несколько нуклеиновых кислот (например, трансген), для продукции фоллистатина (например, трансген, обеспечивающий экспрессию полипептида фоллистатина, такого как терапевтический полипептид фоллистатина). Конкретно, модифицированные В-клетки можно вводить в форме однократной дозы или множественных доз.

[0048] Соответственно, способы введения композиций модифицированных В-клеток, описанных в настоящем описании, можно использовать для долгосрочной доставки in vivo и экспрессии фоллистатина. Настоящее изобретение относится, главным образом, к способам достижения достаточного обогащения и количества клеток, продуцирующих фоллистатин, и достаточных уровней фоллистатина in vivo, в то же время обеспечивая безопасность продукта.

[0049] в рамках изобретения, выражения «долгосрочная выживаемость in vivo» и «долгосрочная выживаемость» относятся к выживаемости модифицированных В-клеток, описанных в настоящем описании, в течение 10 или более суток после введения субъекту. Долгосрочная выживаемость может измеряться сутками, неделями или даже годами. В одном варианте осуществления, большинство модифицированных В-клеток выживают in vivo в течение 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более суток после введения. В одном варианте осуществления, большинство модифицированных В-клеток выживают in vivo в течение 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 или более недель после введения. В другом варианте осуществления, модифицированные В-клетки выживают in vivo в течение 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более лет. Кроме того, в то время как модифицированные В-клетки, описанные в настоящем описании, могут выживать in vivo в течение 10 или более суток, понятно, что большинство модифицированных В-клеток выживают in vivo в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более суток после введения. Соответственно, предусматривают, что модифицированные В-клетки, описанные в настоящем описании, можно использовать в способах краткосрочного лечения (например, 4 суток) и долгосрочного лечения (например, 30 или более суток).

В-клетки

[0050] После покидания костного мозга, В-клетка действует как антигенпредставляющая клетка (APC) и интернализует антигены. Антиген подвергается поглощению В-клеткой с помощью опосредованного рецептором эндоцитоза и процессингу. Антиген подвергается процессингу до антигенных пептидов, нагрузке на молекулы MHC II, и представлению на внеклеточной поверхности В-клетки CD4+ T-клеткам-помощникам. Эти T-клетки связываются с молекулой MHC II/антигена и вызывают активацию В-клетки. После стимуляции посредством T-клетки, активированная В-клетка начинает дифференцировку в более специализированные клетки. В-клетки зародышевого центра могут подвергаться дифференцировке в долгоживущие В-клетки памяти или плазматические клетки. Кроме того, вторичная иммунная стимуляция может приводить к тому, что В-клетки памяти приводят к образованию дополнительных плазматических клеток. Образованию плазматических клеток либо из В-клеток памяти, либо из не относящихся к клеткам памяти В-клеток, предшествует образование плазмабластов-предшественников, которые, в конечном счете, подвергаются дифференцировке в плазматические клетки, продуцирующие большие объемы антител (см., например, Trends Immunol. 2009 June; 30(6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5:231-242). Плазмабласты секретируют больше антител, чем В-клетки, но меньше, чем плазматические клетки. Они быстро делятся, и они продолжают интернализовать антигены и представлять антигены T-клеткам. Плазмабласты имеют способность мигрировать к участкам продукции хемокинов (например, в костном мозге), посредством чего они могут подвергаться дифференцировке в долгоживущие плазматические клетки. В конечном счете, плазмабласт может либо оставаться в форме плазмабласта в течение нескольких суток и затем погибать, либо подвергаться необратимой дифференцировке в зрелую, полностью дифференцированную плазматическую клетку. Конкретно, плазмабласты, способные к хомингу в тканях, содержащих ниши для выживаемости плазматических клеток (например, в костном мозге), являются способными заменять населяющие их плазматические клетки, чтобы становиться долгоживущими плазматическими клетками, которые могут продолжать секретировать высокие уровни белков в течение нескольких лет.

[0051] В-клетки, используемые в способах, описанных в настоящем описании (например, для экспрессии фоллистатина), включают пан-В-клетки, В-клетки памяти, плазмабласты и/или плазматические клетки. В одном варианте осуществления, модифицированные В-клетки представляют собой В-клетки памяти (например, модифицированные для экспрессии фоллистатина). В одном варианте осуществления, модифицированные В-клетки представляют собой плазмабласты (например, модифицированные для экспрессии фоллистатина). В одном варианте осуществления, модифицированные В-клетки представляют собой плазматические клетки (например, модифицированные для экспрессии фоллистатина).

[0052] Терминально дифференцированные плазматические клетки, как правило, не экспрессируют обычные маркеры пан-В-клеток, такие как CD19 и CD20, и экспрессируют относительно немногие поверхностные антигены. Плазматические клетки экспрессируют CD38, CD78, CD138 и рецептор интерлейкина-6 (IL-6R), и лишены экспрессии CD45, и эти маркеры можно использовать, например, посредством проточной цитометрии, для идентификации плазматических клеток. CD27 также является хорошим маркером для плазматических клеток, поскольку наивные В-клетки являются CD27-, В-клетки памяти являются CD27+, и плазматические клетки являются CD27++. Подгруппы В-клеток памяти также могут экспрессировать поверхностные IgG, IgM и IgD, в то время как плазматические клетки не экспрессируют эти маркеры на поверхности клетки. CD38 и CD138 экспрессируются на высоких уровнях на плазматических клетках (см. Wikipedia, The Free Encyclopedia., «Plasma cell» Page Version ID: 404969441; Date of last revision: 30 December 2010 09:54 UTC, retrieved January 4, 2011; см. также: Jourdan et al. Blood. 2009 Dec 10;114(25):5173-81; Trends Immunol. 2009 June; 30(6): 277-285; Nature Reviews, 2005, 5:231-242; Nature Med. 2010, 16:123-129; Neuberger, M. S.; Honjo, T.; Alt, Frederick W. (2004). Molecular biology В-клеток. Amsterdam: Elsevier, pp. 189-191 ; Bertil Glader; Greer, John G.; John Foerster; Rodgers, George G.; Paraskevas, Frixos (2008). Wintrobe’s Clinical Hematology, 2-Vol. Set. Hagerstwon, MD: Lippincott Williams & Wilkins. pp. 347; Walport, Mark; Murphy, Kenneth; Janeway, Charles; Travers, Paul J. (2008). Janeway’s immunobiology. New York: Garland Science, pp. 387-388; Rawstron AC (May 2006). «Immunophenotyping of plasma cells». Curr Protoc Cytom).

[0053] «Покоящаяся», в рамках изобретения, относится к состоянию клеток, когда клетка не является активно пролиферирующей.

[0054] «Активированная», в рамках изобретения, относится к состоянию клетки, где клетка является активно пролиферирующей и/или продуцирующей цитокины в ответ на стимул.

[0055] Термины «дифференцировать» и «дифференцированный», в рамках изобретения, относятся к изменениям фенотипа клетки от одного типа или состояния клеток до другого типа или состояния клеток. Например, В-клетка памяти, переходящая в плазматическую клетку, является дифференцированной.

[0056] Термин «субъект» предназначен для включения живых организмов, у которых можно вызывать адаптивный иммунный ответ (например, млекопитающих). Примеры субъектов включают человека, собак, кошек, мышей, крыс и их трансгенные виды. В одном варианте осуществления, субъект представляет собой человека. В-клетки можно получать из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), костный мозг, ткань лимфатического узла, пуповинную кровь, ткань из участка инфекции, ткань селезенки и опухоли. В предпочтительном варианте осуществления, источник В-клеток представляет собой PBMC. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, можно использовать любое количество линий B-клеток, доступных в данной области.

[0057] В конкретных вариантах осуществления способов, описанных в настоящем описании, В-клетки можно получать из дозы крови, собранной от субъекта, с использованием любого количества способов, известных специалисту в данной области, таких как разделение на фиколле^TM (сополимерах сахарозы и эпихлоргидрина, которые можно использовать для получения растворов высокой плотности). В одном предпочтительном варианте осуществления, клетки из циркулирующей крови индивидуума получают посредством афереза или лейкафереза. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В одном варианте осуществления, клетки, собранные посредством афереза, можно промывать для удаления фракции плазмы и для помещения клеток в подходящий буфер или среду для последующих стадий переработки. В одном варианте осуществления способов, описанных в настоящем описании, клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В альтернативном варианте осуществления, в растворе для промывки отсутствует кальций и может отсутствовать магний, или могут отсутствовать многие, если не все, двухвалентные катионы. Как хорошо известно специалисту в данной области, стадию промывки можно осуществлять способами, известными в данной области, например, с использованием полуавтоматической «проточной» центрифуги (например, устройства для переработки клеток Cobe 2991), в соответствии с инструкциями производителя. После промывки, клетки можно ресуспендировать во множестве биосовместимых буферов, например, таких как PBS. Альтернативно, нежелательные компоненты из образца после афереза можно удалять, и клетки ресуспендировать непосредственно в культуральной среде.

[0058] В-клетки можно выделять из периферической крови или продукта лейкафереза с использованием способов, известных в данной области. Например, PBMC можно выделять с использованием фиколла^TM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) и очищать CD19+ В-клетки посредством отрицательного или положительного отбора с использованием любого из множества антител, известных в данной области, таких как система тетрамерного комплекса Rosette (StemCell Technologies, Vancouver, Canada) или технология микробусин MACS™ (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). В конкретных вариантах осуществления, В-клетки памяти выделяют, как описано в Jourdan et al., (Blood. 2009 Dec 10; 114(25):5173-81). Например, после удаления CD2+ клеток с использованием магнитных бусин против CD2, CD19+ CD27+ В-клетки памяти можно сортировать посредством FACS. Плазматические клетки костного мозга (BMPC) можно очищать с использованием сортировки посредством магнитных микробусин против CD138 или других сходных способов и реагентов. В-клетки человека можно выделять, например, с использованием микробусин против CD19, человека (Miltenyi Biotec, San Diego, CA). В-клетки памяти человека можно выделять, например, с использованием набора для выделения В-клеток памяти человека (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).

[0059] Другие наборы для выделения являются коммерчески доступными, например, набор для выделения В-клеток человека MagCellect от R&D Systems (Minneapolis, MN). В конкретных вариантах осуществления, покоящиеся В-клетки можно получать посредством седиментации в непрерывных градиентах перколла, как описано в (Defranco et al., (1982) J. Exp. Med. 155:1523).

[0060] В одном варианте осуществления, PBMC получают из образца крови с использованием очистки на основе градиента (например, фиколла™). В другом варианте осуществления, PBMC получают посредством сбора на основе афереза. В одном варианте осуществления, В-клетки выделяют из PBMC посредством выделения пан-В-клеток. На стадии выделения можно использовать положительный и/или отрицательный отбор. В одном варианте осуществления, отрицательный отбор включает истощение T-клеток с использованием конъюгированных с антителом против CD3 микробусин, таким образом, получая истощенную по T-клеткам фракцию. В следующем варианте осуществления, В-клетки памяти выделяют из пан-В-клеток или истощенной по T-клеткам фракции посредством положительного отбора по CD27.

[0061] В одном конкретном варианте осуществления, В-клетки памяти выделяют посредством истощения нежелательных клеток и последующего положительного отбора с использованием микробусин против CD27. Нежелательные клетки, например, T-клетки, клетки NK, моноциты, дендритные клетки, гранулоциты, тромбоциты и эритроидные клетки, можно истощать с использованием коктейля биотинилированных антител против CD2, CD14, CD16, CD36, CD43 и CD235a (гликофорина A), и микробусин против биотина.

[0062] В одном варианте осуществления, получают переключенные В-клетки памяти. «Переключенная В-клетка памяти» или «переключенная В-клетка», в рамках изобретения, относится к В-клетке, подвергшейся переключению класса изотипа. В одном варианте осуществления, переключенные В-клетки памяти подвергают положительному отбору по IgG. В другом варианте осуществления, переключенные В-клетки памяти получают посредством истощения экспрессирующих IgD и IgM клеток. Переключенные В-клетки памяти можно выделять, например, с использованием набора для выделения переключенных В-клеток памяти человека (Miltenyi Biotec, San Diego, CA).

[0063] Например, в одном конкретном варианте осуществления, нецелевые клетки можно метить с использованием коктейля биотинилированных антител против CD2, CD14, CD16, CD36, CD43, CD235a (гликофорина A), против IgM и против IgD. Эти клетки можно затем метить магнитными бусинами против биотина. Переключенные В-клетки памяти высокой чистоты можно получать посредством истощения меченных магнитной меткой клеток.

[0064] В следующем варианте осуществления промоторную последовательность из гена, уникального для В-клеток памяти, например, такого как ген CD27 (или другой ген, специфический для В-клеток памяти и не экспрессирующийся в наивных В-клетках), используют для контроля экспрессии селективного маркера, например, такого как мутантная дигидрофолатредуктаза, позволяющая положительный отбор В-клеток памяти в присутствии метотрексата. В другом варианте осуществления, промоторную последовательность из гена пан-В-клеток, например, такого как ген CD19, используют для контроля экспрессии селективного маркера, например, такого как мутантная дигидрофолатредуктаза, позволяющая положительный отбор В-клеток памяти в присутствии метотрексата. В другом варианте осуществления, T-клетки истощают с использованием CD3 или посредством добавления циклоспорина. В другом варианте осуществления, CD138+ клетки выделяют из пан-В-клеток посредством положительного отбора. В другом варианте осуществления, CD138+ клетки выделяют из PBMC посредством положительного отбора. В другом варианте осуществления, CD38+ клетки выделяют из пан-В-клеток посредством положительного отбора. В другом варианте осуществления, CD38+ клетки выделяют из PBMC посредством положительного отбора. В одном варианте осуществления, CD27+ клетки выделяют из PBMC посредством положительного отбора. В другом варианте осуществления, В-клетки памяти и/или плазматические клетки избирательно размножают из PBMC с использованием способов культивирования in vitro, доступных в данной области.

Культивирование B-клеток in vitro

[0065] В-клетки, такие как В-клетки памяти, можно культивировать с использованием способов in vitro для активации и дифференцировки В-клеток в плазматические клетки или плазмабласты, или и в те, и в другие. Как известно специалисту в данной области, плазматические клетки можно идентифицировать по паттернам экспрессии белка на клеточной поверхности с использованием стандартных способов проточной цитометрии. Например, терминально дифференцированные плазматические клетки экспрессируют относительно немногие поверхностные антигены и не экспрессируют обычные маркеры пан-В-клеток, такие как CD19 и CD20. Вместо этого, плазматические клетки можно идентифицировать по экспрессии CD38, CD78, CD138 и IL-6R, и отсутствию CD45. CD27 можно также использовать для идентификации плазматических клеток, поскольку наивные В-клетки являются CD27-, В-клетки памяти являются CD27+, и плазматические клетки являются CD27++. Плазматические клетки экспрессируют высокие уровни CD38 и CD138.

[0066] В одном варианте осуществления, В-клетки представляют собой CD138- В-клетки памяти. В одном варианте осуществления, В-клетки представляют собой CD138+ плазматические клетки. В одном варианте осуществления, В-клетки являются активированными и имеют фенотип клеточной поверхности CD138-, CD27+.

[0067] В одном варианте осуществления, В-клетки представляют собой CD20-, CD138- В-клетки памяти. В одном варианте осуществления, В-клетки представляют собой CD20-, CD138+ плазматические клетки. В одном варианте осуществления, В-клетки являются активированными и имеют фенотип клеточной поверхности CD20-, CD138-, CD27+.

[0068] В одном варианте осуществления, В-клетки представляют собой CD20-, CD38-, CD138- В-клетки памяти. В одном варианте осуществления, В-клетки представляют собой CD20-, CD38+, CD138+ плазматические клетки. В одном варианте осуществления, В-клетки являются активированными и имеют фенотип клеточной поверхности CD20- CD38- CD138- CD27+.

[0069] В одном варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с одним или несколькими активирующими В-клетки факторами, например, любым из множества цитокинов, факторов роста или линий клеток, как известно, активирующих и/или дифференцирующих В-клетки (см., например, Fluckiger, et al. Blood 1998 92: 4509-4520; Luo, et al., Blood 2009 1 13: 1422-1431). Такие факторы могут быть выбраны из группы, состоящей из, но без ограничения, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34 и IL-35, IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-δ, хемокинов C-типа XCL1 и XCL2, хемокинов C-C-типа (к настоящему времени включающих CCL1-CCL28) и хемокинов CXC-типа (к настоящему времени включающих CXCL1-CXCL17), и членов суперсемейства TNF (например, TNF-α, лиганда 4-1 BB, фактора активации В-клеток (BLyS), лиганда FAS, sCD40L (включая мультимерные варианты sCD40L; например, меченный гистидином растворимый рекомбинантный CD40L в комбинации с mAb против полигистидина для совместной группировки множества молекул sCD40L), лимфотоксин, OX40L, RANKL, TRAIL), CpG и других агонистов toll-подобного рецептора (например, CpG).

[0070] Активирующие В-клетку факторы можно добавлять в культуры клеток in vitro в различных концентрациях для достижения желательного исхода (например, размножения или дифференцировки). В одном варианте осуществления, фактор активации В-клеток используют в размножении В-клеток в культуре. В одном варианте осуществления, фактор активации В-клеток используют в дифференцировке В-клеток в культуре. В другом варианте осуществления, фактор активации В-клеток используют как в размножении, так и в дифференцировке В-клеток в культуре. В одном варианте осуществления, фактор активации В-клеток предоставляют в одинаковой концентрации для размножения и дифференцировки. В другом варианте осуществления, фактор активации В-клеток предоставляют в первой концентрации для размножения и во второй концентрации для дифференцировки. Предусматривают, что фактор активации В-клеток можно 1) использовать в размножении В-клеток и не в дифференцировке В-клеток, 2) использовать в дифференцировке В-клеток и не в размножении В-клеток или 3) использовать в размножении и дифференцировке В-клеток.

[0071] Например, в некоторых вариантах осуществления, В-клетки культивируют с использованием среды для культивирования В-клеток, содержащей один или несколько факторов активации В-клеток, выбранных из CD40L, IL-2, IL-4 и IL-10, для размножения В-клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 0,25-5,0 мкг/мл CD40L. В одном варианте осуществления, концентрация CD40L составляет 0,5 мкг/мл. В одном варианте осуществления, средство для перекрестного сшивания (такое как антитело против his в комбинации с меченным HIS CD40L) используют для получения мультимеров CD40L. В одном варианте осуществления молекулы CD40L ковалентно сшивают или удерживают вместе с использованием доменов для мультимеризации белков (например, области Fc IgG или домена лейциновой молнии). В одном варианте осуществления, CD40L конъюгируют с бусинами. В одном варианте осуществления, CD40L экспрессируют из фидерных клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 1-10 нг/мл IL-2. В одном варианте осуществления, концентрация IL-2 составляет 5 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 1-10 нг/мл IL-4. В одном варианте осуществления, концентрация IL-4 составляет 2 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 10-100 нг/мл IL-10. В одном варианте осуществления, концентрация IL-10 составляет 40 нг/мл.

[0072] В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с использованием среды для культивирования В-клеток, содержащей один или несколько факторов активации В-клеток, выбранных из CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 и IL-21, для размножения В-клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 0,25-5,0 мкг/мл CD40L. В одном варианте осуществления, концентрация CD40L составляет 0,5 мкг/мл. В одном варианте осуществления, средство для перекрестного сшивания (такое как антитело против his в комбинации с меченным HIS CD40L) используют для получения мультимеров CD40L. В одном варианте осуществления, молекулы CD40L ковалентно сшивают или удерживают вместе с использованием доменов для мультимеризации белков (например, области Fc IgG или домена лейциновой молнии). В одном варианте осуществления, CD40L конъюгируют с бусинами. В одном варианте осуществления, CD40L экспрессируют из фидерных клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 1-10 нг/мл IL-2. В одном варианте осуществления, концентрация IL-2 составляет 5 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 1-10 нг/мл IL-4. В одном варианте осуществления, концентрация IL-4 составляет 2 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 10-100 нг/мл IL-10. В одном варианте осуществления, концентрация IL-10 составляет 40 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 50-150 нг/мл IL-15. В одном варианте осуществления, концентрация IL-15 составляет 100 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 50-150 нг/мл IL-21. В одном варианте осуществления, концентрация IL-21 составляет 100 нг/мл. В конкретном варианте осуществления, В-клетки культивируют с использованием среды для культивирования В-клеток, содержащей CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 и IL-21 для размножения В-клеток.

[0073] Например, в одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с использованием среды для культивирования В-клеток, содержащей факторы активации В-клеток CD40L, IL-2, IL-4, IL-10, IL-15 и IL-21, для размножения В-клеток, где CD40L перекрестно сшивают с использованием средства для перекрестного сшивания для получения мультимеров CD40L. Такую систему культивирования можно поддерживать на протяжении всего периода культивирования (например, 7-суточного периода культивирования), в котором В-клетки трансфицируют или иным образом модифицируют для экспрессии представляющего интерес трансгена (например, экзогенного полипептида, например, такого как FST). Трансген можно интегрировать в В-клетку (например, посредством вирусного или невирусного вектора). Трансген можно экспрессировать в В-клетке с использованием транспозона. Трансген можно экспрессировать в В-клетке посредством направленной интеграции трансгена в геном В-клетки. Направленную интеграцию можно осуществлять посредством гомологичной рекомбинации. Гомологичная рекомбинация может возникать в двухцепочечном разрыве, индуцированном нуклеазой. Нуклеаза может представлять собой, например, нуклеазу с цинковыми пальцами, TALE-нуклеазу (TALEN), мегануклеазу (например, эндонуклеазу хоминга) или систему нуклеазы CRISPR/CAS9.

[0074] В другом примере, в одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с использованием среды для культивирования В-клеток, содержащей один или несколько факторов активации В-клеток, выбранных из CD40L, IFN-α, IL-2, IL-6, IL-10, IL-15, IL-21 и олигодезоксинуклеотидов CpG класса P (p-ODN), для дифференцировки В-клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 25-75 нг/мл CD40L. В одном варианте осуществления, концентрация CD40L составляет 50 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 250-750 ед./мл IFN-α. В одном варианте осуществления концентрация IFN-α составляет 500 ед./мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 5-50 ед./мл IL-2. В одном варианте осуществления концентрация IL-2 составляет 20 ед./мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 25-75 нг/мл IL-6. В одном варианте осуществления, концентрация IL-6 составляет 50 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 10-100 нг/мл IL-10. В одном варианте осуществления, концентрация IL-10 составляет 50 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 1-20 нг/мл IL-15. В одном варианте осуществления, концентрация IL-15 составляет 10 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 10-100 нг/мл IL-21. В одном варианте осуществления, концентрация IL-21 составляет 50 нг/мл. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют с 1-50 мкг/мл p-ODN. В одном варианте осуществления, концентрация p-ODN составляет 10 мкг/мл.

[0075] В одном варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с фидерными клетками или культивируют на них. В одном варианте осуществления, фидерные клетки представляют собой линию стромальных клеток, например, линию мышиных стромальных клеток S17 или MS5. В другом варианте осуществления, выделенные CD19+ клетки культивируют с один или несколькими цитокинами - факторами активации В-клеток, такими как IL-10 и IL-4, в присутствии фибробластов, экспрессирующих лиганд CD40 (CD40L, CD154). В одном варианте осуществления, CD40L предоставляют связанным с поверхностью, такой как культуральный планшет или бусина. В другом варианте осуществления, очищенные В-клетки культивируют, в присутствии или в отсутствие фидерных клеток, с CD40L и одним или несколькими цитокинами или факторами, выбранными из IL-10, IL-4, IL-7, p-ODN, CpG ДНК, IL-2, IL-15, IL6 и IFN-α.

[0076] В другом варианте осуществления, факторы активации В-клеток предоставляют посредством трансфекции В-клетки или другой фидерной клетки. В этом контексте, можно использовать один или несколько факторов, стимулирующих дифференцировку В-клетки в секретирующую антитело клетку, и/или один или несколько факторов, способствующих длительности жизни продуцирующей антитело клетки. Такие факторы включают, например, Blimp-1, TRF4, антиапоптотические факторы, подобные Bcl-xl или Bcl5, или конститутивно активные мутанты рецептора CD40. Кроме того, факторы, стимулирующие экспрессию нижестоящих передающих сигналы молекул, такие как ассоциированные с рецептором TNF факторы (TRAF), также можно использовать в активации/дифференцировке В-клеток. В этом отношении, активация клетки, выживаемость клетки, и антиапоптотические функции суперсемейства рецептора TNF по большей части опосредованы TRAF1-6 (см., например, R.H. Arch, et al., Genes Dev. 12 (1998), pp. 2821-2830). Нижестоящие эффекторы передачи сигналов TRAF включают факторы транскрипции семейства NF-κB и AP-1, которые могут осуществлять включение генов, вовлеченных в различные аспекты клеточных и иммунных функций. Кроме того, показано, что активация NF-κB и AP-1 обеспечивает защиту клеток от апоптоза посредством транскрипции антиапоптотических генов.

[0077] В другом варианте осуществления, происходящие из вируса Эпштейна-Барр (EBV) белки используют для активации и/или дифференцировки В-клеток, или чтобы способствовать длительности жизни продуцирующей антитело клетки. Происходящие из EBV белки включают, но без ограничения, EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3, LMP-1, LMP-2, EBER, мкРНК, EBV-EA, EBV-MA, EBV-VCA и EBV-AN.

[0078] В конкретных вариантах осуществления, приведение В-клеток в контакт с факторами активации В-клеток с использованием способов, представленных в настоящем описании, приводит, среди прочего, к пролиферации (т.е., размножению) клеток, модуляции IgM+ фенотипа клеточной поверхности до фенотипа, соответствующего активированной зрелой В-клетке, секреции Ig и переключению изотипа. CD19+ В-клетки можно выделять с использованием известных и коммерчески доступных наборов для разделения клеток, таких как система разделения клеток MiniMACS™ (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany). В конкретных вариантах осуществления, CD40L фибробласты облучают перед использованием в способах, описанных в настоящем описании. В одном варианте осуществления, В-клетки культивируют в присутствии одного или нескольких из IL-3, IL-7, лиганда Flt3, тромбопоэтина, SCF, IL-2, IL-10, G-CSF и CpG. В конкретных вариантах осуществления, способы включают культивирование В-клеток в присутствии одного или нескольких из вышеупомянутых факторов в сочетании с трансформированными стромальными клетками (например, MS5), обеспечивающими низкий уровень заякоренного CD40L и/или CD40L, связанного с планшетом или бусиной.

[0079] Как обсуждали выше, факторы активации В-клеток индуцируют размножение, пролиферацию или дифференцировку В-клеток. Соответственно, В-клетки приводят в контакт с одним или несколькими факторами активации В-клеток, перечисленными выше, для получения размноженной популяции клеток. Популяцию клеток можно размножать до трансфекции. Альтернативно или дополнительно, популяцию клеток можно размножать после трансфекции. В одном варианте осуществления, размножение популяции В-клеток включает культивирование клеток с IL-2, IL-4, IL-10 и CD40L (см., например, Neron et al. PLoS ONE, 2012 7(12):e51946). В одном варианте осуществления, размножение популяции В-клеток включает культивирование клеток с IL-2, IL-10, CpG и CD40L. В одном варианте осуществления, размножение популяции В-клеток включает культивирование клеток с IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 и CD40L. В одном варианте осуществления, размножение популяции В-клеток включает культивирование клеток с IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-21 и мультимеризованным CD40L.

[0080] В другом варианте осуществления, размножение популяции В-клеток индуцируют и/или усиливают посредством трансгена, введенного в В-клетки. Например, В-клетка, содержащая рекомбинантный рецептор или сконструированный рецептор, который индуцирует клеточный путь передачи сигнала (например, передачи сигнала ниже CD40) после связывания его лиганда (например, растворимого лиганда или экспрессированного на клеточной поверхности лиганда). В одном варианте осуществления, В-клетка сверхэкспрессирует CD40 благодаря экспрессии трансгена CD40. В другом варианте осуществления, В-клетка экспрессирует сконструированный рецептор, включая, например, рекомбинантно сконструированное антитело. В одном варианте осуществления, сконструированный рецептор является сходным с химерным рецептором антигена (CAR) и содержит слитый белок из scFv и части для передачи внутриклеточных сигналов В-клеточного рецептора (например, CD40).

[0081] В одном варианте осуществления, размножение популяции В-клеток индуцируют и/или усиливают посредством низкомолекулярного соединения, добавленного в культуру клеток. Например, соединение, которое связывает и димеризует CD40, можно использовать для запуска пути передачи сигнала CD40.

[0082] Любую из множества культуральных сред можно использовать в настоящих способах, как известно специалисту в данной области (см., например, Current Protocols in Cell Culture, 2000-2009 by John Wiley & Sons, Inc.). В одном варианте осуществления, среды для использования в способах, описанных в настоящем описании, включают, но без ограничения, среду Дульбекко в модификации Искова (в присутствии или в отсутствие эмбриональной бычьей или другой соответствующей сыворотки). Иллюстративные среды также включает, но без ограничения, IMDM, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20. В следующих вариантах осуществления, среда может содержать поверхностно-активное средство, антитело, плазманат или восстанавливающее средство (например, N-ацетилцистеин, 2-меркаптоэтанол), один или несколько антибиотиков, и/или добавок, таких как инсулин, трансферрин, селенит натрия и циклоспорин. В некоторых вариантах осуществления, можно использовать также IL-6, растворимый CD40L и усилитель перекрестного сшивания.

[0083] В-клетки культивируют в условиях и в течение достаточных периодов времени для достижения желательной дифференцировки и/или активации. В конкретных вариантах осуществления, В-клетки культивируют в таких условиях и в течение достаточных периодов времени, чтобы 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или даже 100% В-клеток являлись дифференцированными и/или активированными, как желательно. В одном варианте осуществления, В-клетки являются активированными и дифференцированными до смешанной популяции плазмабластов и плазматических клеток. Как понятно специалисту в данной области, плазмабласты и плазматические клетки можно идентифицировать по паттернам экспрессии белков клеточной поверхности с использованием стандартных способов проточной цитометрии, как описано в другом месте в настоящем описании, таким как экспрессия одного или нескольких из CD38, CD78, IL-6R, CD27^{высокий} и CD138, и/или отсутствие или уменьшение экспрессии одного или нескольких из CD19, CD20 и CD45. Как понятно специалисту в данной области, В-клетки памяти, как правило, являются CD20+ CD19+ CD27+ CD38-, в то время как ранние плазмабласты являются CD20- CD19+ CD27++ CD38++. В одном варианте осуществления, клетки, культивированные с использованием способов, описанных в настоящем описании, являются CD20-, CD38+, CD138-. В другом варианте осуществления, клетки имеют фенотип CD20-, CD38+, CD138+. В конкретных вариантах осуществления, клетки культивируют в течение 1-7 суток. В следующих вариантах осуществления, клетки культивируют 7, 14, 21 суток или дольше. Таким образом, клетки можно культивировать в подходящих условиях в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или более суток. Клетки повторно рассевают, и среды и добавки можно добавлять или изменять по необходимости, с использованием способов, известных в данной области.

[0084] В конкретных вариантах осуществления, В-клетки культивируют в таких условиях и в течение достаточных периодов времени, чтобы по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% клеток являлись дифференцированными и активированными для продукции Ig и/или для экспрессии трансгена.

[0085] Индукцию активации В-клетки можно измерять такими способами, как включение ³H-уридина в РНК (по мере дифференцировки В-клеток, синтез РНК увеличивается), или посредством включения ³H-тимидина, по которому измеряют синтез ДНК, ассоциированный с пролиферацией клеток. В одном варианте осуществления, интерлейкин-4 (IL-4) можно добавлять в культуральную среду в соответствующей концентрации (например, приблизительно 10 нг/мл) для усиления пролиферации В-клетки.

[0086] Альтернативно, активацию В-клетки измеряют как функцию секреции иммуноглобулина. Например, CD40L добавляют к покоящимся В-клеткам вместе с IL-4 (например, 10 нг/мл) и IL-5 (например, 5 нг/мл) или другими цитокинами, активирующими В-клетки. Проточную цитометрию можно также использовать для измерения маркеров клеточной поверхности, типичных для активированных В-клеток. См., например, Civin CI, Loken MR, Int’l J. Cell Cloning 987; 5:1 -16; Loken, MR, et al, Flow Cytometry Characterization of Erythroid, Lymphoid and Monomyeloid Lineages in Normal Human Bone Marrow, in Flow Cytometry in Hematology, Laerum OD, Bjerksnes R. eds., Academic Press, New York 1992; pp. 31 -42; и LeBein TW, et al., Leukemia 1990; 4:354-358.

[0087] После культивирования в течение соответствующего периода времени, например, такого как от 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или более суток, как правило, около 3 суток, можно добавлять дополнительный объем культуральной среды. Супернатант из индивидуальных культур можно собирать в различные периоды времени в ходе культивирования и количественно оценивать по IgM и IgG1, как описано в Noelle et al., (1991) J. Immunol. 146:1118-1124. В одном варианте осуществления, культуру собирают и измеряют по экспрессии представляющего интерес трансгена с использованием проточной цитометрии, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), ELISPOT или другого анализа, известного в данной области.

[0088] В другом варианте осуществления, ELISA используют для измерения продукции изотипа антитела, например, IgM, или продукта представляющего интерес трансгена. В конкретных вариантах осуществления, определения IgG осуществляют с использованием коммерчески доступных антител, таких как антитела козы против IgG человека, в качестве связывающего антитела, с последующей детекцией с использованием любого из множества соответствующих реагентов для детекции, таких как биотинилированное антитело козы против Ig человека, щелочная фосфатаза со стрептавидином и субстрат.

[0089] В конкретных вариантах осуществления, В-клетки культивируют в таких условиях и в течение достаточных периодов времени, чтобы количество клеток превышало в 1, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 раз или более количество В-клеток в начале культивирования. В одном варианте осуществления, количество клеток составляет в 10-1000 раз больше, включая последовательные целые числа в этом диапазоне, чем количество В-клеток в начале культивирования. Например, размноженная популяция В-клеток составляет по меньшей мере в 10 раз больше, чем исходная выделенная популяция В-клеток. В другом варианте осуществления, размноженная популяция В-клеток составляет по меньшей мере в 100 раз больше, чем исходная выделенная популяция В-клеток. В одном варианте осуществления, размноженная популяция В-клеток составляет по меньшей мере в 500 раз больше, чем исходная выделенная популяция В-клеток.

Модификация В-клеток

[0090] В различных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способам трансфекции, инфекции или иным образом введения в В-клетку трансгена (например, трансгена фоллистатина), таким образом, что трансген экспрессируется в В-клетке. Любой из способов интеграции, описанных в настоящем описании или известных в данной области, можно, в некоторых вариантах осуществления, использовать для экспрессии фоллистатина в В-клетке.

[0091] В одном варианте осуществления, генетически модифицированные В-клетки трансфицируют с использованием трансгена. В конкретных вариантах осуществления, генетически модифицированные В-клетки имеют трансген фоллистатина.

[0092] Иллюстративные способы трансфекции В-клеток представлены в WO 2014/152832 и WO 2016/100932, полное содержание обеих из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Трансфекцию В-клеток можно осуществлять с использованием любого из множества способов, доступных в данной области для введения ДНК или РНК в В-клетку. Пригодные способы могут включать трансфекцию с использованием фосфата кальция, DEAE-декстрана, электропорацию, опосредованную давлением трансфекцию или «сжатие клеток» (например, с использованием микрожидкостной системы CellSqueeze, SQZ Biotechnologies), опосредованную наночастицами или опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например, осповакцины. См., например, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197; US 5124259; US 5297983; US 5283185; US 5661018; US 6878548; US 7799555; US 8551780; и US 8633029. Одним из примеров коммерчески доступного способа электропорации, пригодного для В-клеток, является технология трансфекции Nucleofector™.

[0093] Трансфекцию можно проводить до или во время культивирования in vitro выделенных В-клеток в присутствии одного или нескольких факторов активации и/или дифференцировки, описанных выше. Например, клетки трансфицируют на сутки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют на сутки 1, 2 или 3 культивирования in vitro. В конкретном варианте осуществления, клетки трансфицируют на сутки 2. Например, клетки подвергают электропорации на сутки 2 культивирования in vitro для доставки, например, плазмиды, транспозона, миникольца или самореплицирующейся РНК. В другом варианте осуществления, клетки трансфицируют на сутки 4, 5, 6 или 7 культивирования in vitro. В конкретном варианте осуществления, клетки трансфицируют на сутки 6 культивирования in vitro. В другом варианте осуществления, клетки трансфицируют на сутки 5 культивирования in vitro.

[0094] В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют или иным образом модифицируют (например, посредством направленной интеграции трансгена фоллистатина) до активации. В другом варианте осуществления, клетки трансфицируют или иным образом модифицируют (например, посредством направленной интеграции трансгена фоллистатина) во время активации. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют или иным образом модифицируют (например, посредством направленной интеграции трансгена фоллистатина) после активации. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют или иным образом модифицируют (например, посредством направленной интеграции трансгена фоллистатина) до дифференцировки. В другом варианте осуществления, клетки трансфицируют или иным образом модифицируют (например, посредством направленной интеграции трансгена фоллистатина) во время дифференцировки. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют или иным образом модифицируют (например, посредством направленной интеграции трансгена фоллистатина) после дифференцировки.

[0095] В одном варианте осуществления, невирусный вектор используют для доставки ДНК или РНК (например, ДНК или РНК, содержащей последовательность, кодирующую полипептид фоллистатина) в В-клетки памяти и/или плазматические клетки. Например, системы, которые могут облегчать трансфекцию В-клеток памяти и/или плазматических клеток без необходимости системы интеграции вируса, включают, без ограничения, транспозоны (например, Sleeping Beauty или другую систему транспозона, такую как Piggybac), нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN), короткие палиндромные повторы, расположенные кластерами, равномерно удаленными друг от друга (CRISPR), мегануклеазы, миникольца, репликоны, искусственные хромосомы (например, искусственные хромосомы бактерий, искусственные хромосомы млекопитающих и искусственные хромосомы дрожжей), плазмиды, космиды и бактериофаги.

[0096] В некоторых вариантах осуществления, такие независимые от вирусов векторные системы можно также доставлять посредством вирусного вектора, известного в данной области или описанного ниже. Например, в некоторых вариантах осуществления, вирусный вектор (например, ретровирус, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус), используют для доставки одного или нескольких невирусных векторов (например, такого как один или несколько из вышеупомянутых нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN), подобных активаторам транскрипции эффекторных нуклеаз (TALEN), коротких палиндромных повторов, расположенных кластерами, равномерно удаленными друг от друга (CRISPR), мегануклеаз или любых других ферментов/комплементарных векторов, полинуклеотидов и/или полипептидов), способных облегчать направленную интеграцию. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, клетку (например, В-клетки, такие как В-клетки памяти и/или плазматические клетки), можно модифицировать для экспрессии экзогенной последовательности (например, последовательности, кодирующей полипептид фоллистатина) способом направленной интеграции. Такие способы известны в данной области и могут включать расщепление эндогенного локуса в клетке с использованием одной или нескольких нуклеаз (например, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas, мегануклеазы) и введение трансгена фоллистатина в клетку таким образом, что он интегрирует в эндогенный локус и экспрессируется в клетке. Трансген фоллистатина может содержаться в донорной последовательности, интегрированной в ДНК клетку-хозяина в точке или около точки расщепления нуклеазой.

[0097] Интеграция экзогенной последовательности (например, последовательности, кодирующей полипептид фоллистатина) может происходить посредством рекомбинации. Как понятно специалисту в данной области, «рекомбинация» относится к процессу обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами, включая, но без ограничения, захват донора посредством соединения негомологичных концов (NHEJ) и гомологичной рекомбинации. Рекомбинация может представлять собой гомологичную рекомбинацию. Для целей по настоящему описанию, «гомологичная рекомбинация (HR)» относится к специализированной форме такого обмена, происходящего, например, посредством репарации двухцепочечных разрывов в клетках посредством механизмов направляемой гомологией репарации. Этот процесс использует гомологию нуклеотидной последовательности, посредством чего «донорная» молекула (например, донорная полинуклеотидная последовательность или донорный вектор, содержащий такую последовательность) используется клеточным аппаратом репарации ДНК в качестве матрицы для репарации молекулы-«мишени» (т.е., молекулы, подвергшейся двухцепочечному разрыву), и таким способом осуществляет перенос генетической информации от донора к мишени. В некоторых вариантах осуществления направляемой HR интеграции, донорная молекула может содержать по меньшей мере 2 области гомологии с геномом («плечи гомологии»). В некоторых вариантах осуществления, плечи гомологии могут иметь длину, например, по меньшей мере 50-100 пар оснований. Плечи гомологии могут иметь достаточную гомологию ДНК с областью геномной ДНК, фланкирующей участок расщепления, где может происходить направленная интеграция. Плечи гомологии донорной молекулы могут фланкировать ДНК (например, содержащую ДНК, кодирующую фоллистатин), подлежащую интеграции в геном-мишень или локус ДНК-мишени. Разрыв хромосомы с последующей репарацией с использованием гомологичной области плазмидной ДНК в качестве матрицы может приводить к переносу находящегося внутри трансгена, фланкированного плечами гомологии, в геном. См., например, Koller et al. (1989) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86(22):8927-8931; Thomas et al. (1986) Cell 44(3):419-428. Частоту этого типа направляемой гомологией направленной интеграции можно увеличивать в вплоть до 10⁵ раз посредством намеренного создания двухцепочечного разрыва вблизи области-мишени (Hockemeyer et al. (2009) Nature Biotech. 27(9):851-857; Lombardo et al. (2007) Nature Biotech. 25(11):1298-1306; Moehle et al. (2007) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 104(9):3055-3060; Rouet et al. (1994) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91(13):6064-6068.

[0098] Любую нуклеазу, способную опосредовать нацеленное расщепление геномного локуса, таким образом, что трансген (например, трансген фоллистатина) можно интегрировать в геном клетки-мишени (например, посредством рекомбинации, такой как HR), можно использовать для модификации клетки (например, В-клетки памяти или плазмабласта) по настоящему изобретению.

[0099] Двухцепочечный разрыв (DSB) или ник можно получать посредством сайт-специфической нуклеазы, такой как нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN), нуклеаза с эффекторным доменом TAL (TALEN), мегануклеаза, или с использованием системы CRISPR/Cas9, такой как crРНК/tract РНК (одиночная направляющая РНК) для направления специфического расщепления. См., например, Burgess (2013) Nature Reviews Genetics 14:80-81, Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51; Публикации Патентов США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20110207221; 20110301073 и Международную публикацию WO 2007/014275, полное содержание которых приведено в качестве ссылки для всех целей.

[00100] В некоторых вариантах осуществления, клетку (например, В-клетку памяти или плазмабласт) модифицируют с использованием опосредованной нуклеазой с цинковыми пальцами направленной интеграции донорной конструкции (например, донорной конструкции фоллистатина). Нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN) представляет собой фермент, способный узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность-мишень со специфичностью, обусловленной объединением «связывающего ДНК белка с цинковыми пальцами» (ZFP) (или связывающего домена), который связывает ДНК специфическим для последовательности образом посредством одного или нескольких цинковых пальцев, и фермента нуклеазы. ZFN могут содержать любые пригодные домены расщепления (например, фермент нуклеазу), функционально связанные со связывающим ДНК доменом ZFP для формирования сконструированной ZFN, которая может облегчать сайт-специфическое расщепление последовательности ДНК-мишени (см., например, Kim et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160). Например, ZFN могут содержать специфическую для мишени ZFP, связанную с ферментом FOK1 или частью фермента FOK1. В некоторых вариантах осуществления, ZFN, используемые в опосредованном ZFN способе направленной интеграции, используют две отдельные молекулы, каждая из которых содержит субъединицу фермента FOK1, где каждая связана с ZFP, каждый ZFP имеет специфичность для последовательности ДНК, фланкирующей участок-мишень расщепления, и когда два ZFP связываются со своими соответствующими участками-мишенями ДНК, субъединицы фермента FOK1 сближаются друг с другом и связываются вместе, активируя активность нуклеазы, расщепляющей участок-мишень расщепления. ZFN использовали для модификации генома во множестве организмов (например, Публикации Патентов США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; и Международная публикация WO 07/014,275, полное содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). Сконструированные на заказ ZFP и ZFN являются коммерчески доступными, например, из Sigma Aldrich (St. Louis, MO), и любую локализацию в ДНК можно общепринятым способом подвергать нацеливанию и расщеплению с использованием таких сконструированных на заказ ZFN.

[00101] В некоторых вариантах осуществления, клетку (например, В-клетку памяти или плазмабласт) модифицируют с помощью опосредованной нуклеазой CRISPR/Cas (например, CRISPR Cas9) интеграции донорной конструкции (например, донорной конструкции фоллистатина). Система CRISPR (коротких палиндромных повторов, расположенных кластерами, равномерно удаленными друг от друга)/нуклеазы Cas (ассоциированной с CRISPR) представляет собой сконструированную систему нуклеазы на основе бактериальной системы, которую можно использовать для геномной инженерии. Она частично основана на адаптивном иммунном ответе многих бактерий и архей. Когда вирус или плазмида проникает в бактерию, фрагменты проникающей ДНК переводятся в РНК CRISPR (crРНК) посредством «иммунного» ответа. Эта crРНК затем связывается, через область частичной комплементарности, с другим типом РНК, называемым tracrРНК, для направления нуклеазы Cas9 на область, гомологичную crРНК, в ДНК-мишени, называемую «протоспейсером». Cas9 расщепляет ДНК для получения тупых концов в DSB в участках, определенных 20-нуклеотидной направляющей последовательностью, содержащейся внутри транскрипта crРНК. Cas9 требует как crРНК, так и tracrРНК, для сайт-специфического узнавания и расщепления ДНК. В настоящее время эта система сконструирована таким образом, что crРНК и tracrРНК можно комбинировать в одной молекуле («одиночной направляющей РНК»), и эквивалентную crРНК часть одиночной направляющей РНК можно конструировать, чтобы направлять нуклеазу Cas9 на мишень любой желательной последовательности (см. Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, и David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Таким образом, систему CRISPR/Cas можно конструировать для получения DSB в желательной мишени в геноме, и на репарацию DSB можно влиять посредством использования ингибиторов репарации, чтобы увеличивать допускающую ошибки репарацию. Как понятно специалисту в данной области, другие нуклеазы CRISPR, в дополнение к Cas9, известны и пригодны для использования по настоящему изобретению.

[00102] В некоторых вариантах осуществления, в опосредованной CRISPR/Cas нуклеазой интеграции используют CRISPR типа II. CRISPR типа II является одной из наиболее охарактеризованных систем и осуществляет направленный двухцепочечный разрыв ДНК за четыре последовательные стадии. Во-первых, две некодирующие РНК, массив пре-crРНК и tracrРНК, транскрибируются с локуса CRISPR. Во-вторых, tracrРНК гибридизуется с областями повторов пре-crРНК и опосредует процессинг пре-crРНК в зрелые crРНК, содержащие индивидуальные спейсерные последовательности. В-третьих, зрелый комплекс crРНК:tracrРНК направляет Cas9 на ДНК-мишень посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику между спейсером в crРНК и протоспейсером в ДНК-мишени, следующим за смежным с протоспейсером мотивом (PAM), это дополнительное требование для узнавания мишени. В-четвертых, Cas9 опосредует расщепление ДНК-мишени для образования двухцепочечного разрыва внутри протоспейсера.

[00103] Родственная Cas9 система CRISPR/Cas содержит два некодирующих компонента РНК: tracrРНК и массив пре-crРНК, содержащий направляющие нуклеазу последовательности (спейсеры), перемежающиеся идентичными прямыми повторами (DR). Для использования системы CRISPR/Cas для осуществления геномной инженерии, обе функции этих РНК должны присутствовать (см. Cong et al, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). В некоторых вариантах осуществления, tracrРНК и пре-crРНК поставляют посредством отдельных экспрессирующих конструкций или в форме отдельных РНК. В других вариантах осуществления, конструируют химерную РНК, где сконструированная зрелая crРНК (обеспечивающая специфичность для мишени) слита с tracrРНК (обеспечивающей взаимодействие с Cas9) для получения гибрида химерной cr-РНК-tracrРНК (также названной одиночная направляющая РНК). (см. Jinek, там же, и Cong, там же).

[00104] В некоторых вариантах осуществления, можно конструировать одиночную направляющую РНК, содержащую как crРНК, так и tracrРНК, для направления нуклеазы Cas9 для нацеливания на любую желательную последовательность (например, Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Таким образом, систему CRISPR/Cas можно конструировать для образования DSB в желательной мишени в геноме.

[00105] Сконструированные на заказ системы CRISPR/Cas являются коммерчески доступными, например, из Dharmacon (Lafayette, CO), и любую локализацию в ДНК можно общепринятым способом подвергать нацеливанию и расщеплению с использованием таких сконструированных на заказ последовательностей одиночной направляющей РНК. Одноцепочечные ДНК-матрицы для рекомбинации можно синтезировать (например, способами синтеза олигонуклеотидов, известными в данной области и коммерчески доступными) или предоставлять в векторе, например, вирусном векторе, таком как AAV.

[00106] В некоторых вариантах осуществления, клетку (например, В-клетку памяти или плазмабласт) модифицируют с помощью опосредованной TALE-нуклеазой (TALEN) направленной интеграции донорной конструкции (например, донорной конструкции фоллистатина). «Связывающий ДНК домен TALE» или «TALE» представляет собой полипептид, содержащий один или несколько доменов/единиц повтора TALE. Домены повторов вовлечены в связывание TALE с родственной ему последовательностью ДНК-мишени. Одна «единица повтора» (также обозначенная как «повтор»), как правило, имеет длину 33-35 аминокислот и имеет по меньшей мере некоторую гомологию последовательности с другими последовательностями повтора TALE в природном белке TALE. Эффекторы TAL могут содержать последовательность ядерной локализации, кислый домен активации транскрипции и централизованный домен тандемных повторов, где каждый повтор содержит приблизительно 34 аминокислот, которые являются ключевыми для специфичности связывания ДНК этими белками. (например, Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Эффекторы TAL зависят от последовательностей, обнаруженных в тандемных повторах, содержащих приблизительно 102 п.о., и повторы, как правило, являются на 91-100% гомологичными друг другу (например, Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136). Эти связывающие ДНК повторы можно конструировать в белки с новыми комбинациями и количествами повторов, для получения искусственных факторов транскрипции, которые являются способными взаимодействовать с новыми последовательностями и активировать экспрессию неэндогенного гена репортера (например, Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136). Сконструированные белки TAL можно связывать с полудоменом расщепления FokI для получения слитого белка нуклеазы с эффекторным доменом TAL (TALEN) для расщепления специфической последовательности ДНК-мишени (например, Christian et al (2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717).

[00107] Сконструированные на заказ TALEN являются коммерчески доступными, например, из Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), и любую локализацию в ДНК можно общепринятым способом подвергать нацеливанию и расщеплению.

[00108] В некоторых вариантах осуществления, клетку (например, В-клетку памяти или плазмабласт) модифицируют с помощью опосредованной мегануклеазой направленной интеграции донорной конструкция (например, донорной конструкции фоллистатина). Мегануклеаза (или «эндонуклеаза хоминга») представляет собой эндонуклеазу, которая связывает и расщепляет двухцепочечую ДНК в последовательности узнавания, превышающей 12 пар оснований. Природные мегануклеазы могут являться мономерными (например, I-SceI) или димерными (например, I-CreI). Природные мегануклеазы узнают участки расщепления 15-40 пар оснований и общепринятым образом сгруппированы в четыре семейства: семейство LAGLIDADG, семейство GIY-YIG, семейство бокса His-Cyst и семейство HNH. Иллюстративные эндонуклеазы хоминга включают I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. Их последовательности узнавания известны. См. также Патент США No. 5420032; Патент США No. 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталог New England Biolabs. Термин «мегануклеаза» включает мономерные мегануклеазы, димерные мегануклеазы и мономеры, ассоциирующие для формирования димерных мегануклеаз.

[00109] В конкретных вариантах осуществления, в способах и композициях, описанных в настоящем описании, используют нуклеазу, содержащую сконструированную (неприродную) эндонуклеазу хоминга (мегануклеазу). Последовательности узнавания эндонуклеаз хоминга и мегануклеаз, таких как I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII, известны. См. также Патент США No. 5420032; Патент США No. 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталоги New England Biolabs. Кроме того, специфичность связывания ДНК эндонуклеаз хоминга и мегануклеаз можно модифицировать для связывания неприродных участков-мишеней. См., например, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Публикацию патента США No. 20070117128. Связывающие ДНК домены эндонуклеаз хоминга и мегануклеаз можно изменять в контексте нуклеазы в целом (т.е., таким образом, чтобы нуклеаза включала родственный домен расщепления) или можно сливать с гетерологичным доменом расщепления. Сконструированная на заказ мегануклеаза является коммерчески доступной, например, из New England Biolabs (Ipswich, MA), и любую локализацию в ДНК можно общепринятым способом подвергать нацеливанию и расщеплению.

[00110] Модификация В-клеток может включать введение одной или нескольких нуклеаз (например, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas, мегануклеазы) в В-клетку, например, посредством одного или нескольких векторов, кодирующих нуклеазы, таким образом, чтобы векторы, содержащие кодированные нуклеазы, поглощались В-клеткой. Векторы могут представлять собой вирусные векторы.

[00111] В некоторых вариантах осуществления, нуклеазы расщепляют специфический эндогенный локус (например, ген безопасной гавани или представляющий интерес локус) в клетке (например, В-клетке памяти или плазматической клетке), и вводят одну или несколько экзогенных (донорных) последовательностей (например, трансгенов) (например, один или несколько векторов, содержащих эти экзогенные последовательности). В таких вариантах осуществления, донорная последовательность может кодировать фоллистатин (например, трансген фоллистатина). Нуклеаза может индуцировать двухцепочечный (DSB) или одноцепочечный разрыв (ник) в ДНК-мишени. В некоторых вариантах осуществления, направленную вставку донорного трансгена (например, донорного трансгена фоллистатина) можно осуществлять посредством гомологичной репарации (HDR), механизмов негомологичной репарации (например, опосредованного NHEJ связывания концов) или вставок и/или делеции нуклеотидов (например, эндогенной последовательности) в участке интеграции трансгена (например, трансгена фоллистатина) в геном клетки. В одном варианте осуществления, способ трансфекции В-клетки включает электропорацию В-клетки перед приведением В-клетки в контакт с вектором. В одном варианте осуществления, клетки подвергают электропорации на сутки в диапазоне от суток 1 до суток 12 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки подвергают электропорации на сутки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки подвергают электропорации на сутки 2 культивирования in vitro для доставки плазмиды.

[00112] В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона. В рамках изобретения, термин «транспонированный» может, в некоторых вариантах осуществления, относиться к такой клетке, которая трансфицирована транспозоном. Многочисленные системы транспозонов известны в данной области и пригодны для использования по настоящему изобретению. Например, система транспозона sleeping beauty и системы транспозонов Piggybac хорошо известны в данной области и пригодны для использования по настоящему изобретению. См., например, Hackett P.B., et al., Evaluating Risks of Insertional Mutagenesis by DNA Transposons in Gene Therapy, Transl Res. 2013 April ; 161(4): 265-283; Hudecek M, et al., Going non-viral: the Sleeping Beauty transposon system breaks on through to the clinical side, Crit Rev Biochem Mol Biol. 2017 Aug;52(4):355-380, полное содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. В некоторых вариантах осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона Sleeping Beauty. Транспозон Sleeping Beauty может, в некоторых вариантах осуществления, представлять собой транспозон Sleeping Beauty T2 или транспозон Sleeping Beauty T4. В некоторых вариантах осуществления, использование системы транспозона sleeping beauty может включать трансфекцию (например, посредством электропорации) В-клеток с использованием конструкции ДНК, кодирующими аппарат системы транспозона, и конструкции ДНК, кодирующей полипептид фоллистатина. В некоторых вариантах осуществления, конструкция ДНК, кодирующая аппарат системы транспозона, может представлять собой pCMV-SB100x. В некоторых вариантах осуществления, использование системы транспозона sleeping beauty может включать трансфекцию (например, посредством электропорации) В-клеток с использованием конструкции ДНК, кодирующей полипептид фоллистатина, и дополнительную трансфекцию В-клеток с использованием мРНК, кодирующей аппарат системы транспозона. В некоторых вариантах осуществления, мРНК, кодирующая аппарат системы транспозона, кодирует транспозазу SB100x. В некоторых вариантах осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона Piggybac. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4, или транспозона Piggybac) на сутки в диапазоне от суток 1 до суток 12 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4, или транспозона Piggybac) на сутки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием миникольца на сутки в диапазоне от суток 1 до суток 12 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием миникольца на сутки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 культивирования in vitro.

[00113] В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона Sleeping Beauty (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4) на сутки в диапазоне от суток 1 до суток 12 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием системы транспозона sleeping beauty (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4) на сутки 2 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием системы транспозона sleeping beauty (например, транспозонаа Sleeping beauty T2 или T4) на сутки 5 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием системы транспозона sleeping beauty (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4) на сутки 8 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием системы транспозона Sleeping Beauty (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4) на сутки 11 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием системы транспозона Sleeping Beauty (например, транспозона Sleeping beauty T2 или T4) на сутки 14 культивирования in vitro посредством электропорации.

[00114] В одном варианте осуществления, клетки трансфицируют с использованием транспозона Piggybac на сутки в диапазоне от суток 1 до суток 12 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием транспозона Piggybac на сутки 2 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием транспозона Piggybac на сутки 5 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием транспозона Piggybac на сутки 8 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием транспозона Piggybac на сутки 11 культивирования in vitro посредством электропорации. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют с использованием транспозона Piggybac на сутки 14 культивирования in vitro посредством электропорации.

[00115] В одном варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с вектором, содержащим представляющую интерес нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, в условиях, обеспечивающих трансфекцию по меньшей мере части В-клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с вектором, содержащим представляющую интерес нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, в условиях, обеспечивающих трансфекцию по меньшей мере 5% В-клеток. В следующем варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с вектором в условиях, обеспечивающих трансфекцию по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 100% В-клеток. В одном конкретном варианте осуществления, В-клетки, культивированные in vitro, как описано в настоящем описании, трансфицируют, в этом случае, культивированные В-клетки приводят в контакт с вектором, как описано в настоящем описании, в условиях, обеспечивающих трансфекцию по меньшей мере 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 100% В-клеток.

[00116] Вирусные векторы можно использовать для трансдукции В-клеток памяти и/или плазматических клеток. Примеры вирусных векторов включают, без ограничения, векторы на основе аденовируса, векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), ретровирусные векторы, ретровирусные-аденовирусные векторы, и векторы, происходящие из вирусов простого герпеса (HSVs), включая векторы на основе ампликона, дефектный по реплиации HSV и ослабленный HSV (см., например, Krisky, Gene Ther. 5: 1517-30, 1998; Pfeifer, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 2001, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки).

[00117] В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют вирусным вектором (например, лентивирусным вектором) на сутки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 культивирования in vitro. В конкретном варианте осуществления, клетки трансдуцируют вирусным вектором на сутки 5 культивирования in vitro. В одном варианте осуществления, вирусный вектор представляет собой лентивирус. В одном варианте осуществления, клетки трансдуцируют лентивирусом, псевдотипированным с использованием вируса кори, на сутки 1 культивирования in vitro.

[00118] В одном варианте осуществления, В-клетки трансдуцируют ретровирусными векторами с использованием любого из множества известных в данной области способов (см., например, Science 12 April 1996 272: 263-267; Blood 2007, 99:2342-2350; Blood 2009, 1 13:1422-1431 ; Blood 2009 Oct 8; 1 14(15):3173-80; Blood. 2003;101 (6):2167-2174; Current Protocols in Molecular Biology или Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009)). Дополнительное описание вирусной трансдукции В-клеток можно обнаружить в WO 2011/085247 и WO 2014/152832, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

[00119] Например, PBMC, B- или T-лимфоциты от доноров и другие В-клетки из клеток злокачественных опухолей, такие как B-CLL, можно выделять и культивировать в среде IMDM или RPMI 1640 (GibcoBRL Invitrogen, Auckland, New Zealand) или другой пригодной среде, как описано в настоящем описании, либо бессывороточной, либо дополненной сывороткой (например, 5-10% FCS, человеческой сывороткой AB и заменителями сыворотки) и пенициллином/стрептомицином, и/или другими пригодными добавками, такими как трансферрин и/или инсулин. В одном варианте осуществления, клетки рассевают при 1×10⁵ клеток в 48-луночных планшетах, и концентрированный вектор добавляют в различных дозах, которые может общепринятым образом оптимизировать специалист в данной области с использованием общепринятых способов. В одном варианте осуществления, В-клетки переносят на монослой клеток MS5 в RPMI, дополненной 10% сывороткой AB, 5% FCS, 50 нг/мл rhSCF, 10 нг/мл rhlL-15 и 5нг/мл rhlL-2, и среду обновляют периодически, по необходимости. Как известно специалисту в данной области, другие пригодные среды и добавки можно использовать, как желательно.

[00120] Конкретные варианты осуществления относятся к использованию ретровирусных векторов или векторов, происходящих из ретровирусов. «Ретровирусы» представляют собой оболочечные РНК-вирусы, которые способны инфицировать клетки животных, и которые используют фермент обратную транскриптазу на ранних стадиях инфекции для получения копии ДНК с их РНК-генома, которая затем, как правило, интегрирует в геном хозяина. Примеры ретровирусных векторов представляют собой происходящие из вируса лейкоза мышей Молони (MLV) векторы, ретровирусные векторы на основе вируса стволовых клеток мыши, обеспечивающего длительную стабильную экспрессию в клетках-мишенях, таких как гематопоэтические клетки-предшественники и их дифференцированное потомство (см., например, Hawley et al., PNAS USA 93:10297-10302, 1996; Keller et al., Blood 92:877-887, 1998), гибридные векторы (см., например, Choi, et al., Stem Cells 19:236-246, 2001) и происходящие из комплексных ретровирусов векторы, такие как лентивирусные векторы.

[00121] В одном варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с ретровирусным вектором, содержащим представляющую интерес нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, в условиях, обеспечивающих трансдукцию по меньшей мере части В-клеток. В одном варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с ретровирусным вектором, содержащим представляющую интерес нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, в условиях, обеспечивающих трансдукцию по меньшей мере 2% В-клеток. В следующем варианте осуществления, В-клетки приводят в контакт с вектором в условиях, обеспечивающих трансдукцию по меньшей мере 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 100% покоящихся В-клеток. В одном конкретном варианте осуществления, дифференцированные и активированные В-клетки, культивированные in vitro, как описано в настоящем описании, трансдуцируют, в этом случае, культивированные дифференцированные/активированные В-клетки приводят в контакт с вектором, как описано в настоящем описании, в условиях, обеспечивающих трансдукцию по меньшей мере 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или даже 100% дифференцированных и активированных В-клеток.

[00122] В конкретных вариантах осуществления, до трансдукции, клетки предварительно стимулируют с использованием Staphylococcus Aureus Cowan (SAC; Calbiochem, San Diego, CA) и/или IL-2 в соответствующих концентрациях, известных специалисту в данной области и оптимизированных общепринятым способом. Можно использовать другие факторы активации В-клеток (например, PMA), как известно специалисту в данной области и описано в настоящем описании.

[00123] Как отмечено выше, в конкретных вариантах осуществления используют лентивирусные векторы. Термин «лентивирус» относится к роду комплексных ретровирусов, способных инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Примеры лентивирусов включают HIV (вирус иммунодефицита человека; включая HIV типа 1 и HIV типа 2), вирус висна-маэди, вирус артрита-энцефалита коз, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек (FIV), вирус бычьего иммунодефицита (BIV) и вирус иммунодефицита обезьян (SIV). Лентивирусные векторы могут происходить из любых одного или нескольких из этих лентивирусов (см., например, Evans et al., Hum Gene Ther. 10:1479-1489, 1999; Case et al., PNAS USA 96:2988-2993, 1999; Uchida et al., PNAS USA 95:1 1939-1 1944, 1998; Miyoshi et al., Science 283:682-686, 1999; Sutton et al., J Virol 72:5781-5788, 1998; и Frecha et al., Blood. 1 12:4843-52, 2008, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки).

[00124] Показано, что покоящиеся T и В-клетки можно трансдуцировать покрытым VSVG LV, несущим большинство вспомогательных белков HIV (vif, vpr, vpu и nef) (см., например, Frecha et al., 2010 Mol. Therapy 18:1748). В конкретных вариантах осуществления, ретровирусный вектор содержит конкретные минимальные последовательности из генома лентивируса, такого как геном HIV или геном SIV. Геном лентивируса, как правило, организован в область 5'-длинного концевого повтора (LTR), ген gag, ген pol, ген env, вспомогательные гены (например, nef, vif, vpr, vpu, tat, rev) и область 3'-LTR. Вирусный LTR разделен на три области, обозначенные как U3, R (повтор) и U5. Область U3 содержит энхансерные и промоторные элементы, область U5 содержит сигналы полиаденилирования, и область R разделяет области U3 и U5. Транскрибированные последовательности области R могут возникать на обоих 5'- и 3'-концах вирусной РНК (см., например, «RNA Viruses: A Practical Approach» (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, 2000); O Narayan, J. Gen. Virology. 70:1617-1639, 1989; Fields et al., Fundamental Virology Raven Press., 1990; Miyoshi et al., J Virol. 72:8150-7,1998; и Патент США No. 6013516, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). Лентивирусные векторы могут содержать любой один или несколько из этих элементов лентивирусного генома, для регуляции активности вектора, как желательно, или они могут содержать делеции, вставки, замены, или мутации в одном или нескольких из этих элементов, например, для уменьшения патологических эффектов лентивирусной репликации, или для ограничения лентивирусного вектора одним циклом инфекции.

[00125] Как правило, минимальный ретровирусный вектор содержит конкретные последовательности 5'-LTR и 3'-LTR, один или несколько представляющих интерес генов (подлежащих экспрессии в клетке-мишени), один или несколько промоторов и цис-активирующую последовательность для упаковки РНК. Можно включать другие регуляторные последовательности, как описано в настоящем описании и известно в данной области. Вирусный вектор, как правило, клонирован в плазмиду, которая может быть трансфицирована в упаковывающую линию клеток, такую как эукариотическая клетка (например, 293-HEK), а также, как правило, содержит последовательности, которые можно использовать для репликации плазмиды в бактериях.

[00126] В конкретных вариантах осуществления, вирусный вектор содержит последовательности из 5'- и/или 3'-LTR ретровируса, такого как лентивирус. Последовательности LTR могут представлять собой последовательности LTR из любого лентивируса из любого вида. Например, они могут представлять собой последовательности LTR из HIV, SIV, FIV или BIV. Предпочтительно, последовательности LTR представляют собой последовательности LTR HIV.

[00127] В конкретных вариантах осуществления, вирусный вектор содержит последовательности R и U5 из 5'-LTR лентивируса и инактивированный или «самоинактивирующийся» 3'-LTR из лентивируса. «Самоинактивирующийся 3'-LTR» представляет собой 3'-длинный концевой повтор (LTR), который содержит мутацию, замену или делецию, предотвращающую контроль последовательностями LTR экспрессии нижестоящего гена. Копия области U3 из 3'-LTR действует в качестве матрицы для получения обоих LTR в интегрированном провирусе. Таким образом, когда 3'-LTR с инактивирующей делецией или мутацией интегрирует в качестве 5'-LTR провируса, транскрипция с 5'-LTR невозможна. Это исключает конкуренцию между вирусным энхансером/промотором и любым внутренним энхансером/промотором. Самоинактивирующиеся 3'-LTR описаны, например, в Zufferey et al., J Virol. 72:9873-9880, 1998; Miyoshi et al., J Virol. 72:8150-8157, 1998; и Iwakuma et al., J Virology 261: 120-132, 1999, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Самоинактивирующиеся 3'-LTR можно получать любым способом, известным в данной области. В конкретных вариантах осуществления, элемент U3 3'-LTR содержит делецию энхансерной последовательности, предпочтительно, бокса TATA, участков Spl и/или NF-каппа B. В результате самоинактивации 3'-LTR, провирус, интегрированный в геном клетки-хозяина, содержит инактивированный 5'-LTR.

[00128] Векторы, представленные в настоящем описании, как правило, содержит ген, который кодирует белок, например, фоллистатин, желательным образом экспрессируемый в одной или нескольких клетках-мишенях. Однако, векторы, представленные в настоящем описании, могут также содержать гены, кодиирующие другие молекулы, (например, такие как миРНК), желательным образом экспрессируемые в одной или нескольких клетках-мишенях. В некоторых вариантах осуществления, в вирусном векторе, представляющий интерес ген (например, фоллистатин), предпочтительно, локализован между последовательностями 5'-LTR и 3'-LTR. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления, представляющий интерес ген (например, фоллистатин), предпочтительно, находится в функциональной взаимосвязи с другими генетическими элементами, например, последовательностями регуляции транскрипции, такими как промоторы и/или энхансеры, для регуляции экспрессии представляющего интерес гена (например, фоллистатина) конкретным образом после введения гена в клетку-мишень. В конкретных вариантах осуществления, последовательности регуляции транскрипции, которые можно использовать, представляют собой последовательности, сильно подверженные регуляции, применительно к активности, как временной, так и пространственной.

[00129] В конкретных вариантах осуществления, один или несколько дополнительных генов можно вводить в качестве меры безопасности, например, чтобы позволять избирательное уничтожение или истощение клетки-мишени внутри гетерогенной популяции, например, внутри организма пациента-человека. В одном неограничивающем иллюстративном варианте осуществления, ген представляет собой ген тимидинкиназы (TK), экспрессия которого делает клетку-мишень чувствительной к действию лекарственного средства ганцикловира. В некоторых вариантах осуществления, дополнительный ген представляет собой ген белковой метки поверхности клеток. В некоторых вариантах осуществления, ген представляет собой ген самоубийства. В некоторых вариантах осуществления, ген самоубийства представляет собой ген самоубийства каспазы 9, активируемый посредством димеризующего лекарственного средства (см., например, Tey et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation 13:913-924, 2007).

[00130] В конкретных вариантах осуществления, один или несколько дополнительных генов, кодирующих маркерный белок, можно помещать до или после первичного гена (например, гена фоллистатина) в вирусный или невирусный векторе, чтобы позволять идентификацию и/или отбор клеток, экспрессирующих желательный белок (например, фоллистатин). Конкретные варианты осуществления включают дополнительный белок поверхности клетки, который может облегчать идентификацию и/или отбор клеток, экспрессирующих желательный белок (например, фоллистатин). Конкретные варианты осуществления включают флуоресцентный маркерный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или красный флуоресцентный белок (RFP), вместе с первичным представляющий интерес геном (например, геном фоллистатина). Если включены один или несколько дополнительных репортерных генов, можно включать также последовательности IRES или элементы 2A, отделяющие первичный представляющий интерес ген (например, ген фоллистатина) от репортерного гена и/или любого другого представляющего интерес гена.

[00131] В конкретных вариантах осуществления можно использовать гены, кодирующие один или несколько селективных маркеров. Примеры включают селективные маркеры, которые являются эффективными в эукариотической клетке или в прокариотической клетке, такие как ген устойчивости к лекарственному средству, кодирующий фактор, необходимый для выживаемости или роста трансформированных клеток-хозяев, выращиваемых в селективной культуральной среде. Иллюстративные селективные гены кодируют белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, G418, гигромицину B, пуромицину, зеоцину, уабаину, бластицидину, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину, комплементирующие ауксотрофную недостаточность, или добавка может присутствовать на отдельной плазмиде и быть введена посредством совместной трансфекции с вирусным вектором. В одном варианте осуществления, ген кодирует мутантную дигидрофолатредуктазу (DHFR), придающую устойчивость к метотрексату. В других конкретных вариантах осуществления можно использовать гены, кодирующие один или несколько рецепторов поверхности клетки, которые можно использовать для мечения и детекции или очистки трансфицированных клеток (например, низкоаффинный рецептор фактора роста нервов (LNGFR) или другие такие рецепторы, которые можно использовать в качестве систем меток для трансдукции. См., например, Lauer et al., Cancer Gene Ther. 2000 Mar;7(3):430-7.

[00132] В конкретных вирусных векторах, таких как ретровирусные векторы, используют один или несколько гетерологичных промоторов, энхансеров или и тех, и других. В конкретных вариантах осуществления, последовательность U3 из ретровирусного или лентивирусного 5'-LTR можно заменять на промоторную или энхансерную последовательность в вирусной конструкции. В конкретных вариантах осуществления, используют «внутренний» промотор/энхансер, который локализован между последовательностями 5'-LTR и 3'-LTR вирусного вектора, и является функционально связанным с представляющим интерес геном (например, геном фоллистатина).

[00133] «Функциональная взаимосвязь» и «функционально связанный» означают, без ограничения, что ген (например, ген фоллистатина) находится в правильной локализации и ориентации по отношению к промотору и/или энхансеру, таким образом, что экспрессия гена (например, гена фоллистатина) может быть вызвана, когда промотор и/или энхансер приводят в контакт с соответствующими регуляторными молекулами. Можно использовать любую комбинацию энхансера/промотора, которая либо регулирует (например, увеличивает, уменьшает) экспрессию вирусного РНК-генома в упаковывающей линии клеток, либо регулирует экспрессию выбранного представляющего интерес гена в инфицированной клетке-мишени, либо и то, и другое.

[00134] Промотор представляет собой элемент для контроля экспрессии, образованный последовательностью ДНК, позволяющей происходить связыванию полимеразы и транскрипции. Промоторы представляют собой нетранслируемые последовательности, локализованные выше (5') от инициирующего кодона выбранного представляющего интерес гена (как правило, в пределах приблизительно от 100 до 1000 п.о.) и контролирующие транскрипцию и трансляцию кодирующей полинуклеотидной последовательности, с которой они являются функционально связанными. Промоторы могут являться индуцируемыми или конститутивными. Индуцируемые промоторы инициируют увеличенные уровни транскрипции с ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение условий культивирования, такое как изменение температуры. Промоторы могут являться однонаправленными или двунаправленными. Двунаправленные промоторы можно использовать для совместной экспрессии двух генов, например, представляющего интерес гена, такого как фоллистатин, и селективного маркера. Альтернативно, можно использовать конфигурацию двунаправленного промотора, содержащую два промотора, каждый из которых контролирует экспрессию отличного гена, в противоположной ориентации в одном и том же векторе.

[00135] Множество промоторов известно в данной области, как и способы функционального связывания промотора с полинуклеотидной кодирующей последовательностью. Как нативные промоторные последовательности, так и множество гетерологичных промоторов можно использовать для контроля экспрессии выбранного представляющего интерес гена. В конкретных вариантах осуществления используют гетерологичные промоторы, поскольку они, как правило, позволяют более сильную транскрипцию и более высокие выходы желательного белка, по сравнению с нативным промотором.

[00136] В конкретных вариантах осуществления можно использовать гетерологичные вирусные промоторы. Примеры таких промоторов включают промоторы, полученные из геномов таких вирусов, как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита B и вирус обезьян 40 (SV40). В конкретных вариантах осуществления можно использовать гетерологичный промотор млекопитающих, такой как промотор актина, промотор иммуноглобулина, промотор теплового шока или промотор, ассоциированный с нативной последовательностью представляющего интерес гена (например, гена фоллистатина). Как правило, промотор является совместимым с клеткой-мишенью, такой как активированный B-лимфоцит, плазматическая В-клетка, В-клетка памяти или другая лимфоцитарная клетка-мишень.

[00137] В конкретных вариантах осуществления можно использовать один или несколько из промоторов для РНК-полимеразы II и III. Подходящий отбор промоторов для РНК-полимеразы III можно обнаружить, например, в Paule and White. Nucleic Acids Research., Vol. 28, pp 1283-1298, 2000, полное содержание которого приведено в качестве ссылки. Промоторы для РНК-полимеразы II и III также включают любые синтетические или сконструированные фрагменты ДНК, которые могут направлять РНК-полимеразу II или III, соответственно, для транскрипции их нижележащих кодирующих последовательностей РНК. Кроме того, промотор или промоторы для РНК-полимеразы II или III (Pol II или III), используемые в качестве части вирусного вектора, могут являться индуцируемыми. Любой подходящий индуцируемый промотор Pol II или III можно использовать в способах, описанных в настоящем описании. Иллюстративные промоторы Pol II или III включают чувствительные к тетрациклину промоторы, представленные в Ohkawa and Taira, Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585, 2000; и Meissner et al., Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682, 2001, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

[00138] Неограничивающие примеры конститутивных промоторов, которые можно использовать, включают промотор убиквитина, промотор CMV (см., например, Karasuyama et al., J. Exp. Med. 169:13, 1989), промотор β-актина (см., например, Gunning et al., PNAS USA 84:4831-4835, 1987), промотор фактора элонгации-1 альфа (EF-1 альфа), промотор CAG и промотор pgk (см., например, Adra et al., Gene 60:65-74, 1987); Singer-Sam et al., Gene 32:409-417, 1984; и Dobson et al., Nucleic Acids Res. 10:2635-2637, 1982, содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). Неограничивающие примеры тканеспецифических промоторов включают промотор lck (см., например, Garvin et al., Mol. Cell Biol. 8:3058-3064, 1988; и Takadera et al., Mol. Cell Biol. 9:2173-2180, 1989), промотор миогенина (Yee et al., Genes and Development 7:1277-1289. 1993), и промотор thyl (см., например, Gundersen et al., Gene 1 13:207-214, 1992).

[00139] Дополнительные примеры промоторов включают промотор убиквитина-C, промотор тяжелой цепи µ или промотор тяжелой цепи Ig человека (например, MH), и промотор легкой цепи κ или промотор легкой цепи Ig человека (например, EEK), которые являются функциональными в B-лимфоцитах. Промотор MH содержит промотор тяжелой цепи µ человека, которому предшествует энхансер iEµ, фланкированный областями связывания матрикса, и промотор EEK содержит промотор легкой цепи κ, которому предшествует интронный энхансер (iEκ), область связывания матрикса и 3'-энхансер (3Eκ) (см., например, Luo et al., Blood. 1 13:1422-1431, 2009, и Публикацию патентной заявки США No. 2010/0203630). Соответственно, в конкретных вариантах осуществления, можно использовать один или несколько из этих промоторных или энхансерных элементов.

[00140] В одном варианте осуществления, один промотор управляет экспрессией селективного маркера, и второй промотор управляет экспрессией представляющего интерес гена (например, гена фоллистатина). Например, в одном варианте осуществления, промотор EF-1 альфа управляет продукцией селективного маркера (например, DHFR), и миниатюрный промотор CAG (см., например, Fan et al. Human Gene Therapy 10:2273-2285, 1999) управляет экспрессией представляющего интерес гена (например, фоллистатина).

[00141] Как отмечено выше, в конкретных вариантах осуществления используют энхансерные элементы, такие как внутренний энхансер, для увеличения экспрессии представляющего интерес гена. Энхансеры представляют собой цис-активирующие элементы ДНК, обычно длиной приблизительно от 10 до 300 п.о., которые действуют на промотор для увеличения транскрипции с него. Энхансерные последовательности могут происходить из генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, α-фетопротеина, инсулина), такие как энхансер ιεµ, интронный энхансер ιεκ и 3'-энхансер εκ. Включены также энхансеры из вируса эукариот, включая энхансер SV40 на поздней стороне от точки начала репликации (п.о. 100-270), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне от точки начала репликации и энхансеры аденовирусов. Энхансеры могут являться сплайсированными в векторе в положении 5' или 3' от антигенспецифической полинуклеотидной последовательности, однако, предпочтительно локализованы в участке 5' от промотора. Специалист в данной области может выбирать подходящий энхансер на основании желательного паттерна экспрессии.

[00142] В конкретных вариантах осуществления, промоторы выбирают для обеспечения индуцируемой экспрессии представляющего интерес гена (например, гена фоллистатина). Ряд систем для индуцируемой экспрессии известны в данной области, включая чувствительную к тетрациклину систему и систему оператора-репрессора lac. Предусматривают также, что комбинацию промоторов можно использовать для получения желательной экспрессии представляющего интерес гена (например, гена фоллистатина). Специалист в данной области способен выбирать промотор на основании желательного паттерна экспрессии гена в представляющих интерес организме и/или клетке-мишени.

[00143] Конкретные вирусные векторы содержат цис-активирующие упаковывающие последовательности, чтобы способствовать вставке геномной вирусной РНК в вирусную частицу. Примеры включают psi-последовательности. Такие цис-активирующие последовательности известны в данной области. В конкретных вариантах осуществления, вирусные векторы, описанные в настоящем описании, могут экспрессировать два или более генов, что можно осуществлять, например, посредством вставки внутреннего промотора, который является функционально связанным с каждым отдельным геном после первого гена, посредством вставки элемента, облегчающего совместную экспрессию, такого как элемент внутренней последовательности связывания рибосомы (IRES) (Патент США No. 4937190, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки) или элемент 2A, или оба. Просто в качестве иллюстрации, IRES или элементы 2A можно использовать, когда одиночный вектор содержит последовательности, кодирующие каждую цепь молекулы иммуноглобулина с желательной специфичностью. Например, первая кодирующая область (кодирующая либо тяжелую, либо легкую цепь) может быть локализована непосредственно ниже промотора, и вторая кодирующая область (кодирующая другую цепь) может быть локализована ниже первой кодирующей области, с IRES или элементом 2A, локализованным между первой и второй кодирующими областями, предпочтительно, непосредственно предшествующим второй кодирующей области. В других вариантах осуществления, IRES или элемент 2A используют для совместной экспрессии неродственного гена, такого как репортерный ген, селективный маркер, белок поверхности клетки, или ген, усиливающий иммунную функцию. Примеры последовательностей IRES, которые можно использовать, включают, без ограничения, элементы IRES вируса энцефаломиелита (EMCV), вируса ящура (FMDV), вируса энцефаломиелита мышей Тейлера (TMEV), риновируса человека (HRV), вируса Коксаки (CSV), вируса полиомиелита (POLIO), вируса гепатита A (HAV), вируса гепатита C (HCV) и пестивирусов (например, вируса холеры свиней (HOCV) и бычьего вируса вирусной диареи (BVDV)) (см., например, Le et al., Virus Genes 12:135-147, 1996; и Le et al., Nuc. Acids Res. 25:362-369, 1997, полное содержание каждого из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). Один пример элемента 2A включает последовательность F2A из вируса ящура.

[00144] В конкретных вариантах осуществления, векторы, представленные в настоящем описании, также содержат дополнительные генетические элементы для достижения желательного результата. Например, конкретные вирусные векторы могут включать сигнал, облегчающий вход в ядро вирусного генома в клетке-мишени, такой как сигнал flap HIV-1. В качестве дополнительного примера, конкретные вирусные векторы могут включать элементы, облегчающие характеризацию участка интеграции провируса в клетке-мишени, такие как последовательность амбер-супрессорной тРНК. Конкретные вирусные векторы могут содержать один или несколько генетических элементов, сконструированных для усиления экспрессии представляющего интерес гена (например, гена фоллистатина). Например, отвечающий элемент вируса гепатита сурков (WRE) можно помещать в конструкцию (см., например, Zufferey et al., J. Virol. 74:3668-3681, 1999; и Deglon et al., Hum. Gene Ther. 11:179-190, 2000, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). В качестве другого примера, инсулятор β-глобина кур также можно включать в конструкцию. Показано, что этот элемент уменьшает шанс выключения интегрированной ДНК в клетке-мишени благодаря эффектам метилирования и гетерохроматинизации. Кроме того, инсулятор может защищать внутренний энхансер, промотор и экзогенный ген от положительных или отрицательных эффектов положения окружающей ДНК в участке интеграции на хромосоме. В конкретных вариантах осуществления используют каждый из этих генетических элементов. В другом варианте осуществления, вирусные векторы, представленные в настоящем описании, могут также содержать универсальный хроматинраскрывающий элемент (UCOE) для увеличения экспрессии (см., например, Zhang F, et al., Molecular Therapy: The journal of the American Society of Gene Therapy 2010 Sep;18(9):1640-9).

[00145] В конкретных вариантах осуществления, вирусные векторы (например, ретровирусные, лентивирусные), представленные в настоящем описании, являются «псевдотипированными» с использованием одного или нескольких выбранных вирусных гликопротеинов или белков оболочки, в основном для нацеливания на выбранные типы клеток. Псевдотипирование, в общем, относится к вставке одного или нескольких гетерологичных вирусных гликопротеинов на поверхность вирусной частицы, часто позволяющей вирусной частице инфицировать выбранную клетку, отличающуюся от его нормальных клеток-мишеней. «Гетерологичный» элемент происходит из вируса, отличного от вируса, из которого происходит РНК-геном вирусного вектора. Как правило, кодирующие гликопротеин области вирусного вектора генетически изменяют, например, посредством делеции, для предотвращения экспрессии его собственного гликопротеина. Просто в качестве иллюстрации, оболочечные гликопротеины gp41 и/или gp120 из происходящего из HIV лентивирусного вектора, как правило, делетируют до псевдотипирования с использованием гетерологичного вирусного гликопротеина.

[00146] В конкретных вариантах осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием гетерологичного вирусного гликопротеина, нацеленного на B-лимфоциты. В конкретных вариантах осуществления, вирусный гликопротеин позволяет избирательную инфекцию или трансдукцию покоящихся или неделящихся B лимфоцитов. В конкретных вариантах осуществления, вирусный гликопротеин позволяет избирательную инфекцию плазматических B-лимфоцитов, плазмабластов и активированных В-клеток. В конкретных вариантах осуществления, вирусный гликопротеин позволяет инфекцию или трансдукцию покоящихся B-лимфоцитов, плазмабластов, плазматических клеток и активированных В-клеток. В конкретных вариантах осуществления, вирусный гликопротеин позволяет инфекцию клеток В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза. В одном варианте осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием VSV-G. В другом варианте осуществления, гетерологичный вирусный гликопротеин происходит из гликопротеина вируса кори, такого как вирус кори Эдмонтон. Конкретные варианты осуществления псевдотипирования включают гликопротеины вируса кори гемагглютинин (H), белок слияния (F) или оба (см., например, Frecha et al., Blood. 1 12:4843-52, 2008; и Frecha et al., Blood. 1 14:3173-80, 2009, полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки). В одном варианте осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием вируса лейкоза гиббонов (GALV). В одном варианте осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием эндогенного ретровируса кошек (RD114). В одном варианте осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием эндогенного ретровируса бабуина (BaEV). В одном варианте осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием вируса лейкоза мышей (MLV). В одном варианте осуществления, вирусный вектор псевдотипирован с использованием вируса лейкоза гиббонов (GALV). В следующих вариантах осуществления, вирусный вектор содержит встроенный связывающий домен антитела, например, одну или несколько вариабельных областей (например, вариабельных областей тяжелой и легкой цепи), служащих для нацеливания вектора на конкретный тип клеток.

[00147] Получение вирусных векторов можно осуществлять с использованием любых пригодных способов генной инженерии, известных в данной области, включая, без ограничения, стандартные способы расщепления рестрикционными эндонуклеазами, лигирования, трансформации, очистки плазмид, амплификации ПЦР и секвенирования ДНК, например, как описано в Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) и «RNA Viruses: A Practical Approach» (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)).

[00148] Любое множество способов, известных в данной области, можно использовать для получения пригодных ретровирусных частиц, геном которых содержит РНК-копию вирусного вектора. В качестве одного способа, вирусный вектор можно вводить в упаковывающую линию клеток, которая упаковывает вирусную геномную РНК на основе вирусного вектора в вирусные частицы со специфичностью к желательной клетке-мишени. Упаковывающая линия клеток как правило, обеспечивает в транс-ориентации вирусные белки, необходимые для упаковки вирусной геномной РНК в вирусные частицы и инфекции клетки-мишени, включая структурные белки gag, ферментные белки pol и оболочечные гликопротеины.

[00149] В конкретных вариантах осуществления, упаковывающая линия клеток стабильно экспрессирует конкретные необходимые или желательные вирусные белки (например, gag, pol) (см., например, Патент США No. 6218181, содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки). В конкретных вариантах осуществления, упаковывающую линию клеток временно трансфицируют плазмидами, кодирующими конкретный из необходимых или желательных вирусных белков (например, gag, pol, гликопротеин), включая последовательности гликопротеинов вируса кори, описанные в настоящем описании. В одном иллюстративном варианте осуществления, упаковывающая линия клеток стабильно экспрессирует последовательности gag и pol, и затем линию клеток трансфицируют плазмидой, кодирующей вирусный вектор, и плазмидой, кодирующей гликопротеин. После введения желательных плазмид, вирусные частицы собирают и перерабатывают соответственно, например, посредством ультрацентрифугирования, для получения концентрированного препарата для хранения вирусных частиц. Иллюстративные упаковывающие линии клеток включают линии клеток 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) и Cf2Th (ATCC CRL 1430).

Лекарственное средство

[00150] В рамках изобретения, «представляющий интерес ген» или «ген», или «представляющая интерес нуклеиновая кислота» относится к трансгену, подлежащему экспрессии в трансфицированной клетке-мишени. В конкретных вариантах осуществления, ген представляет собой ген фоллистатина. В то время как можно использовать термин «ген», он не подразумевает, что это ген, как обнаружено в геномной ДНК, и использован взаимозаменяемо с термином «нуклеиновая кислота». В общем, представляющая интерес нуклеиновая кислота предоставляет пригодную нуклеиновую кислоту для кодирования лекарственного средства (например, фоллистатина) и может содержать кДНК или ДНК, и может включать или может не включать интроны, но, как правило, не включает интроны. Как отмечено в другом месте в настоящем описании, представляющая интерес нуклеиновая кислота является функционально связанной с последовательностями для контроля экспрессии для эффективной экспрессии представляющего интерес белка в клетке-мишени. В конкретных вариантах осуществления, векторы, описанные в настоящем описании, могут содержать один или несколько представляющих интерес генов, и могут включать 2, 3, 4 или 5, или более представляющих интерес генов, например, таких как гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, которые могут быть организованы с использованием внутреннего промотора, как описано в настоящем описании.

[00151] Выражение «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», в рамках изобретения, обозначает мРНК, РНК, кРНК, кДНК или ДНК. Термин, как правило, относится к полимерной форме нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, или к модифицированной форме любого типа нуклеотида. Термин включает одно- и двухцепочечные формы ДНК и РНК. Представляющие интерес нуклеиновая кислота или ген могут представлять собой любую нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес белок.

[00152] В некоторых вариантах осуществления, в любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, можно использовать представляющий интерес ген, т.е., ген белка фоллистатина. Белок фоллистатин может, в некоторых вариантах осуществления, представлять собой любой из белков фоллистатинов, указанных в SEQ ID NO: 1-4. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, лекарственное средство, доставляемое в генетически модифицированную В-клетку, как описано в настоящем описании, может представлять собой белок фоллистатин.

Фоллистатин

[00153] В различных аспектах, настоящее изобретение относится к В-клеткам, модифицированным для экспрессии фоллистатина (например, одного или нескольких полипептидов фоллистатина). В рамках изобретения, термин «фоллистатин» относится к семейству белков фоллистатинов (FST) и родственных фоллистатину белков, происходящих из любого вида. Фоллистатин представляет собой аутокринный гликопротеин, экспрессирующийся почти во всех тканях высших животных. Он первоначально выделен из фолликулярной жидкости и идентифицирован как белковая фракция, ингибирующая секрецию фоликулостимулирующего гормона (FSH) из передней доли гипофиза, и таким образом, обозначен как супрессирующий FSH белок (FSP). Впоследствии определено, что его первичной функцией является связывание и нейтрализация членов суперсемейства TGF-β, включая, например, активин, паракринный гормон, усиливающий секрецию FSH в передней доле гипофиза.

[00154] В некоторых вариантах осуществления, термины «полипептид фоллистатина» или «фоллистатин» используют для обозначения полипептидов, содержащих любой природный полипептид из семейства фоллистатина, так же как любые его варианты (включая формы мутантов, фрагментов, слитых белков и пептидомиметиков), сохраняющие полезную активность, включая, например, связывание лиганда (например, миостатина, GDF-11, активина A, активина B) или связывание гепарина. Например, в некоторых вариантах осуществления, полипептиды фоллистатина могут включать полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, происходящую из последовательности любого известного фоллистатина, имеющего последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80% идентичную последовательности полипептида фоллистатина, и предпочтительно, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или более идентичную.

[00155] Фоллистатин представляет собой одноцепочечный полипептид с диапазоном молекулярных масс от 31 до 49 кДа на основании альтернативного сплайсинга мРНК и изменчивого гликозилирования белка. Ген человека, кодирующий фоллистатин (FST), имеет шесть экзонов, покрывающих 5329 п.о. на хромосоме 5q11.2, и образует два основных транскрипта: вариант транскрипта FST344 (1122 п.о.) и транскрипт FST317 (1386 п.о.). Экзон 1 в FST кодирует сигнальный пептид фоллистатина, экзон 2 кодирует N-концевой домен фоллистатина, и каждый из экзонов 3-5 кодирует модуль фоллистатина. Из-за альтернативного сплайсинга, используются любой из экзона 6A (кодирующего кислую область в FST344) или экзона 6B (содержащего два основания из стоп-кодона FST317) (Shimasaki, S. et al., 1988).

[00156] Эти альтернативно сплайсированные мРНК (FST344 и FST317) приводят к продукции двух белков фоллистатинов из 315 аминокислот (т.е., FST315) и 288 аминокислот (т.е., FST288), соответственно, после удаления сигнального пептида из 29 аминокислот, и фоллистатин 315 может далее подвергаться протеолитической деградации до фоллистатина 303 (FST303). Анализ аминокислотной последовательности выявил, что природный полипептид фоллистатина человека содержит пять доменов (от N-концевой стороны): пептид сигнальной последовательности (аминокислоты 1-29 из SEQ ID NO:1), N-концевой домен (FSN) (аминокислоты 30-94 из SEQ ID NO:1), домен I фоллистатина (FSDI) (аминокислоты 95-164 из SEQ ID NO:1), домен II фоллистатина (FSDII) (аминокислоты (168-239 из SEQ ID NO:1) и домен III фоллистатина (FSDIII) (аминокислоты 245-316 из SEQ ID NO:1). См. PNAS, U.S.A., 1988, Vol. 85, No 12, pp 4218-4222.

[00157] Предшественник фоллистатина-288 (FST288) человека (т.е., FST317) имеет следующую аминокислотную последовательность, с сигнальным пептидом, обозначенным жирным шрифтом, N-концевым доменом (FSN), обозначенным одиночным подчеркиванием, и доменами фоллистатина I-III (FSI, FSII, FSIII), обозначенными двойным подчеркиванием.

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA GNCWLRQAKNGRCQVLYKTEL SKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDC GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARC KEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPA SSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQC TGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEA ACSSGVLLEVKHSGSCN (SEQ ID NO: 1)

[00158] Процессированный (зрелый) вариант фоллистатина человека (FST288) имеет следующую аминокислотную последовательность с N-концевым доменом, обозначенным одиночным подчеркиванием, и доменами фоллистатина I-III, обозначенными двойным подчеркиванием. Кроме того, понятно, что любая из начальных аминокислот G или N, перед первым остатком цистеина, может быть удалена посредством процессинга или намеренно удалена без каких-либо последствий, и полипептиды, содержащие такие немного меньшие полипептиды, дополнительно включены.

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWM

IFNGGAPNCIPCKET CENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKG

PVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTC

VVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGR

SIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKS

DEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN (SEQ ID NO: 2)

[00159] Предшественник фоллистатина-315 (FST315) человека (т.е., FST344) имеет следующую аминокислотную последовательность, с сигнальным пептидом, обозначенным жирным шрифтом, N-концевым доменом (FSN), обозначенным одиночным подчеркиванием, и доменами фоллистатина I-III (FSI, FSII, FSIII), обозначенными двойным подчеркиванием (Номер доступа в NCBI AAH04107.1; 344 аминокислоты).

MVRARHQPGGLCLLLLLLCQFMEDRSAQA GNCWLRQAKNGRCQVLYKTEL

SKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKET CENVDC

GPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARC

KEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPA

SSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQC

TGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEA

ACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW

(SEQ ID NO: 3)

[00160] Процессированный (зрелый) FST315 человека имеет следующую аминокислотную последовательность с N-концевым доменом, обозначенным одиночным подчеркиванием, и доменами фоллистатина I-III, обозначенными двойным подчеркиванием. Кроме того, понятно, что любая из начальных аминокислот G или N, перед первым остатком цистеина, может быть удалена посредством процессинга или намеренно удалена без каких-либо последствий, и полипептиды, содержащие такие немного меньшие полипептиды, дополнительно включены.

GNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWM

IFNGGAPNCIPCKET CENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKG

PVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTC

VVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGR

SIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKS

DEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEED

EDQDYSFPISSILEW (SEQ ID NO: 4)

[00161] Полипептиды фоллистатина по настоящему изобретению могут включать любой природный домен белка фоллистатина, так же как его варианты (например, формы мутантов, фрагментов и пептидомиметиков), сохраняющие полезную активность. Например, хорошо известно, что FST315 и FST288 имеют высокую аффинность как для активина (активина A и активинв B), так и для миостатина (и близкородственного GDF11), и считают, что домены фоллистатина (например, FSN и FSD I-III) вовлечены в связывание таких лигандов TGF-β. Однако, считают, что каждый из этих трех доменов может иметь различную аффинность для этих лигандов TGF-β. Например, в одном исследовании показано, что полипептидные конструкции, содержащие только N-концевой домен (FSN) и два домена FSDI в тандеме, сохраняли высокую аффинность для миостатина, имели низкую аффинность или отсутствие аффинности для активина и стимулировали системный рост мышц при введении мыши посредством экспрессии гена (Nakatani et al., The FASEB Journal, Vol. 22477-487 (2008)).

[00162] Соответственно, настоящее изобретение относится, частично, к вариантам белков фоллистатина, для которых показано избирательное связывание и/или ингибирование данного лиганда TGF-β, по сравнению с природным белком FST (например, сохранение высокой аффинности для миостатина, с наличием в то же время значительно уменьшенной аффинности для активина).

[00163] Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам (выделенным или очищенным, или чистым полинуклеотидам), кодирующим лекарственные средства (например, фоллистатин) по настоящему изобретению, для генетической модификации В-клеток, к векторам (включая клонирующие векторы и экспрессирующие векторы), содержащим такие полинуклеотиды, и к клеткам (например, клеткам-хозяевам), трансформированным или трансфицированным полинуклеотидом или вектором по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления, в любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, можно использовать фоллистатин (например, для экспрессии в В-клетке), выбранный из полипептидов фоллистатина из SEQ ID NO: 1-4. В конкретных вариантах осуществления, в любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, можно использовать фоллистатин (например, для экспрессии в В-клетке), представляющий собой вариант участка сплайсинга FST344 фоллистатина человека. В конкретных вариантах осуществления, предусмотрен полинуклеотид (ДНК или РНК), кодирующий представляющий интерес белок (например, фоллистатин) по настоящему изобретению. Экспрессирующие кассеты, кодирующие представляющие интерес белки, также предусмотрены в настоящем описании.

[00164] Настоящее изобретение относится также к векторам, включающим полинуклеотид по настоящему изобретению и, в частности, к рекомбинантным экспрессирующим конструкциям. В одном варианте осуществления, по настоящему изобретению предусмотрен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок по настоящему изобретению (например, фоллистатин), вместе с другими полинуклеотидными последовательностями, вызывающими или облегчающими транскрипцию, трансляцию и процессинг таких кодирующих белок последовательностей. Подходящие клонирующие и экспрессирующие векторы для использования с прокариотическими и эукариотическими хозяевами описаны, например, в Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989). Иллюстративные клонирующие/экспрессирующие векторы включают клонирующие векторы, челночные векторы и экспрессирующие конструкции, которые могут быть основаны на плазмидах, фагмидах, фазмидах, космидах, вирусах, искусственных хромосомах или любой нуклеиновой кислоте-носителе, известной в данной области, пригодной для амплификации, переноса и/или экспрессии содержащегося в ней полинуклеотида.

[00165] В рамках изобретения, если иное не описано применительно к вирусным векторам, «вектор» обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Иллюстративные векторы включают плазмиды, миникольца, транспозоны (например, транспозон Sleeping Beauty), искусственные хромосомы дрожжей, самореплицирующиеся РНК и вирусные геномы. Конкретные векторы могут автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в то время как другие векторы могут интегрировать в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются с геномом хозяина. Кроме того, конкретные векторы обозначены в настоящем описании как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы»), которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, функционально связанные с последовательностью для контроля экспрессии и, таким образом, являются способными управлять экспрессией этих последовательностей. В конкретных вариантах осуществления, экспрессирующие конструкции происходят из плазмидных векторов. Иллюстративные конструкции включают модифицированный вектор pNASS (Clontech, Palo Alto, CA), имеющий последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие ген устойчивости к ампициллину, сигнал полиаденилирования и промоторный участок T7; pDEF38 и pNEF38 (CMC ICOS Biologies, Inc.), имеющие промотор CHEF1; и pD18 (Lonza), имеющий промотор CMV. Другие пригодные экспрессирующие векторы для млекопитающих хорошо известны (см., например, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., выше; см. также, например, каталоги из Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, Wl; Pharmacia, Piscataway, NJ).

[00166] Можно получать полезные конструкции, включающие кодирующую дигидрофолатредуктазуа (DHFR) последовательность под поддходящим контролем регуляции, чтобы способствовать увеличенным уровням продукции слитых белков, где такие уровни возникают в результате амплификации гена после введения соответствующего селективного средства (например, метотрексата). В одном варианте осуществления, с использованием бифункционального транспозона, кодирующего терапевтический ген (например, FST), вместе с устойчивостью к лекарственному средству-DHFR, в комбинации с инкубацией с метотрексатом (MTX) для обогащения по успешно транспонированным В-клеткам, получают более активный продукт.

[00167] В общем, рекомбинантные экспрессирующие векторы могут включать точки начала репликации и селективные маркеры, позволяющие трансформацию клетки-хозяина, и промотора, происходящего из гена с высокой экспрессией, для управления транскрипцией нижележащей структурной последовательности, как описано выше. Вектор в функциональной связи с полинуклеотидом по настоящему изобретению образует клонирующую или экспрессирующую конструкцию. Иллюстративные клонирующие/экспрессирующие конструкции содержат по меньшей мере один элемент для контроля экспрессии, например, промотор, функционально связанный с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Дополнительные элементы для контроля экспрессии, такие как энхансеры, специфические для факторов участки связывания, терминаторы и участки связывания рибосомы, также предусмотрены в векторах и клонирующих/экспрессирующих конструкциях по настоящему изобретению. Гетерологичную структурную последовательность полинуклеотида по настоящему изобретению собирают в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции. Таким образом, например, кодирующие нуклеиновые кислоты, как представлено в настоящем описании, можно включать в любую из множества экспрессирующих векторных конструкций (например, миниколец) в качестве рекомбинантной экспрессирующей конструкции для экспрессии такого белка в клетке-хозяине.

[00168] Соответствующие последовательность(последовательности) ДНК можно вставлять в вектор, например, посредством множества способов. Как правило, последовательность ДНК вставляют в соответствующие участок(участки) расщепления рестрикционных эндонуклеаз способами, известными в данной области. Предусмотрены стандартные способы клонирования, выделения, амплификации и очистки ДНК для ферментных реакций, включающих ДНК-лигазу, ДНК-полимеразу, рестрикционные эндонуклеазы и т.п., и различные способы разделения. Ряд стандартных способов описан, например, в Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook et al. (Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed.) (DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames and Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK, 1985); и в других источниках.

[00169] Последовательность ДНК в экспрессирующем векторе является функционально связанной по меньшей мере с одной соответствующей последовательностью для контроля экспрессии (например, конститутивным промотором или регулируемым промотором) для управления синтезом мРНК. Репрезентативные примеры таких последовательностей для контроля экспрессии включают промоторы эукариотических клеток или их вирусов, как описано выше. Промоторные области могут быть выбраны из любого желательного гена с использованием векторов с CAT (хлорамфениколтрансферазой), векторов с канамицином или других векторов с селективным маркером. Эукариотические промоторы включают немедленный ранний CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний SV40, LTR из ретровируса и промотор металлотионеина-l мыши. Выбор подходящего вектора и промотора полностью находится в компетенции обычного специалиста в данной области, и получение конкретных особенно предпочтительных рекомбинантных экспрессирующих конструкций, содержащих по меньшей мере один промотор или регулируемый промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или полипептид по настоящему изобретению, описаны в настоящем описании.

[00170] Варианты полинуклеотидов по настоящему изобретению также предусмотрены. Варианты полинуклеотидов являются по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% и предпочтительно, на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,9% идентичными одному из полинуклеотидов определенной последовательности, как описано в настоящем описании, или гибридизуются с одним из этих полинуклеотидов определенной последовательности в строгих условиях гибридизации в 0,015 M хлориде натрия, 0,0015 M цитрате натрия при приблизительно 65-68°C, или в 0,015 M хлориде натрия, 0,0015 M цитрате натрия и 50% формамиде при приблизительно 42°C. Варианты полинуклеотидов сохраняют способность кодировать связывающий домен или слитый с ним белок, имеющий функциональность, описанную в настоящем описании.

[00171] Термин «строгий» используют для обозначения условий, общепринятых в данной области как строгие. Строгость гибридизации принципиально определяется температурой, ионной силой и концентрацией денатурирующих средств, таких как формамид. Примеры строгих условий для гибридизации и отмывки представляют собой 0,015 M хлорид натрия, 0,0015 M цитрат натрия при приблизительно 65-68°C, или 0,015 M хлорид натрия, 0,0015 M цитрат натрия и 50% формамид при приблизительно 42°C (см. Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). Можно использовать также более строгие условия (такие как более высокая температура, более низкая ионная сила, более высокая концентрация формамида или другого денатруриующего средства); однако, это влияет на процент гибридизации. В случаях, когда рассматривают гибридизацию дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные иллюстративные строгие условия гибридизации включают отмывку в 6xSSC, 0,05% пирофосфате натрия при 37°C (для олигонуклеотидов из 14 оснований), 48°C (для олигонуклеотидов из 17 оснований), 55°C (для олигонуклеотидов из 20 оснований) и 60°C (для олигонуклеотидов из 23 оснований).

[00172] В следующем аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной любым из полинуклеотидов или векторов/экспрессирующих конструкций по настоящему изобретению (например, полинуклеотидами или вектором/экспрессирующими конструкциями фоллистатина), или содержащей их иным образом. Полинуклеотиды или клонирующие/экспрессирующие конструкции по настоящему изобретению вводят в подходящие клетки с использованием любого способа, известного в данной области, включая трансформацию, трансфекцию и трансдукцию (например, любого из способов, описанных в настоящем описании). Клетки-хозяева включают клетки субъекта, подвергаемого клеточной терапии ex vivo, включая, например, генотерапию ex vivo. Эукариотические клетки-хозяева предусмотрены в качестве аспекта настоящего изобретения, когда они несут полинуклеотид, вектор или белок по настоящему изобретению, включая, в дополнение к собственным клеткам субъекта (например, собственным клеткам пациента-человека клетки), клетки VERO, клетки HeLa, линии клеток яичника китайского хомяка (CHO) (включая модифицированные клетки CHO, способные модифицировать паттерн гликозилирования экспрессированных мультивалентных связывающих молекул, см. Публикация патентной заявки США No. 2003/01 15614), клетки COS (такие как COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, клетки HEK293, клетки HepG2, клетки N, клетки 3T3, клетки Spodoptera frugiperda (например, клетки Sf9), клетки Saccharomyces cerevisiae и любую другую эукариотическую клетку, которую, как известно в данной области, можно использовать для экспрессии, и необязательно, выделения, белка или пептида по настоящему изобретению. Предусмотрены также прокариотические клетки, включая Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Streptomycete или любую прокариотическую клетку, как известно в данной области, пригодную для экспрессии и необязательно, выделения, белка или пептида по настоящему изобретению. При выделении белка или пептида из прокариотических клеток, в частности, предусматривают, что можно использовать способы, известные в данной области для экстракции белка из телец включения. Выбор соответствующего хозяина по объяснениям в настоящем описании находится в пределах компетенции специалиста в данной области. Предусматривают клетки-хозяева, гликозилирующие слитые белки по настоящему изобретению.

[00173] Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») относится к клетке, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что такие термины предназначены для обозначения не только конкретной рассматриваемой клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку конкретные модификации могут возникать в последующих поколениях либо из-за мутации, либо из-за влияния внешней среды, такое потомство может, фактически, не являться идентичным исходной клетке, но все еще включено в объем термина «клетка-хозяин» в рамках изобретения. Рекомбинантные клетки-хозяева можно культивировать в общепринятой питательной среде, модифицированной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации конкретных генов. Условия культивирования для конкретных клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, такие как температура, pH и т.п., ясно очевидны специалисту в данной области. Различные системы культур клеток млекопитающих также можно использовать для экспрессии рекомбинантного белка. Примеры систем экспрессии для млекопитающих включают линии COS-7 фибробластов почки обезьяны, описанные в Gluzman (1981) Cell 23:175, и другие линии клеток, способные к экспрессии совместимого вектора, например, линии клеток C127, 3T3, CHO, HeLa и BHK. Экспрессирующие векторы для млекопитающих могут содержать точку начала репликации, подходящий промотор и, необязательно, энхансер, а также любые необходимые участки связывания рибосомы, участок полиаденилирования, донорные и акцепторные участки сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие нетранскрибированные последовательности, например, как описано в настоящем описании применительно к получению экспрессирующих мультивалентный связывающий белок конструкций. Последовательности ДНК, происходящие из участков сплайсинга и полиаденилирования SV40, можно использовать для предоставления необходимых нетранскрибированных генетических элементов. Введение конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять множеством способов, известных специалисту в данной области, включая трансфекцию с фосфатом кальция, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, или электропорацию (Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology).

Клетки и композиции

[00174] В одном варианте осуществления, модифицированные В-клетки, описанные в настоящем описании, активированы/дифференцированы in vitro и трансфицированы для экспрессии лекарственного средства, как описано в настоящем описании (например, фоллистатина). В одном варианте осуществления, модифицированные В-клетки, описанные в настоящем описании, активированы/дифференцированы in vitro и модифицированы (например, с использованием способа направленной интеграции трансгена, такой как опосредованная нуклеазой с цинковыми пальцами, TALEN, мегануклеазой или CRISPR/CAS9- интеграция трансгена) для экспрессии лекарственного средства, как описано в настоящем описании (например, фоллистатина). В одном варианте осуществления, композиции содержат В-клетки, дифференцированные в плазматические В-клетки, трансфицированные или иным образом модифицированные и экспрессирующие один или несколько представляющих интерес белков (например, фоллистатин). Популяции клеток-мишеней, такие как трансфицированные или иным образом модифицированные и активированные популяции В-клеток по настоящему описанию, можно вводить либо отдельно, либо в форме фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как цитокины или популяции клеток.

[00175] В одном варианте осуществления, модифицированные В-клетки, модифицированные для экспрессии одного или нескольких представляющих интерес белков (например, фоллистатина) собирают из культуры после активации/дифференцировки in vitro во временной точке, в которой модифицированные В-клетки имеют оптимальную способность к миграции для конкретного хемоаттрактанта. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать на сутки 7, сутки 8, или сутки 9 культивирования В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать на сутки 5, сутки 6 или сутки 7 культивирования В-клеток после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать на сутки 8 культивирования В-клеток после трансфекции или модификации, или позже в культуре, чем сутки 8 после трансфекции или модификации (например, сутки 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, или позже, чем сутки 20). В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать до суток 10 культивирования В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать до суток 8 культивирования В-клеток после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать на сутки 6 или сутки 7 культивирования В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать на сутки 4 или сутки 5 культивирования В-клеток после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать до суток 9 культивирования В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции может присутствовать до суток 7 культивирования В-клеток после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции является оптимальной для хоминга модифицированной В-клетки к CXCL12. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции является оптимальной для хоминга модифицированной В-клетки в костном мозге субъекта, подвергнутого одному или нескольким введениям модифицированных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL12 и/или в костный мозг субъекта на от приблизительно суток 7 до приблизительно суток 9 в культуре. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL12 и/или в костный мозг субъекта на от приблизительно сутки 5 до приблизительно сутки 7 в культуре после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL12 и/или в костный мозг субъекта до приблизительно суток 10 в культуре. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL12 и/или в костный мозг субъекта до приблизительно суток 8 в культуре после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции является оптимальной для хоминга модифицированной В-клетки к CXCL13. В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции является оптимальной для хоминга модифицированной В-клетки в участок воспаления у субъекта, подвергнутого одному или нескольким введениям модифицированных В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL13 и/или в участок воспаления у субъекта на приблизительно сутки 6 или приблизительно сутки 7 в культуре. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL13 и/или в участок воспаления у субъекта на приблизительно сутки 4 или приблизительно сутки 5 в культуре после трансфекции или модификации. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL13 и/или в участок воспаления до приблизительно суток 10 в культуре. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают для введения субъекту при оптимальной способности к миграции к CXCL13 и/или в участок воспаления до приблизительно суток 8 в культуре после трансфекции или модификации.

[00176] В некоторых вариантах осуществления, оптимальная способность к миграции является оптимальной для хоминга модифицированной В-клетки как к CXCL12, так и к CXCL13. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают при оптимальной способности к миграции для хоминга как к CXCL12, так и к CXCL13, на сутки 7 культивирования В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, В-клетки собирают при оптимальной способности к миграции для хоминга как к CXCL12, так и к CXCL13, на сутки 5 культивирования В-клеток после трансфекции или модификации.

[00177] В некоторых вариантах осуществления, модифицированные В-клетки собирают, когда по меньшей мере приблизительно 20% В-клеток мигрируют в анализе хемотаксиса к конкретному хемоаттрактанту. Например, но без ограничения этим примером, модифицированные В-клетки (например, продуцирующие FST), можно собирать, когда по меньшей мере приблизительно 20% В-клеток мигрируют в анализе хемотаксиса к CXCL12. Или, в другом неограничивающем примере, модифицированные В-клетки (например, продуцирующие FST) можно собирать, когда по меньшей мере приблизительно 20% В-клеток мигрируют в анализе хемотаксиса к CXCL13. Кроме того, модифицированные В-клетки (например, продуцирующие FST) можно собирать, когда по меньшей мере приблизительно 30% В-клеток мигрируют в анализе хемотаксиса к конкретному хемоаттрактанту (например, CXCL12 или CXCL13), или когда по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или по меньшей мере приблизительно 70% В-клеток мигрируют в анализе хемотаксиса к конкретному хемоаттрактанту (например, CXCL12 или CXCL13). Кроме того, модифицированные В-клетки (например, продуцирующие FST) можно собирать, когда более, чем 70% В-клеток мигрируют в анализе хемотаксиса. Такие анализы хемотаксиса известны в данной области.

[00178] Кратко, композиции клеток по настоящему описанию могут содержать дифференцированную и активированную популяцию В-клеток, которая была трансфицирована и экспрессирует лекарственное средство, как описано в настоящем описании (например, фоллистатин), в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически пригодными носителями, разбавителями или наполнителями. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, лактированный раствор Рингера и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия); и консерванты. Композиции по настоящему описанию предпочтительно составляют для внутривенного или подкожного введения.

[00179] В одном варианте осуществления, композицию клеток оценивают по чистоте перед введением. В другом варианте осуществления, композицию клеток тестируют по надежности продукции лекарственного средства. В одном варианте осуществления, композицию клеток тестируют по стерильности. В другом варианте осуществления, композицию клеток подвергают скринингу для подтверждения того, что она совпадает с субъектом-реципиентом.

[00180] В одном варианте осуществления, модифицированную популяцию В-клеток оценивают по поликлональности перед введением субъекту. В некоторых вариантах осуществления, обеспечение поликлональности конечного продукта клеток является важным параметром безопасности. Конкретно, возникновение доминантного клона можно рассматривать как потенциально вносящее вклад in vivo в образование опухолей или аутоиммунное заболевание. Поликлональность можно оценивать любыми способами, известными в данной области или описанными в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления, поликлональность оценивают посредством секвенирования (например, глубокого секвенирования) В-клеточных рецепторов, экспрессированных в модифицированной популяции В-клеток. Поскольку В-клеточный рецептор подвергается изменениям в ходе развития В-клеток, которые делают его уникальным между В-клетками, этот способ позволяет количественную оценку того, как много клеток разделяют одну и ту же последовательность В-клеточного рецептора (что означает, что они являются клональными). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, чем больше В-клеток в модифицированной популяции В-клеток, которые экспрессируют одинаковую последовательность В-клеточного рецептора, тем более клональной является популяция и, таким образом, менее безопасной популяция является для введения субъекту. Напротив, в некоторых вариантах осуществления, чем меньше В-клеток в модифицированной популяции В-клеток, которые экспрессируют одинаковую последовательность В-клеточного рецептора, тем менее клональной является популяция (т.е., более поликлональной) и, таким образом, более безопасной популяция является для введения субъекту.

[00181] В некоторых вариантах осуществления, модифицированные В-клетки вводят субъекту после того, как определили, что они являются достаточно поликлональными. Например, модифицированные В-клетки можно вводить субъекту после того, как определили, что ни один конкретный клон В-клеток в конечной популяции не содержит более, чем приблизительно 0,2% общей популяции В-клеток. Модифицированные В-клетки можно вводить субъекту после того, как определили, что ни один конкретный клон В-клеток в конечной популяции не содержит более, чем приблизительно 0,1% общей популяции В-клеток, или более чем приблизительно 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05% или приблизительно 0,04%, общей популяции В-клеток. В конкретных вариантах осуществления, модифицированные В-клетки (например, продуцирующие (фоллистатин)) вводят субъекту после того, как определили, что ни один конкретный клон В-клеток в конечной популяции не содержит более, чем приблизительно 0,03% общей популяции В-клеток.

[00182] В одном варианте осуществления, композицию клеток хранят и/или транспортируют при 4°C. В другом варианте осуществления, композицию клеток замораживают для хранения и/или транспортировки. Композицию клеток можно замораживать, например, при -20°C или -80°C. В одном варианте осуществления, стадия замораживания композиции клеток включает жидкий азот. В одном варианте осуществления, композицию клеток замораживают с использованием морозильника с контролируемой скоростью. Соответственно, способы, описанные в настоящем описании, могут дополнительно включать стадию размораживания.

Способы применения

[00183] Один аспект настоящего изобретения относится к доставке in vivo лекарственного средства (например, фоллистатина) посредством доставки модифицированной В-клетки, модифицированной для экспрессии лекарственного средства (например, фоллистатина). В конкретных вариантах осуществления, В-клетки, модифицированные для экспрессии фоллистатина, используют в способах лечения и/или предотвращения хронического заболевания и нарушения, и/или в способах увеличения размера или силы мышц у пациента.

[00184] Модифицированные В-клетки, описанные в настоящем описании, можно вводить способом, подходящим для заболевания или нарушения, подлежащего лечению или предотвращению.

[00185] Количество и частоту введения могут определять такие факторы, как состояние пациента, и тип и тяжесть заболевания пациента, хотя подходящие дозы можно определять посредством клинических исследований.

[00186] В одном варианте осуществления, однократную дозу модифицированных В-клеток вводят субъекту. В одном варианте осуществления, две или более дозы модифицированных В-клеток последовательно вводят субъекту. В одном варианте осуществления, три дозы модифицированных В-клеток последовательно вводят субъекту. В одном варианте осуществления, дозу модифицированных В-клеток вводят раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца, раз в три месяца, раз в полгода, раз в год или раз в два года субъекту. В одном варианте осуществления, вторую или последующую дозу модифицированных В-клеток вводят субъекту, когда количество лекарственного средства, продуцированного модифицированными В-клетками, уменьшается.

[00187] В одном варианте осуществления, дозу модифицированных В-клеток вводят субъекту с конкретной частотой (например, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца или раз в три месяца), пока желательное количество (например, эффективное количество) лекарственного средства (например, фоллистатина) не будет детектировано у субъекта. В одном варианте осуществления, количество лекарственного средства (например, фоллистатин) мониторируют у субъекта. В одном варианте осуществления, последующую дозу модифицированных В-клеток вводят субъекту, когда количество лекарственного средства, продуцированного модифицированными В-клетками, уменьшается ниже желательного количества. В одном варианте осуществления, желательное количество представляет собой диапазон, оказывающий желательный эффект. Например, в способе лечения мышечной дистрофии (например, мышечной дистрофии Беккера), желательное количество фоллистатина может представлять собой количество в плазме субъекта, которому вводят модифицированные В-клетки. В некоторых вариантах осуществления, желательное количество может представлять собой количество фоллистатина, приводящее к определенному уровню набора массы тела субъекта. В некоторых вариантах осуществления, желательное количество может представлять собой количество фоллистатина, приводящее к определенному уровню увеличения силы субъекта. В некоторых вариантах осуществления, желательное количество может представлять собой количество фоллистатина, приводящее к определенному уровню увеличения массы тела субъекта.

[00188] Когда указано «эффективное количество» или «терапевтическое количество», точное количество композиций по настоящему описанию, подлежащее введению, может определять терапевт с учетом индивидуальных различий возраста, массы, размера опухоли, степени инфекции или метастазирования и состояния пациента (субъекта). Композиции В-клеток можно также вводить множество раз в подходящей дозе(дозах). Клетки можно вводить с использованием способов инфузии, общеизвестных в иммунотерапии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

[00189] Оптимальную дозу и режим лечения для конкретного пациента может определять специалист в области медицины посредством мониторирования у пациента признаков заболевания и коррекции лечения, соответственно. Лечение можно также корректировать после измерения уровней лекарственного средства (например, фоллистатина) в биологическом образце (например, жидкости организма, такой как плазма, или образце ткани), которое можно также использовать для оценки эффективности лечения, и лечение можно корректировать, соответственно, в сторону увеличения или уменьшения.

[00190] В некоторых аспектах настоящего изобретения, оптимальную дозу модифицированных В-клеток для режима множественных доз можно определять посредством определения сначала оптимальной концентрации В-клеток в однократной дозе для субъекта, уменьшения количества В-клеток, присутствующих в оптимальной концентрации в однократной дозе для получения субоптимальной концентрации модифицированных В-клеток в однократной дозе, и введения двух или более доз с субоптимальной концентрацией модифицированных В-клеток в однократной дозе субъекту. В некоторых аспектах, 2, 3 или более доз с субоптимальной концентрацией модифицированных В-клеток в однократной дозе вводят субъекту. В некоторых аспектах, введение 2, 3 или более доз с субоптимальной концентрацией модифицированных В-клеток в однократной дозе субъекту приводит к синергической продукции in vivo терапевтического полипептида, для экспрессии которого модифицированы модифицированные В-клетки. В некоторых аспектах, субоптимальная концентрация в однократной дозе составляет 1/2 или в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше раз менее оптимальной концентрации в однократной дозе. В некоторых аспектах, терапевтический полипептид представляет собой фоллистатин.

[00191] В некоторых аспектах настоящего изобретения, можно вводить более низкие количества трансфицированных В-клеток по настоящему описанию, в диапазоне 10⁶/килограмм (10⁶-10¹¹ на пациента). В конкретных вариантах осуществления, В-клетки вводят при 1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹, 5×10¹¹ или 1×10¹² клеток субъекту. Композиции В-клеток можно вводить множество раз в дозах в этих диапазонах. Клетки могут являться аутологичными или гетерологичными (например, аллогенными) для пациента, подвергаемого терапии. Если желательно, лечение может также включать введение митогенов (например, PHA) или лимфокинов, цитокинов и/или хемокинов (например, GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-13, IL-21, Flt3-L, RANTES, MIP1α, BAFF и т.д.), как описано в настоящем описании, для усиления индукции иммунного ответа и приживления введенных посредством инфузии В-клеток.

[00192] Введение рассматриваемых композиций можно проводить любым удобным способом, включая аэрозольную ингаляцию, инъекцию, прием внутрь, трансфузию, имплантацию или трансплантацию. Композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, интранодально, интрамедуллярно, интратекально, внутримышечно, посредством внутривенной (i.v.) инъекции или внутрибрюшинно. Композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить пациенту непосредственно в нервную систему. В одном варианте осуществления, композиции В-клеток по настоящему описанию вводят пациенту посредством внутрикожной или подкожной инъекции. В другом варианте осуществления, композиции В-клеток, как описано в настоящем описании, предпочтительно, вводят посредством i.v. инъекции. Композиции В-клеток можно инъецировать непосредственно в опухоль, лимфатический узел, костный мозг или участок инфекции.

[00193] В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления, можно использовать насос (см. Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980; Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления, можно использовать полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release, 1974, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, 1984, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York; Ranger and Peppas, 1983; J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ; см. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). В другом варианте осуществления, систему с контролируемым высвобождением можно помещать поблизости от терапевтической мишени, таким образом, необходима только доля от системной дозы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, 1984, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla., vol. 2, pp. 1 15-138).

[00194] Композиции В-клеток по настоящему описанию можно также вводить с использованием любого количества матриксов. Матриксы использовали в течение нескольких лет в контексте тканевой инженерии (см., например, Principles of Tissue Engineering (Lanza, Langer, and Chick (eds.)), 1997. По настоящему изобретению используют такие матриксы в новом контексте действия в качестве искусственного лимфоидного органа для поддержания и сохранения В-клеток. Соответственно, по настоящему изобретению можно использовать те матриксные композиции и составы, для которых показана полезность в тканевой инженерии. Соответственно, тип матрикса, который можно использовать в композициях, устройствах и способах по настоящему изобретению, фактически неограничен и может включать как биологические, так и синтетические матриксы. В одном конкретном примере, используют композиции и устройства, указанные в Патентах США No: 5980889; 5913998; 5902745; 5843069; 5787900; или 5626561. Матриксы имеют признаки, обычно ассоциированные с биосовместимостью при введении хозяину-млекопитающему. Матриксы могут быть сформированы из природных и/или синтетических материалов. Матриксы могут являться небиоразлагаемыми, в случаях, когда является желательным оставлять постоянные структуры или извлекаемые структуры в организме животного, такие как имплантат; или биоразлагаемыми. Матриксы могут иметь форму губок, имплантатов, трубок, тампонов telfa, волокон, полых волокон, лиофилизированных компонентов, гелей, порошков, пористых композиций или наночастиц. Кроме того, матриксы можно разрабатывать, чтобы позволять замедленное высвобождение посеянных клеток или продуцированного цитокина, или другого действующего вещества. В конкретных вариантах осуществления, матрикс по настоящему описанию является гибким и эластичным, и может быть описан как полутвердый каркас, проницаемый для таких веществ, как неорганические соли, водные жидкости и растворенные газообразные средства, включая кислород.

[00195] Матрикс использован в настоящем описании в качестве примера биосовместимого вещества. Однако, настоящее описание не ограничено матриксами и таким образом, во всех случаях появления термина матрикс или матриксы, эти термины следует понимать как включающие устройства и другие вещества, которые позволяют удержание клеток или прохождение клеток, являются биосовместимыми и либо являются способными позволять прохождение макромолекул напрямую через вещество таким образом, что само вещество является полупроницаемой мембраной, либо использованы в сочетании с конкретным полупроницаемым веществом.

[00196] В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, В-клетки трансфицированные и активированные с использованием способов, описанных в настоящем описании, или других способов, известных в данной области, вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) любым количеством соответствующих вариантов лекарственных средств, включая, но без ограничения, лечение с использованием таких средств, как противовирусные средства, химиотерапия, радиоактивное облучение, иммуносупрессивные средства, такие как циклоспорин, бисульфин, бортезомиб, азатиоприн, метотрексат, микофенолят и FK506, антитела или другие иммунодеструктивные средства, такие как кампат, антитела к CD3 или другие терапевтические антитела, цитоксин, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофеноловая кислота, стероиды, FR901228, цитокины и облучение. Эти лекарственные средства либо ингибируют зависимую от кальция фосфатазу кальциневрин (циклоспорин и FK506), протеасому (бортезомиб), либо ингибируют киназу p70S6, которая является важной для индуцированной фактором роста передачи сигналов (рапамицин). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993; Isoniemi (выше)). В следующем варианте осуществления, композиции клеток по настоящему описанию вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, уничтожающей T-клетки терапией с использованием либо химиотерапевтических средств, таких как флударабин, наружной дистанционной лучевой терапии (XRT), циклофосфамид, либо антител, таких как OKT3 или кампат. В одном варианте осуществления, композиции клеток по настоящему описанию вводят после уничтожающей B-клетки терапии, такой как средства, вступающие в реакцию с CD20, например, ритуксан®. В одном варианте осуществления, композиции клеток по настоящему описанию вводят после уничтожающей B-клетки терапии с использованием такого средства, как бортезомиб. Например, в одном варианте осуществления, субъектов можно подвергать стандартному лечению с использованием высокой дозы химиотерапии с последующей трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В конкретных вариантах осуществления, после трансплантации, субъектов подвергают инфузии размноженных иммуноцитов по настоящему описанию. В дополнительном варианте осуществления, размноженные клетки вводят до или после хирургического вмешательства.

[00197] Дозу вышеуказанных лекарственных средств, подлежащую введению пациенту, можно менять, в зависимости от точного характера состояния, подвергаемого лечению, и реципиента лечения. Масштабирование доз для введения человеку можно осуществлять в соответствии с принятой в данной области практикой.

[00198] Модифицированные В-клетки можно использовать для лечения или предотвращения различных заболеваний и нарушений. В конкретных вариантах осуществления, В-клетки, модифицированные для экспрессии фоллистатина, используют в способах увеличения размера или силы мышц у пациента. Например, настоящее изобретение относится к способу увеличения размера или силы мышц у субъекта, включающему введение эффективного количества В-клетки, экспрессирующей полипептид фоллистатина. Увеличенный размер или сила мышц могут возникать в общем в организме субъекта или могут возникать в мышце-мишени. Мышца-мишень может подвергаться разрушению, ослаблению или недостаточности, как может происходить в случае мышечных нарушений, включая мышечные дистрофии (такие как мышечная дистрофия Дюшенна, мышечная дистрофия Беккера, мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса, конечностно-поясная мышечная дистрофия, синдром ригидного позвоночника, синдром Ульриха, мышечная дистрофия Фукуяма, синдром Уокера-Варбург, мышечно-глазо-мозговая болезнь, лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия), врожденную мышечную дистрофию, миотоническую дистрофию (болезнь Штейнера), недистрофическую миотонию, спинальную мышечную атрофию с периодическими параличами, семейный боковой амиотрофический склероз, наследственную моторную и сенсорную невропатию, болезнь Шарко-Мари-Тута, хроническую воспалительную невропатию, дистальную миопатию, миотубулярную/центронуклеарную миопатию, немалиновую миопатию, миопатию с маленькими стержнями, миопатию центрального стержня, десминопатию, миозит с тельцами включения, митохондриальную миопатию, врожденный миастенический синдром, постполиомиелитную дисфункцию мышц и нарушения, описанные в Emery (2002) The Lancet, 359:687-695; и Khurana et al. (2003) Nat. Rev. Drug Disc., 2:379-386), воспалительные мышечные нарушения (такие как миозит с тельцами включения), повреждение или травму мышцы, бездействие мышцы (какое может возникать после длительного постельного режима или иммобилизации конечности) и атрофию или ослабление мышцы вследствие старения, злокачественной опухоли или хронических заболеваний различных типов. Например, в некоторых случаях, мышца может подвергаться разрушению, ослаблению или недостаточности из-за саркопении. В некоторых случаях, мышца может подвергаться разрушению, ослаблению или недостаточности из-за спинальной мышечной атрофии (SMA). В некоторых случаях, мышца может подвергаться разрушению, ослаблению или недостаточности из-за бокового амиотрофического склероза (ALS). В некоторых случаях, мышца может подвергаться разрушению, ослаблению или недостаточности из-за болезни Помпе. Способы могут также представлять собой увеличение размера или силы мышц для здоровой мышцы.

[00199] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), нуждающемуся в этом субъекту.

[00200] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечного нарушения у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту, имеющему, или как подозревают, имеющему такое мышечное нарушение, где мышечное нарушение представляет собой мышечную дистрофию. В некоторых вариантах осуществления, мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Дюшенна, мышечной дистрофии Беккера, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, конечностно-поясной мышечной дистрофии, синдрома ригидного позвоночника, синдрома Ульриха, мышечной дистрофии Фукуяма, синдрома Уокера-Варбург, мышечно-глазо-мозговой болезни, лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии, врожденной мышечной дистрофии, миотонической дистрофии (болезни Штейнера), недистрофической миотонии, спинальной мышечной атрофии с периодическими параличами, семейного бокового амиотрофического склероза, наследственной моторной и сенсорной невропатии, болезни Шарко-Мари-Тута, хронической воспалительной невропатии, дистальной миопатии, миотубулярной/центронуклеарной миопатии, немалиновой миопатии, миопатии с маленькими стержнями, миопатии центрального стержня, десминопатии, миозита с тельцами включения, митохондриальной миопатии, врожденного миастенического синдрома, постполиомиелитной дисфункции мышц и нарушений, описанных в Emery (2002) The Lancet, 359:687-695; и Khurana et al. (2003) Nat. Rev. Drug Disc., 2:379-386).

[00201] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечного нарушения у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту, имеющему, или как подозревают, имеющему такое мышечное нарушение, где мышечное нарушение представляет собой воспалительное мышечное нарушение. В некоторых вариантах осуществления, воспалительное нарушение представляет собой миозит с тельцами включения.

[00202] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечного нарушения у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту имеющему, или как подозревают, имеющему такое мышечное нарушение, где мышечное нарушение вызвано повреждением или травмой мышцы.

[00203] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечного нарушения у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту имеющему, или как подозревают, имеющему такое мышечное нарушение, где мышечное нарушение вызвано бездействием мышцы (например, какое может возникать после длительного постельного режима или иммобилизации конечности).

[00204] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечного нарушения у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту, имеющему, или как подозревают, имеющему такое мышечное нарушение, где мышечное нарушение выбрано из атрофии или ослабления мышцы вследствие старения, злокачественной опухоли или хронических заболеваний различных типов.

[00205] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, у которого проявляются мягкие, умеренные или тяжелые слабость мышц, истощение мышечной ткани и/или воздействия на самостоятельное передвижение, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту.

[00206] В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, у которого проявляются мягкие, умеренные или тяжелые хрупкость мышц, гипертрофия мышц, псевдогипертрофия мышц, контрактура сустава, деформация скелета, кардиомиопатия, затруднение глотания, нарушение функции кишечника и мочевого пузыря, ишемия мышц, нарушение когнитивных функций, поведенческая дисфункция, нарушение социализации, сколиоз и/или нарушение дыхательной функции, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту.

[00207] В конкретных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения мышечной дистрофии у индивидуума, включающему введение В-клетки, генетически модифицированной для экспрессии фоллистатина (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту, имеющему, или как подозревают, имеющему мышечную дистрофию Беккера.

[00208] В некоторых вариантах осуществления, однократную, максимально эффективную дозу фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), вводят субъекту. В некоторых вариантах осуществления, две или более дозы фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344) вводят субъекту, таким образом, максимизируя количество прижившихся фоллистатин+ В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, две или более дозы фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), которые вводят субъекту, содержат меньше фоллистатин+ В-клеток, чем однократная, максимально эффективная доза фоллистатин+ В-клеток. В некоторых вариантах осуществления, когда две или более дозы фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344) вводят субъекту в дозе фоллистатин+ В-клеток, составляющей ниже максимально эффективной однократной дозы фоллистатин+ В-клеток, в результате происходит синергическое увеличение продукции фоллистатина. В одном варианте осуществления, введение фоллистатин+ В-клеток субъекту приводит к нормальным уровням фоллистатина, наблюдаемым у здорового, контрольного субъекта. В одном варианте осуществления, введение фоллистатин+ В-клеток субъекту приводит к большим, чем нормальные, уровням фоллистатина у субъекта. В одном варианте осуществления, введение фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту увеличивает силу субъекта. В одном варианте осуществления, введение фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту увеличивает силу субъекта по сравнению с нормальным уровнем. В одном варианте осуществления, введение фоллистатин+ В-клеток (например, фоллистатин+ В-клеток, экспрессирующих вариант транскрипта FST344), субъекту предотвращает потерю силы у субъекта.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ФОЛЛИСТАТИН B-КЛЕТОК

[00209] Получали конструкции транспозона Sleeping Beauty и транспозазы для транспозиции и экспрессии фоллистатина (FST) человека. Транспозоны собирали для получения интеграции гена FST и экспрессии в В-клетках. Авторы настоящего изобретения использовали промотор EEK, состоящий из промоторных и энхансерных элементов из гена иммуноглобулина человека, так же как другие ранее описанные регуляторные элементы, для достижения высокого уровня экспрессии в В-клетках. Для тестирования транспозиции и экспрессии FST, В-клетки человека выделяли от двух отдельных доноров и размножали в культуре в среде для культивирования В-клеток, и инкубировали при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂, подвергали электропорации на сутки 3 с использованием pKT2/EEK-FST344 плюс мРНК, кодирующей транспозазу SB100x. Лизаты клеток, полученные через 2, 5, 8 и 11 суток после электропорации (т.е., на сутки 5, 7, 11 и 14 в культуре) содержали значимо больше FST, чем нетрансфицированные клетки дикого типа, что показывает эффективность системы транспозона SB для достижения высокого уровня экспрессия FST в размноженных В-клетках человека (ФИГ. 5A). Примечательно, что экспрессия FST персистировала от суток 7 до 14, после небольшого уменьшения от суток 5 (вероятно, обусловленного начальной эписомной экспрессией FST), что позволяет предполагать стабильную интеграцию конструкции в В-клетки. Действительно, RT-ПЦР подтвердила стабильную интеграцию вставки FST в геном В-клетки (ФИГ. 5B). Эти экспрессирующие FST В-клетки обозначены как FST+ В-клетки в следующих примерах.

ПРИМЕР 2

ПРОДУКЦИЯ FST IN VIVO

[00210] Для определения того, способны ли В-клетки, модифицированные по настоящему изобретению, способствовать увеличению продукции FST in vivo, авторы настоящего изобретения инъецировали мышам дикого типа FST+ В-клетки, полученные в примере 1.

[00211] Конкретно, четырем мышам вводили внутривенные (в хвостовую вену) инъекции на сутки 0 носителя (500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS)) или 2×10⁶ FST+ В-клеток человека, разведенных в носителе (PBS) до 500 мкл. Кроме того, мышам вводили посредством инфузии внутрибрюшинно (i.p.) на сутки -7 3×10⁶ первичных аутологичных клеток периферической крови, обогащенных CD4+ T-клетками, для обеспечения поддержки В-клеток, транспонированных pKT2/EEK-FST плюс мРНК, кодирующей транспозазу SB100x. Авторы настоящего изобретения наблюдали двукратное увеличение уровня FST человека в плазме мышей, обработанных FST+ В-клетками, обеспечивающее надежное доказательство успешного адоптивного переноса В-клеток человека (фигура 1). Уровни FST достигали пика приблизительно на сутки 28 после инфузии и уменьшались до почти нормальных уровней к суткам 35. Хотя и не полученные для животных с недостаточностью FST, результаты этого эксперимента тем не менее предоставляют пример уровней FST человека, которые можно достигать после введения высоко активной FST+ популяции В-клеток мышам wt. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что уровни в плазме FST коррелировали с уровнями в плазме IgG человека; таким образом, предоставляя доказательство адоптивного переноса и приживления FST+ В-клеток (фигура 2A-2D).

[00212] Для определения того, оказывали ли FST+В-клетки какой-либо эффект на обработанных мышей, авторы настоящего изобретения мониторировали массу контрольных и обработанных FST+ В-клетками мышей через 35 суток после инфузии. Как показано на фигуре 3, мыши с FST+ В-клетками выросли в среднем на 4,1% (0,9 грамм) больше, чем обработанные контрольным носителем мыши. Кроме того, увеличение набора массы соответствует заметному увеличению силы в тесте прогулки по приподнятой перекладине для передних лап (улучшение на 16% у обработанных FST+ В-клетками мышей по сравнению с контролем с носителем) (ФИГ. 4A); тест прогулки по приподнятой перекладине для четырех лап (улучшение на 23% у обработанных FST+ В-клетками мышей по сравнению с контролем с носителем)(ФИГ. 4B); и тест подвешивания (улучшение на 23% у обработанных FST+ В-клетками мышей по сравнению с контролем с носителем) (ФИГ. 4C).

[00213] Таким образом, эти данные показывают, что В-клетки можно использовать в способах, описанных в настоящем описании, для экспрессии и доставки FST субъекту для индукции увеличения массы и улучшения силы.

[00214] Различные варианты осуществления, описанные выше, можно комбинировать для получения дополнительных вариантов осуществления. Полное содержание всех Патентов США, Публикаций патентных заявок США, Патентных заявок США, иностранных патентов, иностранных патентных заявок и непатентных публикаций, на которые ссылаются в этом описании и/или которые перечислены в Информационном листке заявки, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Аспекты вариантов осуществления можно модифицировать, если необходимо использовать концепции различных патентов, заявок и публикаций для предоставления еще дополнительных вариантов осуществления.

[00215] Эти и другие изменения можно вносить в варианты осуществления в свете приведенного выше подробного описания. Как правило, в следующей формуле изобретения, использованные термины не следует рассматривать как ограничивающие пункты формулы изобретения конкретными вариантами осуществления, описанными в описании и в формуле изобретения, но следует рассматривать как включающие все возможные варианты осуществления вместе с полным объемом эквивалентов, допускаемых такими пунктами формулы изобретения. Соответственно, пункты формулы изобретения не являются ограниченными описанием.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Immunsoft Corporation

Scholz, Matthew Rein

Herbig, Eric J.

McIvor, R. Scott

<120> B-КЛЕТКИ, ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ДЛЯ СЕКРЕЦИИ ФОЛЛИСТАТИНА,

И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С ФОЛЛИСТАТИНОМ ЗАБОЛЕВАНИЙ,

СОСТОЯНИЙ, НАРУШЕНИЙ И ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ РОСТА И СИЛЫ МЫШЦ

<130> IMCO-008/01WO 312423-2028

<150> US 62/644362

<151> 2018-03-16

<150> US 62/644356

<151> 2018-03-16

<160> 4

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 317

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys

20 25 30

Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr

35 40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

50 55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile

65 70 75 80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

85 90 95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys

115 120 125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135 140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr

145 150 155 160

Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185 190

Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly

195 200 205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215 220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile

225 230 235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280 285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295 300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

305 310 315

<210> 2

<211> 288

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu

1 5 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys

35 40 45

Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu

50 55 60

Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

65 70 75 80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile

85 90 95

Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

100 105 110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu

115 120 125

Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys

130 135 140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155 160

Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr

165 170 175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200 205

Lys Cys Ile Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly

210 215 220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

245 250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265 270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280 285

<210> 3

<211> 344

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys

20 25 30

Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr

35 40 45

Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser

50 55 60

Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile

65 70 75 80

Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu

85 90 95

Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn

100 105 110

Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys

115 120 125

Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala

130 135 140

Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr

145 150 155 160

Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser

165 170 175

Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys

180 185 190

Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly

195 200 205

Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr

210 215 220

Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile

225 230 235 240

Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys

245 250 255

Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu

260 265 270

Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn

275 280 285

Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser

290 295 300

Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser

305 310 315 320

Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe

325 330 335

Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp

340

<210> 4

<211> 315

<212> белок

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu

1 5 10 15

Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu

20 25 30

Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys

35 40 45

Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu

50 55 60

Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn

65 70 75 80

Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile

85 90 95

Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn

100 105 110

Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu

115 120 125

Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys

130 135 140

Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys

145 150 155 160

Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr

165 170 175

Leu Cys Gly Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg

180 185 190

Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly

195 200 205

Lys Cys Ile Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly

210 215 220

Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu

225 230 235 240

Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala

245 250 255

Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala

260 265 270

Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn

275 280 285

Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp

290 295 300

Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp

305 310 315

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к способам введения аутологичных и/или аллогенных В-клеток, генетически модифицированных для продукции лекарственного средства, такого как фоллистатин. Клетки и способы по настоящему изобретению могут быть использованы для долгосрочной доставки фоллистатина in vivo. 10 н. и 71 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Рекомбинантная В-клетка для продукции фоллистатина у субъекта, содержащая ген фоллистатина, где В-клетка была трансдуцирована с использованием конструкции ДНК, кодирующей систему транспозона, и конструкции ДНК, кодирующей полипептид фоллистатина.

2. Рекомбинантная В-клетка по п. 1, где ген фоллистатина функционально связан с промотором.

3. Рекомбинантная В-клетка по п. 1 или 2, где ген фоллистатина представляет собой ген фоллистатина человека.

4. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-3, где ген фоллистатина представляет собой вариант участка сплайсинга FST-344 фоллистатина человека.

5. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-4, где В-клетка представляет собой В-клетку человека.

6. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-5, где система транспозона представляет собой систему транспозона sleeping beauty или систему транспозона Piggybac.

7. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-6, где трансдукция осуществлена через вирус.

8. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-7, где В-клетка содержит ген фоллистатина, поскольку она была трансдуцирована ретровирусом, лентивирусом, аденовирусом или аденоассоциированным вирусом, содержащим ген фоллистатина.

9. Рекомбинантная В-клетка для продукции фоллистатина у субъекта, содержащая ген фоллистатина, где В-клетка модифицирована, чтобы содержать ген фоллистатина, с использованием способа направленной интеграции.

10. Рекомбинантная В-клетка по п. 9, где в направленной интеграции используется одна или более нуклеаз с цинковыми пальцами, подобных активаторам транскрипции эффекторных нуклеаз (TALEN) и/или систем CRISPR/Cas.

11. Рекомбинантная В-клетка по п. 9, где В-клетка модифицирована, чтобы содержать ген фоллистатина, посредством введения кодирующей фоллистатин нуклеиновой кислоты с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из ретровирусных векторов, лентивирусных векторов, аденоассоциированных вирусных векторов, аденовирусных векторов, любых других РНК- или ДНК-вирусных векторов, невирусной ДНК и/или РНК, кодирующей фоллистатин, введенных с использованием химических или физических способов, таких как липофекция, образование комплексов с поликатионами, электропорация.

12. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-11, где полипептид фоллистатин секретирован рекомбинантной В-клеткой.

13. Способ доставки фоллистатина субъекту, включающий введение рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 1-12.

14. Способ доставки фоллистатина нуждающемуся в этом субъекту, включающий введение рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 1-12.

15. Способ по п. 13 или 14, где субъект представляет собой млекопитающее.

16. Способ по любому из пп. 13-15, где субъект представляет собой человека.

17. Способ по любому из пп. 13-16, где субъект имеет мышечную дистрофию.

18. Способ по любому из пп. 13-17, где субъект имеет мышечную дистрофию Беккера.

19. Способ по любому из пп. 13-18, где введение рекомбинантной В-клетки субъекту обеспечивает лечение заболевания, нарушения или состояния субъекта.

20. Способ по любому из пп. 13-18, где введение рекомбинантной В-клетки субъекту обеспечивает лечение мышечной дистрофии.

21. Способ по любому из пп. 13-20, где введение рекомбинантной В-клетки субъекту вызывает увеличение массы тела субъекта.

22. Способ по п. 21, где масса тела субъекта увеличивается по меньшей мере приблизительно на 4%.

23. Способ по п. 22, где значительное увеличение массы тела происходит в течение 30 суток.

24. Способ по п. 22, где значительное увеличение массы тела происходит за приблизительно 30 суток.

25. Способ по любому из пп. 13-24, где введение рекомбинантной В-клетки субъекту вызывает увеличение мышечной массы у субъекта.

26. Способ по любому из пп. 13-25, где введение рекомбинантной В-клетки увеличивает мышечную силу субъекта.

27. Способ по любому из пп. 13-26, где введение рекомбинантной В-клетки приводит к увеличению уровней фоллистатина в плазме субъекта.

28. Способ лечения или облегчения мышечного нарушения посредством введения рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 1-12, где мышечное нарушение характеризуется снижением фоллистатина.

29. Способ профилактики мышечного нарушения посредством введения рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 1-12, где мышечное нарушение характеризуется снижением фоллистатина.

30. Способ лечения или облегчения мышечной дистрофии посредством введения рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 1-12.

31. Способ профилактики мышечной дистрофии посредством введения рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 1-12.

32. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-12, где рекомбинантная В-клетка происходит из В-клетки, полученной от субъекта, или В-клетки, происходящей из клетки, полученной от субъекта.

33. Рекомбинантная В-клетка по п. 32, где рекомбинантная В-клетка происходит из предшественника В-клетки, полученного от субъекта.

34. Рекомбинантная В-клетка по п. 32, где рекомбинантная В-клетка происходит из клетки, полученной от субъекта, дифференцированной в В-клетку или предшественник В-клетки.

35. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 1-12 и 32-34, где рекомбинантная В-клетка модифицирована посредством

(a) сбора и выделения иммуноцитов из крови субъекта;

(b) трансдукции клеток ДНК, кодирующей фоллистатин;

(c) размножения отобранных клеток ex vivo; и

(d) дифференцировки размноженных клеток ex vivo в плазматические клетки и/или плазмабласты;

36. Рекомбинантная В-клетка по п. 35, где выделенные иммуноциты со стадии a представляют собой положительные по CD19 клетки.

37. Рекомбинантная В-клетка по п. 35 или 36, где трансдукцию на стадии b проводят посредством электропорации.

38. Рекомбинантная В-клетка по любому из пп. 35-37, где дифференцированные клетки являются CD38(+) и CD20(-).

39. Способ лечения или облегчения мышечного нарушения, включающий введение субъекту рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 35-38, где мышечное нарушение характеризуется снижением фоллистатина.

40. Способ профилактики мышечного нарушения, включающий введение субъекту рекомбинантной В-клетки по любому из пп. 35-38, где мышечное нарушение характеризуется снижением фоллистатина.

41. Способ по любому из пп. 13-29 или 39, 40, где способ включает введение двух или более последовательных доз генетически модифицированных В-клеток субъекту.

42. Способ по п. 41, где введение включает две или более дозы генетически модифицированных В-клеток в субоптимальных концентрациях однократных доз.

43. Способ по п. 41, где введение включает три или более дозы генетически модифицированных В-клеток.

44. Способ по п. 41, где генетически модифицированные В-клетки являются аутологичными для субъекта.

45. Способ по п. 41, где генетически модифицированные В-клетки являются аллогенными для субъекта.

46. Способ по п. 41, где субъект представляет собой человека.

47. Способ по п. 41, где генетически модифицированные В-клетки представляют собой CD20-, CD38- и CD138-.

48. Способ по п. 41, где генетически модифицированные В-клетки представляют собой CD20-, CD38+ и CD138+.

49. Способ по п. 41, где генетически модифицированные В-клетки представляют собой CD20-, CD38+ и CD138-.

50. Способ по п. 41, где введение включает внутривенную, внутрибрюшинную, подкожную, интратекальную, внутрикамерную или внутримышечную инъекцию.

51. Способ по п. 50, где введение включает внутривенную инъекцию.

52. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-51, где рекомбинантные В-клетки модифицируют на сутки 2 или сутки 3 после культивирования.

53. Способ по п. 52, где рекомбинантные В-клетки модифицируют с использованием способа, включающего электропорацию.

54. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-53, где

(a) рекомбинантные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки в диапазоне от суток 1 до суток 12 культивирования in vitro.

(b) рекомбинантные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки 4, сутки 5, сутки 6 или сутки 7, или сутки 8 в культуре после модификации.

55. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-54, где рекомбинантные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки 8 от начала культивирования или позже, после модификации.

56. Способ по п. 55, где рекомбинантные В-клетки собирают для введения субъекту на сутки 10 от начала культивирования или ранее, после модификации.

57. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-56, где рекомбинантные В-клетки выращивают в системе культивирования, содержащей каждый из IL-2, IL-4, IL-10, IL-15, IL-31 и мультимеризованного лиганда CD40, на протяжении всего периода культивирования до и после модификации.

58. Способ по п. 57, где мультимеризованный лиганд CD40 представляет собой меченный HIS лиганд CD40, мультимеризованный с использованием антитела к his.

59. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-58, дополнительно включающий размножение рекомбинантных В-клеток до введения субъекту.

60. Способ по п. 59, где не более 1% от общей конечной популяции расширенной популяции рекомбинантных В-клеток продуцируют одну и ту же последовательность рецепторов В-клеток.

61. Способ по п. 59, где любой конкретный клон В-клеток в конечной популяции размноженных рекомбинантных В-клеток составляет менее 0,2% общей популяции В-клеток.

62. Способ по п. 59, где любой конкретный клон В-клеток в конечной популяции размноженных рекомбинантных В-клеток составляет менее 0,05% общей популяции В-клеток.

63. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-62, где рекомбинантные В-клетки содержат полинуклеотид, кодирующий селективный маркер.

64. Способ по п. 63, где селективный маркер представляет собой ген DHFR человека с увеличенной устойчивостью к метотрексату.

65. Способ по п. 64, где ген DHFR человека с увеличенной устойчивостью к метотрексату содержит мутации замены лейцина на тирозин в положении аминокислоты 22 и фенилаланина на серин в положении аминокислоты 31.

66. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-65, включающий обработку рекомбинантных В-клеток метотрексатом до сбора для введения.

67. Способ по п. 66, где метотрексат вводят в количестве от 100 нМ до 300 нМ.

68. Способ по п. 67, где метотрексат вводят вводят в количестве 200 нМ.

69. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-68, где рекомбинантные В-клетки мигрируют к различным тканям при введении субъекту.

70. Способ по любому из пп. 13-30 или 39-69, где по меньшей мере одна рекомбинантная В-клетка из популяции рекомбинантных В-клеток, которые вводят субъекту, мигрирует в одну или несколько тканей, выбранных из группы, состоящей из костного мозга, кишечника, мышцы, селезенки, почки, сердца, печени, легкого и головного мозга.

71. Способ по п. 70, где по меньшей мере одна рекомбинантная В-клетка из популяции рекомбинантных В-клеток, которые вводят субъекту, мигрирует в костный мозг, кишечник, мышцу, селезенку, почку, сердце, печень, легкое и головной мозг субъекта.

72. Способ по пп. 28, 39 или 40, где мышечное нарушение выбрано из мышечной дистрофии, воспалительного мышечного нарушения, повреждения или травмы мышцы, бездействия мышцы и атрофии или ослабления мышцы.

73. Способ по п. 72, где мышечная дистрофия представляет собой мышечную дистрофию Дюшенна, мышечную дистрофию Беккера или лице-лопаточно-плечевую мышечную дистрофию.

74. Способ по п. 72, где воспалительное мышечное нарушение представляет собой миозит с тельцами включения.

75. Способ по п. 72, где бездействие мышцы возникает после длительного постельного режима или иммобилизации конечности.

76. Способ по п. 72, где атрофия или ослабление мышцы вызваны старением, злокачественной опухолью или хроническими заболеваниями.

77. Способ по пп. 28, 39 или 40, где мышечное нарушение представляет собой саркопению.

78. Способ по пп. 28, 39 или 40, где мышечное нарушение представляет собой спинальную мышечную атрофию (SMA).

79. Способ по пп. 28, 39 или 40, где мышечное нарушение представляет собой боковой амиотрофический склероз (ALS).

80. Способ по пп. 28, 39 или 40, где мышечное нарушение представляет собой болезнь Помпе.

81. Способ по любому из пп. 72-80, где фоллистатин содержит аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 1-4.