СПОСОБЫ ГЕННОЙ МОДИФИКАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК Российский патент 2024 года по МПК C12N15/63 C12N5/74 C12N5/78 C12N15/867 A61K35/28 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 62/712,146, поданной 30 июля 2018 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка подается в электронном виде через EFS-Web и включает в себя перечень последовательностей, представленный в электронном виде в формате .txt. Файл .txt содержит перечень последовательностей под названием «ROPA_01001WO_SeqList_ST25.txt», созданный 30 июля 2019 г. и имеющий размер 57 килобайт. Перечень последовательностей, содержащийся в этом .txt-файле, является частью описания и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к способам генетической модификации гемопоэтических клеток. В частности, изобретение относится к применению комбинаций двух или более усилителей трансдукции, выбранных из простагландина E2 (PGE2), фрагмента рекомбинантного фибронектина, полоксамера и протаминсульфата, для усиления трансдукции рекомбинантным ретровирусным вектором.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Опосредованный перенос генов ex vivo в клетки-мишени является применяемым в клинической практике методом клеточной и генной терапии. Рекомбинантные ретровирусные векторы (например, рекомбинантные лентивирусные векторы) могут быть использованы для доставки полинуклеотидов в клетки (например, гемопоэтические клетки). Приведение целевых гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным (например, лентивирусным) вектором приводит к доставке гена(ов) в указанные гемопоэтические клетки, этот процесс известен как трансдукция. Затем указанные гемопоэтические клетки могут быть введены субъекту с тем, чтобы гемопоэтические клетки прижились в костном мозге указанного субъекта.

[0003] Эффективность трансдукции ретровирусным (например, лентивирусным) вектором часто невысока, и она часто является основным препятствием для успешной генной терапии. Соответственно, остается неудовлетворенная потребность в композициях и способах, подходящих для применения в отношении гемопоэтических клеток в клиническом контексте. В настоящем изобретении предложены такие композиции, способы и другие объекты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение в целом относится к способам генетической модификации гемопоэтических клеток. В частности, изобретение относится к применению комбинации двух или более усилителей трансдукции, где по меньшей мере два усилителя трансдукции из указанной комбинации выбраны из простагландина E2 (PGE2), полоксамера, фрагмента рекомбинантного фибронектина и/или протаминсульфата, для усиления трансдукции рекомбинантным ретровирусным вектором. В отдельных вариантах осуществления указанная комбинация включает три или более реагентов для трансдукции, включая простагландин E2 (PGE2), полоксамер и протаминсульфат. В отдельных вариантах осуществления указанная комбинация включает четыре или более реагентов для трансдукции, включая простагландин E2 (PGE2), полоксамер, фрагмент рекомбинантного фибронектина и протаминсульфат. Композиции и способы согласно настоящему изобретению особенно подходят для применения в генной терапии, включая лечение моногенных генетических заболеваний и расстройств. Способы согласно изобретению обладают тем преимуществом, что они приводят к снижению токсичности (большей выживаемости) трансдуцированной популяции клеток по сравнению с трансдукцией без усилителей трансдукции.

[0005] В одном из аспектов изобретения предложен способ генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий: приведение гемопоэтических клеток в контакт с полоксамером; приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с простагландином E2 (PGE2) или его производным; и приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором.

[0006] В одном из аспектов изобретения предложен способ генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий: обеспечение гемопоэтических клеток; приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с полоксамером; приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с простагландином E2 (PGE2) или его производным; и приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором.

[0007] В одном из вариантов осуществления рекомбинантный ретровирусный вектор представляет собой рекомбинантный лентивирусный вектор.

[0008] В одном из вариантов осуществления гемопоэтические клетки были подвергнуты манипуляциям.

[0009] В одном из вариантов осуществления стадия обеспечения включает обогащение CD34+ клетками.

[0010] В одном из вариантов осуществления гемопоэтические клетки были культивированы в сосудах, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина.

[0011] В одном из вариантов осуществления полоксамер выбран из группы, состоящей из полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

[0012] В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST).

[0013] В одном из вариантов осуществления PGE2 или его производное модифицированы.

[0014] В одном из вариантов осуществления PGE2 или его производное представляет собой 16,16-диметил-PGE2 (dmPGE2).

[0015] В одном из вариантов осуществления PGE2 или его производное не модифицированы.

[0016] В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с протаминсульфатом и/или фрагментом рекомбинантного фибронектина. В отдельных вариантах осуществления фрагмент рекомбинантного фибронектина может присутствовать в культуре в жидкой среде или может быть нанесен на чашку для культивирования. В отдельных вариантах осуществления клетки могут быть подвергнуты предварительной обработке путем культивирования на чашке, содержащей рекомбинантный фибронектин, и/или фрагмент рекомбинантного фибронектина может присутствовать в жидкой культуральной среде во время трансдукции.

[0017] В одном из вариантов осуществления стадии приведения в контакт проводят одновременно, или время их проведения частично совпадает.

[0018] В одном из вариантов осуществления концентрация PGE2 или его производного составляет 5-30 мкг/мл.

[0019] В одном из вариантов осуществления концентрация PGE2 или его производного составляет приблизительно 10 мкг/мл.

[0020] В одном из вариантов осуществления концентрация полоксамера составляет 200-1200 мкг/мл.

[0021] В одном из вариантов осуществления концентрация полоксамера составляет приблизительно 1000 мкг/мл.

[0022] В одном из вариантов осуществления концентрация протаминсульфата составляет 4-10 мкг/мл.

[0023] В одном из вариантов осуществления концентрация протаминсульфата составляет приблизительно 4 мкг/мл.

[0024] В одном из вариантов осуществления концентрация фрагмента рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin, составляет от приблизительно 5 до приблизительно 50 мкг/мл при использовании в культуре в жидкой среде.

[0025] В одном из вариантов осуществления концентрация фрагмента рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin, составляет приблизительно 20 мкг/мл при использовании в культуре в жидкой среде.

[0026] Во втором аспекте изобретения предложен способ усиления опосредованной рекомбинантным ретровирусным вектором генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий обработку указанных гемопоэтических клеток или приведение их в контакт ex vivo с эффективным количеством PGE2 или его производного и с эффективным количеством полоксамера; и подвергание указанных гемопоэтических клеток воздействию или приведение их в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий представляющий интерес ген, где эффективность вирусной трансдукции указанного рекомбинантного ретровирусного вектора повышена по сравнению с трансдукцией гемопоэтических клеток указанным рекомбинантным ретровирусным вектором в отсутствие PGE2 и полоксамера.

[0027] В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает обработку гемопоэтических клеток или приведение их в контакт ex vivo с эффективным количеством протаминсульфата и/или фрагмента рекомбинантного фибронектина.

[0028] В одном из вариантов осуществления представляющий интерес ген восполняет дефект в гене, связанный с моногенным генетическим заболеванием или расстройством.

[0029] В одном из вариантов осуществления представляющий интерес ген выбран из группы, состоящей из RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1. В частных вариантах осуществления представляющий интерес ген кодирует белок, кодируемый любым из этих генов, или кодирует функциональный фрагмент или вариант любого из этих генов. В частных вариантах осуществления ген или белок представляет собой ген или белок человека.

[0030] В одном из вариантов осуществления способ противодействует клиническим осложнениям или облегчает моногенное генетическое заболевание или расстройство.

[0031] В одном из вариантов осуществления моногенетическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из анемии Фанкони (включая любую из групп комплементации), дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы и инфантильного злокачественного остеопороза.

[0032] В одном из вариантов осуществления гемопоэтические клетки представляют собой CD34-обогащенные клетки, необязательно гемопоэтические клетки, клетки, полученные из костного мозга (BM), клетки, полученные из пуповинной крови (CB) или мобилизованные клетки периферической крови (mPB). В отдельных вариантах осуществления гемопоэтические клетки были получены от субъекта, подлежащего лечению рекомбинантно модифицированными гемопоэтическими клетками.

[0033] В третьем аспекте изобретения предложен способ опосредованной рекомбинантным ретровирусным вектором генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий получение CD34-обогащенных клеток из биологического образца (необязательно, периферической крови), полученного от субъекта, получавшего Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) или его аналог (необязательно, филграстим, сарграмостим или пегфилграстим) и/или плериксафор; и генетическую модификацию указанных CD34-обогащенных клеток рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген группы комплементации анемии Фанкони (FANC), ITGB2, пируваткиназу типа R, OSTM1, TCIRG1, CLCN7, OSTM1, или ген, кодирующий их функциональный вариант или фрагмент, и функционально связанную с ним последовательность активного в эукариотических клетках промотора; где стадия генетической модификации включает приведение указанных CD34-обогащенных клеток в контакт с указанным рекомбинантным ретровирусным вектором, PGE2 и полоксамером и, необязательно, с протаминсульфатом и/или фрагментом рекомбинантного фибронектина.

[0034] В изобретении предложен способ генетической модификации гемопоэтических клеток in vitro, опосредованной рекомбинантным ретровирусным вектором, включающий получение CD34-обогащенных клеток из биологического образца (необязательно, периферической крови), полученного от субъекта, получавшего Г-КСФ или его аналог (необязательно, филграстим, сарграмостим или пегфилграстим) и/или плериксафор; и генетическую модификацию указанных CD34-обогащенных клеток рекомбинантным ретровирусным вектором для заболевания или расстройства, выбранного из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы или инфантильного злокачественного остеопороза; где указанный рекомбинантный ретровирусный вектор содержит полинуклеотид, кодирующий ген группы комплементации анемии Фанкони (FANC), ITGB2, пируваткиназу типа R, CLCN7, OSTM1, TCIRG1, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A, или ген, кодирующий их функциональный вариант или фрагмент, и функционально связанную с ним последовательность активного в эукариотических клетках промотора; где стадия генетической модификации включает приведение указанных CD34-обогащенных клеток в контакт с PGE2 и полоксамером и, необязательно, с протаминсульфатом.

[0035] В изобретении предложен способ лечения моногенного генетического заболевания или расстройства у нуждающегося в этом субъекта, включающий предоставление указанному субъекту генетически модифицированных гемопоэтических клеток, экспрессирующих полипептид, отсутствующий или мутировавший вследствие указанного моногенного генетического заболевания или расстройства. В частных вариантах осуществления CD34-обогащенные клетки, полученные из биологического образца (необязательно, периферической крови), полученного от субъекта после проведения у указанного субъекта терапии Г-КСФ или его аналогом (необязательно, филграстимом, сарграмостимом или пегфилграстимом) и/или плериксафором, генетически модифицируют путем приведения их в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим кассету экспрессии, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую указанный полипептид, в присутствии по меньшей мере двух усилителей трансдукции, выбранных из простагландина E2 (PGE2), полоксамера, фрагмента рекомбинантного фибронектина и/или протаминсульфата, и полученные генетически модифицированные клетки предоставляют указанному субъекту. В отдельных вариантах осуществления заболевание или расстройство выбрано из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы или инфантильного злокачественного остеопороза; и рекомбинантный ретровирусный вектор содержит полинуклеотид, содержащий ген группы комплементации анемии Фанкони (FANC), ITGB2, пируваткиназу типа R, CLCN7, OSTM1, TCIRG1, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A, или ген, кодирующий их функциональный вариант или фрагмент, и функционально связанную с ним последовательность активного в эукариотических клетках промотора.

[0036] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения анемии Фанкони у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, полученных путем генетической модификации гемопоэтических клеток рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген группы комплементации анемии Фанкони (FANC) или ген, кодирующий его функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[0037] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения дефицита адгезии лейкоцитов I типа у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, полученных путем генетической модификации гемопоэтических клеток рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген ITGB2 или ген, кодирующий его функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[0038] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения дефицита пируваткиназы у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, полученных путем генетической модификации гемопоэтических клеток рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген пируваткиназы типа R или ген, кодирующий его функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[0039] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения инфантильного злокачественного остеопороза у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, полученных путем генетической модификации гемопоэтических клеток рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген CLCN7, OSTM1, TCIRG1, TNFSF11, PLEKHM1 или TNFRSF11A, или ген, кодирующий их функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[0040] В дополнительном связанном аспекте изобретения предложен способ получения популяции гемопоэтических клеток, содержащей по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% генетически модифицированных гемопоэтических клеток, включающий: приведение гемопоэтических клеток в контакт ex vivo с рекомбинантным ретровирусным вектором (необязательно, лентивирусным вектором), содержащим полинуклеотид, содержащий представляющий интерес ген или кодирующий представляющий интерес полипептид, где приведение в контакт происходит в присутствии PGE2 или его производного, необязательно PGE2 человека или 16,16-диметил-PGE2 (dmPGE2), и полоксамера, необязательно полоксамера 338 (LentiBOOST™). Клетки могут быть приведены в контакт с ретровирусным вектором в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения трансдукции клеток ретровирусным вектором, например, в подходящей культуральной среде в течение по меньшей мере одного часа, по меньшей мере двух часов, по меньшей мере четырех часов, по меньшей мере восьми часов, по меньшей мере двенадцати часов, по меньшей мере 16 часов или по меньшей мере 24 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют один раз или два раза подряд, например, после предварительной стимуляции, причем каждый цикл трансдукции составляет от 12 до 24 часов или от 16 до 18 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с ретровирусным вектором и усилителями трансдукции в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени. После трансдукции клетки могут быть включены в среду для заморозки (например, CryoStor CS5, BioLife Solutions, Ботелл, Вашингтон, США) и подвергнуты криоконсервации для последующего использования. В отдельных вариантах осуществления этого и других аспектов полоксамер выбран из группы, состоящей из полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407. В частных вариантах осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления PGE2 или его производное не модифицировано или модифицировано, например, 16,16-диметил-PGE2 (dmPGE2). В частных вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с протаминсульфатом и/или фрагментом рекомбинантного фибронектина. В некоторых вариантах осуществления концентрация PGE2 или его производного составляет 5-30 мкг/мл или приблизительно 10 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация полоксамера составляет 200-1200 мкг/мл или приблизительно 1000 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация протаминсульфата составляет 4-10 мкг/мл или приблизительно 4 мкг/мл. В отдельных вариантах осуществления полинуклеотид восполняет дефект в гене, связанный с моногенным генетическим заболеванием или расстройством. В отдельных вариантах осуществления представляющий интерес полипептид выбран из группы, состоящей из RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой моногенное генетическое заболевание или расстройство, например, выбранное из группы, состоящей из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы и инфантильного злокачественного остеопороза. В частных вариантах осуществления гемопоэтические клетки представляют собой CD34-обогащенные клетки или CD34+ гемопоэтические клетки, необязательно клетки, полученные из костного мозга (BM), клетки, полученные из пуповинной крови (CB) или мобилизованные клетки периферической крови (mPB). В некоторых вариантах осуществления популяция гемопоэтических клеток имеет VCN/клетку, равное по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0 или по меньшей мере 2,5.

[0041] В связанном аспекте изобретения предложена популяция гемопоэтических клеток, содержащая по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% генетически модифицированных гемопоэтических клеток, где указанная популяция клеток была получена раскрытым способом.

[0042] В еще одном связанном аспекте изобретения предложен способ лечения генетического заболевания или расстройства у нуждающегося в этом субъекта, включающий предоставление указанному субъекту популяции гемопоэтических клеток, содержащей по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% генетически модифицированных гемопоэтических клеток, где указанная популяция клеток была получена раскрытым способом, где указанные гемопоэтические клетки были получены от указанного субъекта до приведения их в контакт ex vivo с ретровирусным вектором, и где представляющий интерес ген кодирует функциональный полипептид, мутировавший или отсутствующий у указанного субъекта вследствие указанного генетического заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес полипептид выбран из группы, состоящей из RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой моногенное генетическое заболевание или расстройство, например, выбранное из группы, состоящей из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы и инфантильного злокачественного остеопороза. В частных вариантах осуществления гемопоэтические клетки представляют собой CD34-обогащенные клетки, необязательно клетки, полученные из костного мозга (BM), клетки, полученные из пуповинной крови (CB) или мобилизованные клетки периферической крови (mPB).

[0043] В различных вариантах осуществления любого из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, клетки трансдуцируют на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™. В различных вариантах осуществления любого из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™, до и/или во время трансдукции. В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют в жидкой среде, содержащей Retro-Nectin. В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, а также трансдуцируют в культуре в жидкой среде в присутствии фрагмента рекомбинантного фибронектина и других УТ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления клетки подвергают воздействию рекомбинантного фибронектина до воздействия других УТ во время трансдукции, а в некоторых вариантах осуществления клетки подвергают воздействию рекомбинантного фибронектина в одно время с воздействием других УТ или в течение частично совпадающего с ним периода времени.

[0044] В различных вариантах осуществления любого из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, клетки трансдуцируют в присутствии простагландина E2 (PGE2), полоксамера (например, LentiBoost™), фрагмента рекомбинантного фибронектина (например, RetroNectin™) и протаминсульфата.

[0045] Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения и охватываются ими.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0046] На ФИГ. 1 показан иллюстративный протокол трансдукции. Количества или комбинации УТ могут варьироваться. Криоконсервация является необязательной. Клетки могут быть использованы в свежем виде или после хранения в замороженном состоянии.

[0047] На ФИГ. 2A и 2B показаны результаты определения VCN для клеток в культуре в жидкой среде, трансдуцированных в присутствии PGE2. Для ФИГ. 2A при каждой показанной концентрации левый столбец относится к результатам для клеток, трансдуцированных 2,5х10⁷ TU/мл, а правый столбец относится к результатам для клеток, трансдуцированных 5х10⁷ TU/мл лентивирусного вектора.

[0048] На ФИГ. 3A-3C показаны результаты анализа КОК (ФИГ. 3A), определения VCN (ФИГ. 3B) и процента (%) трансдукции (ФИГ. 3C) в анализе КОК для клеток, трансдуцированных в присутствии PGE2.

[0049] На ФИГ. 4 показаны результаты определения VCN для клеток в культуре в жидкой среде, трансдуцированных в присутствии LentiBOOST.

[0050] На ФИГ. 5A-5C показаны результаты определения VCN и процента (%) трансдукции в анализе КОК для клеток, трансдуцированных с использованием LentiBOOST.

[0051] На ФИГ. 6 показаны результаты определения VCN для клеток в культуре в жидкой среде, трансдуцированных с использованием одного или более из LentiBOOST (LB), PGE2 и протаминсульфата (PS).

[0052] На ФИГ. 7A-7E показаны результаты анализа КОК для клеток, трансдуцированных с использованием одного или более из LentiBOOST (LB), PGE2 и протаминсульфата (PS) (ФИГ. 7A), определения VCN (ФИГ. 7B) и процента (%) трансдукции в анализе КОК для клеток, трансдуцированных в присутствии только PS, или LB, PGE2 и PS (ФИГ. 7C). На ФИГ. 7D и 7E показано влияние LB, PGE2 и PS на процент трансдукции (ФИГ. 7D) и VCN (ФИГ. 7E) КОК, полученных из различных источников CD34+, включая пуповинную кровь (CB-CD34+) и мобилизованную периферическую кровь (mPB-CD34+).

[0053] На ФИГ. 8 показаны результаты масштабирования трансдукции только с PS («без УТ») или с PS и усилителями трансдукции LB и PGE2 («с УТ»). Анализ VCN показан для клеток спустя 14 дней культивирования в жидкой среде.

[0054] На ФИГ. 9A-9C показаны результаты масштабирования трансдукции только с PS или PS с усилителями трансдукции LB и PGE2. На ФИГ. 9A показаны результаты анализа КОК. На ФИГ. 9B показаны результаты по VCN в КОЕ. Результаты показаны для бурстобразующих единиц эритроидного ряда (BFU-E), гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (CFU-GM) и миелоидных предшественников (CFU-GM). На ФИГ. 9C показана эффективность трансдукции в КОК.

[0055] На ФИГ. 10A и 10B показаны результаты in vivo для трансдуцированных CD34+ клеток только с PS или PS с усилителями трансдукции LB и PGE2, трансплантированных иммунодефицитным мышам NSG. Показан процент (%)CD45-положительных (hCD45⁺) клеток человека (ФИГ. 10A) и VCN/клетку (ФИГ. 10B). Результат показан через один (1), два (2) или три (3) месяца после трансплантации (мпт).

[0056] На ФИГ. 11 показано VCN в культуре в жидкой среде для партии LV GMP с (+УТ) усилителями трансдукции LB и PGE2 при MOI, равной 20 или 50, или без них (-УТ).

[0057] На ФИГ. 12A-12D показаны колониеобразующие единицы (КОЕ) для всех клеток (ФИГ. 12A), BFU (ФИГ. 12B), GM (ФИГ. 12C) и смешанных миелоидных предшественников (ФИГ. 12D) для партии LV GMP с (+УТ) усилителями трансдукции LB и PGE2 или без них (-УТ).

[0058] На ФИГ. 13A и 13B показано VCN в КОЕ для партии LV GMP с (+УТ) усилителями трансдукции LB и PGE2 или без них (-УТ) для бурстобразующих единиц эритроидного ряда (BFU-E), гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (CFU-GM) и миелоидных предшественников (CFU-GM) при MOI 20 (ФИГ. 13A) и MOI 50 (ФИГ. 13B).

[0059] На ФИГ. 14A и 14B показано VCN и эффективность трансдукции в КОЕ с (+УТ) усилителями трансдукции LB и PGE2 при MOI 20 (ФИГ. 14A) и MOI 50 (ФИГ. 14B), или без них (-УТ).

[0060] ФИГ. 15 представляет собой схематическую карту вектора для переноса pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO.

[0061] ФИГ. 16 представляет собой схематическую карту вектора для переноса pCCL-ChimhCD18W-82-RO.

[0062] ФИГ. 17 представляет собой схематическую карту вектора для переноса pCCL-PGK-coRPKW-82-RO.

[0063] ФИГ. 18 представляет собой схематическую карту вектора для переноса pRRL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0064] Настоящее изобретение относится к композициям и способам генетической модификации гемопоэтических клеток. В частности, изобретение относится к применению комбинации двух или более из простагландина E2 (PGE2), полоксамера, фрагмента рекомбинантного фибронектина и/или протаминсульфата для усиления трансдукции рекомбинантным ретровирусным вектором. Композиции и способы согласно настоящему изобретению особенно подходят для применения в генной терапии, включая лечение моногенных заболеваний и расстройств. Сложности, ограничивавшие успех генной терапии, включая низкую эффективность трансдукции, решаются с помощью предложенных в настоящем документе композиций и способов.

A. Определения

[0065] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится данное изобретение. Хотя при практическом осуществлении настоящего изобретения могут быть использованы методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, подходящие методы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упомянутые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки. В случае противоречий преимущественную силу имеет настоящее описание, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры, описанные в настоящем документе, являются лишь иллюстративными и не подразумевают ограничительного характера.

[0066] В различных вариантах осуществления, предусмотренных в настоящем документе, будут использоваться, если специально не указано иное, обычные методы из области химии, биохимии, органической химии, молекулярной биологии, микробиологии, технологии рекомбинантных ДНК, генетики, иммунологии и клеточной биологии, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области техники, и многие из таких методов описаны ниже с целью иллюстрации. Такие методы полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, updated July 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; а также монографии в таких журналах, как Advances in Immunology, каждый из которых прямо включен в настоящий документ посредством ссылки.

[0067] В контексте настоящего документа термин «приблизительно» или «около» относится к количеству, уровню, значению, числу, частоте, проценту, измерению, размеру, величине, массе или длине, которые варьируются на вплоть до 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от референсного количества, уровня, значения, числа, частоты, процента, измерения, размера, величины, массы или длины. В частных вариантах осуществления термины «приблизительно» или «около», предшествующие численному значению, означают указанное значение плюс или минус диапазон, равный 15%, 10%, 5% или 1%.

[0068] «Трансфекция» относится к процессу введения голой ДНК в клетки невирусными методами.

[0069] «Инфицирование» относится к процессу введения чужеродной ДНК в клетки с использованием вирусного вектора.

[0070] «Трансдукция» относится к введению чужеродной ДНК в геном клетки с использованием вирусного вектора.

[0071] «Число копий вектора» или «VCN» относится к числу копий вектора в образце, деленному на число клеток. Обычно число копий вектора определяют с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) с использованием зонда к последовательности Psi встроенного провируса, а число клеток определяют с помощью кПЦР с использованием зонда к гену домашнего хозяйства человека, для которого будет присутствовать две копии на клетку (по одной на хромосому).

[0072] «Эффективность трансдукции» относится к проценту клеток, трансдуцированных по меньшей мере одной копией провируса. Например, если 1 x 10⁶ клеток подвергаются воздействию вируса, и определено, что 0,5 x 10⁶ клеток имеют хотя бы одну копию вируса в своем геноме, то эффективность трансдукции составляет 50%. Примером способа определения эффективности трансдукции является проточная цитометрия.

[0073] В контексте настоящего документа термин «ретровирус» или «ретровирусный» относится к РНК-вирусу, который осуществляет обратную транскрипцию своей геномной РНК в линейную двухцепочечную копию ДНК, и затем ковалентно встраивает свою геномную ДНК в геном хозяина. Ретровирусные векторы являются общепринятым инструментом для доставки генов (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). После того, как вирус встраивается в геном хозяина, его называют «провирусом». Провирус служит матрицей для РНК-полимеразы II и управляет экспрессией молекул РНК, кодируемых вирусом.

[0074] Иллюстративные ретровирусы (семейство Retroviridae) включают, не ограничиваясь перечисленным: (1) род гаммаретровирусов, например, вирус мышиного лейкоза Молони (M-MuLV), вирус мышиной саркомы Молони (MoMSV), вирус рака молочной железы мышей (MuMTV), вирус лейкоза гиббонов (GaLV) и вирус лейкоза кошачьих (FLV), (2) род спумавирусов, например, обезьяний пенистый вирус, (3) род лентивирусов, например, вирус иммунодефицита человека-1 и вирус иммунодефицита обезьян.

[0075] В контексте настоящего документа термин «лентивирусный» или «лентивирус» относится к группе (или роду) сложных ретровирусов. Иллюстративные лентивирусы включают, не ограничиваясь перечисленным: ВИЧ (вирус иммунодефицита человека); включая ВИЧ 1 типа и ВИЧ 2 типа; вирус висна-маеди (VMV); вирус артрита-энцефалита коз и овец (CAEV); вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV); вирус иммунодефицита кошачьих (FIV); вирус иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV); и вирус иммунодефицита обезьян (SIV). В одном из вариантов осуществления предпочтительными являются векторные остовы на основе ВИЧ (т. е. цис-действующие элементы последовательности ВИЧ).

[0076] Ретровирусные векторы и, в частности, лентивирусные векторы, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящего изобретения. Соответственно, подразумевается, что термин «ретровирусный вектор» в контексте настоящего документа включает «лентивирусный вектор»; и термин «ретровирус» в контексте настоящего документа включает «лентивирус».

[0077] Термин «вектор» в контексте настоящего документа обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить или транспортировать другую молекулу нуклеиновой кислоты. Переносимая нуклеиновая кислота обычно связана с молекулой нуклеиновой кислоты вектора, например, встроена в нее. Вектор может включать последовательности, управляющие автономной репликацией или обратной транскрипцией в клетке, или может включать последовательности, достаточные для встраивания в ДНК клетки-хозяина. Подходящие векторы включают вирусные векторы. Подходящие вирусные векторы включают, например, дефектные по репликации ретровирусы и лентивирусы.

[0078] Термин «вирусный вектор» может относиться либо к вектору, либо к векторной частице, способной переносить нуклеиновую кислоту в клетку, или к самой переносимой нуклеиновой кислоте. Вирусные векторы содержат структурные и/или функциональные генетические элементы, которые в основном происходят из вируса. Термин «ретровирусный вектор» относится к вирусному вектору, содержащему структурные и функциональные генетические элементы или их части, которые в основном происходят из ретровируса. Термин «лентивирусный вектор» относится к вирусному вектору, содержащему структурные и функциональные генетические элементы или их части, включая LTR, которые в основном происходят из лентивируса. Термин «гибрид» относится к вектору, LTR или другой нуклеиновой кислоте, содержащим как ретровирусные, например, лентивирусные, последовательности, так и нелентивирусные вирусные последовательности. В одном из вариантов осуществления гибридный вектор относится к вектору или плазмиде для переноса, содержащим ретровирусные, например, лентивирусные, последовательности для обратной транскрипции, репликации, встраивания и/или упаковки.

[0079] В частных вариантах осуществления термины «лентивирусный вектор» и «лентивирусный вектор экспрессии» могут использоваться для обозначения лентивирусных плазмид для переноса и/или инфекционных лентивирусных частиц. Если в настоящем документе делается ссылка на такие элементы, как сайты клонирования, промоторы, регуляторные элементы, гетерологичные нуклеиновые кислоты и т. д., следует иметь в виду, что последовательности этих элементов присутствуют в форме РНК в лентивирусных частицах согласно изобретению и присутствуют в форме ДНК в ДНК-плазмидах согласно изобретению.

[0080] Согласно некоторым частным вариантам осуществления большая часть или все последовательности остова вирусного вектора происходят из лентивируса, например, ВИЧ-1. Однако следует иметь в виду, что может быть использовано множество различных источников лентивирусных последовательностей, и в некоторых из лентивирусных последовательностей может быть сделано множество замен и изменений, не оказывающих отрицательного влияния на способность вектора для переноса выполнять описанные в настоящем документе функции. Более того, в данной области техники известно множество лентивирусных векторов, см. Naldini et al., (1996a, 1996b и 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, патенты США № 6,013,516 и 5,994,136, многие из которых могут быть адаптированы для получения вирусного вектора или плазмиды для переноса согласно настоящему изобретению.

[0081] В контексте настоящего документа термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» в общем смысле относятся к биополимеру, содержащему нуклеотидные мономеры, ковалентно связанные в цепь, такую как ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид относится к геномной ДНК (гДНК), комплементарной ДНК (кДНК) или ДНК. Полинуклеотиды включают одно- и двухцепочечные полинуклеотиды, рекомбинантные, синтетические или выделенные. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид относится к матричной РНК (мРНК), РНК, геномной РНК (гРНК), плюс-цепи РНК (РНК (+)), минус-цепи РНК (РНК (-)). В контексте настоящего документа термины «полирибонуклеотид» или «рибонуклеиновая кислота» также относятся к матричной РНК (мРНК), РНК, геномной РНК (гРНК), плюс-цепи РНК (РНК (+)), минус-цепи РНК (РНК (-)). Предпочтительно полинуклеотиды согласно изобретению включают полинуклеотиды или варианты, обладающие по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности любой из референсных последовательностей, описанных в настоящем документе (см., например, Перечень последовательностей), как правило, где вариант сохраняет по крайней мере одну биологическую активность референсной последовательности. В различных иллюстративных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотидные последовательности вирусных векторов и плазмид для переноса, и содержащие их композиции. В частных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие один или более терапевтических полипептидов и/или другие представляющие интерес гены. В частных вариантах осуществления полинуклеотиды, кодирующие терапевтический полипептид, включают, не ограничиваясь перечисленным, гены RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой кодон-оптимизированные варианты любого из этих генов. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды кодируют полипептид человека или его функциональный фрагмент или вариант, такой как, например, полипептид, кодируемый любым из раскрытых генов.

[0082] В контексте настоящего документа «псевдотипированный» вектор относится к вектору, имеющему рекомбинантный белок капсида или оболочки, который отличается от белка капсида или оболочки нативного вектора. Например, псевдотипированный VSVG лентивирусный вектор представляет собой вектор, созданный путем совместной экспрессии в пакующей клеточной линии белка оболочки вируса VSVG с РНК-геномом вируса таким образом, чтобы обеспечить включение белка оболочки VSVG в вирусные частицы, содержащие РНК-геном. Псевдотипированные векторы могут иметь измененный тропизм и/или пониженную иммуногенность, что делает их желательными для применения в генной терапии. Создание псевдотипированного вектора, а также изменение псевдотипирования вектора путем создания вирусных частиц в другой пакующей клеточной линии или путем совместной экспрессии белка оболочки (или белка капсида) из плазмиды или другой ДНК, кодирующей другой белок оболочки (или белок капсида), находится в компетенции специалистов в данной области техники. Примеры способов представлены в Cronin et al. Curr. Gene Ther. 5:387-398 (2005). В некоторых вариантах осуществления способы согласно изобретению включают использование псевдотипированных рекомбинантных ретровирусных векторов (например, лентивирусных векторов). В некоторых вариантах осуществления псевдотипированные рекомбинантные ретровирусные векторы псевдотипированы VSVG.

[0083] Под «усиливать», или «способствовать», или «увеличивать», или «расширять» обычно понимается способность композиций и/или способов, рассматриваемых в настоящем документе, вызывать, быть причиной или продуцировать большее количество трансдуцированных клеток по сравнению с количеством клеток, трансдуцированных либо носителем, либо контрольной молекулой/композицией, либо вызвать, быть причиной или продуцировать более высокое VCN в популяции трансдуцированных клеток. В одном из вариантов осуществления гемопоэтическая стволовая клетка или клетка-предшественник, трансдуцированная композициями и способами, рассматриваемыми в настоящем документе, характеризуется увеличением количества трансдуцированных клеток по сравнению с существующими композициями и способами для трансдукции, или характеризуется увеличением VCN в популяции трансдуцированных клеток. Увеличение трансдукции клеток может быть установлено с использованием способов, известных в данной области техники, таких как, среди прочего, репортерные анализы, ПЦР в реальном времени и экспрессия белков клеточной поверхности. «Увеличенная» или «усиленная» величина трансдукции обычно является «статистически значимой» величиной и может включать увеличение в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, в 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные значения между ними и выше 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т. д.) по сравнению с количеством клеток, трансдуцированных носителем, контрольной композицией или другим методом трансдукции.

[0084] Под «уменьшать» или «понижать», или «убавлять», или «снижать», или «ослаблять» обычно понимаются композиции или способы, обеспечивающие сравнительно меньшее количество трансдуцированных клеток по сравнению с клетками, трансдуцированными с помощью композиций и/или способов согласно настоящему изобретению. «Уменьшенная» или «сниженная» величина трансдукции обычно является «статистически значимой» величиной и может включать уменьшение в 1,1, 1,2, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 или более раз (например, в 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные значения между ними и выше 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 и т. д.) по сравнению с количеством трансдуцированных клеток (референсный ответ), полученных с помощью композиций и/или способов согласно настоящему изобретению.

[0085] Под «поддерживать», или «сохранять», или «поддержание», или «отсутствие изменений», или «без существенных изменений», или «без существенного уменьшения» обычно понимают физиологический ответ, сопоставимый с ответом, вызванным носителем, контрольной молекулой/композицией, или ответом в определенной клетке. Сопоставимый ответ представляет собой ответ, по существу не отличающийся или не отличающийся в поддающейся измерению степени от референсного ответа.

[0086] В нижеследующем описании изложены определенные частные подробности, чтобы обеспечить полное понимание различных иллюстративных вариантов осуществления изобретения, предусмотренных в настоящем документе. Однако специалисту в данной области техники будет понятно, что частные иллюстративные варианты осуществления могут быть реализованы на практике без этих подробностей. Кроме того, следует иметь в виду, что отдельные векторы или группы векторов, полученные из различных комбинаций описанных в настоящем документе структур и заместителей, раскрыты в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждый вектор или группа векторов были указаны по отдельности. Таким образом, выбор конкретных структур векторов или конкретных заместителей находится в пределах объема настоящего изобретения.

[0087] В контексте настоящего документа «X-VIVO 20» или «X-VIVO» относятся к бессывороточной среде с химически определенным составом для гемопоэтических клеток X-VIVO™ 20, доступной от Lonza®. Могут быть использованы среды, отличные от X-VIVO 20, и специалисты в данной области техники способны выбрать подходящие среды для выращивания и трансдукции клеток.

[0088] В контексте настоящего документа «rhSCF» относится к рекомбинантному фактору стволовых клеток человека.

[0089] В контексте настоящего документа «rhTPO» относится к рекомбинантному тромбопоэтину человека.

[0090] В контексте настоящего документа «rh-FLT3-L» относится к рекомбинантному лиганду fms-подобной тирозинкиназы 3 человека.

[0091] В контексте настоящего документа «IL-3» или «rhIL-3» относится к рекомбинантному интерлейкину-3 человека.

[0092] В контексте настоящего документа «PGE2» относится к простагландину E2 (PGE2), также известному как динопростон.

[0093] В контексте настоящего документа «полоксамер» относится к неионогенным триблок-сополимерам, состоящим из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)) с двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)) по бокам.

[0094] В контексте настоящего документа «фрагмент рекомбинантного фибронектина» относится к любому фрагменту белка фибронектина, который способствует повышению эффективности трансдукции. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что фрагмент рекомбинантного фибронектина способствует колокализации лентивируса или ретровируса с клетками-мишенями. Примером фрагмента рекомбинантного фибронектина является фрагмент CH296 фибронектина человека, имеющий торговое наименование RetroNectin™.

[0095] Концентрации PGE2 или его производного, полоксамера или протаминсульфата, приведенные в описании и формуле изобретения, относятся к концентрации каждого агента в среде, в которой культивируются клетки.

[0096] В контексте настоящего документа «LB» или «LentiBoost» относится к усилителю трансдукции LentiBOOST™, доступному от Sirion Biotech®. Синонимы включают полоксамер 338, F108 и Kolliphor® P338.

[0097] В контексте настоящего документа «HSA» относится к сывороточному альбумину человека.

[0098] В контексте настоящего документа «ДМСО» относится к диметилсульфоксиду.

[0099] В контексте настоящего документа «КОК» относится к колониеобразующим клеткам. Анализ колониеобразующих клеток (КОК) используется для изучения характера пролиферации и дифференцировки гемопоэтических предшественников по их способности образовывать колонии в полутвердой среде. Количество и морфология колоний, образованных фиксированным количеством исходных клеток, дают предварительную информацию о способности предшественников к дифференцировке и пролиферации. Примеры анализов представлены в Sarma et al. Colony forming cell (CFC) assay for human hematopoietic cells. J Vis Exp. 2010 Dec 18;(46).

[00100] В контексте настоящего документа «LC» относится к «культуре в жидкой среде».

[00101] В контексте настоящего документа «КОЕ» относится к колониеобразующим единицам. КОЕ считается синонимом КОК, но иногда используется в отношении типов КОЕ, растущих в полутвердых средах.

[00102] В контексте настоящего документа «TU» относится к трансдуцирующим единицам. TU/мл представляет собой общепринятую меру функционального титра ретровирусного (лентивирусного) препарата.

[00103] В контексте настоящего документа «PS» относится к протаминсульфату.

[00104] В контексте настоящего документа «УТ» относится к одному или более усилителям трансдукции.

[00105] В контексте настоящего документа «свежие клетки CB» относится к свежим клеткам пуповинной крови.

[00106] В контексте настоящего документа «MOI» относится к множественности заражения.

[00107] В контексте настоящего документа «BFU-E» относится к бурстобразующим единицам эритроидного ряда (BFU-E), самым ранним эритроидным предшественникам.

[00108] В контексте настоящего документа «CFU-GM» относится к колониеобразующим единицам гранулоцитарно-макрофагальных предшественников.

[00109] В контексте настоящего документа «CFU-GEMM» относится к колониеобразующим единицам миелоидных стволовых клеток (гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов, мегакариоцитов).

[00110] В контексте настоящего документа «mPB» относится к мобилизованным клеткам периферической крови.

[00111] В контексте настоящего документа «SCGM» относится к бессывороточной среде SCGM (питательная среда для стволовых клеток) от CellGenix®.

[00112] Термины «введение» или «предоставление» в контексте настоящего документа относятся к доставке популяции гемопоэтических клеток субъекту, например, путем инфузии указанной популяции клеток субъекту внутриартериально или внутривенно. Популяция гемопоэтических клеток может быть введена в различных растворах, таких как физиологический раствор. В некоторых вариантах осуществления используемый раствор будет изотоничным крови субъекта и иметь забуференный pH.

[00113] Обычно клетка называется «трансдуцированной» после введения вирусным вектором или векторной частицей гетерологичной ДНК (например, вектора или его кассеты экспрессии) в геном указанной клетки.

[00114] Термин «клетка-хозяин» в контексте настоящего документа относится к клетке, трансдуцированной вирусным вектором или векторной частицей. Следует иметь в виду, что термин «клетка-хозяин» относится к исходной трансдуцированной клетке и ее потомству.

[00115] Термины «лечение», «лечить» и тому подобные в настоящем документе в общем смысле означают достижение желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, например, снижения вероятности того, что заболевание или его симптом возникнет у субъекта, и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или нежелательного явления, связанного с заболеванием. «Лечение» в контексте настоящего документа охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего и включает: (a) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к его развитию, но у которого оно еще не было диагностировано; (b) подавление заболевания, т. е. остановку его развития; или (c) облегчение заболевания, т. е. способствование регрессии заболевания. Терапевтический агент может быть введен до, во время или после начала заболевания или травмы. Особый интерес представляет лечение текущего заболевания, при котором лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы у пациента. Такое лечение желательно проводить до полной утраты функции в пораженных тканях. Желательно, чтобы рассматриваемая терапия проводилась во время симптоматической стадии заболевания, а в некоторых случаях - после симптоматической стадии заболевания.

[00116] Термины «индивидуум», «хозяин», «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, включая, не ограничиваясь перечисленным, человека и нечеловекообразных приматов, включая обезьян и людей; животных для спорта из числа млекопитающих (например, лошадей); сельскохозяйственных животных из числа млекопитающих (например, овец, коз и т. д.); домашних животных из числа млекопитающих (собак, кошек и т. д.); и грызунов (например, мышей, крыс и т. д.).

B. Варианты осуществления и вариации

[00117] Ниже описаны различные композиции и способы. Хотя в настоящем документе приведены примеры частных вариантов композиций и способов, понятно, что любая из ряда альтернативных композиций и способов применима и подходит для применения при практическом осуществлении раскрытых в настоящем документе композиций и способов. Также ясно, что оценку конструкций экспрессии и способов, раскрытых в настоящем документе, можно проводить с использованием процедур, являющихся стандартными в данной области техники.

1. Трансдукция с использованием комбинаций усилителей трансдукции

[00118] В настоящем изобретении предложены обеспечивающие преимущества способы трансдукции гемопоэтических клеток лентивирусными векторами с получением популяции гемопоэтических клеток, имеющих высокий процент клеток, трансдуцированных лентивирусным вектором. Эти способы особенно предпочтительны для трансдукции гемопоэтических клеток с помощью лентивирусных векторов для генной терапии для исправления генетического дефекта, поскольку они позволяют получить большое количество клеток, экспрессирующих функциональный продукт скорректированного гена, введенного лентивирусным вектором для генной терапии.

[00119] В данной области техники известны различные усилители трансдукции, включая полибрен, протаминсульфат, ретронектин (фрагмент рекомбинантного фибронектина) и ДЭАЭ-декстран. В некоторых случаях в качестве усилителей трансдукции использовали поликатионные агенты, такие как полибрен. Denning et al. Mol Biotechnol. 2013 Mar; 53(3): 308-314. Кроме того, в качестве усилителей трансдукции используются рапамицин и циклоспорин А. Однако в настоящем изобретении обнаружены определенные комбинации усилителей трансдукции, которые обеспечивают значительно более высокие уровни лентивирусной трансдукции гемопоэтических клеток по сравнению с использованием каждого из таких усилителей трансдукции по отдельности.

[00120] В одном из аспектов изобретения предложен способ генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий: приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с по меньшей мере двумя усилителями трансдукции, выбранными из простагландина E2 (PGE2) или его производного, полоксамера, протаминсульфата и фрагмента рекомбинантного фибронектина; и приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором. Клетки могут быть приведены в контакт с ретровирусным вектором в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения трансдукции клеток ретровирусным вектором, например, в подходящей культуральной среде в течение по меньшей мере одного часа, по меньшей мере двух часов, по меньшей мере четырех часов, по меньшей мере восьми часов, по меньшей мере двенадцати часов или по меньшей мере 16 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют один раз или два раза подряд, например, после предварительной стимуляции, причем каждый цикл трансдукции составляет от 12 до 24 часов или от 16 до 18 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с ретровирусным вектором и усилителями трансдукции в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с усилителями трансдукции и рекомбинантным ретровирусным вектором в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени. В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер и PGE2 или его производное, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер и протаминсульфат, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер, PGE2 и протаминсульфат, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат простагландин E2 (PGE2) или его производное, полоксамер, протаминсульфат и фрагмент рекомбинантного фибронектина, или состоят из них. В различных вариантах осуществления любого из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, клетки трансдуцируют на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™. В различных вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™, до и/или во время трансдукции. В отдельных вариантах осуществления способ включает предварительную стимуляцию путем культивирования клеток на планшетах, покрытых приблизительно 2 мкг/см² RetroNectin™ (RN). В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют в жидкой среде, содержащей Retro-Nectin™. В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, а также трансдуцируют в культуре в жидкой среде в присутствии фрагмента рекомбинантного фибронектина и других УТ.

[00121] В одном из аспектов изобретения предложен способ генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий: обеспечение гемопоэтических клеток; приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с по меньшей мере двумя усилителями трансдукции, выбранными из простагландина E2 (PGE2) или его производного, полоксамера (например, полоксамера 338 (LentiBOOST™)), протаминсульфата и фрагмента рекомбинантного фибронектина; и приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором. В частных вариантах осуществления клетки приводят в контакт с усилителями трансдукции и рекомбинантным ретровирусным вектором в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени. В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер и PGE2 или его производное. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер и протаминсульфат, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер, PGE2 и протаминсульфат, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат простагландин E2 (PGE2) или его производное, полоксамер, протаминсульфат и фрагмент рекомбинантного фибронектина, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат простагландин E2 (PGE2) или его производное, полоксамер, протаминсульфат и фрагмент рекомбинантного фибронектина, или состоят из них. В различных вариантах осуществления любого из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, клетки трансдуцируют на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™. В различных вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™, до и/или во время трансдукции. В отдельных вариантах осуществления способ включает предварительную стимуляцию путем культивирования клеток на планшетах, покрытых приблизительно 2 мкг/см² RetroNectin™ (RN). В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют в жидкой среде, содержащей Retro-Nectin™. В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, а также трансдуцируют в культуре в жидкой среде в присутствии фрагмента рекомбинантного фибронектина и других УТ.

[00122] В различных вариантах осуществления способов, раскрытых в настоящем документе, популяцию клеток культивируют в присутствии ретровирусного вектора, одного или более агентов, стимулирующих сигнальный путь рецептора простагландина EP, и полоксамера, имеющего среднюю молекулярную массу приблизительно 10000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с усилителями трансдукции и рекомбинантным ретровирусным вектором в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени.

[00123] В различных вариантах осуществления способов, раскрытых в настоящем документе, популяцию клеток культивируют в присутствии ретровирусного вектора, одного или более агентов, стимулирующих сигнальный путь рецептора простагландина EP, и полоксамера, имеющего среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц более приблизительно 2250 дальтон и содержащего более приблизительно 40% полиэтиленоксида. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с усилителями трансдукции и рекомбинантным ретровирусным вектором в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени.

[00124] В частных вариантах осуществления способов, раскрытых в настоящем документе, клетки трансдуцируют в среде, содержащей комбинацию трех усилителей трансдукции: полоксамера 338 (LentiBOOST), PGE2 и протаминсульфата, например, в жидкой среде. Клетки могут быть прикреплены к чашке для культивирования, или клетки могут не быть прикреплены к чашке для культивирования. В частных вариантах осуществления клетки приводят в контакт с усилителями трансдукции и рекомбинантным ретровирусным вектором в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени. В отдельных вариантах осуществления способ включает предварительную стимуляцию путем культивирования клеток на планшетах, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™ (RN). В отдельных вариантах осуществления клетки трансдуцируют на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™. В различных вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™, до и/или во время трансдукции. В отдельных вариантах осуществления способ включает предварительную стимуляцию путем культивирования клеток на планшетах, покрытых приблизительно 2 мкг/см² RetroNectin™ (RN). В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют в жидкой среде, содержащей Retro-Nectin™. В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, а также трансдуцируют в культуре в жидкой среде в присутствии фрагмента рекомбинантного фибронектина и других УТ.

[00125] В связанном аспекте изобретения предложен способ усиления опосредованной рекомбинантным ретровирусным вектором генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий обработку гемопоэтических клеток или приведение их в контакт ex vivo с эффективным количеством комбинации двух или более усилителей трансдукции, где по меньшей мере два из указанных усилителей трансдукции выбраны из PGE2 или его производного, полоксамера, протаминсульфата и фрагмента рекомбинантного фибронектина. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с PGE2 или его производным и эффективным количеством полоксамера; и приводят в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий представляющий интерес ген, где эффективность вирусной трансдукции указанного ретровирусного вектора повышена по сравнению с трансдукцией гемопоэтических клеток указанным рекомбинантным ретровирусным вектором в отсутствие указанной комбинации усилителей трансдукции, например, PGE2 и полоксамера. В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер и PGE2 или его производное. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат полоксамер и протаминсульфат, или состоят из них. В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает обработку гемопоэтических клеток или приведение их в контакт ex vivo с эффективным количеством протаминсульфата. В отдельных вариантах осуществления два или более усилителей трансдукции содержат простагландин E2 (PGE2) или его производное, полоксамер, протаминсульфат и фрагмент рекомбинантного фибронектина, или состоят из них. В различных вариантах осуществления любого из аспектов и вариантов осуществления, раскрытых в настоящем документе, клетки трансдуцируют на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™. В различных вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™, до и/или во время трансдукции. В отдельных вариантах осуществления способ включает предварительную стимуляцию путем культивирования клеток на планшетах, покрытых приблизительно 2 мкг/см² RetroNectin™ (RN). В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют в жидкой среде, содержащей Retro-Nectin™. В некоторых вариантах осуществления клетки подвергают предварительной обработке путем культивирования на чашках, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, а также трансдуцируют в культуре в жидкой среде в присутствии фрагмента рекомбинантного фибронектина и других УТ.

[00126] В отдельных вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с раствором или культуральной средой, содержащими два или более усилителей трансдукции. Раствор или культуральная среда могут дополнительно содержать рекомбинантный ретровирусный вектор, или рекомбинантный ретровирусный вектор может быть добавлен после приведения клеток в контакт с раствором или культуральной средой, содержащей усилители трансдукции. В частных вариантах осуществления клетки присутствуют в чашке для культивирования, содержащей раствор или культуральную среду. В частных вариантах осуществления чашка для культивирования покрыта фрагментом рекомбинантного фибронектина. Клетки могут быть приведены в контакт с ретровирусным вектором в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения трансдукции клеток ретровирусным вектором, например, в подходящей культуральной среде в течение по меньшей мере одного часа, по меньшей мере двух часов, по меньшей мере четырех часов, по меньшей мере восьми часов, по меньшей мере двенадцати часов или по меньшей мере 16 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки трансдуцируют один раз или два раза подряд, например, после предварительной стимуляции, причем каждый цикл трансдукции составляет от 12 до 24 часов или от 16 до 18 часов. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с ретровирусным вектором и усилителями трансдукции в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени.

[00127] В отдельных вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером. В одном из вариантов осуществления полоксамер выбран из группы, состоящей из полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). LentiBOOST™может быть использован в конечной концентрации от приблизительно 50 мкг/мл до приблизительно 1500 мкг/мл, от приблизительно 500 мкг/мл до приблизительно 1500 мкг/мл, от приблизительно 750 мкг/мл до приблизительно 1250 мкг/мл, приблизительно 900 мкг/мл, приблизительно 900 мкг/мл, приблизительно 950 мкг/мл, приблизительно 1000 мкг/мл, приблизительно 1050 мкг/мл, приблизительно 1100 мкг/мл или приблизительно 1150 мкг/мл.

[00128] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления PGE2 или его производное модифицированы. В одном из вариантов осуществления PGE2 или его производное представляет собой диметилированный PGE2. В одном из вариантов осуществления диметилированный PGE2 представляет собой 16,16-диметилпростагландин E2. 16,16-диметилпростагландин E2 имеет следующую структуру (представленную как «скелетная структура», которую также называют «линейно-угловой (line-angle) формулой» или «упрощенной формулой»):

Молекулярная формула: C₂₂H₃₆O₅

[00129] В некоторых вариантах осуществления PGE2 или его производное не модифицированы.

[00130] В некоторых вариантах осуществления PGE2 или его производное могут быть использованы в конечной концентрации от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 200 мкМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 20 мкМ, от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 40 мкМ, от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 60 мкМ, от приблизительно 60 мкМ до приблизительно 80 мкМ, приблизительно 5 мкМ, приблизительно 10 мкМ, приблизительно 15 мкМ, приблизительно 20 мкМ, приблизительно 25 мкМ, приблизительно 30 мкМ, приблизительно 35 мкМ или приблизительно 40 мкМ. PGE2 или его производное могут быть использованы в конечной концентрации от приблизительно 0,3 мкМ до приблизительно 70 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 7 мкг/мл до приблизительно 13 мкг/мл, от приблизительно 13 мкг/мл до приблизительно 20 мкг/мл, от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 26 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 7 мкг/мл, приблизительно 8 мкг/мл, приблизительно 9 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 11 мкг/мл, приблизительно 12 мкг/мл, приблизительно 13 мкг/мл, приблизительно 14 мкг/мл или приблизительно 15 мкг/мл.

[00131] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов способ включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с протаминсульфатом. Протаминсульфат может быть использован в конечной концентрации от приблизительно 4 мкг/мл до приблизительно 15 мкг/мл, от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл, или приблизительно 5 мкг/мл, приблизительно 6 мкг/мл, приблизительно 7 мкг/мл, приблизительно 8 мкг/мл, приблизительно 9 мкг/мл, приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 11 мкг/мл, приблизительно 12 мкг/мл, приблизительно 13 мкг/мл, приблизительно 14 мкг/мл или приблизительно 15 мкг/мл, или более. В отдельных вариантах осуществления протаминсульфат может быть использован в конечной концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл или приблизительно 5 мкг/мл.

[00132] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером 338 и PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 900 мкг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00133] В некоторых вариантах осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 950 мкг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 950 мкг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00134] В некоторых вариантах осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 1000 мкг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1000 мкг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00135] В некоторых вариантах осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 1050 мкг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1050 мкг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00136] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером 338 и PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 0,5 мг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 0,5 мг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00137] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером 338 и PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 1 мг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 1 мг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00138] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером 338 и PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 2 мг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 2 мг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00139] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером 338 и PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях приблизительно 4 мг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00140] В некоторых вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с полоксамером 338 и PGE2 или его производным. В одном из вариантов осуществления полоксамер 338 и PGE2 или его производное используют в конечных концентрациях от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 2 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или приблизительно 900 мкг/мл и приблизительно 3 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 4 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 5 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 6 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 7 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 8 мкг/мл, соответственно, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл и приблизительно 9 мкг/мл, соответственно. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления протаминсульфат может необязательно быть использован в конечной концентрации от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 7 мкг/мл, от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, от приблизительно 3 мкг/мл до приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл, приблизительно 3 мкг/мл, приблизительно 4 мкг/мл, приблизительно 5 мкг/мл, или приблизительно 6 мкг/мл.

[00141] В предпочтительных вариантах осуществления клетки трансдуцируют лентивирусным вектором в среде, содержащей полоксамер 338 в концентрации от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл; PGE2 в концентрации от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл; и протаминсульфат в концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл. В варианте с прикреплением подложку в некоторых случаях покрывают фрагментом CH296 фибронектина человека, имеющим торговое наименование RetroNectin™, с использованием раствора RetroNectin™ в концентрации от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 100 мкг/мл.

[00142] В предпочтительных вариантах осуществления клетки приводят в контакт с полоксамером 338 в концентрации от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл; PGE2 в концентрации от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл; и протаминсульфатом в концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до приблизительно 10 мкг/мл.

[00143] В предпочтительных вариантах осуществления клетки трансдуцируют лентивирусным вектором в среде, содержащей полоксамер 338 в концентрации приблизительно 1 мг/мл; PGE2 в концентрации приблизительно 10 мкМ; и протаминсульфат в концентрации приблизительно 4 мкг/мл. В варианте с прикреплением подложку в некоторых случаях покрывают фрагментом CH296 фибронектина человека, имеющим торговое наименование RetroNectin™, с использованием раствора RetroNectin™ в концентрации приблизительно 20 мкг/мл. В отдельных вариантах осуществления чашки для культивирования покрывают 2 мкг/см² RetroNectin™. В отдельных вариантах осуществления способ включает предварительную стимуляцию путем культивирования клеток на планшетах, покрытых фрагментом рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™ (RN).

[00144] В предпочтительных вариантах осуществления клетки приводят в контакт с полоксамером 338 в концентрации приблизительно 1 мг/мл; PGE2 в концентрации приблизительно 10 мкМ; и протаминсульфатом в концентрации приблизительно 4.

[00145] Дополнительные иллюстративные варианты осуществления представлены в таблице 1 и таблице 2. Любая из указанных комбинаций и концентраций усилителей трансдукции может быть использована в соответствии с раскрытыми способами, а также с другими типами клеток. Кроме того, любая из указанных комбинаций может быть использована дополнительно в комбинации с рекомбинантным фибронектином, таким как RetroNectin™, например, когда чашки для культивирования, используемые для трансдукции, покрыты RetroNectin™.

[00146] В некоторых вариантах осуществления стадии приведения в контакт проводят одновременно, или время их проведения частично совпадает.

[00147] В некоторых вариантах осуществления концентрация PGE2 или его производного составляет 5-30 мкг/мл.

[00148] В некоторых вариантах осуществления концентрация PGE2 или его производного составляет приблизительно 10 мкг/мл.

[00149] В некоторых вариантах осуществления концентрация полоксамера составляет 200-1200 мкг/мл.

[00150] В некоторых вариантах осуществления концентрация полоксамера составляет приблизительно 1000 мкг/мл.

[00151] В некоторых вариантах осуществления концентрация протаминсульфата составляет 4-10 мкг/мл.

[00152] В некоторых вариантах осуществления концентрация протаминсульфата составляет приблизительно 4 мкг/мл.

[00153] В некоторых вариантах осуществления гемопоэтические клетки были культивированы или культивируются в сосудах, покрытых рекомбинантным фибронектином или его фрагментом, который повышает эффективность трансдукции. Фрагмент рекомбинантного фибронектина (например, фрагмент CH296 фибронектина человека, имеющий торговое наименование RetroNectin™) способствует колокализации лентивируса или ретровируса с клетками-мишенями и повышает эффективность трансдукции.

[00154] В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с фрагментом рекомбинантного фибронектина, полоксамером и PGE2.

[00155] В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с фрагментом рекомбинантного фибронектина, полоксамером и протаминсульфатом. В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с фрагментом рекомбинантного фибронектина, полоксамером, PGE2 и протаминсульфатом.

[00156] В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение гемопоэтических клеток в контакт с фрагментом рекомбинантного фибронектина, PGE2 и протаминсульфатом.

[00157] В отдельных вариантах осуществления любого из раскрытых в настоящем документе способов клетки приводят в контакт с усилителями трансдукции в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени. В отдельных вариантах осуществления клетки также приводят в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором, например, в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени, как в случае приведения клеток в контакт с усилителями трансдукции. В отдельных вариантах осуществления клетки присутствуют в сосудах, содержащих раствор или культуральную среду, где в указанных сосудах и/или культуральных средах присутствуют усилители трансдукции.

Простагландины

[00158] Простагландины в целом относятся к гормоноподобным молекулам, которые являются производными жирных кислот, содержащими 20 атомов углерода, включая 5-углеродное кольцо, как описано в настоящем документе и известно в данной области техники. Простагландин E2 (PGE2), также известный как динопростон, представляет собой природный простагландин, применяемый в качестве лекарственного средства. PGE2 имеет следующую структуру (представленную как «скелетная структура», которую также называют «линейно-угловой (line-angle) формулой» или «упрощенной формулой»):

Молекулярная формула PGE2: C₂₂H₃₆O₅

[00159] Было показано, что простагландин E2 (PGE2) увеличивает уровень лентивирусной доставки трансгенов в культуре CD34+ клеток ex vivo. Heffner et al. Mol Ther. 2018 Jan 3;26(1):320-328.

[00160] Иллюстративные примеры «аналогов» или «производных» PGE2 включают, не ограничиваясь перечисленным, 16,16-диметил-PGE₂ (dmPGE₂), пара-(пара-ацетамидобензамидо)фениловый эфир 16-16-диметил-PGE₂, 11-дезокси-16,16-диметил-PGE₂, 9-дезокси-9-метилен-16,16-диметил-PGE₂, 9-дезокси-9-метилен-PGE₂, 9-кетофлупростенол, 5-транс-PGE₂, 17-фенил-омега-тринор-PGE₂, PGE₂-сериноламид, сложный метиловый эфир PGE₂, 16-фенилтетранор-PGE₂, 15(S)-15-метил-PGE₂, 15(R)-15-метил-PGE₂, 8-изо-15-кето-PGE₂, изопропиловый сложный эфир 8-изо-PGE₂, 20-гидрокси-PGE₂, ноклопрост, сульпростон, бутапрост, 15-кето-PGE₂ и 19(R)-гидрокси-PGE₂.

[00161] В настоящем документе также рассматриваются аналоги или производные простагландина, имеющие аналогичную PGE2 структуру, замещенные галогеном в положении 9 (см., например, заявку WO 2001/12596, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки), а также 2-декарбокси-2-фосфиновые производные простагландина, такие как описанные в публикации заявки на патент США № 2006/0247214, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

Полоксамеры

[00162] Полоксамеры представляют собой неионогенные триблок-сополимеры, состоящие из центральной гидрофобной цепи полиоксипропилена (поли(пропиленоксида)) с двумя гидрофильными цепями полиоксиэтилена (поли(этиленоксида)) по бокам. Полоксамеры также известны под торговыми наименованиями Synperonics, ® Pluronics® и Kolliphor®. Поскольку длину полимерных блоков можно регулировать, существует множество различных полоксамеров. Полоксамеры обычно обозначают буквой P (от слова полоксамер), за которой следуют три цифры: первые две цифры, умноженные на 100, дают приблизительную молекулярную массу полиоксипропиленового ядра, а последняя цифра, умноженная на 10, дает процентное содержание полиоксиэтилена (например, P407 = полоксамер с молекулярной массой полиоксипропилена 4000 г/моль и содержанием полиоксиэтилена 70%).

[00163] В частных вариантах осуществления полоксамер имеет среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц, равную по меньшей мере приблизительно 2750 дальтон. В частных вариантах осуществления полоксамер имеет среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц, равную по меньшей мере приблизительно 3250 дальтон. В частных вариантах осуществления полоксамер имеет среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц, равную по меньшей мере приблизительно 4000 дальтон или по меньшей мере приблизительно 10000 дальтон.

[00164] В частных вариантах осуществления полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% полиэтиленоксида. В частных вариантах осуществления полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 60% полиэтиленоксида. В частных вариантах осуществления полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 70% полиэтиленоксида. В частных вариантах осуществления полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 80% полиэтиленоксида.

[00165] В частных вариантах осуществления полоксамер имеет среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц, равную по меньшей мере приблизительно 2750 дальтон, и полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 40% полиэтиленоксида. В частных вариантах осуществления полоксамер имеет среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц, равную по меньшей мере приблизительно 2750 дальтон, и полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% полиэтиленоксида. В частных вариантах осуществления полоксамер имеет среднюю молекулярную массу полипропиленовых субъединиц, равную по меньшей мере приблизительно 3250 дальтон, и полоксамер содержит по меньшей мере приблизительно 50% полиэтиленоксида.

[00166] В отдельных вариантах осуществления полоксамер выбран из группы, состоящей из полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 288. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 335. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 407. В одном из вариантов осуществления рекомбинантный ретровирусный вектор представляет собой рекомбинантный лентивирусный вектор.

[00167] Недавно было показано, что полоксамер F108 улучшает трансдукцию гемопоэтических клеток. Hoefig et al. J Gene Med. 2012 Aug;14(8):549-60; патент США № 9,771,599. Включение полоксамера в стандартный протокол трансдукции гемопоэтических стволовых клеток (HSC) дает высокие эффективности трансдукции, обеспечивая при этом сохранение способности трансдуцированных HSC к дифференцировке в различные гемопоэтические линии. Hauber at al. Hum Gene Ther Methods. 2018 Apr;29(2):104-113.

Фрагмент рекомбинантного фибронектина

[00168] Фрагмент рекомбинантного фибронектина может представлять собой любой фрагмент белка фибронектина, например, фибронектина человека, который способствует повышению эффективности трансдукции. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что фрагмент рекомбинантного фибронектина способствует колокализации лентивируса или ретровируса с клетками-мишенями. Примером фрагмента рекомбинантного фибронектина является фрагмент CH296 фибронектина человека, имеющий торговое наименование RetroNectin™.

Гемопоэтические клетки

[00169] Гемопоэтические клетки, которые могут быть трансдуцированы в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе, включают любые гемопоэтические клетки или их популяцию. В отдельных вариантах осуществления гемопоэтические клетки являются гемопоэтическими клетками млекопитающего, например, человека, полученными от млекопитающего. В отдельных вариантах осуществления гемопоэтические клетки получены от человека, подлежащего лечению гемопоэтическими клетками после их трансдукции в соответствии со способом, раскрытым в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления гемопоэтические клетки были обогащены CD34+ клетками. В отдельных вариантах осуществления гемопоэтические клетки представляют собой CD34-обогащенные популяции клеток, полученные из биологического образца, полученного от субъекта. В одном из вариантов осуществления биологический образец представляет собой образец костного мозга. В еще одном варианте осуществления биологический образец представляет собой периферическую кровь. В еще одном варианте осуществления биологический образец представляет собой пуповинную кровь.

[00170] В частных вариантах осуществления биологический образец, например, периферическую кровь, получают от субъекта после мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (HSC). В одном из вариантов осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют путем проведения у субъекта терапии Г-КСФ или его аналогом. HSC и клетки-предшественники (HSPC) в периферической крови могут быть мобилизованы до взятия биологического образца. HSC и HSPC периферической крови могут быть мобилизованы любым способом, известным в данной области техники. HSC и HSPC периферической крови могут быть мобилизованы путем проведения у субъекта терапии любым агентом(ами), описанным в настоящем документе или известным в данной области техники, который увеличивает количество HSPC, циркулирующих в периферической крови субъекта. Например, в частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем проведения у субъекта терапии одним или более цитокинами или факторами роста (например, Г-КСФ, kit-лигандом (KL), IL-I, IL-7, IL-8, IL-11, лигандом Flt3, SCF, тромбопоэтином или ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором) (таким как сарграмостим)). Различные типы Г-КСФ, которые могут быть использованы в способах мобилизации периферической крови, включают филграстим и Г-КСФ пролонгированного действия пэгфилграстим. В частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем проведения у субъекта терапии одним или более хемокинами (например, макрофагальным белком воспаления-1a (MIP1a/CCL3)), лигандами хемокиновых рецепторов (например, лигандами хемокинового рецептора-2 GROl3 и GR013M), аналогами хемокиновых рецепторов (например, аналогами белка фактора стромальных клеток-1a (SDF-1a), такими как CTCE-0021, CTCE-0214, или SDF-1a, таким как Met-SDF-113), или антагонистами хемокиновых рецепторов (например, антагонистами хемокинового (мотив C-X-C) рецептора 4 (CXCR4), такими как AMD3100). В частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем проведения у субъекта терапии одним или более агентами против интегриновой сигнализации (например, блокирующим антителом к очень позднему антигену 4 (VLA-4) или антителом к молекуле адгезии сосудистого эндотелия 1 типа (VCAM-1)). В частных вариантах осуществления периферическую кровь мобилизуют путем проведения у субъекта терапии одним или более цитотоксическими лекарственными средствами, такими как циклофосфамид, этопозид или паклитаксел. В частных вариантах осуществления периферическая кровь может быть мобилизована путем введения субъекту одного или более агентов, перечисленных выше, в течение определенного периода времени. Например, у субъекта может быть проведена терапия одним или более агентами (например, Г-КСФ) посредством инъекции (например, подкожной, внутривенной или внутрибрюшинной) раз в сутки или два раза в сутки за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней до сбора HSPC. В частных вариантах осуществления HSPC собирают в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часов после последней дозы агента, используемого для мобилизации HSPC в периферическую кровь. В частных вариантах осуществления HSC и HSPC мобилизуют путем проведения у субъекта терапии двумя или более разными типами агентов, описанных выше или известных в данной области техники, например, фактором роста (например, Г-КСФ) и антагонистом хемокинового рецептора (например, антагонистом рецептора CXCR4, таким как AMD3100), или фактором роста (например, Г-КСФ или KL) и анти-интегриновым агентом (например, блокирующим антителом к VLA-4). В одном из вариантов осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют путем проведения у субъекта терапии Г-КСФ или его аналогом. В одном из вариантов осуществления Г-КСФ представляет собой филграстим. В одном из вариантов осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют путем проведения у субъекта терапии плериксафором. В отдельном варианте осуществления HSC и/или клетки-предшественники мобилизуют с помощью комбинации филграстима и плериксафора, филграстимом в отдельности или плериксафором в отдельности. В частных вариантах осуществления различные типы мобилизующих агентов вводят одновременно или последовательно. Для получения дополнительной информации относительно способов мобилизации периферической крови см., например, Craddock et al., 1997, Blood 90(12):4779-4788; Jin et al., 2008, Journal of Translational Medicine 6:39; Pelus, 2008, Curr. Opin. Hematol. 15(4):285-292; Papayannopoulou et al., 1998, Blood 91(7):2231-2239; Tricot et al., 2008, Haematologica 93(11):1739-1742; и Weaver et al., 2001, Bone Marrow Transplantation 27(2):S23-S29).

[00171] В отдельных вариантах осуществления периферическую кровь получают через шприц или катетер, вводимый в вену субъекта. Например, периферическая кровь может быть собрана с помощью аппарата для афереза. Кровь течет из вены через катетер в аппарат для афереза, который отделяет лейкоциты, включая HSPC, от остальной крови, а затем возвращает оставшуюся кровь в организм пациента. Аферез можно проводить в течение нескольких часов несколько дней подряд (например, от 1 до 5 дней), пока не будет собрано достаточное количество HSPC.

[00172] В отдельных вариантах осуществления костный мозг получают из заднего гребня подвздошной кости субъекта путем пункционной аспирации (см., например, Koda et al., 1984, J. Clin Invest. 73:1377-1384).

[00173] В отдельных вариантах осуществления может быть определен уровень гематокрита биологического образца. Уровень гематокрита может быть определен путем центрифугирования образца в камере для обработки для образования слоя эритроцитов образца, чтобы можно было определить объем осажденных эритроцитов. Следует учесть, что образец может быть объединен с антикоагулянтом для облегчения определения уровня гематокрита, и что такой антикоагулянт может быть добавлен в камеру для обработки до или во время центрифугирования. В качестве альтернативы, уровень гематокрита может быть определен путем измерения оптических свойств образца. Например, для анализа образца можно использовать спектрометр. Следует учесть, что можно использовать любой тип известных спектроскопических методов определения уровня гематокрита, таких как, например, рамановская спектроскопия и/или методы светорассеяния.

[00174] В отдельных вариантах осуществления биологический образец обеднен эритроцитами, например, перед получением одной или более популяций клеток, обогащенных CD34+ клетками, из биологического образца. В некоторых вариантах осуществления клетки, оставшиеся после проведения процедур обеднения, промывают. В еще одном варианте к промытым клеткам добавляют неспецифический IgG. В некоторых вариантах осуществления неспецифический IgG представляет собой флебогамму.

[00175] В некоторых случаях два или более биологических образцов смешивают перед селекцией CD34+, включая, например, образцы костного мозга, собранные в разное время, например, с интервалом в 1, 2, 3, 4 или более дней, или с интервалом в 1, 2 или 3 недели, или с интервалом в 1, 2 или 3 месяца, или с интервалом в несколько лет, включая другие промежутки времени.

Обогащение гемопоэтических клеток CD34+ клетками

[00176] В некоторых вариантах осуществления гемопоэтические клетки представляют собой CD34-положительные гемопоэтические клетки. Обычно клетки CD34+ получают обогащением по CD34 при высокой строгости селекции. В качестве альтернативы или дополнительно к обогащению при высокой строгости селекции может быть проведено обогащение по CD34 при низкой строгости селекции.

[00177] В контексте настоящего документа «высокая строгость селекции» или «условия высокой строгости» относятся к способу обогащения популяцией клеток, предназначенному для достижения значительного обогащения клеток клетками, экспрессирующими определенный биологический маркер, например, CD34. Например, обогащение CD34 «при высокой строгости селекции» при использовании в клинических условиях дает средний выход CD34⁺ клеток 61,6% и медианный выход 65,7%, и среднюю относительную чистоту 88,5% и медианную относительную чистоту 95,9% (N=166) (Clin Lab. 2016 Jul 1;62(7):1243-1248 (PMID: 28164638)). «Высокая строгость селекции» относится к процессу, направленному на существенное обогащение относительно редким типом клеток, CD34+, который обычно составляет 0,2-2% клеточного продукта лейкофереза с мобилизацией или образца костного мозга. Обогащение по CD34+ клеткам при высокой строгости селекции из продукта лейкофереза с мобилизацией или образца костного мозга направлено на получение конечных процентных содержаний CD34+, увеличенных с 0,2-2% до > 80%. Для этого после первоначального нанесения биологического образца на матрицу захвата проводят повторные замены буфера, называемые в настоящем документе «промывками», с целью удаления клеток, слабо или неспецифически связанных с матрицей захвата. Как правило, клетки удаляют из матрицы захвата и наносят повторно для каждого цикла промывки. Удаление и повторное нанесение может выполняться вручную путем отбирания раствора из пробирок с помощью пипетки или автоматически с использованием системы насоса и трубок. Например, при использовании MagCloudz® от Quad Technologies в сочетании с системой магнитной сепарации клеток Dynabeads® комплексы клетка-магнитная частица отделяются в пробирках на магнитном штативе, а промывку выполняют вручную. При использовании системы CliniMACS® от Miltenyi Biotec предварительно настроенная автоматизированная программа загружает комплексы клетка-магнитная частица в магнитную колонку посредством набора трубок, и промывки/повторные загрузки выполняются с помощью системы клапанного насоса. В отдельных вариантах осуществления селекция в условиях высокой строгости может быть проведена на различных приборах, включая, не ограничиваясь перечисленным, MACSQuant Tyto® от Miltenyi Biotec, MagCloudz® от Quad Technologies, систему разделения клеток Sepax® от GE, систему разделения клеток Elutra® от Terumo, клеточный сепаратор COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Lovo® от Fresenius-Kabi, систему CliniMACS® от Miltenyi Biotec или систему CliniMACS Prodigy®. Селекцию можно проводить в лаборатории или в месте оказания медицинской помощи. Подробные методы подготовки и обогащения клеток и популяций клеток, включая иллюстративные методы селекции CD34+ клеток в условиях высокой строгости, описаны, например, в публикации международной заявки WO 2016/118780. Иллюстративный метод селекции, подходящий для селекции высокой строгости, предоставлен в патенте США № 8,727,132. Дополнительные иллюстративные методы селекции приведены в международной патентной заявке PCT/US2019/027083, в частности, в примере 1.

[00178] В протоколе обогащения при высокой строгости селекции биологический образец, содержащий CD34+ клетки, помечают реагентом для мечения CD34, например, напрямую конъюгированными иммуномагнитными микросферами. Биологический образец может быть суспендирован в любой подходящей жидкости, такой как, не ограничиваясь перечисленным, натрий-фосфатный буфер (PBS) с, необязательно, этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) при рН буфера и изотоничности, совместимых с жизнеспособностью клеток. В некоторых случаях используемая жидкость также содержит сывороточный альбумин человека в подходящей концентрации, например, приблизительно 2,5%. При помощи технологии магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) биологический образец после мечения загружают в колонку, содержащую магниточувствительный или ферромагнитный материал. С помощью системы MACS магниточувствительный или ферромагнитный материал колонки удерживает целевые клетки, не влияя на способность нецелевых клеток проходить через колонку и выходить из нее. Такие магниточувствительные или ферромагнитные материалы включают железо, сталь, кобальт, никель и другие ферромагнитные редкоземельные металлы или их сплавы. Специалистам в данной области техники будет понятно, что такие материалы можно легко намагничивать и размагничивать. В некоторых вариантах осуществления биологический образец повторно пропускают через магниточувствительный или ферромагнитный материал один или несколько раз. После загрузки колонки связанные клетки промывают, элюируют и/или повторно загружают в колонку при медленной скорости для повышения чистоты обогащенной фракции. Подходящие промывочные буферы включают PBS с (необязательно) ЭДТА и (необязательно) сывороточным альбумином человека. Любой компонент меченого биологического образца, который удаляется во время этапов промывки, собирают в пакет для отходов или «нецелевой» пакет. После подходящих стадий промывки обогащенные при высокой строгости селекции клетки элюируют в пакет для целевых клеток.

[00179] В протоколе обогащения при низкой строгости селекции биологический образец, содержащий CD34+ клетки, помечают реагентом для мечения CD34, например, напрямую конъюгированными иммуномагнитными микросферами. При помощи технологии магнитно-активированной сортировки клеток (MACS) биологический образец после мечения загружают в колонку, содержащую магниточувствительный или ферромагнитный материал, при более низкой скорости потока, чем при обогащении при высокой строгости селекции. Как и в случае обогащения при высокой строгости селекции, магниточувствительный или ферромагнитный материал колонки удерживает целевые клетки, не влияя на способность нецелевых клеток проходить через колонку и выходить из нее. В некоторых вариантах осуществления биологический образец повторно пропускают через магниточувствительный или ферромагнитный материал один или несколько раз. После загрузки колонки для обогащения при низкой строгости селекции связанные клетки промывают при более низкой степени строгости селекции. Затем связанные клетки элюируют в пакет для сбора.

[00180] В иллюстративном варианте осуществления обогащение при низкой строгости селекции проводят путем модификации стандартной рабочей процедуры системы MACS так, чтобы системная программа «режима обеднения», предназначенная для достижения обеднения при высокой строгости селекции (т. е. удаления целевых клеток), вместо этого приводила к обогащению при низкой строгости селекции. Работа системы MACS в режиме обеднения вызывает связывание целевых клеток в биологическом образце с магниточувствительным или ферромагнитным материалом в колонке с использованием медленной загрузки колонки и этапов промывки при более низкой строгости селекции, чем при работе в режиме обогащения. Нецелевые клетки вымываются системой MACS в промывочный или так называемый «целевой» пакет. Затем программа режима обеднения переключает выпускной клапан, чтобы направить жидкость в так называемый «нецелевой» пакет, а затем размагничивает колонку. Продолжающаяся загрузка жидкости в размагниченную колонку приводит к элюированию обогащенной CD34+ популяции клеток, которая была обогащена в условиях низкой строгости, в так называемый «нецелевой» пакет, в котором с помощью этого метода собирают целевые клетки.

[00181] Специалисты в данной области техники поймут, что метод обогащения при низкой строгости селекции может быть проведен на различных приборах, включая, не ограничиваясь перечисленным, MACSQuant Tyto® от Miltenyi Biotec, MagCloudz® от Quad Technologies, систему разделения клеток Sepax® от GE, систему разделения клеток Elutra® от Terumo, клеточный сепаратор COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Lovo® от Fresenius-Kabi, систему CliniMACS® от Miltenyi Biotec или систему CliniMACS Prodigy®. Специалисты в данной области техники смогут без проведения излишних экспериментов перепрограммировать программное обеспечение такой системы MACS таким образом, чтобы выходной клапан направлял поток начальной стадии связывания в пакет для отходов или «нецелевой» пакет (а не в целевой пакет), и направлял элюированную CD34-обогащенную при низкой строгости селекции популяцию в «целевой» пакет. В результате обогащение при низкой строгости селекции затем проводится в режиме разделения без обычных стадий промывки общепринятых программ MACS.

[00182] В контексте настоящего документа «низкая строгость селекции» или «условия низкой строгости» относятся к способу обогащения популяции клеток, предназначенному для достижения обогащения клеток клетками, экспрессирующими определенный биологический маркер, например, CD34, таким образом, что сохраняется более высокий выход обогащенной популяции клеток, чем достигаемый при селекции высокой строгости, за счет обогащения клетками, экспрессирующими биологический маркер, по сравнению с другими клетками в биологическим образце, т. е., пониженное обогащение. По определению кратность обогащения в условиях высокой строгости больше, чем кратность обогащения в условиях низкой строгости. Кратность обогащения клетками, например, CD34+ клетками, в (CD34 или другой маркер)-обогащенной при высокой строгости селекции популяции клеток в некоторых случаях составляет в 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75 или в 4 раза больше, чем кратность обогащения CD34+ клетками в (CD34 или другой маркер)-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток. В одном из вариантов осуществления кратность обогащения клетками, например, CD34+ клетками, в (CD34 или другой маркер)-обогащенной при высокой строгости селекции популяции клеток составляет в 2-4 раза больше, чем кратность обогащения CD34+ клетками в (CD34 или другой маркер)-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток. В отдельных вариантах осуществления селекция в условиях низкий строгости может быть проведена на различных приборах, включая, не ограничиваясь перечисленным, MACSQuant Tyto® от Miltenyi Biotec, MagCloudz® от Quad Technologies, систему разделения клеток Sepax® от GE, систему разделения клеток Elutra® от Terumo, клеточный сепаратор COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Lovo® от Fresenius-Kabi, систему CliniMACS® от Miltenyi Biotec или систему CliniMACS Prodigy®. Селекцию можно проводить в лаборатории или в месте оказания медицинской помощи. Иллюстративные методы обогащения клетками в условиях низкой строгости приведены в международной патентной заявке PCT/US2019/027083, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.

[00183] Популяции клеток, обогащенные CD34+ клетками, могут быть получены путем селекции CD34+ клеток в условиях высокой строгости и/или в условиях низкой строгости с получением тем самым CD34-обогащенной при высокой строгости селекции популяции клеток и/или CD34-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток. Методы селекции CD34+ клеток могут представлять собой позитивную селекцию, негативную селекцию или их комбинацию. В отдельных вариантах осуществления биологический образец, полученный от субъекта, делят на два образца, один из которых используют для получения CD34-обогащенной при высокой строгости селекции популяции клеток, а другой - для получения CD34-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток. В других вариантах осуществления биологический образец, полученный от субъекта, сначала подвергают селекции CD34+ при низкой строгости для получения CD34-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток, а затем часть указанной CD34-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток подвергают селекции CD34+ при высокой строгости для получения CD34-обогащенной при высокой строгости селекции популяции клеток. Селекцию можно применять последовательно, например, селекция CD34-обогащенных клеток в условиях низкой строгости может быть применена первой, с последующей селекцией из полученной популяции дополнительно CD34-обогащенных клеток в условиях высокой строгости. В других случаях селекция CD34-обогащенных клеток в условиях высокой строгости может быть применена первой, с последующей селекцией из остаточной популяции CD34-обогащенных клеток в условиях низкой строгости. В некоторых случаях популяции клеток могут быть разделены таким образом, что селекция низкой строгости или высокой строгости применяется к части клеток, ранее подвергнутой селекции высокой строгости или низкой строгости. В некоторых случаях один биологический образец делят на два или более образцов перед селекцией CD34-обогащенных клеток в условиях низкой или высокой строгости.

[00184] В каждом случае предполагается селекция высокой строгости или низкой строгости до или после смешивания или разделения биологических образцов или обогащенных популяций клеток во всех возможных сочетаниях. В отдельных вариантах осуществления способ включает получение CD34-обогащенной при высокой строгости селекции популяции клеток из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем селекции CD34⁺ клеток в условиях высокой строгости; и получение CD34-обогащенной при низкой строгости селекции популяции клеток из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем селекции CD34⁺ клеток в условиях низкой строгости.

Трансдуцированные гемопоэтические клетки

[00185] Как более подробно описано в разделе примеров, популяции гемопоэтических клеток, трансдуцированных в присутствии комбинации раскрытых в настоящем документе усилителей трансдукции, например, протаминсульфата, PGE2 или его производного и полоксамера (например, LentiBOOST), проявляют превосходные свойства по сравнению с гемопоэтическими клетками, трансдуцированными без указанной комбинации усилителей трансдукции. В отдельных вариантах осуществления клетки также были трансдуцированы в присутствии фрагмента рекомбинантного фибронектина, например, RetroNectin™. В частных вариантах осуществления трансдуцированные гемопоэтические клетки или их популяция обладают одним или более из следующего: увеличенное VCN, увеличенное VCN/клетку, увеличенный процент генно-модифицированных КОЕ и увеличенный процент генно-модифицированных КОК. В некоторых вариантах осуществления усиливается восстановление представляющего интерес гена. В частных вариантах осуществления для пациентов с LAD-1 процент (%) CD18⁺ клеток увеличивается после трансдукции лентивирусным вектором, содержащим ген CD18, по сравнению с трансдукцией без PGE2 или полоксамера, или по сравнению с трансдукцией без какого-либо усилителя трансдукции или только с одним усилителем трансдукции.

[00186] В некоторых вариантах осуществления раскрытых способов процент гемопоэтических клеток, генетически модифицированных данным способом, увеличен по меньшей мере в 1,5 раза, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 2,5 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 3,5 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз или по меньшей мере в 8 раз по сравнению с процентом гемопоэтических клеток, генетически модифицированных тем же вирусным вектором без обработки клеток PGE2 или полоксамером, или по сравнению с процентом гемопоэтических клеток, генетически модифицированных тем же вирусным вектором при обработке клеток только одним усилителем трансдукции.

[00187] В некоторых вариантах осуществления способ трансдукции гемопоэтических клеток ретровирусным (например, лентивирусным) вектором обеспечивает популяцию гемопоэтических клеток, имеющую VCN/клетку, равное по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0 или по меньшей мере 2,5. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта включает предоставление указанному субъекту популяции трансдуцированных гемопоэтических клеток, имеющей VCN/клетку, равное по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0 или по меньшей мере 2,5.

[00188] В некоторых вариантах осуществления способ трансдукции гемопоэтических клеток ретровирусным вектором обеспечивает популяцию гемопоэтических клеток, характеризующуюся эффективностью трансдукции, равной по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100%. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта включает предоставление указанному субъекту популяции трансдуцированных гемопоэтических клеток, характеризующейся эффективностью трансдукции, равной по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100%.

[00189] В некоторых вариантах осуществления способ трансдукции гемопоэтических клеток ретровирусным вектором обеспечивает популяцию гемопоэтических клеток, имеющую процент трансдуцированных колониеобразующих клеток, равный по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100%. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта включает предоставление указанному субъекту популяции трансдуцированных гемопоэтических клеток, имеющей процент трансдуцированных колониеобразующих клеток, равный по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100%.

[00190] В некоторых вариантах осуществления изобретения предложена популяция гемопоэтических клеток, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусным вектором (например, лентивирусным вектором), имеющая VCN/клетку, равное по меньшей мере 1,0, по меньшей мере 1,5, по меньшей мере 2,0 или по меньшей мере 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложена популяция гемопоэтических клеток, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусным вектором (например, лентивирусным вектором), характеризующаяся эффективностью трансдукции, равной по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100%.

[00191] В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ получения популяции гемопоэтических клеток, содержащей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 71%, по меньшей мере 72%, по меньшей мере 73%, по меньшей мере 74%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 77%, по меньшей мере 78%, по меньшей мере 79%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 81%, по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94% или по меньшей мере 95% генетически модифицированных гемопоэтических клеток, включающий: приведение гемопоэтических клеток в контакт ex vivo с рекомбинантным ретровирусным вектором (необязательно, лентивирусным вектором), содержащим полинуклеотид, содержащий представляющий интерес ген или кодирующий представляющий интерес полипептид, где приведение в контакт происходит в присутствии PGE2 или его производного, необязательно PGE2 человека или 16,16-диметил-PGE2 (dmPGE2), и полоксамера, необязательно полоксамера 338 (LentiBOOST™). Клетки могут быть приведены в контакт с ретровирусным вектором в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения трансдукции клеток ретровирусным вектором, например, в подходящей культуральной среде в течение по меньшей мере одного часа, по меньшей мере двух часов, по меньшей мере четырех часов, по меньшей мере восьми часов или по меньшей мере двенадцати часов. В некоторых вариантах осуществления клетки приводят в контакт с ретровирусным вектором и усилителями трансдукции в одно и то же время или в течение частично совпадающего периода времени.

[00192] Способы согласно изобретению обладают тем преимуществом, что они приводят к снижению токсичности (большей выживаемости) трансдуцированной популяции клеток по сравнению с трансдукцией без усилителей трансдукции. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложен способ получения популяции гемопоэтических клеток, в котором токсичность по сравнению с трансдукцией без усилителя трансдукции снижена по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 11%, по меньшей мере на 12%, по меньшей мере на 13%, по меньшей мере на 14%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 16%, по меньшей мере на 17%, по меньшей мере на 18%, по меньшей мере на 19%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 21%, по меньшей мере на 22%, по меньшей мере на 23%, по меньшей мере на 24%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 26%, по меньшей мере на 27%, по меньшей мере на 28%, по меньшей мере на 29%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 31%, по меньшей мере на 32%, по меньшей мере на 33%, по меньшей мере на 34% или по меньшей мере на 35%.

Векторы и кассеты экспрессии

[00193] Любой подходящий рекомбинантный ретровирусный вектор, который находит применение для доставки полинуклеотидных последовательностей в клетки млекопитающих, охватывается рекомбинантными ретровирусными векторами согласно настоящему изобретению. Например, вектор может содержать одноцепочечную или двухцепочечную нуклеиновую кислоту, например, одноцепочечную или двухцепочечную ДНК. Например, рекомбинантный ретровирусный вектор может представлять собой ДНК. Вектор может содержать одноцепочечную или двухцепочечную РНК, включая модифицированные формы РНК. В еще одном примере рекомбинантный ретровирусный вектор может представлять собой РНК, например, мРНК или модифицированную мРНК.

[00194] В частных вариантах осуществления рекомбинантный ретровирусный вектор может представлять собой вирусный вектор, полученный из вируса, например, аденовируса, аденоассоциированного вируса, лентивируса (LV), вируса герпеса, альфавируса или ретровируса, например, вируса мышиного лейкоза Молони (M-MuLV), вируса мышиной саркомы Молони (MoMSV), вируса саркомы мышей Харви (HaMuSV), вируса рака молочной железы мышей (MuMTV), вируса лейкоза гиббонов (GaLV), вируса лейкоза кошачьих (FLV), спумавируса, вируса лейкоза мышей Френд, вируса стволовых клеток мышей (MSCV) или вируса саркомы Рауса (RSV). Хотя ниже более подробно описаны варианты осуществления, охватывающие применение LV, ожидается, что специалист в данной области техники поймет, что аналогичные знания и навыки в данной области могут быть применены и к рекомбинантным ретровирусным векторам, не относящимся к LV. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный ретровирусный вектор представляет собой самоограниченный LV.

[00195] В частных вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления он представляет собой псевдотипированный лентивирусный вектор, например, псевдотипированный VSVG лентивирусный вектор.

[00196] В частности, отдельные способы, раскрытые в настоящем документе, относятся к трансдукции двух популяций стволовых клеток или клеток-предшественников, например, гемопоэтических стволовых клеток (HSC) или гемопоэтических клеток-предшественников (также называемых в настоящем документе «гемопоэтическими предшественниками»), рекомбинантным ретровирусным вектором, кодирующим и/или экспрессирующим терапевтический полипептид, например, FANCA, где одну популяцию получают селекцией в условиях высокой строгости, а другую популяцию получают селекцией в условиях низкой строгости. В одном из вариантов осуществления популяции клеток обогащены CD34+ клетками. В одном из вариантов осуществления HSC или гемопоэтические предшественники получены от субъекта с пониженной или отсутствующей активностью белка из одного или более белков, кодируемых FANCA. В одном из вариантов осуществления субъект имеет FA-A. В одном из вариантов осуществления эндогенный ген FANCA в HSC подвергнут делеции и/или мутирован.

[00197] В одном из вариантов осуществления трансдукция клетки рекомбинантным ретровирусным вектором приводит к встраиванию в клеточный геном кассеты экспрессии, содержащей промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей терапевтический агент в указанном рекомбинантном ретровирусном векторе. В некоторых вариантах осуществления трансдукция клетки рекомбинантным ретровирусным вектором приводит к экспрессии терапевтического агента, например, биологически активного белка FANCA.

[00198] Например, биологически активный белок FANCA является частью корового комплекса FA. В некоторых вариантах осуществления ген FANCA доставляют с помощью вирусного вектора. В одном из вариантов осуществления ген FANCA доставляют с помощью лентивирусного вектора. В отдельных вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой PGK-FANCA.WPRE*LV. Предполагается, что после трансдукции клеток костного мозга (BM), или стволовых клеток, или клеток-предшественников от пациентов с FA-A лентивирусным вектором (LV) с FANCA терапевтический вектор встраивается в геном клеток. После встраивания терапевтический белок (например, белок FANCA человека) экспрессируется клетками. Трансдуцированные клетки FA подвергаются генетической коррекции и, таким образом, способны активировать путь FA путем моноубиквитинирования FANCD2 и FANCI. Затем эти белки смогут мигрировать в области повреждения ДНК и совместно с другими ДНК-репарирующими белками будут способствовать репарации ДНК в этих клетках, как это происходит в здоровых клетках.

[00199] Как обсуждается в настоящем документе, рассматриваемые способы и композиции находят применение для экспрессии трансгена, например, FANCA, в клетках животного. Например, рассматриваемые композиции могут применяться в исследованиях, например, для определения влияния гена на жизнеспособность и/или функцию клеток. В качестве еще одного примера, рассматриваемые композиции могут применяться в медицине, например, для лечения расстройства, такого как FA.

[00200] В некоторых вариантах осуществления рассматриваемые способы обеспечивают терапевтический эффект, например, предотвращают развитие расстройства, останавливают прогрессирование расстройства, обращают вспять прогрессирование расстройства и т. д. Например, в одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой анемию Фанкони (FA). В еще одном варианте осуществления заболевание или расстройство представляет собой недостаточность костного мозга (BMF). В одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой тромбоцитопению. В еще одном варианте осуществления расстройство представляет собой лейкопению. В одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой панцитопению. В одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой нейтропению. В еще одном варианте осуществления расстройство представляет собой анемию. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый способ включает стадию обнаружения достижения терапевтического эффекта. Специалист в данной области техники поймет, что такие меры терапевтической эффективности будут применимы к конкретному изменяемому заболеванию, и определит соответствующие методы обнаружения, которые следует использовать для измерения терапевтической эффективности.

[00201] Соответственно, настоящее изобретение относится к способам лечения FA или одного или более гематологических проявлений FA. В одном из вариантов осуществления гематологическое проявление FA выбрано из одного или более из недостаточности костного мозга (BMF), тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии. В частном варианте осуществления гематологическое проявление представляет собой BMF, который у большинства пациентов с FA проявляется в детском возрасте. В одном из вариантов осуществления гематологическое проявление представляет собой тромбоцитопению. В еще одном варианте осуществления гематологическое проявление представляет собой лейкопению. В одном из вариантов осуществления гематологическое проявление представляет собой панцитопению. В одном из вариантов осуществления гематологическое проявление представляет собой нейтропению. В еще одном варианте осуществления гематологическое проявление представляет собой анемию. В одном из вариантов осуществления гематологическое проявление представляет собой комбинацию двух или более из BMF, тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии.

[00202] Дополнительные LV векторы, которые могут быть использованы в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе, включают, не ограничиваясь перечисленным, векторы, полученные с использованием векторов для переноса, раскрытых ниже.

2. Применение трансдуцированных гемопоэтических клеток

[00203] В некоторых вариантах осуществления гемопоэтические клетки, трансдуцированные в соответствии со способом, раскрытым в настоящем документе, применяют в генной терапии. В частных вариантах осуществления гемопоэтические клетки трансдуцируют вектором, содержащим представляющий интерес ген. Трансдуцированные клетки могут быть предоставлены нуждающемуся в этом субъекту, например, для лечения у указанного субъекта генетического заболевания или расстройства. В частных вариантах осуществления представляющий интерес ген восполняет дефект в гене, связанный с моногенным генетическим заболеванием или расстройством. В некоторых вариантах осуществления у субъекта содержится мутация в представляющем интерес эндогенном гене. В некоторых вариантах осуществления представляющий интерес ген, предоставляемый субъекту, кодон-оптимизирован, например, для усиления экспрессии в клетках млекопитающих.

[00204] В одном из вариантов осуществления представляющий интерес ген выбран из группы, состоящей из группы комплементации A (FANCA), группы комплементации C (FANCC) и группы комплементации G (FANCG) анемии Фанкони. В одном из вариантов осуществления представляющий интерес ген представляет собой эритроцитарную пируваткиназу (RPK). В одном из вариантов осуществления представляющий интерес ген представляет собой интегрин бета-2 (ITGB2), и/или представляющий интерес ген кодирует белок, кодируемый любым из генов, раскрытых в настоящем документе, или его функциональный фрагмент или вариант.

[00205] В одном из вариантов осуществления способ предотвращает или облегчает моногенное генетическое заболевание или расстройство.

[00206] В одном из вариантов осуществления моногенетическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы и инфантильного злокачественного остеопороза.

[00207] Таким образом, в изобретении предложены способы лечения моногенных генетических заболеваний или расстройств, включая, не ограничиваясь перечисленным, анемию Фанкони, дефицит адгезии лейкоцитов I типа, дефицит пируваткиназы и инфантильный злокачественный остеопороз. В частных вариантах осуществления способ включает предоставление нуждающемуся в этом субъекту гемопоэтических клеток, трансдуцированных ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую терапевтический белок, функционально связанный с последовательностью промотора, где клетки были трансдуцированы в соответствии со способом, раскрытым в настоящем документе, например, в присутствии двух или более усилителей трансдукции, раскрытых в настоящем документе.

[00208] В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение включает клетку, содержащую кассету экспрессии гена, кассету для переноса гена или рекомбинантный ретровирусный вектор, например, любой из раскрытых в настоящем документе. В связанных вариантах осуществления клетка была трансдуцирована рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим кассету экспрессии, или кассета экспрессии встроена в геном указанной клетки, где трансдукция была проведена в соответствии со способом, раскрытым в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, используемую для получения рекомбинантного ретровирусного вектора, например, пакующую клетку.

[00209] В отдельных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку, которая должна быть доставлена субъекту, чтобы предоставить субъекту продукт гена, кодируемый кассетой экспрессии. Таким образом, в отдельных вариантах осуществления клетка является аутологичной для субъекта, подлежащего лечению, или была получена от субъекта, подлежащего лечению. В других вариантах осуществления клетка является аллогенной для субъекта, подлежащего лечению, или была получена от донора, отличного от субъекта, подлежащего лечению. В частных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего, например, клетку человека. В отдельных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку крови, эритроцит, гемопоэтическую клетку-предшественника, клетку костного мозга, например, не несущую линейных маркеров клетку костного мозга, гемопоэтическую стволовую клетку (например, CD34+) или коммитированную гемопоэтическую эритроидную клетку-предшественника. В частных вариантах осуществления клетка представляет собой CD34+ клетку, полученную от субъекта, подлежащего лечению указанной клеткой после ее трансдукции рекомбинантным ретровирусным вектором, раскрытым в настоящем документе. В частном варианте осуществления клетка представляет собой CD34+ клетку FA, полученную от субъекта, у которого диагностирована FA. Настоящее изобретение дополнительно включает популяции гемопоэтических клеток (необязательно CD34-обогащенных клеток), трансдуцированных в соответствии со способом, раскрытым в настоящем документе.

[00210] В некоторых вариантах осуществления раскрытые в настоящем документе способы обеспечивают терапевтический эффект, например, предотвращают развитие расстройства, останавливают прогрессирование расстройства, обращают вспять прогрессирование расстройства и т. д. Например, в одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой BMF. В одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой тромбоцитопению. В еще одном варианте осуществления расстройство представляет собой лейкопению. В одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой панцитопению. В одном из вариантов осуществления расстройство представляет собой нейтропению. В еще одном варианте осуществления расстройство представляет собой анемию. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый способ включает стадию обнаружения достижения терапевтического эффекта. Специалист в данной области техники поймет, что такие меры терапевтической эффективности будут применимы к конкретному изменяемому заболеванию, и определит соответствующие методы обнаружения, которые следует использовать для измерения терапевтической эффективности.

[00211] Ожидается, что экспрессия трансгена при использовании рассматриваемого трансгена будет устойчивой. Соответственно, в некоторых случаях экспрессия трансгена, например, как определено путем измерения уровней продукта гена, путем измерения терапевтической эффективности и т. д., может наблюдаться два месяца или менее после введения, например, 4, 3 или 2 недели или менее после введения, например, 1 неделю после введения рассматриваемой композиции. Также ожидается, что экспрессия трансгена будет сохраняться с течением времени. Соответственно, в некоторых случаях экспрессия трансгена, например, как определено путем измерения уровней продукта гена, путем измерения терапевтической эффективности и т. д., может наблюдаться 2 месяца или более после введения рассматриваемой композиции, например, 4, 6, 8 или 10 месяцев или более, в некоторых случаях - 1 год или более, например, 2, 3, 4 или 5 лет, в некоторых случаях - более чем 5 лет.

[00212]В отдельных вариантах осуществления способ включает стадию обнаружения экспрессии трансгена в клетках или в организме субъекта, где экспрессия усилена по сравнению с экспрессией из полинуклеотидной кассеты, не содержащей один или более улучшенных элементов согласно настоящему изобретению. Как правило, экспрессия будет увеличена в 2 раза или более по сравнению с экспрессией из референсной, т. е. контрольной полинуклеотидной кассеты, например, как известно в данной области техники, например, в 3 раза, 4 раза или 5 раз, или более, в некоторых случаях в 10 раз, 20 раз или 50 раз, или более, например, в 100 раз, о чем свидетельствует, например, более раннее обнаружение, более высокий уровень продукта гена, более сильное функциональное воздействие на клетки и т. д.

[00213] В некоторых вариантах осуществления доза клеток, которую пациенты получают путем инфузии, будет такой же, как и доза, полученная в результате процесса трансдукции. В различных предпочтительных вариантах осуществления пациенту вводят путем инфузии по меньшей мере приблизительно 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸ или более CD34-обогащенных при высокой строгости селекции клеток/кг массы тела пациента. В различных предпочтительных вариантах осуществления пациенту вводят путем инфузии по меньшей мере приблизительно 1x10¹, 1x10², 1x10³, 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸ или более CD34-обогащенных при низкой строгости селекции клеток/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят путем инфузии от 1x10⁶ до 4x10⁶ CD34-обогащенных при высокой строгости селекции клеток/кг массы тела пациента. В других вариантах осуществления пациенту вводят путем инфузии 3x10⁵ и 4x10⁶ CD34-обогащенных при высокой строгости селекции клеток/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят путем инфузии от 1x10⁶ до 4x10⁶ CD34-обогащенных при высокой строгости селекции клеток/кг массы тела пациента. В других вариантах осуществления пациенту вводят путем инфузии 3x10⁵ и 4x10⁶ CD34-обогащенных при высокой строгости селекции клеток/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления инфузию клеток пациенту осуществляют в виде однократной дозы. В других вариантах осуществления инфузию клеток пациенту осуществляют в нескольких дозах (например, CD34-обогащенные при высокой и низкой строгости селекции популяции клеток вводят последовательно один или несколько раз). Инфузию трансдуцированных клеток можно проводить сразу после завершения процесса трансдукции. В частных вариантах осуществления трансдуцированные клетки хранят или замораживают перед использованием, тогда как в отдельных вариантах осуществления их предоставляют субъекту сразу же или вскоре после их трансдукции, например, в течение одного часа, двух часов, четырех часов или восьми часов.

[00214] После встраивания терапевтический белок (например, белок FANCA человека) экспрессируется клетками. Трансдуцированные клетки FA подвергаются генетической коррекции и, таким образом, способны активировать путь FA путем моноубиквитинирования FANCD2 и FANCI. Эти белки мигрируют в области повреждения ДНК и совместно с другими ДНК-репарирующими белками способствуют репарации ДНК в этих клетках, как это происходит в здоровых клетках.

[00215] Как более подробно описано в разделе примеров, данные доклинических исследований in vitro с образцами костного мозга от людей с FA уже показали эффективность LV FANCA в отношении коррекции фенотипа этих клеток.

[00216] В одном из вариантов осуществления вводят по меньшей мере от 1 x 10⁵ до 4 x 10⁵ CD34⁺ скорректированных клеток (например, HSC, трансдуцированных FANCA) на килограмм массы тела пациента для восстановления гемопоэза у пациента с FA без проведения кондиционирования. В некоторых вариантах осуществления инфузию или введение трансдуцированных клеток пациенту проводят сразу же после трансдукции. В других вариантах осуществления трансдуцированные клетки замораживают перед проведением инфузии или введения пациенту с кондиционированием или без него.

[00217] Генетическая коррекция HSC от пациентов с FA с последующей аутологичной трансплантацией этих клеток (гемопоэтическая генная терапия) является хорошей альтернативой для пациентов с FA, особенно тех, у кого нет HLA-идентичного родственника для аллогенной трансплантации. В одном из вариантов осуществления гемопоэтическая генная терапия является предпочтительной схемой лечения для пациента, у которого нет HLA-идентичного родственника. В еще одном варианте осуществления гемопоэтическая генная терапия является предпочтительной схемой лечения для пациента, у которого есть HLA-идентичный родственник.

[00218] Анемия Фанкони (FA) является заболеванием с аутосомно-рецессивным типом наследования (за исключением группы комплементации FA-B, которая наследуется как сцепленная с Х-хромосомой), и медианная выживаемость пациентов составляет около 24 лет (Butturini A, et al. (1994) Blood 84:1650-1655; Kutler DI, et al. (2003) Blood 101:1249-1256). При рождении анализ крови у этих пациентов обычно находится в пределах нормы. Макроцитоз часто является первым гематологическим отклонением, обнаруживаемым у таких пациентов. Обычно он развивается в тромбоцитопению, анемию и панцитопению. Недостаточность костного мозга (BMF) обычно наблюдается у этих пациентов через 5-10 лет, при этом средний возраст начала гематологического заболевания составляет 7 лет. Приблизительно у 80% пациентов с FA в течение первого десятилетия жизни развиваются признаки BMF. На основании эпидемиологических исследований, проведенных на сегодняшний день, если злокачественные эпизоды не появляются до развития аплазии, практически у всех пациентов с FA к 40 годам разовьется BMF, что является основной причиной смертности этих пациентов. Из-за сложных клинических проявлений FA ведение этих пациентов в основном направлено на улучшение следующих клинических проявлений: недостаточность костного мозга (BMF), миелоидный лейкоз и солидные опухоли.

[00219] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения анемии Фанкони (FA) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген группы комплементации анемии Фанкони (FANC) или ген, кодирующий его функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ген кодирует FANCA.

[00220] В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем документе, применяют для трансдукции гемопоэтических клеток лентивирусным вектором, полученным с использованием вектора для переноса pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO, например, для создания популяции клеток для лечения FA. pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO представляет собой лентивирусный вектор на основе плазмиды для переноса pCCL, используемой в системах лентивирусных векторов третьего поколения. Плазмида для переноса pCCL представляет собой лентивирусный вектор, содержащий химерные 5'-LTR CMV-ВИЧ и остовы вектора, в которые включены последовательности полиаденилирования и (без энхансера) точки начала репликации вируса обезьян 40 по ходу транскрипции от 3'-LTR ВИЧ, заменяя большую часть последовательности человека, оставшейся от сайта встраивания ВИЧ. В pCCL энхансер и промотор (нуклеотиды с -673 по -1 относительно сайта инициации транскрипции; регистрационный № GenBank K03104) CMV были присоединены к R-области ВИЧ-1. В векторе используется промотор PGK, связанный с кодон-оптимизированным геном FANCA с элементами RRE и cPPT/CTS, расположенными против хода транскрипции, и с элементом wPRE, расположенным по ходу транскрипции (ФИГ. 15).

[00221] Полученный лентивирусный вектор используют для трансдукции аутологичных CD34+ гемопоэтических стволовых клеток («HSC»), восполняя таким образом генетический дефект. Вкратце, HSC мобилизуют путем проведения у пациента терапии Г-КСФ, плериксафором или комбинацией Г-КСФ и плериксафора. Затем HSC собирают из периферической крови пациента с помощью афереза. Проводят обогащение CD34+ клетками с помощью магнитной сепарации (например, в системе CliniMACs от Miltenyi Biotec) и трансдуцируют CD34+ обогащенные клетки ex vivo в соответствии с раскрытыми в настоящем документе способами лентивирусными частицами, ранее полученными путем временной трансфекции системы лентивирусного вектора третьего поколения, которая включает плазмиду для переноса pCCL-PGK-FANCAW-82-RO. В отдельных вариантах осуществления клетки трансдуцируют в присутствии PGE2 и полоксамера. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). Затем трансдуцированные HSC трансплантируют пациенту путем инфузии и восстанавливают популяцию ниши HSC экспрессирующими FANCA клетками.

[00222] Последовательность кассеты экспрессии FANCA в pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO (5'-3') представляет собой следующую. Кодирующая последовательность FANCA обозначена выделенными полужирным шрифтом заглавными буквами. Последовательность WPRE подчеркнута.

ggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccagggggatcccccgggctgcaggaattcATGTCCGACTCGTGGGTCCCGAACTCCGCCTCGGGCCAGGACCCAGGGGGCCGCCGGAGGGCCTGGGCCGAGCTGCTGGCGGGAAGGGTCAAGAGGGAAAAATATAATCCTGAAAGGGCACAGAAATTAAAGGAATCAGCTGTGCGCCTCCTGCGAAGCCATCAGGACCTGAATGCCCTTTTGCTTGAGGTAGAAGGTCCACTGTGTAAAAAATTGTCTCTCAGCAAAGTGATTGACTGTGACAGTTCTGAGGCCTATGCTAATCATTCTAGTTCATTTATAGGCTCTGCTTTGCAGGATCAAGCCTCAAGGCTGGGGGTTCCCGTGGGTATTCTCTCAGCCGGGATGGTTGCCTCTAGCGTGGGACAGATCTGCACGGCTCCAGCGGAGACCAGTCACCCTGTGCTGCTGACTGTGGAGCAGAGAAAGAAGCTGTCTTCCCTGTTAGAGTTTGCTCAGTATTTATTGGCACACAGTATGTTCTCCCGTCTTTCCTTCTGTCAAGAATTATGGAAAATACAGAGTTCTTTGTTGCTTGAAGCGGTGTGGCATCTTCACGTACAAGGCATTGTGAGCCTGCAAGAGCTGCTGGAAAGCCATCCCGACATGCATGCTGTGGGATCGTGGCTCTTCAGGAATCTGTGCTGCCTTTGTGAACAGATGGAAGCATCCTGCCAGCATGCTGACGTCGCCAGGGCCATGCTTTCTGATTTTGTTCAAATGTTTGTTTTGAGGGGATTTCAGAAAAACTCAGATCTGAGAAGAACTGTGGAGCCTGAAAAAATGCCGCAGGTCACGGTTGATGTACTGCAGAGAATGCTGATTTTTGCACTTGACGCTTTGGCTGCTGGAGTACAGGAGGAGTCCTCCACTCACAAGATCGTGAGGTGCTGGTTCGGAGTGTTCAGTGGACACACGCTTGGCAGTGTAATTTCCACAGATCCTCTGAAGAGGTTCTTCAGTCATACCCTGACTCAGATACTCACTCACAGCCCTGTGCTGAAAGCATCTGATGCTGTTCAGATGCAGAGAGAGTGGAGCTTTGCGCGGACACACCCTCTGCTCACCTCACTGTACCGCAGGCTCTTTGTGATGCTGAGTGCAGAGGAGTTGGTTGGCCATTTGCAAGAAGTTCTGGAAACGCAGGAGGTTCACTGGCAGAGAGTGCTCTCCTTTGTGTCTGCCCTGGTTGTCTGCTTTCCAGAAGCGCAGCAGCTGCTTGAAGACTGGGTGGCGCGTTTGATGGCCCAGGCATTCGAGAGCTGCCAGCTGGACAGCATGGTCACTGCGTTCCTGGTTGTGCGCCAGGCAGCACTGGAGGGCCCCTCTGCGTTCCTGTCATATGCAGACTGGTTCAAGGCCTCCTTTGGGAGCACACGAGGCTACCATGGCTGCAGCAAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAACTCGTGCCTTTTGAGTCTCCCCGGTACCTGCAGGTGCACATTCTCCACCCACCCCTGGTTCCCAGCAAGTACCGCTCCCTCCTCACAGACTACATCTCATTGGCCAAGACACGGCTGGCCGACCTCAAGGTTTCTATAGAAAACATGGGACTCTACGAGGATTTGTCATCAGCTGGGGACATTACTGAGCCCCACAGCCAAGCTCTTCAGGATGTTGAAAAGGCCATCATGGTGTTTGAGCATACGGGGAACATCCCAGTCACCGTCATGGAGGCCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTACGTGTCCCACTTCCTCCCCGCCCTGCTCACACCTCGAGTGCTCCCCAAAGTCCCTGACTCCCGTGTGGCGTTTATAGAGTCTCTGAAGAGAGCAGATAAAATCCCCCCATCTCTGTACTCCACCTACTGCCAGGCCTGCTCTGCTGCTGAAGAGAAGCCAGAAGATGCAGCCCTGGGAGTGAGGGCAGAACCCAACTCTGCTGAGGAGCCCCTGGGACAGCTCACAGCTGCACTGGGAGAGCTGAGAGCCTCCATGACAGACCCCAGCCAGCGTGATGTTATATCGGCACAGGTGGCAGTGATTTCTGAAAGACTGAGGGCTGTCCTGGGCCACAATGAGGATGACAGCAGCGTTGAGATATCAAAGATTCAGCTCAGCATCAACACGCCGAGACTGGAGCCACGGGAACACATTGCTGTGGACCTCCTGCTGACGTCTTTCTGTCAGAACCTGATGGCTGCCTCCAGTGTCGCTCCCCCGGAGAGGCAGGGTCCCTGGGCTGCCCTCTTCGTGAGGACCATGTGTGGACGTGTGCTCCCTGCAGTGCTCACCCGGCTCTGCCAGCTGCTCCGTCACCAGGGCCCGAGCCTGAGTGCCCCACATGTGCTGGGGTTGGCTGCCCTGGCCGTGCACCTGGGTGAGTCCAGGTCTGCGCTCCCAGAGGTGGATGTGGGTCCTCCTGCACCTGGTGCTGGCCTTCCTGTCCCTGCGCTCTTTGACAGCCTCCTGACCTGTAGGACGAGGGATTCCTTGTTCTTCTGCCTGAAATTTTGTACAGCAGCAATTTCTTACTCTCTCTGCAAGTTTTCTTCCCAGTCACGAGATACTTTGTGCAGCTGCTTATCTCCAGGCCTTATTAAAAAGTTTCAGTTCCTCATGTTCAGATTGTTCTCAGAGGCCCGACAGCCTCTTTCTGAGGAGGACGTAGCCAGCCTTTCCTGGAGACCCTTGCACCTTCCTTCTGCAGACTGGCAGAGAGCTGCCCTCTCTCTCTGGACACACAGAACCTTCCGAGAGGTGTTGXAAAGAGGAAGATGTTCACTTAACTTACCAAGACTGGTTACACCTGGAGCTGGAAATTCAACCTGAAGCTGATGCTCTTTCAGATACTGAACGGCAGGACTTCCACCAGTGGGCGATCCATGAGCACTTTCTCCCTGAGTCCTCGGCTTCAGGGGGCTGTGACGGAGACCTGCAGGCTGCGTGTACCATTCTTGTCAACGCACTGATGGATTTCCACCAAAGCTCAAGGAGTTATGACCACTCAGAAAATTCTGATTTGGTCTTTGGTGGCCGCACAGGAAATGAGGATATTATTTCCAGATTGCAGGAGATGGTAGCTGACCTGGAGCTGCAGCAAGACCTCATAGTGCCTCTCGGCCACACCCCTTCCCAGGAGCACTTCCTCTTTGAGATTTTCCGCAGACGGCTCCAGGCTCTGACAAGCGGGTGGAGCGTGGCTGCCAGCCTTCAGAGACAGAGGGAGCTGCTAATGTACAAACGGATCCTCCTCCGCCTGCCTTCGTCTGTCCTCTGCGGCAGCAGCTTCCAGGCAGAACAGCCCATCACTGCCAGATGCGAGCAGTTCTTCCACTTGGTCAACTCTGAGATGAGAAACTTCTGCTCCCACGGAGGTGCCCTGACACAGGACATCACTGCCCACTTCTTCAGGGGCCTCCTGAACGCCTGTCTGCGGAGCAGAGACCCCTCCCTGATGGTCGACTTCATACTGGCCAAGTGCCAGACGAAATGCCCCTTAATTTTGACCTCTGCTCTGGTGTGGTGGCCGAGCCTGGAGCCTGTGCTGCTCTGCCGGTGGAGGAGACACTGCCAGAGCCCGCTGCCCCGGGAACTGCAGAAGCTACAAGAAGGCCGGCAGTTTGCCAGCGATTTCCTCTCCCCTGAGGCTGCCTCCCCAGCACCCAACCCGGACTGGCTCTCAGCTGCTGCACTGCACTTTGCGATTCAACAAGTCAGGGAAGAAAACATCAGGAAGCAGCTAAAGAAGCTGGACTGCGAGAGAGAGGAGCTATTGGTTTTCCTTTTCTTCTTCTCCTTGATGGGCCTGCTGTCGTCACATCTGACCTCAAATAGCACCACAGACCTGCCAAAGGCTTTCCACGTTTGTGCAGCAATCCTCGAGTGTTTAGAGAAGAGGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTTTCAGTTGACAGAGAGTGACCTCAGGCTGGGGCGGCTCCTCCTCCGTGTGGCCCCGGATCAGCACACCAGGCTGCTGCCTTTCGCTTTTTACAGTCTTCTCTCCTACTTCCATGAAGACGCGGCCATCAGGGAAGAGGCCTTCCTGCATGTTGCTGTGGACATGTACTTGAAGCTGGTCCAGCTCTTCGTGGCTGGGGATACAAGCACAGTTTCACCTCCAGCTGGCAGGAGCCTGGAGCTCAAGGGTCAGGGCAACCCCGTGGAACTGATAACAAAAGCTCGTCTTTTTCTGCTGCAGTTAATACCTCGGTGCCCGAAAAAGAGCTTCTCACACGTGGCAGAGCTGCTGGCTGATCGTGGGGACTGCGACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGCTGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGATGAgaattcgatatcaagcttatcgataccgtcgaatcccccgggctgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcc (SEQ ID NO: 1).

[00223] Последовательность белка FANCA, кодируемая этим полипептидом, представлена как SEQ ID NO: 2. Векторы для экспрессии FANCA, применимые в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, векторы, раскрытые в публикации международной патентной заявки WO 2018/049273, содержание которой полностью включено в настоящий документ.

[00224] Дефицит адгезии лейкоцитов-1 (LAD-1) - это редкое заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования, вызываемое мутациями в гене ITGB2, кодирующем CD18 - белок, присутствующий в нескольких рецепторных комплексах на клеточной поверхности, обнаруженных на лейкоцитах, включая лимфоцитарный функционально-ассоциированный антиген-1 (LFA-1), рецептор комплемента 3 (CR-3) и рецептор комплемента 4 (CR-4). Дефицит LFA-1 приводит к тому, что нейтрофилы не могут прикрепляться к кровеносным сосудам и мигрировать из них, поэтому их количество может быть высоким. Он также нарушает взаимодействие иммунных клеток, иммунологическое распознавание и функции лимфоцитов, связанные с уничтожением клеток.

[00225] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения дефицита адгезии лейкоцитов I типа (LAD-1) у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген ITGB2 или ген, кодирующий его функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[00226] В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем документе, применяют для трансдукции гемопоэтических клеток лентивирусным вектором, полученным с использованием вектора для переноса pCCL-ChimhCD18W-82-RO, например, для создания популяции клеток для лечения LAD-1. pCCL-ChimhCD18W-82-RO представляет собой лентивирусный вектор для переноса на основе плазмиды для переноса pCCL, используемой в системах лентивирусных векторов третьего поколения. Плазмида для переноса pCCL представляет собой лентивирусный вектор, содержащий химерные 5'-LTR CMV-ВИЧ и остовы вектора, в которые включены последовательности полиаденилирования и (без энхансера) точки начала репликации вируса обезьян 40 по ходу транскрипции от 3'-LTR ВИЧ, заменяя большую часть последовательности человека, оставшейся от сайта встраивания ВИЧ. В pCCL энхансер и промотор (нуклеотиды с -673 по -1 относительно сайта инициации транскрипции; регистрационный № GenBank K03104) CMV были присоединены к R-области ВИЧ-1. В векторе используется промотор Chim, связанный с кодон-оптимизированным геном ITGB2 с элементами RRE и cPPT/CTS, расположенными против хода транскрипции, и с элементом wPRE, расположенным по ходу транскрипции (ФИГ. 16). Промотор Chim представляет собой слияние промотора c-Fes и минимальных 5'-фланкирующих областей CTSG (где ТАТА-бокс промотора CTSG мутирован для ограничения инициации транскрипции только минимальным промотором c-Fes).

[00227] Лентивирусные частицы получают путем временной трансфекции системы лентивирусного вектора третьего поколения, которая включает плазмиду для переноса LAD-1. Лентивирусные частицы используют для трансдукции аутологичных CD34+ гемопоэтических стволовых клеток (HSC), восполняя таким образом генетический дефект. Вкратце, HSC мобилизуют путем проведения у пациента терапии Г-КСФ, плериксафором или комбинацией Г-КСФ и плериксафора. Затем HSC собирают из периферической крови пациента с помощью афереза. Проводят обогащение CD34+ клетками с помощью магнитной сепарации (например, в системе CliniMACs от Miltenyi Biotec) и трансдуцируют CD34+ обогащенные клетки ex vivo лентивирусными частицами. Процесс трансдукции включает использование усилителей трансдукции, в частности, полиоксамеров (компания Rocket получила лицензию на LentiBOOST от Sirion Biotech GmbH как для клинического, так и для коммерческого использования) и PGE2 (коммерчески доступен от LGM Pharma). Затем трансдуцированные HSC трансплантируют пациенту путем инфузии, и они восстанавливают популяцию ниши HSC экспрессирующими LAD-1 клетками.

[00228] Полученный лентивирусный вектор используют для трансдукции аутологичных CD34+ гемопоэтических стволовых клеток («HSC»), восполняя генетический дефект. Вкратце, HSC мобилизуют путем проведения у пациента терапии Г-КСФ, плериксафором или комбинацией Г-КСФ и плериксафора. Затем HSC собирают из периферической крови пациента с помощью афереза. Обогащение CD34+ клетками может быть проведено с помощью магнитной сепарации (например, в системе CliniMACs от Miltenyi Biotec), и CD34+ обогащенные клетки трансдуцируют ex vivo в соответствии с раскрытыми в настоящем документе способами лентивирусными частицами, ранее полученными путем временной трансфекции системы лентивирусного вектора третьего поколения, которая включает плазмиду для переноса pCCL-ChimhCD18W-82-RO. В отдельных вариантах осуществления клетки трансдуцируют в присутствии PGE2 и полоксамера. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). Затем трансдуцированные HSC трансплантируют пациенту путем инфузии и восстанавливают популяцию ниши HSC экспрессирующими ITGB2 клетками.

[00229] Последовательность кассеты экспрессии ITGB2 в pCCL-ChimhCD18W-82-RO (5'-3') представляет собой следующую. Кодирующая последовательность ITGB, также известного как CD18, обозначена выделенными полужирным шрифтом заглавными буквами. Последовательность WPRE подчеркнута.

cgcgtctgccagctttcttgctttgctggagtattctggaatttgatgggttgagggttctggacacaatgccccaagccccttccttgttgtgctgggttcctatttctgctctcggcactgacttagcagctgctcaagagctcaccatgttggcttggattacacggtctcacccacatctccggcagtttgtgggcaaacttcctgagcagccttgggtgatgaaacctttcatggtagcaggagaatgggactgtgaattctcaatcccctgtccccaccccttccttcctctctcagggccttgctgtctaggaggagggagcacagcagcaactgactgggcagcctttcaggaaaggctagcccgggctcgatcgagaagcttgataattccgtgaggtggggagggctgggaccagggttccctctttctcttctgcggtggccctggcctggtgctaggactgcgcgcctcccctcagtacccgcggacaccctgggcttccctgggcccagcatctgcctggggcctcgccctgggctccccctcctgacccccaccttgcgccccttcccggtgttcccggggcgctgccgggccctggggcctgcggggcgcgggcggctcttggctgggccattctttcccggccccctcctcccttccgtttccgtggccgtgcggccggctagaggctgcggcccagcgcggagcaggggggctggcaggcgtcggggcggtcgggccggtcccgcccgccccttcccctccacaggcccgccccggggcctgggccaactgaaaccgcgggaggaggaagcgcggaatcaggaactggccggggtccgcaccgggcctgagtcggtccgaggccgtcccaggagcagctgcccgaagggcgaattgggggatcccccgggctaatgccaactttgtacaaaaaagcaggctccaccATGCTGGGCCTGCGCCCCCCACTTCTCGCCCTGGTGGGGCTGCTCTCCCTCGGGTGCGTCCTCTCTCAGGAGTGCACGAAGTTCAAGGTCAGCAGCTGCCGGGAATGCATCGAGTCGGGGCCCGGCTGCACCTGGTGCCAGAAGCTGAACTTCACAGGGCCGGGGGATCCTGACTCCATTCGCTGCGACACCCGGCCACAGCTGCTCATGAGGGGCTGTGCGGCTGACGACATCATGGACCCCACAAGCCTCGCTGAAACCCAGGAAGACCACAATGGGGGCCAGAAGCAGCTGTCCCCACAAAAAGTGACGCTTTACCTGCGACCAGGCCAGGCAGCAGCGTTCAACGTGACCTTCCGGCGGGCCAAGGGCTACCCCATCGACCTGTACTATCTGATGGACCTCTCCTACTCCATGCTTGATGACCTCAGGAATGTCAAGAAGCTAGGTGGCGACCTGCTCCGGGCCCTCAACGAGATCACCGAGTCCGGCCGCATTGGCTTCGGGTCCTTCGTGGACAAGACCGTGCTGCCGTTCGTGAACACGCACCCTGATAAGCTGCGAAACCCATGCCCCAACAAGGAGAAAGAGTGCCAGCCCCCGTTTGCCTTCAGGCACGTGCTGAAGCTGACCAACAACTCCAACCAGTTTCAGACCGAGGTCGGGAAGCAGCTGATTTCCGGAAACCTGGATGCACCCGAGGGTGGGCTGGACGCCATGATGCAGGTCGCCGCCTGCCCGGAGGAAATCGGCTGGCGCAACGTCACGCGGCTGCTGGTGTTTGCCACTGATGACGGCTTCCATTTCGCGGGCGACGGGAAGCTGGGCGCCATCCTGACCCCCAACGACGGCCGCTGTCACCTGGAGGACAACTTGTACAAGAGGAGCAACGAATTCGACTACCCATCGGTGGGCCAGCTGGCGCACAAGCTGGCTGAAAACAACATCCAGCCCATCTTCGCGGTGACCAGTAGGATGGTGAAGACCTACGAGAAACTCACCGAGATCATCCCCAAGTCAGCCGTGGGGGAGCTGTCTGAGGACTCCAGCAATGTGGTCCATCTCATTAAGAATGCTTACAATAAACTCTCCTCCAGGGTATTCCTGGATCACAACGCCCTCCCCGACACCCTGAAAGTCACCTACGACTCCTTCTGCAGCAATGGAGTGACGCACAGGAACCAGCCCAGAGGTGACTGTGATGGCGTGCAGATCAATGTCCCGATCACCTTCCAGGTGAAGGTCACGGCCACAGAGTGCATCCAGGAGCAGTCGTTTGTCATCCGGGCGCTGGGCTTCACGGACATAGTGACCGTGCAGGTCCTTCCCCAGTGTGAGTGCCGGTGCCGGGACCAGAGCAGAGACCGCAGCCTCTGCCATGGCAAGGGCTTCTTGGAGTGCGGCATCTGCAGGTGTGACACTGGCTACATTGGGAAAAACTGTGAGTGCCAGACACAGGGCCGGAGCAGCCAGGAGCTGGAAGGAAGCTGCCGGAAGGACAACAACTCCATCATCTGCTCAGGGCTGGGGGACTGTGTCTGCGGGCAGTGCCTGTGCCACACCAGCGACGTCCCCGGCAAGCTGATATACGGGCAGTACTGCGAGTGTGACACCATCAACTGTGAGCGCTACAACGGCCAGGTCTGCGGCGGCCCGGGGAGGGGGCTCTGCTTCTGCGGGAAGTGCCGCTGCCACCCGGGCTTTGAGGGCTCAGCGTGCCAGTGCGAGAGGACCACTGAGGGCTGCCTGAACCCGCGGCGTGTTGAGTGTAGTGGTCGTGGCCGGTGCCGCTGCAACGTATGCGAGTGCCATTCAGGCTACCAGCTGCCTCTGTGCCAGGAGTGCCCCGGCTGCCCCTCACCCTGTGGCAAGTACATCTCCTGCGCCGAGTGCCTGAAGTTCGAAAAGGGCCCCTTTGGGAAGAACTGCAGCGCGGCGTGTCCGGGCCTGCAGCTGTCGAACAACCCCGTGAAGGGCAGGACCTGCAAGGAGAGGGACTCAGAGGGCTGCTGGGTGGCCTACACGCTGGAGCAGCAGGACGGGATGGACCGCTACCTCATCTATGTGGATGAGAGCCGAGAGTGTGTGGCAGGCCCCAACATCGCCGCCATCGTCGGGGGCACCGTGGCAGGCATCGTGCTGATCGGCATTCTCCTGCTGGTCATCTGGAAGGCTCTGATCCACCTGAGCGACCTCCGGGAGTACAGGCGCTTTGAGAAGGAGAAGCTCAAGTCCCAGTGGAACAATGATAATCCCCTTTTCAAGAGCGCCACCACGACGGTCATGAACCCCAAGTTTGCTGAGAGTTAGgacccagctttcttgtacaaagttggcattaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcc (SEQ ID NO: 3).

[00230] Последовательность белка ITGB2 человека представлена как SEQ ID NO: 4.

[00231] Дефицит пируваткиназы (PKD) - это моногенное метаболическое заболевание, вызываемое мутациями в гене PKLR, которые нарушают энергетический баланс эритроцитов, вызывая тем самым гемолитическую анемию, которая может очень сильно различаться по степени и может привести к летальному исходу в неонатальном периоде.

[00232] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения дефицита пируваткиназы у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген пируваткиназы типа R или ген, кодирующий его функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[00233] В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем документе, применяют для трансдукции гемопоэтических клеток лентивирусным вектором, полученным с использованием вектора для переноса pCCL-PGK-coRPKW-82-RO, например, для создания популяции клеток для лечения IMO. pCCL-PGK-coRPKW-82-RO ((плазмида PKD) основана на плазмиде для переноса pCCL, используемой в системах лентивирусных векторов третьего поколения. Плазмида для переноса pCCL представляет собой лентивирусный вектор, содержащий химерные 5'-LTR CMV-ВИЧ и остовы вектора, в которые включены последовательности полиаденилирования и (без энхансера) точки начала репликации вируса обезьян 40 по ходу транскрипции от 3'-LTR ВИЧ, заменяя большую часть последовательности человека, оставшейся от сайта встраивания ВИЧ. В pCCL энхансер и промотор (нуклеотиды с -673 по -1 относительно сайта инициации транскрипции; регистрационный № GenBank K03104) CMV были присоединены к R-области ВИЧ-1. Плазмида PKD включает промотор PGK, связанный с кодон-оптимизированным геном PKLR с элементами RRE и cPPT/CTS, расположенными против хода транскрипции, и с элементом wPRE, расположенным по ходу транскрипции (ФИГ. 1). Лентивирусные векторные частицы получают путем временной трансфекции системы лентивирусного вектора третьего поколения, которая включает плазмиду PKD (ФИГ. 17).

[00234] Лентивирусные векторные частицы затем могут быть использованы для трансдукции аутологичных CD34+ гемопоэтических стволовых клеток («HSC»), восполняя таким образом генетический дефект. Вкратце, HSC мобилизуют путем проведения у пациента терапии Г-КСФ, плериксафором или комбинацией Г-КСФ и плериксафора. Затем HSC собирают из периферической крови пациента с помощью афереза. Обогащение CD34+ клетками может быть проведено с помощью магнитной сепарации (например, в системе CliniMACs от Miltenyi Biotec), и CD34+ обогащенные клетки трансдуцируют ex vivo лентивирусными векторными частицами в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе. В отдельных вариантах осуществления клетки трансдуцируют в присутствии PGE2 и полоксамера. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). Затем трансдуцированные HSC трансплантируют пациенту путем инфузии и восстанавливают популяцию ниши HSC экспрессирующими PKLR клетками.

[00235] Последовательность кассеты экспрессии PKLR в pCCL-PGK-coRPKW-82-RO (5'-3') представляет собой следующую. Кодирующая последовательность PKLR обозначена выделенными полужирным шрифтом заглавными буквами. Промотор PGK выделен курсивом, а последовательность WPRE подчеркнута.

ggggttggggttgcgccttttccaaggcagccctgggtttgcgcagggacgcggctgctctgggcgtggttccgggaaacgcagcggcgccgaccctgggtctcgcacattcttcacgtccgttcgcagcgtcacccggatcttcgccgctacccttgtgggccccccggcgacgcttcctgctccgcccctaagtcgggaaggttccttgcggttcgcggcgtgccggacgtgacaaacggaagccgcacgtctcactagtaccctcgcagacggacagcgccagggagcaatggcagcgcgccgaccgcgatgggctgtggccaatagcggctgctcagcagggcgcgccgagagcagcggccgggaaggggcggtgcgggaggcggggtgtggggcggtagtgtgggccctgttcctgcccgcgcggtgttccgcattctgcaagcctccggagcgcacgtcggcagtcggctccctcgttgaccgaatcaccgacctctctccccagggggatccgtcgacaccggtgccaccATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGAccgcggtctagaggatcccccgggctgcaggaattcgagcatcttaccgccatttattcccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagggcc (SEQ ID NO: 5).

[00236] Последовательность белка PKLR, кодируемая этим полипептидом, представлена как SEQ ID NO: 6. Дополнительные полинуклеотидные последовательности PKLR, применимые в настоящем изобретении, включают SEQ ID NO: 7-9. Векторы для экспрессии PKLR, применимые в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, векторы, раскрытые в международной патентной заявке PCT/US2019/041465, содержание которой полностью включено в настоящий документ.

[00237] Инфантильный злокачественный остеопороз (IMO) - это редкое расстройство с рецессивным типом наследования, характеризующееся увеличением костной массы, вызванным нарушением функции остеокластов. Это заболевание чаще всего вызвано мутациями в гене TCIRG1, кодирующем субъединицу V-АТФазы, участвующую в способности остеокластов резорбировать кость. Richter et al. показали, что функция остеокластов может быть восстановлена путем опосредованной лентивирусным вектором экспрессии TCIRG1, но точный порог восстановления резорбции, а также клеточный ответ на опосредованную вектором экспрессию TCIRG1 неизвестны.

[00238] В отдельных вариантах осуществления изобретения предложен способ лечения инфантильного злокачественного остеопороза у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение гемопоэтических клеток, трансдуцированных рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген CLCN7, OSTM1, Т-клеточного иммунного регулятора 1, a3-субъединицы V0-домена Н+-транспортирующей АТФазы (TCIRG1), TNFSF11, PLEKHM1 или TNFRSF11A, или ген, кодирующий их функциональный вариант или фрагмент, в соответствии со способами, раскрытыми в настоящем документе.

[00239] В некоторых вариантах осуществления способы, раскрытые в настоящем документе, применяют для трансдукции гемопоэтических клеток лентивирусным вектором, полученным с использованием вектора для переноса pCCL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre, например, для создания популяции клеток для лечения IMO. pCCL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre представляет собой лентивирусный вектор для переноса на основе плазмиды для переноса pCCL, используемой в системах лентивирусных векторов третьего поколения. Плазмида для переноса pCCL представляет собой лентивирусный вектор, содержащий химерные 5'-LTR CMV-ВИЧ и остовы вектора, в которые включены последовательности полиаденилирования и (без энхансера) точки начала репликации вируса обезьян 40 по ходу транскрипции от 3'-LTR ВИЧ, заменяя большую часть последовательности человека, оставшейся от сайта встраивания ВИЧ. В pCCL энхансер и промотор (нуклеотиды с -673 по -1 относительно сайта инициации транскрипции; регистрационный № GenBank K03104) CMV были присоединены к R-области ВИЧ-1. В векторе используется промотор EFS (короткая, безинтронная форма промотора EF1-альфа), связанный с кодон-оптимизированным геном TCIRG1 с элементами RRE и cPPT/CTS, расположенными против хода транскрипции, и с элементом wPRE, расположенным по ходу транскрипции (ФИГ. 18).

[00240] Полученный лентивирусный вектор используют для трансдукции аутологичных CD34+ гемопоэтических стволовых клеток («HSC»), восполняя таким образом генетический дефект. В некоторых вариантах осуществления HSC мобилизуют путем проведения у пациента терапии Г-КСФ, плериксафором или комбинацией Г-КСФ и плериксафора. Затем HSC собирают из периферической крови пациента с помощью афереза. Обогащение CD34+ клетками может быть проведено с помощью магнитной сепарации (например, в системе CliniMACs от Miltenyi Biotec), и CD34+ обогащенные клетки могут быть трансдуцированы ex vivo в соответствии с раскрытыми в настоящем документе способами лентивирусными частицами, ранее полученными путем временной трансфекции системы лентивирусного вектора, которая включает плазмиду для переноса pCCLL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre. В отдельных вариантах осуществления клетки трансдуцируют в присутствии PGE2 и полоксамера. В одном из вариантов осуществления полоксамер представляет собой полоксамер 338 (LentiBOOST™). Затем трансдуцированные HSC трансплантируют пациенту путем инфузии и генерируют остеокласты, экспрессирующие TCIRG1.

[00241] Последовательность кассеты экспрессии TCIRG1 в pCCL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre (5'-3') представляет собой следующую. Кодирующая последовательность TCIRG1, также известного как CD18, обозначена выделенными полужирным шрифтом заглавными буквами. Последовательность WPRE подчеркнута.

ggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtgtcgtgacgcgggatccgccaccATGGGCTCCATGTTTCGGAGCGAGGAGGTGGCCCTGGTCCAGCTCTTTCTGCCCACAGCGGCTGCCTACACCTGCGTGAGTCGGCTGGGCGAGCTGGGCCTCGTGGAGTTCAGAGACCTCAACGCCTCGGTGAGCGCCTTCCAGAGACGCTTTGTGGTTGATGTTCGGCGCTGTGAGGAGCTGGAGAAGACCTTCACCTTCCTGCAGGAGGAGGTGCGGCGGGCTGGGCTGGTCCTGCCCCCGCCAAAGGGGAGGCTGCCGGCACCCCCACCCCGGGACCTGCTGCGCATCCAGGAGGAGACGGAGCGCCTGGCCCAGGAGCTGCGGGATGTGCGGGGCAACCAGCAGGCCCTGCGGGCCCAGCTGCACCAGCTGCAGCTCCACGCCGCCGTGCTACGCCAGGGCCATGAACCTCAGCTGGCAGCCGCCCACACAGATGGGGCCTCAGAGAGGACGCCCCTGCTCCAGGCCCCCGGGGGGCCGCACCAGGACCTGAGGGTCAACTTTGTGGCAGGTGCCGTGGAGCCCCACAAGGCCCCTGCCCTAGAGCGCCTGCTCTGGAGGGCCTGCAGAGGCTTCCTCATTGCCAGCTTCAGGGAGCTGGAGCAGCCGCTGGAGCACCCCGTGACGGGCGAGCCAGCCACGTGGATGACCTTCCTCATCTCCTACTGGGGTGAGCAGATCGGACAGAAGATCCGCAAGATCACGGACTGCTTCCACTGCCACGTCTTCCCGTTTCTGCAGCAGGAGGAGGCCCGCCTCGGGGCCCTGCAGCAGCTGCAACAGCAGAGCCAGGAGCTGCAGGAGGTCCTCGGGGAGACAGAGCGGTTCCTGAGCCAGGTGCTAGGCCGGGTGCTGCAGCTGCTGCCGCCAGGGCAGGTGCAGGTCCACAAGATGAAGGCCGTGTACCTGGCCCTGAACCAGTGCAGCGTGAGCACCACGCACAAGTGCCTCATTGCCGAGGCCTGGTGCTCTGTGCGAGACCTGCCCGCCCTGCAGGAGGCCCTGCGGGACAGCTCGATGGAGGAGGGAGTGAGTGCCGTGGCTCACCGCATCCCCTGCCGGGACATGCCCCCCACACTCATCCGCACCAACCGCTTCACGGCCAGCTTCCAGGGCATCGTGGATGCCTACGGCGTGGGCCGCTACCAGGAGGTCAACCCCGCTCCCTACACCATCATCACCTTCCCCTTCCTGTTTGCTGTGATGTTCGGGGATGTGGGCCACGGGCTGCTCATGTTCCTCTTCGCCCTGGCCATGGTCCTTGCGGAGAACCGACCGGCTGTGAAGGCCGCGCAGAACGAGATCTGGCAGACTTTCTTCAGGGGCCGCTACCTGCTCCTGCTTATGGGCCTGTTCTCCATCTACACCGGCTTCATCTACAACGAGTGCTTCAGTCGCGCCACCAGCATCTTCCCCTCGGGCTGGAGTGTGGCCGCCATGGCCAACCAGTCTGGCTGGAGTGATGCATTCCTGGCCCAGCACACGATGCTTACCCTGGACCCCAACGTCACCGGTGTCTTCCTGGGACCCTACCCCTTTGGCATCGATCCTATTTGGAGCCTGGCTGCCAACCACTTGAGCTTCCTCAACTCCTTCAAGATGAAGATGTCCGTCATCCTGGGCGTCGTGCACATGGCCTTTGGGGTGGTCCTCGGAGTCTTCAACCACGTGCACTTTGGCCAGAGGCACCGGCTGCTGCTGGAGACGCTGCCGGAGCTCACCTTCCTGCTGGGACTCTTCGGTTACCTCGTGTTCCTAGTCATCTACAAGTGGCTGTGTGTCTGGGCTGCCAGGGCCGCCTCGGCCCCCAGCATCCTCATCCACTTCATCAACATGTTCCTCTTCTCCCACAGCCCCAGCAACAGGCTGCTCTACCCCCGGCAGGAGGTGGTCCAGGCCACGCTGGTGGTCCTGGCCTTGGCCATGGTGCCCATCCTGCTGCTTGGCACACCCCTGCACCTGCTGCACCGCCACCGCCGCCGCCTGCGGAGGAGGCCCGCTGACCGACAGGAGGAAAACAAGGCCGGGTTGCTGGACCTGCCTGACGCATCTGTGAATGGCTGGAGCTCCGATGAGGAAAAGGCAGGGGGCCTGGATGATGAAGAGGAGGCCGAGCTCGTCCCCTCCGAGGTGCTCATGCACCAGGCCATCCACACCATCGAGTTCTGCCTGGGCTGCGTCTCCAACACCGCCTCCTACCTGCGCCTGTGGGCCCTGAGCCTGGCCCACGCCCAGCTGTCCGAGGTTCTGTGGGCCATGGTGATGCGCATAGGCCTGGGCCTGGGCCGGGAGGTGGGCGTGGCGGCTGTGGTGCTGGTCCCCATCTTTGCCGCCTTTGCCGTGATGACCGTGGCTATCCTGCTGGTGATGGAGGGACTCTCAGCCTTCCTGCACGCCCTGCGGCTGCACTGGGTGGAATTCCAGAACAAGTTCTACTCAGGCACGGGCTACAAGCTGAGTCCCTTCACCTTCGCTGCCACAGATGACTAGtaagtcgacggatcccccgggctgcaggaattcgagcatcttaccgccatttatacccatatttgttctgtttttcttgatttgggtatacatttaaatgttaataaaacaaaatggtggggcaatcatttacatttttagggatatgtaattactagttcaggtgtattgccacaagacaaacatgttaagaaactttcccgttatttacgctctgttcctgttaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactgatattcttaactatgttgctccttttacgctgtgtggatatgctgctttaatgcctctgtatcatgctattgcttcccgtacggctttcgttttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtccgtcaacgtggcgtggtgtgctctgtgtttgctgacgcaacccccactggctggggcattgccaccacctgtcaactcctttctgggactttcgctttccccctcccgatcgccacggcagaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctaggttgctgggcactgataattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttcg (SEQ ID NO: 10).

[00242] Последовательность белка TCIRG1, кодируемая этим полипептидом, представлена как SEQ ID NO: 11.

[00243] В некоторых случаях рекомбинантный ретровирусный вектор обеспечивает трансген для гена, отличного от гена, связанного с заболеванием или расстройством, или восстанавливает такой ген. Например, не ограничиваясь перечисленным, рекомбинантный ретровирусный вектор может повышающе или понижающе регулировать гены иммунных эффекторов, может изменять маркеры клеточной поверхности, может обеспечивать альтернативные молекулы MHC или может кодировать гены иммуноглобулинов. В частности, предполагается, что в некоторых случаях рекомбинантный ретровирусный вектор или векторы обеспечивают возможность использования трансплантата от аллогенного или несовместимого донора, например, путем изменения иммунных маркеров (например, генов HLA или MHC) или индукции экспрессии генов иммунных эффекторов.

[00244] Кодирующая последовательность, которую необходимо экспрессировать в клетках, может представлять собой любую полинуклеотидную последовательность, например, ген или кДНК, которые кодируют продукт гена, например, терапевтический препарат на основе полипептида или РНК (миРНК, антисмысловой, рибозима, кшРНК и т. д.). Кодирующая последовательность может быть гетерологичной по отношению к промоторной последовательности, с которой она функционально связана, т. е. не быть функционально связанной с ней в природе. В качестве альтернативы, кодирующая последовательность может быть эндогенной по отношению к промоторной последовательности, с которой она функционально связана, т. е. быть свяанной с этим промотором в природе. Продукт гена может действовать внутри клетки млекопитающего или может действовать извне, например, он может секретироваться. Например, когда трансген является терапевтическим геном, кодирующая последовательность может представлять собой любой ген, кодирующий желаемый продукт гена или его функциональный фрагмент или вариант, который может применяться в качестве терапевтического средства для лечения заболевания или расстройства. В различных вариантах осуществления трансген кодирует FANCA человека.

[00245] В некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность трансгена модифицирована или «кодон-оптимизирована» для усиления экспрессии путем замены редко представленных кодонов более часто представленными кодонами. Кодирующая последовательность представляет собой часть последовательности мРНК, которая кодирует аминокислоты для трансляции. Во время трансляции каждый из 61 тринуклеотидного кодона транслируется в одну из 20 аминокислот, что приводит к вырождению или избыточности генетического кода. Однако разные типы клеток и разные виды животных используют тРНК (каждая из которых несет антикодон), кодирующие одни и те же аминокислоты с разной частотой. Когда последовательность гена содержит кодоны, которые редко представлены соответствующей тРНК, трансляционный аппарат рибосом может замедляться, препятствуя эффективной трансляции. Экспрессия может быть улучшена с помощью «оптимизации кодонов» для определенных видов, при которой кодирующую последовательность изменяют так, чтобы она кодировала ту же белковую последовательность, но с использованием кодонов, которые широко представлены и/или используются высокоэкспрессируемыми белками человека (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). В одном из аспектов настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена модифицирована для замены кодонов, редко экспрессируемых у млекопитающих или приматов, на кодоны, часто экспрессируемые у приматов. Например, в некоторых вариантах осуществления кодирующая последовательность, кодируемая трансгеном, кодирует полипептид, обладающий по меньшей мере 85% идентичностью последовательности полипептиду, кодируемому последовательностью, раскрытой выше или в настоящем документе, например, по меньшей мере 90% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере 98% идентичностью последовательности, по меньшей мере 99% идентичностью последовательности, где по меньшей мере один кодон кодирующей последовательности имеет более высокую частоту встречаемости тРНК у людей, чем соответствующий кодон в последовательности, раскрытой выше или в настоящем документе.

[00246] В дополнительных вариантах осуществления кодирующая последовательность трансгена модифицирована для усиления экспрессии путем терминации или удаления открытых рамок считывания (ORF), которые не кодируют желаемый трансген. Открытая рамка считывания (ORF) представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая следует за стартовым кодоном и не содержит стоп-кодона. ORF могут находиться в прямой или обратной ориентации и могут быть «в рамке считывания» или «вне рамки считывания» по сравнению с представляющим интерес геном. Такие открытые рамки считывания потенциально могут быть экспрессированы в кассете экспрессии вместе с представляющим интерес геном и могут привести к нежелательным побочным действиям. В одном из аспектов настоящего изобретения кодирующая последовательность трансгена была модифицирована для удаления открытых рамок считывания путем дополнительного изменения использования кодонов. Это может быть сделано путем удаления стартовых кодонов (ATG) и введения стоп-кодонов (TAG, TAA или TGA) в ORF, находящиеся в обратной ориентации или вне рамки считывания, при сохранении аминокислотной последовательности и поддержании широко используемых кодонов в представляющем интерес гене (т. е. избегая кодонов с частотой <20%). В настоящем изобретении кодирующая последовательность трансгена может быть оптимизирована либо путем оптимизации кодонов и удаления не относящихся к трансгену ORF, либо с помощью обоих методов. Как будет очевидно специалисту в данной области техники, после оптимизации кодонов предпочтительно удалить или минимизировать не относящиеся к трансгену ORF, чтобы удалить ORF, введенные во время оптимизации кодонов.

[00247] Кроме того, как будет понятно специалисту в данной области техники, кассеты экспрессии и рекомбинантные ретровирусные векторы могут необязательно содержать другие элементы, включая, не ограничиваясь перечисленным, сайты рестрикции для облегчения клонирования и регуляторные элементы для конкретного рекомбинантного ретровирусного вектора.

[00248] В некоторых аспектах настоящего изобретения рассматриваемые полинуклеотидные кассеты применяют для доставки гена в клетки, например, для определения влияния этого гена на жизнеспособность и/или функцию клеток, для лечения заболевания клеток и т. д. В различных вариантах осуществления доставка вирусного вектора в клетки путем трансдукции может происходить in vivo, ex vivo или in vitro. Соответственно, в некоторых аспектах изобретения композиция, которая обеспечивает экспрессию трансгена в клетках млекопитающих, представляет собой рекомбинантный ретровирусный вектор, содержащий полинуклеотидную кассету, например, кассету для переноса гена, согласно настоящему изобретению.

[00249] Рекомбинантные ретровирусные векторы, заключающие в себе полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению, могут быть получены с использованием стандартной методики.

[00250] Например, в случае LV вирионов LV вектор экспрессии согласно изобретению может быть введен в клетку-продуцента с последующим введением хелперной конструкции для LV, где указанная хелперная конструкция включает кодирующие области LV, способные экспрессироваться в клетке-продуценте и восполняющие хелперные функции LV, отсутствующие в LV векторе. После этого осуществляют введение хелперного вируса и/или дополнительных векторов в клетку-продуцента, где хелперный вирус и/или дополнительные векторы обеспечивают вспомогательные функции, способные поддерживать эффективную продукцию LV. Затем клетки-продуценты культивируют с получением LV. Эти этапы выполняют по стандартной методике. В частных вариантах осуществления для получения рекомбинантных ретровирусных векторов используют плазмиды, изображенные на ФИГ. 38-41.

Способы получения вирусных векторов

[00251] Рекомбинантные ретровирусные векторы, заключающие в себе полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению, могут быть получены с использованием стандартной методики.

[00252] Например, в случае LV вирионов LV вектор экспрессии согласно изобретению может быть введен в клетку-продуцента с последующим введением хелперной конструкции для LV, где указанная хелперная конструкция включает кодирующие области LV, способные экспрессироваться в клетке-продуценте и восполняющие хелперные функции LV, отсутствующие в LV векторе. После этого осуществляют введение хелперного вируса и/или дополнительных векторов в клетку-продуцента, где хелперный вирус и/или дополнительные векторы обеспечивают вспомогательные функции, способные поддерживать эффективную продукцию LV. Затем клетки-продуценты культивируют с получением LV. Эти этапы выполняют по стандартной методике. В частных вариантах осуществления для получения рекомбинантных ретровирусных векторов используют плазмиды, изображенные на ФИГ. 38-41.

[00253] Может быть использован любой подходящий способ получения вирусных векторов для доставки рассматриваемых полинуклеотидных кассет, включая, не ограничиваясь перечисленным, способы, описанные в следующих ниже примерах. Для приведения в контакт с клетками млекопитающих in vitro или in vivo может быть приготовлена любая концентрация инфекционного вирусного вектора, подходящая для эффективной трансдукции клеток млекопитающих. Например, вирусные частицы могут быть приготовлены с концентрацией 10⁸ инфекционных единиц на мл или более, например, 1x10⁸ инфекционных единиц на мл; 5x10⁸ инфекционных единиц на мл; 10⁹ инфекционных единиц на мл; 5 x 10⁹ инфекционных единиц на мл, 10¹⁰ инфекционных единиц на мл, 5x10¹⁰ инфекционных единиц на мл; 10¹¹ инфекционных единиц на мл; 5 x10¹¹ инфекционных единиц на мл; 10¹² инфекционных единиц на мл; 5x10¹² инфекционных единиц на мл; 10¹³ инфекционных единиц на мл; 1,5 x10¹³ инфекционных единиц на мл; 3x10¹³ инфекционных единиц на мл; 5x10¹³ инфекционных единиц на мл; 7,5x10¹³ инфекционных единиц на мл; 9x10¹³ инфекционных единиц на мл; 1 x 10¹⁴ инфекционных единиц на мл, 5 x 10¹⁴ инфекционных единиц на мл или более, но обычно не более 1 x 10¹⁵ инфекционных единиц на мл.

[00254] При получении рассматриваемых рекомбинантных LV ретровирусных векторов могут быть использованы любые клетки-хозяева для продуцирования LV вирионов, включая, например, клетки млекопитающих (например, клетки HEK 293T). Клетки-хозяева также могут быть пакующими клетками, в которых гены LV gag/pol и Rev стабильно поддерживаются в клетке-хозяине, или клетками-продуцентами, в которых стабильно поддерживается и упаковывается геном LV вектора. LV векторы очищают и вводят в состав препарата с использованием стандартных методик, известных в данной области техники.

Фармацевтические композиции и препараты

[00255] Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции и препараты, содержащие популяции клеток, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Рассматриваемые популяции клеток можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и реагентами, пригодными для приготовления препарата, который является в целом безопасным, нетоксичным и подходящим, и включает вспомогательные вещества, приемлемые для применения у приматов. Примеры таких вспомогательных веществ, носителей или разбавителей включают, не ограничиваясь перечисленным, воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% сывороточный альбумин человека. В состав препаратов также могут быть включены дополнительные активные соединения. Растворы или суспензии, используемые в препаратах, могут включать стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, диметилсульфоксид (ДМСО), жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные соединения, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие соединения, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; детергенты, такие как Tween 20, для предотвращения агрегации; и соединения для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. pH можно регулировать с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроксид натрия. В частных вариантах осуществления препараты являются стерильными.

[00256] В некоторых вариантах осуществления популяции клеток производят в соответствии с действующими Правилами надлежащей производственной практики. Производство в соответствии с действующими Правилами надлежащей производственной практики означает, что препарат, приготовленный для введения, достаточно безопасен, чтобы его можно было вводить человеку в соответствии с регулирующими нормативными положениями и государственными разрешениями. Как правило, регулирующие нормативные положения и разрешения диктуют, что препарат должен соответствовать заранее утвержденным критериям приемлемости в отношении принадлежности, силы действия, качества и чистоты. Критерии приемлемости включают количественные пределы, диапазоны или другие подходящие меры результатов испытаний, используемые для определения того, соответствует ли препарат действующим Правилам надлежащей производственной практики. Нормативная документация устанавливает аналитические процедуры, которые используются для проверки соответствия критериям приемлемости. Препараты могут оцениваться партиями. Партия представляет собой определенное количество препарата, испытанное на соответствие критериям приемлемости.

[00257] Препараты могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор, например, шприц, например, предварительно заполненный шприц, вместе с инструкциями по введению.

[00258] Если это необходимо или целесообразно, препараты могут включать местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции.

[00259] Терапевтически эффективные количества клеток в препаратах могут составлять более 10² клеток, более 10³ клеток, более 10⁴ клеток, более 10⁵ клеток, более 10⁶ клеток, более 10⁷ клеток, более 10⁸ клеток, более 10⁹ клеток, более 10¹⁰ клеток или более 10¹¹. Терапевтически эффективные количества клеток в препаратах могут составлять менее 10³ клеток, менее 10⁴ клеток, менее 10⁵ клеток, менее 10⁶ клеток, менее 10⁷ клеток, менее 10⁸ клеток, менее 10⁹ клеток, менее 10¹⁰ клеток, менее 10¹¹ клеток или менее 10¹². Терапевтически эффективные количества клеток в препаратах могут составлять от 10³ клеток до 10¹² клеток, от 10⁴ клеток до 10¹¹ клеток, от 10⁵ клеток до 10¹⁰ клеток, от 10⁸ клеток до 10¹² клеток, от 10⁹ клеток до 10¹² клеток, от 10⁸ клеток до 10¹⁰ клеток или от 10⁹ клеток до 10¹¹ клеток.

[00260] В препаратах, раскрытых в настоящем документе, клетки обычно содержатся в объеме литр или менее, 500 мл или менее, 250 мл или менее или 100 мл или менее. Следовательно, плотность вводимых клеток обычно составляет более 104 клеток/мл, 10⁷ клеток/мл или 10⁸ клеток/мл.

[00261] Описанные в настоящем документе препараты могут быть приготовлены для введения, например, путем инъекции, инфузии, перфузии или лаважа. Терапевтически эффективные количества для введения могут включать более 10² клеток, более 10³ клеток, более 10⁴ клеток, более 10⁵ клеток, более 10⁶ клеток, более 10⁷ клеток, более 10⁸ клеток, более 10⁹ клеток, более 10¹⁰ клеток или более 10¹¹. В частных вариантах осуществления минимальная доза составляет 2 x 10⁶ клеток/кг массы тела субъекта. Терапевтически эффективные количества для введения могут включать менее 10³ клеток, менее 10⁴ клеток, менее 10⁵ клеток, менее 10⁶ клеток, менее 10⁷ клеток, менее 10⁸ клеток, менее 10⁹ клеток, менее 10¹⁰ клеток, менее 10¹¹ клеток или менее 10¹². В частных вариантах осуществления максимальная доза составляет 2 x 10¹² клеток/кг массы тела субъекта. Терапевтически эффективные количества для введения могут составлять от 10³ клеток до 10¹² клеток, от 10⁴ клеток до 10¹¹ клеток, от 10⁵ клеток до 10¹⁰ клеток, от 10⁸ клеток до 10¹² клеток, от 10⁹ клеток до 10¹² клеток, от 10⁸ клеток до 10¹⁰ клеток или от 10⁹ клеток до 10¹¹ клеток.

[00262] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем документе, содержит терапевтически эффективное количество популяции клеток, как раскрыто в настоящем документе, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или вспомогательным веществом, например, физиологическим раствором, натрий-фосфатным буфером, фосфатом и аминокислотами, полимерами, многоатомными спиртами, сахаром, буферами, консервантами и другими белками. Примеры аминокислот, полимеров, сахаров и тому подобного представляют собой соединения октилфеноксиполиэтоксиэтанола, соединения полиэтиленгликольмоностеарата, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот, сахарозу, фруктозу, декстрозу, мальтозу, глюкозу, маннит, декстран, сорбит, инозит, галактит, ксилит, лактозу, трегалозу, бычий сывороточный альбумин или сывороточный альбумин человека, цитрат, ацетат, растворы Рингера и Хенка, цистеин, аргинин, карнитин, аланин, глицин, лизин, валин, лейцин, поливинилпирролидон, полиэтилен и гликоль. Предпочтительно, чтобы указанный препарат был стабильным в течение по меньшей мере шести месяцев при 4°C. В одном из вариантов осуществления популяция клеток свежеприготовлена из источника in vivo. В одном из вариантов осуществления популяцию клеток замораживают для хранения до включения в состав или после включения в состав фармацевтической композиции.

[00263] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем документе, содержит буфер, такой как натрий-фосфатный буфер (PBS) или фосфат натрия/сульфат натрия, трис-буфер, глициновый буфер, стерильную воду и другие буферы, известные специалисту в данной области техники, такие как описанные в Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. pH буфера, в котором содержится фармацевтическая композиция, содержащая ген-супрессор опухоли, содержащийся в системе для доставки на основе аденовирусного вектора, может находиться в диапазоне от 6,5 до 7,75, предпочтительно от 7 до 7,5 и наиболее предпочтительно от 7,2 до 7,4.

[00264] Все публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в него посредством ссылки для раскрытия и описания методов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Подразумевается, что настоящее раскрытие превалирует над любым раскрытием включенной публикации в той степени, в которой имеет место противоречие.

[00265] Кроме того, следует отметить, что формула изобретения может быть составлена с исключением любого необязательного элемента. В этой связи данное утверждение предназначено для использования в качестве оснований для использования такой исключительной терминологии, как «исключительно», «только» и т. п. в связи с перечислением элементов формулы изобретения, или использования «негативного» признака.

[00266] Обсуждаемые в настоящем документе публикации приведены исключительно в отношении содержащейся в них информации, опубликованной до даты подачи настоящей заявки. Кроме того, указанные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут потребовать отдельного подтверждения.

[00267] Изобретение дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанного в формуле изобретения.

Примеры

Пример 1

Трансдукция гемопоэтических клеток с помощью протаминсульфата и PGE2

[00268] Трансдукция гемопоэтических клеток ретровирусными векторами для клинического применения остается сложной задачей. В частности, из литературы неясно, какие усилители трансдукции или их комбинации вероятнее всего будут наиболее эффективными, или величина эффекта, который может быть достигнут. В этом примере установлено, что комбинация протаминсульфата и PGE2 увеличивает эффективность трансдукции.

[00269] Иллюстративный протокол трансдукции гемопоэтических клеток лентивирусными векторами, как ее проводили в следующих примерах, представлен на ФИГ. 1, однако в различных экспериментах, описанных в примерах, среда для трансдукции не включала УТ, включала один УТ или различные комбинации УТ. Предварительная стимуляция включала культивирование клеток на планшетах, покрытых 2 мкг/см² RetroNectin™ (RN). Среда для трансдукции включала содержимое среды для предварительной стимуляции (среда X-VIVO™ 20 плюс 100 нг/мл rhSCF, 100 нг/мл rhTPO, 100 нг/мл rh-FLT3-L и 20 нг/мл IL-3) и 4 мкг/мл протаминсульфата.

[00270 ] В одном эксперименте гемопоэтические клетки трансдуцировали с помощью псевдотипированного VSVG LV, экспрессирующего репортер трансгена GFP (зеленый флуоресцентный белок). Клетки трансдуцировали 2,5x10⁷ TU/мл или 5x10⁷ TU/мл лентивирусного вектора в культуре в жидкой среде в присутствии PGE2 в различных концентрациях и анализировали для определения VCN спустя 14 дней культивирования в жидкой среде (ФИГ. 2A). Результаты показывают, что возрастающие концентрации PGE2 (10 мкг/мл, 30 мкг/мл или 50 мкг/мл) увеличивают эффективность трансдукции, измеряемую числом копий вектора на клетку.

[00273] В другом эксперименте клетки трансдуцировали 1x10⁷ TU/мл или 1x10⁸ TU/мл лентивирусного вектора в культуре в жидкой среде в присутствии PGE2, и анализировали для определения VCN спустя 14 дней культивирования в жидкой среде (ФИГ. 2B). При обеих концентрациях вектора PGE2 увеличивал эффективность трансдукции согласно результатам определения VCN/клетку. Анализ колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили на трансдуцированных клетках (ФИГ. 3A, КОК = колониеобразующие клетки), а VCN и процент (%) трансдукции анализировали на отдельных колониях (ФИГ. 3B и 3C). При самой высокой протестированной концентрации PGE2 было трансдуцировано вплоть до приблизительно 75% клеток (ФИГ. 3C).

Пример 2

Трансдукция гемопоэтических клеток с помощью протаминсульфата и полоксамера F108

[00272] В этом примере установлено, что протаминсульфат и полоксамер F108 (также известный как полоксамер 338) увеличивают эффективность трансдукции. Тестирование согласно общему протоколу, показанному на ФИГ. 1, проводили в культуре в жидкой среде с использованием полоксамера F108 (LentiBOOST™). Результаты показаны на ФИГ. 4 для VCN в культуре в жидкой среде и ФИГ. 5A-5C для анализа результатов анализа КОЕ (ФИГ. 5A), а также VCN в изолированных одиночных КОЕ (ФИГ. 5B и 5C). При концентрациях 0,5 мг/мл, 1 мг/мл, 2 мг/мл и 4 мг/мл LentiBOOST™ увеличивал эффективность трансдукции псевдотипированного VSVG LV, экспрессирующего репортер трансгена GFP. Как и в случае с PGE2, при самой высокой протестированной концентрации PGE2 было возможным трансдуцировать вплоть до приблизительно 75% клеток (ФИГ. 5C).

Пример 3

Трансдукция гемопоэтических клеток с помощью протаминсульфата, Pge2 и полоксамера F108

[00273] В этом примере было установлено, что комбинация протаминсульфата, PGE2 и LentiBOOST™ неожиданным образом увеличивала эффективность трансдукции свыше результатов, наблюдавшихся с PGE2 либо LentiBOOST™ по отдельности. Проводили тестирование согласно протоколу, показанному на ФИГ. 1, и использовали его для сравнения протаминсульфата (PS), LentiBOOST™ (LB), LB плюс PGE2, PS плюс LB, или PS плюс LB плюс PGE2. LB использовали в концентрации 1 мг/мл, PGE2 использовали в концентрации 10 мкг/мл, а PS использовали в концентрации 4 мкг/мл. Результаты, полученные для VCN в трансдуцированных клетках спустя 14 дней культивирования в жидкой среде, показаны на ФИГ. 6. На ФИГ. 7A показан анализ КОЕ на трансдуцированных клетках, полученных из CB и mPB. Также показано VCN в изолированных колониях в присутствии LB плюс PGE2 плюс PS (ФИГ. 7B, ФИГ. 7E) и показана эффективность трансдукции (ФИГ. 7C, ФИГ. 7D). Как показано на ФИГ. 7C, более 80% клеток было трансдуцировано вектором в этих условиях.

Пример 4

Масштабирование и тестирование способов усиления трансдукции in vivo

[00274] Данный пример демонстрирует, что протоколы, установленные в примерах 1-3, могут быть перенесены в терапевтический вектор и масштабированы для получения достаточного количества вектора для клинических исследований, с использованием пуповинной крови в качестве исходного материала. Масштабирование процедуры трансдукции проводили с использованием CD34-обогащенных клеток пуповинной крови (CB) и LV, полученного из pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO без усилителей трансдукции (кроме PS, который использовали во всех экспериментах) или с усилителями трансдукции (+УТ), в частности, LB, PGE2 и PS. LB использовали в концентрации 1 мг/мл, PGE2 использовали в концентрации 10 мкг/мл, а PS использовали в концентрации 4 мкг/мл. VCN спустя 14 дней культивирования в жидкой среде показано на ФИГ. 8. Результаты анализа КОЕ (ФИГ. 9A), VCN в изолированных отдельных КОЕ (ФИГ. 9B), а также эффективность трансдукции в КОЕ (ФИГ. 9C) показаны в трансдуцированных клетках in vitro до трансплантации на ФИГ. 9A-9C. Результаты показаны для бурстобразующих единиц эритроидного ряда (BFU-E), гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (CFU-GM) и миелоидных предшественников (CFU-GM) на ФИГ. 9B. На ФИГ. 10A и 10B показаны результаты in vivo. CD34⁺ клетки пуповинной крови трансдуцировали в присутствии или в отсутствие усилителей трансдукции (УТ: LB плюс PGE2 плюс PS) терапевтическим LV в течение ночи при множественности заражения (MOI), равной 50. LB использовали в концентрации 1 мг/мл, PGE2 использовали в концентрации 10 мкг/мл, а PS использовали в концентрации 4 мкг/мл. Затем собранные трансдуцированные клетки промывали и суспендировали при плотности 1-2,5×10⁶ клеток/мл. Диапазон 1,3-1,6×10⁵ трансдуцированных клеток внутривенно трансплантировали иммунодефицитным мышам NSG, облученным 1,5 Гр, в качестве ксеногенной модели гемопоэза человека. Процент (%)CD45-положительных (hCD45⁺) клеток чеовека (ФИГ. 10A) и VCN/клетку (ФИГ. 10B) оценивали через один (1), два (2) или три (3) месяца после трансплантации (мпт) в клетках костного мозга, взятых у перенесших трансплантацию животных.

Пример 5

Продукция LV в условиях, соответствующих Правилам надлежащей производственной практики (GMP), и трансдукция mPB

[00275] Данный пример демонстрирует, что протоколы, установленные в примерах 1-4, могут быть перенесены в терапевтический вектор и масштабированы для получения достаточного количества вектора для клинических исследований, с использованием мобилизованной периферической крови в качестве исходного материала. Осуществляли продукцию LV согласно GMP и использовали в следующей серии экспериментов, проведенных с использованием CD34+ гемопоэтических стволовых клеток, очищенных из мобилизованной периферической крови (mPB) от здорового донора. LV вектор представлял собой псевдотипированный VSVG LV, экспрессирующий трансген FANCA, который был получен с использованием вектора для переноса pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO. На ФИГ. 11 показано VCN/клетку в трансдуцированных клетках спустя 14 дней культивирования в жидкой среде с (+УТ) усилителями трансдукции PS, LB и PGE2 и при двух разных MOI, или без них (-УТ). LB использовали в концентрации 1 мг/мл, PGE2 использовали в концентрации 10 мкг/мл, а PS использовали в концентрации 4 мкг/мл. На ФИГ. 12A-12D показаны результаты анализов колониеобразующих единиц (КОЕ) для всех клеток, BFU, GM и смешанных миелоидных предшественников для GMP003 с (+УТ) усилителями трансдукции PS, LB и PGE2 при двух разных MOI, или без них (-УТ). На ФИГ. 13A и 13B показаны VCN в изолированных одиночных КОЕ для GMP003 с (+УТ) усилителями трансдукции PS, LB и PGE2 при 20 или 50 MOI, или без них (-УТ). Результаты показаны для бурстобразующих единиц эритроидного ряда (BFU-E), гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (CFU-GM) и миелоидных предшественников (CFU-GM). На ФИГ. 14A и 14B показана эффективность трансдукции и VCN в КОЕ с (+УТ) усилителями трансдукции PS, LB и PGE2 или без них (-УТ) для бурстобразующих единиц эритроидного ряда (BFU-E), гранулоцитарно-макрофагальных предшественников (GM) и миелоидных предшественников (смешанных).

--->

Перечень последовательностей

<110> CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGETICAS, MEDIOAMBIENTALES Y

TECNOLOGICAS, O.A., M.P.

CONSORCIO CENTRO DE INVESTIGACION BIOMEDICA EN RED, M.P.

FUNDACION INSTITUTO DE INVESTIGACION SANITARIA FUNDACION

JIMENEZ DIAZ

ROCKET PHARMACEUTICALS, LTD.

<120> METHODS FOR GENE MODIFICATION OF HEMATOPOIETIC CELLS

<130> ROPA-010/01WO 329592-2074

<150> US 62/712,146

<151> 2018-07-30

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5554

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCCL-PGK-FANCAW-82-PRO vector sequence

<400> 1

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccc ccgggctgca ggaattcatg 540

tccgactcgt gggtcccgaa ctccgcctcg ggccaggacc cagggggccg ccggagggcc 600

tgggccgagc tgctggcggg aagggtcaag agggaaaaat ataatcctga aagggcacag 660

aaattaaagg aatcagctgt gcgcctcctg cgaagccatc aggacctgaa tgcccttttg 720

cttgaggtag aaggtccact gtgtaaaaaa ttgtctctca gcaaagtgat tgactgtgac 780

agttctgagg cctatgctaa tcattctagt tcatttatag gctctgcttt gcaggatcaa 840

gcctcaaggc tgggggttcc cgtgggtatt ctctcagccg ggatggttgc ctctagcgtg 900

ggacagatct gcacggctcc agcggagacc agtcaccctg tgctgctgac tgtggagcag 960

agaaagaagc tgtcttccct gttagagttt gctcagtatt tattggcaca cagtatgttc 1020

tcccgtcttt ccttctgtca agaattatgg aaaatacaga gttctttgtt gcttgaagcg 1080

gtgtggcatc ttcacgtaca aggcattgtg agcctgcaag agctgctgga aagccatccc 1140

gacatgcatg ctgtgggatc gtggctcttc aggaatctgt gctgcctttg tgaacagatg 1200

gaagcatcct gccagcatgc tgacgtcgcc agggccatgc tttctgattt tgttcaaatg 1260

tttgttttga ggggatttca gaaaaactca gatctgagaa gaactgtgga gcctgaaaaa 1320

atgccgcagg tcacggttga tgtactgcag agaatgctga tttttgcact tgacgctttg 1380

gctgctggag tacaggagga gtcctccact cacaagatcg tgaggtgctg gttcggagtg 1440

ttcagtggac acacgcttgg cagtgtaatt tccacagatc ctctgaagag gttcttcagt 1500

cataccctga ctcagatact cactcacagc cctgtgctga aagcatctga tgctgttcag 1560

atgcagagag agtggagctt tgcgcggaca caccctctgc tcacctcact gtaccgcagg 1620

ctctttgtga tgctgagtgc agaggagttg gttggccatt tgcaagaagt tctggaaacg 1680

caggaggttc actggcagag agtgctctcc tttgtgtctg ccctggttgt ctgctttcca 1740

gaagcgcagc agctgcttga agactgggtg gcgcgtttga tggcccaggc attcgagagc 1800

tgccagctgg acagcatggt cactgcgttc ctggttgtgc gccaggcagc actggagggc 1860

ccctctgcgt tcctgtcata tgcagactgg ttcaaggcct cctttgggag cacacgaggc 1920

taccatggct gcagcaagaa ggccctggtc ttcctgttta cgttcttgtc agaactcgtg 1980

ccttttgagt ctccccggta cctgcaggtg cacattctcc acccacccct ggttcccagc 2040

aagtaccgct ccctcctcac agactacatc tcattggcca agacacggct ggccgacctc 2100

aaggtttcta tagaaaacat gggactctac gaggatttgt catcagctgg ggacattact 2160

gagccccaca gccaagctct tcaggatgtt gaaaaggcca tcatggtgtt tgagcatacg 2220

gggaacatcc cagtcaccgt catggaggcc agcatattca ggaggcctta ctacgtgtcc 2280

cacttcctcc ccgccctgct cacacctcga gtgctcccca aagtccctga ctcccgtgtg 2340

gcgtttatag agtctctgaa gagagcagat aaaatccccc catctctgta ctccacctac 2400

tgccaggcct gctctgctgc tgaagagaag ccagaagatg cagccctggg agtgagggca 2460

gaacccaact ctgctgagga gcccctggga cagctcacag ctgcactggg agagctgaga 2520

gcctccatga cagaccccag ccagcgtgat gttatatcgg cacaggtggc agtgatttct 2580

gaaagactga gggctgtcct gggccacaat gaggatgaca gcagcgttga gatatcaaag 2640

attcagctca gcatcaacac gccgagactg gagccacggg aacacattgc tgtggacctc 2700

ctgctgacgt ctttctgtca gaacctgatg gctgcctcca gtgtcgctcc cccggagagg 2760

cagggtccct gggctgccct cttcgtgagg accatgtgtg gacgtgtgct ccctgcagtg 2820

ctcacccggc tctgccagct gctccgtcac cagggcccga gcctgagtgc cccacatgtg 2880

ctggggttgg ctgccctggc cgtgcacctg ggtgagtcca ggtctgcgct cccagaggtg 2940

gatgtgggtc ctcctgcacc tggtgctggc cttcctgtcc ctgcgctctt tgacagcctc 3000

ctgacctgta ggacgaggga ttccttgttc ttctgcctga aattttgtac agcagcaatt 3060

tcttactctc tctgcaagtt ttcttcccag tcacgagata ctttgtgcag ctgcttatct 3120

ccaggcctta ttaaaaagtt tcagttcctc atgttcagat tgttctcaga ggcccgacag 3180

cctctttctg aggaggacgt agccagcctt tcctggagac ccttgcacct tccttctgca 3240

gactggcaga gagctgccct ctctctctgg acacacagaa ccttccgaga ggtgttgaaa 3300

gaggaagatg ttcacttaac ttaccaagac tggttacacc tggagctgga aattcaacct 3360

gaagctgatg ctctttcaga tactgaacgg caggacttcc accagtgggc gatccatgag 3420

cactttctcc ctgagtcctc ggcttcaggg ggctgtgacg gagacctgca ggctgcgtgt 3480

accattcttg tcaacgcact gatggatttc caccaaagct caaggagtta tgaccactca 3540

gaaaattctg atttggtctt tggtggccgc acaggaaatg aggatattat ttccagattg 3600

caggagatgg tagctgacct ggagctgcag caagacctca tagtgcctct cggccacacc 3660

ccttcccagg agcacttcct ctttgagatt ttccgcagac ggctccaggc tctgacaagc 3720

gggtggagcg tggctgccag ccttcagaga cagagggagc tgctaatgta caaacggatc 3780

ctcctccgcc tgccttcgtc tgtcctctgc ggcagcagct tccaggcaga acagcccatc 3840

actgccagat gcgagcagtt cttccacttg gtcaactctg agatgagaaa cttctgctcc 3900

cacggaggtg ccctgacaca ggacatcact gcccacttct tcaggggcct cctgaacgcc 3960

tgtctgcgga gcagagaccc ctccctgatg gtcgacttca tactggccaa gtgccagacg 4020

aaatgcccct taattttgac ctctgctctg gtgtggtggc cgagcctgga gcctgtgctg 4080

ctctgccggt ggaggagaca ctgccagagc ccgctgcccc gggaactgca gaagctacaa 4140

gaaggccggc agtttgccag cgatttcctc tcccctgagg ctgcctcccc agcacccaac 4200

ccggactggc tctcagctgc tgcactgcac tttgcgattc aacaagtcag ggaagaaaac 4260

atcaggaagc agctaaagaa gctggactgc gagagagagg agctattggt tttccttttc 4320

ttcttctcct tgatgggcct gctgtcgtca catctgacct caaatagcac cacagacctg 4380

ccaaaggctt tccacgtttg tgcagcaatc ctcgagtgtt tagagaagag gaagatatcc 4440

tggctggcac tctttcagtt gacagagagt gacctcaggc tggggcggct cctcctccgt 4500

gtggccccgg atcagcacac caggctgctg cctttcgctt tttacagtct tctctcctac 4560

ttccatgaag acgcggccat cagggaagag gccttcctgc atgttgctgt ggacatgtac 4620

ttgaagctgg tccagctctt cgtggctggg gatacaagca cagtttcacc tccagctggc 4680

aggagcctgg agctcaaggg tcagggcaac cccgtggaac tgataacaaa agctcgtctt 4740

tttctgctgc agttaatacc tcggtgcccg aaaaagagct tctcacacgt ggcagagctg 4800

ctggctgatc gtggggactg cgacccagag gtgagcgccg ccctccagag cagacagcag 4860

gctgcccctg acgctgacct gtcccaggag cctcatctct tctgatgaga attcgatatc 4920

aagcttatcg ataccgtcga atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt 4980

tattcccata tttgttctgt ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca 5040

aaatggtggg gcaatcattt acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg 5100

ccacaagaca aacatgttaa gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa 5160

cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt 5220

acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct 5280

ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc 5340

gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg 5400

ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc 5460

acggcagaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc 5520

actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ggcc 5554

<210> 2

<211> 1455

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Asp Ser Trp Val Pro Asn Ser Ala Ser Gly Gln Asp Pro Gly

1 5 10 15

Gly Arg Arg Arg Ala Trp Ala Glu Leu Leu Ala Gly Arg Val Lys Arg

20 25 30

Glu Lys Tyr Asn Pro Glu Arg Ala Gln Lys Leu Lys Glu Ser Ala Val

35 40 45

Arg Leu Leu Arg Ser His Gln Asp Leu Asn Ala Leu Leu Leu Glu Val

50 55 60

Glu Gly Pro Leu Cys Lys Lys Leu Ser Leu Ser Lys Val Ile Asp Cys

65 70 75 80

Asp Ser Ser Glu Ala Tyr Ala Asn His Ser Ser Ser Phe Ile Gly Ser

85 90 95

Ala Leu Gln Asp Gln Ala Ser Arg Leu Gly Val Pro Val Gly Ile Leu

100 105 110

Ser Ala Gly Met Val Ala Ser Ser Val Gly Gln Ile Cys Thr Ala Pro

115 120 125

Ala Glu Thr Ser His Pro Val Leu Leu Thr Val Glu Gln Arg Lys Lys

130 135 140

Leu Ser Ser Leu Leu Glu Phe Ala Gln Tyr Leu Leu Ala His Ser Met

145 150 155 160

Phe Ser Arg Leu Ser Phe Cys Gln Glu Leu Trp Lys Ile Gln Ser Ser

165 170 175

Leu Leu Leu Glu Ala Val Trp His Leu His Val Gln Gly Ile Val Ser

180 185 190

Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ser His Pro Asp Met His Ala Val Gly Ser

195 200 205

Trp Leu Phe Arg Asn Leu Cys Cys Leu Cys Glu Gln Met Glu Ala Ser

210 215 220

Cys Gln His Ala Asp Val Ala Arg Ala Met Leu Ser Asp Phe Val Gln

225 230 235 240

Met Phe Val Leu Arg Gly Phe Gln Lys Asn Ser Asp Leu Arg Arg Thr

245 250 255

Val Glu Pro Glu Lys Met Pro Gln Val Thr Val Asp Val Leu Gln Arg

260 265 270

Met Leu Ile Phe Ala Leu Asp Ala Leu Ala Ala Gly Val Gln Glu Glu

275 280 285

Ser Ser Thr His Lys Ile Val Arg Cys Trp Phe Gly Val Phe Ser Gly

290 295 300

His Thr Leu Gly Ser Val Ile Ser Thr Asp Pro Leu Lys Arg Phe Phe

305 310 315 320

Ser His Thr Leu Thr Gln Ile Leu Thr His Ser Pro Val Leu Lys Ala

325 330 335

Ser Asp Ala Val Gln Met Gln Arg Glu Trp Ser Phe Ala Arg Thr His

340 345 350

Pro Leu Leu Thr Ser Leu Tyr Arg Arg Leu Phe Val Met Leu Ser Ala

355 360 365

Glu Glu Leu Val Gly His Leu Gln Glu Val Leu Glu Thr Gln Glu Val

370 375 380

His Trp Gln Arg Val Leu Ser Phe Val Ser Ala Leu Val Val Cys Phe

385 390 395 400

Pro Glu Ala Gln Gln Leu Leu Glu Asp Trp Val Ala Arg Leu Met Ala

405 410 415

Gln Ala Phe Glu Ser Cys Gln Leu Asp Ser Met Val Thr Ala Phe Leu

420 425 430

Val Val Arg Gln Ala Ala Leu Glu Gly Pro Ser Ala Phe Leu Ser Tyr

435 440 445

Ala Asp Trp Phe Lys Ala Ser Phe Gly Ser Thr Arg Gly Tyr His Gly

450 455 460

Cys Ser Lys Lys Ala Leu Val Phe Leu Phe Thr Phe Leu Ser Glu Leu

465 470 475 480

Val Pro Phe Glu Ser Pro Arg Tyr Leu Gln Val His Ile Leu His Pro

485 490 495

Pro Leu Val Pro Ser Lys Tyr Arg Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ile Ser

500 505 510

Leu Ala Lys Thr Arg Leu Ala Asp Leu Lys Val Ser Ile Glu Asn Met

515 520 525

Gly Leu Tyr Glu Asp Leu Ser Ser Ala Gly Asp Ile Thr Glu Pro His

530 535 540

Ser Gln Ala Leu Gln Asp Val Glu Lys Ala Ile Met Val Phe Glu His

545 550 555 560

Thr Gly Asn Ile Pro Val Thr Val Met Glu Ala Ser Ile Phe Arg Arg

565 570 575

Pro Tyr Tyr Val Ser His Phe Leu Pro Ala Leu Leu Thr Pro Arg Val

580 585 590

Leu Pro Lys Val Pro Asp Ser Arg Val Ala Phe Ile Glu Ser Leu Lys

595 600 605

Arg Ala Asp Lys Ile Pro Pro Ser Leu Tyr Ser Thr Tyr Cys Gln Ala

610 615 620

Cys Ser Ala Ala Glu Glu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Leu Gly Val Arg

625 630 635 640

Ala Glu Pro Asn Ser Ala Glu Glu Pro Leu Gly Gln Leu Thr Ala Ala

645 650 655

Leu Gly Glu Leu Arg Ala Ser Met Thr Asp Pro Ser Gln Arg Asp Val

660 665 670

Ile Ser Ala Gln Val Ala Val Ile Ser Glu Arg Leu Arg Ala Val Leu

675 680 685

Gly His Asn Glu Asp Asp Ser Ser Val Glu Ile Ser Lys Ile Gln Leu

690 695 700

Ser Ile Asn Thr Pro Arg Leu Glu Pro Arg Glu His Ile Ala Val Asp

705 710 715 720

Leu Leu Leu Thr Ser Phe Cys Gln Asn Leu Met Ala Ala Ser Ser Val

725 730 735

Ala Pro Pro Glu Arg Gln Gly Pro Trp Ala Ala Leu Phe Val Arg Thr

740 745 750

Met Cys Gly Arg Val Leu Pro Ala Val Leu Thr Arg Leu Cys Gln Leu

755 760 765

Leu Arg His Gln Gly Pro Ser Leu Ser Ala Pro His Val Leu Gly Leu

770 775 780

Ala Ala Leu Ala Val His Leu Gly Glu Ser Arg Ser Ala Leu Pro Glu

785 790 795 800

Val Asp Val Gly Pro Pro Ala Pro Gly Ala Gly Leu Pro Val Pro Ala

805 810 815

Leu Phe Asp Ser Leu Leu Thr Cys Arg Thr Arg Asp Ser Leu Phe Phe

820 825 830

Cys Leu Lys Phe Cys Thr Ala Ala Ile Ser Tyr Ser Leu Cys Lys Phe

835 840 845

Ser Ser Gln Ser Arg Asp Thr Leu Cys Ser Cys Leu Ser Pro Gly Leu

850 855 860

Ile Lys Lys Phe Gln Phe Leu Met Phe Arg Leu Phe Ser Glu Ala Arg

865 870 875 880

Gln Pro Leu Ser Glu Glu Asp Val Ala Ser Leu Ser Trp Arg Pro Leu

885 890 895

His Leu Pro Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ala Ala Leu Ser Leu Trp Thr

900 905 910

His Arg Thr Phe Arg Glu Val Leu Lys Glu Glu Asp Val His Leu Thr

915 920 925

Tyr Gln Asp Trp Leu His Leu Glu Leu Glu Ile Gln Pro Glu Ala Asp

930 935 940

Ala Leu Ser Asp Thr Glu Arg Gln Asp Phe His Gln Trp Ala Ile His

945 950 955 960

Glu His Phe Leu Pro Glu Ser Ser Ala Ser Gly Gly Cys Asp Gly Asp

965 970 975

Leu Gln Ala Ala Cys Thr Ile Leu Val Asn Ala Leu Met Asp Phe His

980 985 990

Gln Ser Ser Arg Ser Tyr Asp His Ser Glu Asn Ser Asp Leu Val Phe

995 1000 1005

Gly Gly Arg Thr Gly Asn Glu Asp Ile Ile Ser Arg Leu Gln Glu

1010 1015 1020

Met Val Ala Asp Leu Glu Leu Gln Gln Asp Leu Ile Val Pro Leu

1025 1030 1035

Gly His Thr Pro Ser Gln Glu His Phe Leu Phe Glu Ile Phe Arg

1040 1045 1050

Arg Arg Leu Gln Ala Leu Thr Ser Gly Trp Ser Val Ala Ala Ser

1055 1060 1065

Leu Gln Arg Gln Arg Glu Leu Leu Met Tyr Lys Arg Ile Leu Leu

1070 1075 1080

Arg Leu Pro Ser Ser Val Leu Cys Gly Ser Ser Phe Gln Ala Glu

1085 1090 1095

Gln Pro Ile Thr Ala Arg Cys Glu Gln Phe Phe His Leu Val Asn

1100 1105 1110

Ser Glu Met Arg Asn Phe Cys Ser His Gly Gly Ala Leu Thr Gln

1115 1120 1125

Asp Ile Thr Ala His Phe Phe Arg Gly Leu Leu Asn Ala Cys Leu

1130 1135 1140

Arg Ser Arg Asp Pro Ser Leu Met Val Asp Phe Ile Leu Ala Lys

1145 1150 1155

Cys Gln Thr Lys Cys Pro Leu Ile Leu Thr Ser Ala Leu Val Trp

1160 1165 1170

Trp Pro Ser Leu Glu Pro Val Leu Leu Cys Arg Trp Arg Arg His

1175 1180 1185

Cys Gln Ser Pro Leu Pro Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gln Glu Gly

1190 1195 1200

Arg Gln Phe Ala Ser Asp Phe Leu Ser Pro Glu Ala Ala Ser Pro

1205 1210 1215

Ala Pro Asn Pro Asp Trp Leu Ser Ala Ala Ala Leu His Phe Ala

1220 1225 1230

Ile Gln Gln Val Arg Glu Glu Asn Ile Arg Lys Gln Leu Lys Lys

1235 1240 1245

Leu Asp Cys Glu Arg Glu Glu Leu Leu Val Phe Leu Phe Phe Phe

1250 1255 1260

Ser Leu Met Gly Leu Leu Ser Ser His Leu Thr Ser Asn Ser Thr

1265 1270 1275

Thr Asp Leu Pro Lys Ala Phe His Val Cys Ala Ala Ile Leu Glu

1280 1285 1290

Cys Leu Glu Lys Arg Lys Ile Ser Trp Leu Ala Leu Phe Gln Leu

1295 1300 1305

Thr Glu Ser Asp Leu Arg Leu Gly Arg Leu Leu Leu Arg Val Ala

1310 1315 1320

Pro Asp Gln His Thr Arg Leu Leu Pro Phe Ala Phe Tyr Ser Leu

1325 1330 1335

Leu Ser Tyr Phe His Glu Asp Ala Ala Ile Arg Glu Glu Ala Phe

1340 1345 1350

Leu His Val Ala Val Asp Met Tyr Leu Lys Leu Val Gln Leu Phe

1355 1360 1365

Val Ala Gly Asp Thr Ser Thr Val Ser Pro Pro Ala Gly Arg Ser

1370 1375 1380

Leu Glu Leu Lys Gly Gln Gly Asn Pro Val Glu Leu Ile Thr Lys

1385 1390 1395

Ala Arg Leu Phe Leu Leu Gln Leu Ile Pro Arg Cys Pro Lys Lys

1400 1405 1410

Ser Phe Ser His Val Ala Glu Leu Leu Ala Asp Arg Gly Asp Cys

1415 1420 1425

Asp Pro Glu Val Ser Ala Ala Leu Gln Ser Arg Gln Gln Ala Ala

1430 1435 1440

Pro Asp Ala Asp Leu Ser Gln Glu Pro His Leu Phe

1445 1450 1455

<210> 3

<211> 3903

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCCL-ChimhCD18W-82-RO vector sequence

<400> 3

cgcgtctgcc agctttcttg ctttgctgga gtattctgga atttgatggg ttgagggttc 60

tggacacaat gccccaagcc ccttccttgt tgtgctgggt tcctatttct gctctcggca 120

ctgacttagc agctgctcaa gagctcacca tgttggcttg gattacacgg tctcacccac 180

atctccggca gtttgtgggc aaacttcctg agcagccttg ggtgatgaaa cctttcatgg 240

tagcaggaga atgggactgt gaattctcaa tcccctgtcc ccaccccttc cttcctctct 300

cagggccttg ctgtctagga ggagggagca cagcagcaac tgactgggca gcctttcagg 360

aaaggctagc ccgggctcga tcgagaagct tgataattcc gtgaggtggg gagggctggg 420

accagggttc cctctttctc ttctgcggtg gccctggcct ggtgctagga ctgcgcgcct 480

cccctcagta cccgcggaca ccctgggctt ccctgggccc agcatctgcc tggggcctcg 540

ccctgggctc cccctcctga cccccacctt gcgccccttc ccggtgttcc cggggcgctg 600

ccgggccctg gggcctgcgg ggcgcgggcg gctcttggct gggccattct ttcccggccc 660

cctcctccct tccgtttccg tggccgtgcg gccggctaga ggctgcggcc cagcgcggag 720

caggggggct ggcaggcgtc ggggcggtcg ggccggtccc gcccgcccct tcccctccac 780

aggcccgccc cggggcctgg gccaactgaa accgcgggag gaggaagcgc ggaatcagga 840

actggccggg gtccgcaccg ggcctgagtc ggtccgaggc cgtcccagga gcagctgccc 900

gaagggcgaa ttgggggatc ccccgggcta atgccaactt tgtacaaaaa agcaggctcc 960

accatgctgg gcctgcgccc cccacttctc gccctggtgg ggctgctctc cctcgggtgc 1020

gtcctctctc aggagtgcac gaagttcaag gtcagcagct gccgggaatg catcgagtcg 1080

gggcccggct gcacctggtg ccagaagctg aacttcacag ggccggggga tcctgactcc 1140

attcgctgcg acacccggcc acagctgctc atgaggggct gtgcggctga cgacatcatg 1200

gaccccacaa gcctcgctga aacccaggaa gaccacaatg ggggccagaa gcagctgtcc 1260

ccacaaaaag tgacgcttta cctgcgacca ggccaggcag cagcgttcaa cgtgaccttc 1320

cggcgggcca agggctaccc catcgacctg tactatctga tggacctctc ctactccatg 1380

cttgatgacc tcaggaatgt caagaagcta ggtggcgacc tgctccgggc cctcaacgag 1440

atcaccgagt ccggccgcat tggcttcggg tccttcgtgg acaagaccgt gctgccgttc 1500

gtgaacacgc accctgataa gctgcgaaac ccatgcccca acaaggagaa agagtgccag 1560

cccccgtttg ccttcaggca cgtgctgaag ctgaccaaca actccaacca gtttcagacc 1620

gaggtcggga agcagctgat ttccggaaac ctggatgcac ccgagggtgg gctggacgcc 1680

atgatgcagg tcgccgcctg cccggaggaa atcggctggc gcaacgtcac gcggctgctg 1740

gtgtttgcca ctgatgacgg cttccatttc gcgggcgacg ggaagctggg cgccatcctg 1800

acccccaacg acggccgctg tcacctggag gacaacttgt acaagaggag caacgaattc 1860

gactacccat cggtgggcca gctggcgcac aagctggctg aaaacaacat ccagcccatc 1920

ttcgcggtga ccagtaggat ggtgaagacc tacgagaaac tcaccgagat catccccaag 1980

tcagccgtgg gggagctgtc tgaggactcc agcaatgtgg tccatctcat taagaatgct 2040

tacaataaac tctcctccag ggtattcctg gatcacaacg ccctccccga caccctgaaa 2100

gtcacctacg actccttctg cagcaatgga gtgacgcaca ggaaccagcc cagaggtgac 2160

tgtgatggcg tgcagatcaa tgtcccgatc accttccagg tgaaggtcac ggccacagag 2220

tgcatccagg agcagtcgtt tgtcatccgg gcgctgggct tcacggacat agtgaccgtg 2280

caggtccttc cccagtgtga gtgccggtgc cgggaccaga gcagagaccg cagcctctgc 2340

catggcaagg gcttcttgga gtgcggcatc tgcaggtgtg acactggcta cattgggaaa 2400

aactgtgagt gccagacaca gggccggagc agccaggagc tggaaggaag ctgccggaag 2460

gacaacaact ccatcatctg ctcagggctg ggggactgtg tctgcgggca gtgcctgtgc 2520

cacaccagcg acgtccccgg caagctgata tacgggcagt actgcgagtg tgacaccatc 2580

aactgtgagc gctacaacgg ccaggtctgc ggcggcccgg ggagggggct ctgcttctgc 2640

gggaagtgcc gctgccaccc gggctttgag ggctcagcgt gccagtgcga gaggaccact 2700

gagggctgcc tgaacccgcg gcgtgttgag tgtagtggtc gtggccggtg ccgctgcaac 2760

gtatgcgagt gccattcagg ctaccagctg cctctgtgcc aggagtgccc cggctgcccc 2820

tcaccctgtg gcaagtacat ctcctgcgcc gagtgcctga agttcgaaaa gggccccttt 2880

gggaagaact gcagcgcggc gtgtccgggc ctgcagctgt cgaacaaccc cgtgaagggc 2940

aggacctgca aggagaggga ctcagagggc tgctgggtgg cctacacgct ggagcagcag 3000

gacgggatgg accgctacct catctatgtg gatgagagcc gagagtgtgt ggcaggcccc 3060

aacatcgccg ccatcgtcgg gggcaccgtg gcaggcatcg tgctgatcgg cattctcctg 3120

ctggtcatct ggaaggctct gatccacctg agcgacctcc gggagtacag gcgctttgag 3180

aaggagaagc tcaagtccca gtggaacaat gataatcccc ttttcaagag cgccaccacg 3240

acggtcatga accccaagtt tgctgagagt taggacccag ctttcttgta caaagttggc 3300

attaggaatt cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt 3360

tgggtataca tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg 3420

gatatgtaat tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc 3480

gttatttacg ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 3540

ctgatattct taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc 3600

tgtatcatgc tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt 3660

tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg 3720

tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg 3780

ggactttcgc tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc 3840

gctgctggac aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg 3900

gcc 3903

<210> 4

<211> 769

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Leu Gly Leu Arg Pro Pro Leu Leu Ala Leu Val Gly Leu Leu Ser

1 5 10 15

Leu Gly Cys Val Leu Ser Gln Glu Cys Thr Lys Phe Lys Val Ser Ser

20 25 30

Cys Arg Glu Cys Ile Glu Ser Gly Pro Gly Cys Thr Trp Cys Gln Lys

35 40 45

Leu Asn Phe Thr Gly Pro Gly Asp Pro Asp Ser Ile Arg Cys Asp Thr

50 55 60

Arg Pro Gln Leu Leu Met Arg Gly Cys Ala Ala Asp Asp Ile Met Asp

65 70 75 80

Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Gln Glu Asp His Asn Gly Gly Gln Lys

85 90 95

Gln Leu Ser Pro Gln Lys Val Thr Leu Tyr Leu Arg Pro Gly Gln Ala

100 105 110

Ala Ala Phe Asn Val Thr Phe Arg Arg Ala Lys Gly Tyr Pro Ile Asp

115 120 125

Leu Tyr Tyr Leu Met Asp Leu Ser Tyr Ser Met Leu Asp Asp Leu Arg

130 135 140

Asn Val Lys Lys Leu Gly Gly Asp Leu Leu Arg Ala Leu Asn Glu Ile

145 150 155 160

Thr Glu Ser Gly Arg Ile Gly Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Thr Val

165 170 175

Leu Pro Phe Val Asn Thr His Pro Asp Lys Leu Arg Asn Pro Cys Pro

180 185 190

Asn Lys Glu Lys Glu Cys Gln Pro Pro Phe Ala Phe Arg His Val Leu

195 200 205

Lys Leu Thr Asn Asn Ser Asn Gln Phe Gln Thr Glu Val Gly Lys Gln

210 215 220

Leu Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ala Pro Glu Gly Gly Leu Asp Ala Met

225 230 235 240

Met Gln Val Ala Ala Cys Pro Glu Glu Ile Gly Trp Arg Asn Val Thr

245 250 255

Arg Leu Leu Val Phe Ala Thr Asp Asp Gly Phe His Phe Ala Gly Asp

260 265 270

Gly Lys Leu Gly Ala Ile Leu Thr Pro Asn Asp Gly Arg Cys His Leu

275 280 285

Glu Asp Asn Leu Tyr Lys Arg Ser Asn Glu Phe Asp Tyr Pro Ser Val

290 295 300

Gly Gln Leu Ala His Lys Leu Ala Glu Asn Asn Ile Gln Pro Ile Phe

305 310 315 320

Ala Val Thr Ser Arg Met Val Lys Thr Tyr Glu Lys Leu Thr Glu Ile

325 330 335

Ile Pro Lys Ser Ala Val Gly Glu Leu Ser Glu Asp Ser Ser Asn Val

340 345 350

Val His Leu Ile Lys Asn Ala Tyr Asn Lys Leu Ser Ser Arg Val Phe

355 360 365

Leu Asp His Asn Ala Leu Pro Asp Thr Leu Lys Val Thr Tyr Asp Ser

370 375 380

Phe Cys Ser Asn Gly Val Thr His Arg Asn Gln Pro Arg Gly Asp Cys

385 390 395 400

Asp Gly Val Gln Ile Asn Val Pro Ile Thr Phe Gln Val Lys Val Thr

405 410 415

Ala Thr Glu Cys Ile Gln Glu Gln Ser Phe Val Ile Arg Ala Leu Gly

420 425 430

Phe Thr Asp Ile Val Thr Val Gln Val Leu Pro Gln Cys Glu Cys Arg

435 440 445

Cys Arg Asp Gln Ser Arg Asp Arg Ser Leu Cys His Gly Lys Gly Phe

450 455 460

Leu Glu Cys Gly Ile Cys Arg Cys Asp Thr Gly Tyr Ile Gly Lys Asn

465 470 475 480

Cys Glu Cys Gln Thr Gln Gly Arg Ser Ser Gln Glu Leu Glu Gly Ser

485 490 495

Cys Arg Lys Asp Asn Asn Ser Ile Ile Cys Ser Gly Leu Gly Asp Cys

500 505 510

Val Cys Gly Gln Cys Leu Cys His Thr Ser Asp Val Pro Gly Lys Leu

515 520 525

Ile Tyr Gly Gln Tyr Cys Glu Cys Asp Thr Ile Asn Cys Glu Arg Tyr

530 535 540

Asn Gly Gln Val Cys Gly Gly Pro Gly Arg Gly Leu Cys Phe Cys Gly

545 550 555 560

Lys Cys Arg Cys His Pro Gly Phe Glu Gly Ser Ala Cys Gln Cys Glu

565 570 575

Arg Thr Thr Glu Gly Cys Leu Asn Pro Arg Arg Val Glu Cys Ser Gly

580 585 590

Arg Gly Arg Cys Arg Cys Asn Val Cys Glu Cys His Ser Gly Tyr Gln

595 600 605

Leu Pro Leu Cys Gln Glu Cys Pro Gly Cys Pro Ser Pro Cys Gly Lys

610 615 620

Tyr Ile Ser Cys Ala Glu Cys Leu Lys Phe Glu Lys Gly Pro Phe Gly

625 630 635 640

Lys Asn Cys Ser Ala Ala Cys Pro Gly Leu Gln Leu Ser Asn Asn Pro

645 650 655

Val Lys Gly Arg Thr Cys Lys Glu Arg Asp Ser Glu Gly Cys Trp Val

660 665 670

Ala Tyr Thr Leu Glu Gln Gln Asp Gly Met Asp Arg Tyr Leu Ile Tyr

675 680 685

Val Asp Glu Ser Arg Glu Cys Val Ala Gly Pro Asn Ile Ala Ala Ile

690 695 700

Val Gly Gly Thr Val Ala Gly Ile Val Leu Ile Gly Ile Leu Leu Leu

705 710 715 720

Val Ile Trp Lys Ala Leu Ile His Leu Ser Asp Leu Arg Glu Tyr Arg

725 730 735

Arg Phe Glu Lys Glu Lys Leu Lys Ser Gln Trp Asn Asn Asp Asn Pro

740 745 750

Leu Phe Lys Ser Ala Thr Thr Thr Val Met Asn Pro Lys Phe Ala Glu

755 760 765

Ser

<210> 5

<211> 2890

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pCCL-PGK-coRPKW-82-RO vector sequence

<400> 5

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccg tcgacaccgg tgccaccatg 540

agcatccagg aaaatatcag ctctctgcag ctgcggtcct gggtgtccaa gagccagaga 600

gacctggcca agagcatcct gatcggagcc cctggcggac cagccggata cctgagaagg 660

gctagcgtgg cccagctgac ccaggaactg ggcaccgcct ttttccagca gcagcagctg 720

ccagccgcca tggccgacac ctttctggaa cacctgtgcc tgctggacat cgactctgag 780

cccgtggccg ccagaagcac cagcatcatt gccaccatcg gccctgccag cagaagcgtg 840

gagcggctga aagagatgat caaggccggc atgaatatcg cccggctgaa cttctcccac 900

ggcagccacg agtaccacgc agagagcatt gccaacgtcc gggaggccgt ggagagcttt 960

gccggcagcc ccctgagcta cagacccgtg gccattgccc tggacaccaa gggccccgag 1020

atcagaacag gaattctgca gggagggcct gagagcgagg tggagctggt gaagggcagc 1080

caagtgctgg tgaccgtgga ccccgccttc agaaccagag gcaacgccaa cacagtgtgg 1140

gtggactacc ccaacatcgt gcgggtggtg cctgtgggcg gcagaatcta catcgacgac 1200

ggcctgatca gcctggtggt gcagaagatc ggacctgagg gcctggtgac ccaggtcgag 1260

aatggcggcg tgctgggcag cagaaagggc gtgaatctgc caggcgccca ggtggacctg 1320

cctggcctgt ctgagcagga cgtgagagac ctgagatttg gcgtggagca cggcgtggac 1380

atcgtgttcg ccagcttcgt gcggaaggcc tctgatgtgg ccgccgtgag agccgctctg 1440

ggccctgaag gccacggcat caagatcatc agcaagatcg agaaccacga gggcgtgaag 1500

cggttcgacg agatcctgga agtgtccgac ggcatcatgg tggccagagg cgacctgggc 1560

atcgagatcc ccgccgagaa ggtgttcctg gcccagaaaa tgatgatcgg acggtgcaac 1620

ctggccggca aacctgtggt gtgcgccacc cagatgctgg aaagcatgat caccaagccc 1680

agacccacca gagccgagac aagcgacgtg gccaacgccg tgctggatgg cgctgactgc 1740

atcatgctgt ccggcgagac agccaagggc aacttccccg tggaggccgt gaagatgcag 1800

cacgccattg ccagagaagc cgaggccgcc gtgtaccacc ggcagctgtt cgaggaactg 1860

cggagagccg cccctctgag cagagatccc accgaagtga ccgccatcgg agccgtggaa 1920

gccgccttca agtgctgcgc cgctgcaatc atcgtgctga ccaccacagg cagaagcgcc 1980

cagctgctgt ccagatacag acccagagcc gccgtgatcg ccgtgacaag atccgcccag 2040

gccgctagac aggtccacct gtgcagaggc gtgttccccc tgctgtaccg ggagcctccc 2100

gaggccatct gggccgacga cgtggacaga cgggtgcagt tcggcatcga gagcggcaag 2160

ctgcggggct tcctgagagt gggcgacctg gtgatcgtgg tgacaggctg gcggcctggc 2220

agcggctaca ccaacatcat gagggtgctg tccatcagct gaccgcggtc tagaggatcc 2280

cccgggctgc aggaattcga gcatcttacc gccatttatt cccatatttg ttctgttttt 2340

cttgatttgg gtatacattt aaatgttaat aaaacaaaat ggtggggcaa tcatttacat 2400

ttttagggat atgtaattac tagttcaggt gtattgccac aagacaaaca tgttaagaaa 2460

ctttcccgtt atttacgctc tgttcctgtt aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 2520

agattgactg atattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta 2580

atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa 2640

tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg 2700

tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc 2760

ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc 2820

cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg 2880

gggaagggcc 2890

<210> 6

<211> 574

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Ser Ile Gln Glu Asn Ile Ser Ser Leu Gln Leu Arg Ser Trp Val

1 5 10 15

Ser Lys Ser Gln Arg Asp Leu Ala Lys Ser Ile Leu Ile Gly Ala Pro

20 25 30

Gly Gly Pro Ala Gly Tyr Leu Arg Arg Ala Ser Val Ala Gln Leu Thr

35 40 45

Gln Glu Leu Gly Thr Ala Phe Phe Gln Gln Gln Gln Leu Pro Ala Ala

50 55 60

Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Leu Cys Leu Leu Asp Ile Asp Ser

65 70 75 80

Glu Pro Val Ala Ala Arg Ser Thr Ser Ile Ile Ala Thr Ile Gly Pro

85 90 95

Ala Ser Arg Ser Val Glu Arg Leu Lys Glu Met Ile Lys Ala Gly Met

100 105 110

Asn Ile Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Ser His Glu Tyr His Ala

115 120 125

Glu Ser Ile Ala Asn Val Arg Glu Ala Val Glu Ser Phe Ala Gly Ser

130 135 140

Pro Leu Ser Tyr Arg Pro Val Ala Ile Ala Leu Asp Thr Lys Gly Pro

145 150 155 160

Glu Ile Arg Thr Gly Ile Leu Gln Gly Gly Pro Glu Ser Glu Val Glu

165 170 175

Leu Val Lys Gly Ser Gln Val Leu Val Thr Val Asp Pro Ala Phe Arg

180 185 190

Thr Arg Gly Asn Ala Asn Thr Val Trp Val Asp Tyr Pro Asn Ile Val

195 200 205

Arg Val Val Pro Val Gly Gly Arg Ile Tyr Ile Asp Asp Gly Leu Ile

210 215 220

Ser Leu Val Val Gln Lys Ile Gly Pro Glu Gly Leu Val Thr Gln Val

225 230 235 240

Glu Asn Gly Gly Val Leu Gly Ser Arg Lys Gly Val Asn Leu Pro Gly

245 250 255

Ala Gln Val Asp Leu Pro Gly Leu Ser Glu Gln Asp Val Arg Asp Leu

260 265 270

Arg Phe Gly Val Glu His Gly Val Asp Ile Val Phe Ala Ser Phe Val

275 280 285

Arg Lys Ala Ser Asp Val Ala Ala Val Arg Ala Ala Leu Gly Pro Glu

290 295 300

Gly His Gly Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu Asn His Glu Gly Val

305 310 315 320

Lys Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Val Ser Asp Gly Ile Met Val Ala

325 330 335

Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu Lys Val Phe Leu Ala

340 345 350

Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Leu Ala Gly Lys Pro Val Val

355 360 365

Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Thr Lys Pro Arg Pro Thr

370 375 380

Arg Ala Glu Thr Ser Asp Val Ala Asn Ala Val Leu Asp Gly Ala Asp

385 390 395 400

Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Pro Val Glu

405 410 415

Ala Val Lys Met Gln His Ala Ile Ala Arg Glu Ala Glu Ala Ala Val

420 425 430

Tyr His Arg Gln Leu Phe Glu Glu Leu Arg Arg Ala Ala Pro Leu Ser

435 440 445

Arg Asp Pro Thr Glu Val Thr Ala Ile Gly Ala Val Glu Ala Ala Phe

450 455 460

Lys Cys Cys Ala Ala Ala Ile Ile Val Leu Thr Thr Thr Gly Arg Ser

465 470 475 480

Ala Gln Leu Leu Ser Arg Tyr Arg Pro Arg Ala Ala Val Ile Ala Val

485 490 495

Thr Arg Ser Ala Gln Ala Ala Arg Gln Val His Leu Cys Arg Gly Val

500 505 510

Phe Pro Leu Leu Tyr Arg Glu Pro Pro Glu Ala Ile Trp Ala Asp Asp

515 520 525

Val Asp Arg Arg Val Gln Phe Gly Ile Glu Ser Gly Lys Leu Arg Gly

530 535 540

Phe Leu Arg Val Gly Asp Leu Val Ile Val Val Thr Gly Trp Arg Pro

545 550 555 560

Gly Ser Gly Tyr Thr Asn Ile Met Arg Val Leu Ser Ile Ser

565 570

<210> 7

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PKLR polynucloetide seqeunce

<400> 7

atggtctgct tcagactgtt ccctgtccct ggatctggtc tggtgcttgt gtgcttggtg 60

ctgggtgctg tgagatccta tgcccttgag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120

tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgagactac caacaagacc 180

tacaagactg tgaccatctc agaccatggc actgtcacct acaatggatc aatctgtggt 240

gatgatcaga atggcccaaa gatagcagtg cagtttgggc ccggtttttc ctggattgct 300

aacttcacca aggcagcctc cacctacagc attgactcag tcagcttcag ctacaacact 360

ggggataaca ccaccttccc tgacgcagag gacaagggaa tccttactgt ggacgaactc 420

ctggcaatca gaatccccct taacgacctg ttcagatgca actccctttc aacccttgaa 480

aagaatgatg tggtgcaaca ctattgggac gtcctggtgc aagcctttgt gcagaatggg 540

acagtgagta ccaacgagtt cctctgtgac aaggacaaga ccagcactgt ggcccccact 600

atccacacca ctgtgcccag ccctaccact acccccaccc ctaaagagaa gccagaagct 660

ggaacctact cagtcaacaa tggaaatgac acatgcctcc ttgccaccat gggactgcag 720

ctgaacatca ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca tcaaccctaa caccactcat 780

agcactggga gctgcagatc acatacagct ctgctgaggc tcaactcctc caccatcaag 840

tacctggact ttgtgtttgc tgtgaagaat gagaacaggt tctacctcaa ggaagtgaac 900

atttccatgt acctggtcaa tggttcagtg ttctctattg ccaacaacaa tctgagctac 960

tgggatgcac ccctgggatc ctcctacatg tgcaacaagg agcagactgt gagtgtgtca 1020

ggtgcttttc agatcaacac ttttgacctg agggtgcagc ccttcaatgt gactcaggga 1080

aagtactcca ctgcacaaga gtgttccttg gatgatgaca ctatcctcat ccccattatt 1140

gtgggagctg gactgtcagg attgattata gtgattgtga ttgcttatgt gattggaagg 1200

agaaagagct atgctggcta ccagaccctg taa 1233

<210> 8

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PKLR polynucloetide seqeunce

<400> 8

atggtgtgct ttagactgtt tcctgtgcct ggttcagggc tggtcctggt ctgtctggtg 60

ctgggggctg tcagaagcta tgccttggag ctgaacctca ctgatagtga aaatgccact 120

tgtctgtatg ctaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgaaaccac caacaagact 180

tacaaaacag tgaccatctc agatcatgga actgtgacct acaacggcag catttgtgga 240

gacgaccaga acggaccaaa aatcgctgtc caatttgggc ctggattctc ctggattgcc 300

aatttcacta aagctgcctc cacatattca attgactcag tgtccttctc ctacaacact 360

ggggacaaca ctactttccc tgatgctgaa gataagggaa tcttgacagt ggatgagctg 420

ctggctatca ggatcccttt gaatgacctg tttaggtgta attcactgag cactctggag 480

aagaacgacg tggtgcagca ctactgggac gtgctggtgc aggcctttgt gcagaacggc 540

actgtgtcca ccaacgaatt cctgtgtgat aaggacaaaa cttccactgt ggcacctaca 600

attcacacta ctgtgccttc acctaccacc actccaactc caaaggaaaa gcctgaagca 660

ggaacctact ctgtgaacaa tggcaatgat acctgtctgt tggccaccat gggcctccaa 720

ctgaacatta ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca ttaaccccaa cactacccac 780

tccactggca gctgtagatc acacacagcc ttgctcagac tgaatagcag caccatcaag 840

tatttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gaaaacaggt tctacctgaa ggaagtcaac 900

atctcaatgt acctggtgaa cggctcagtg ttcagcattg ccaacaacaa cctctcctat 960

tgggacgctc cactggggag cagctacatg tgtaacaagg aacagactgt gtcagtgtca 1020

ggagccttcc agattaacac ctttgatctg agggtccaac cctttaatgt cactcaagga 1080

aagtatagca ctgcccagga gtgctccctg gatgatgaca ccattctgat tccaatcatt 1140

gtgggtgcag gactttctgg gcttattatt gtgattgtga ttgcctatgt gattggcaga 1200

aggaaatcct atgcagggta ccaaactctg taa 1233

<210> 9

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PKLR polynucloetide seqeunce

<400> 9

atggtctgtt ttaggctgtt ccctgtccct ggttcaggac tggtcttagt gtgtctggtg 60

cttggagctg tcagaagcta tgccctggag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120

tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtcagat atgaaaccac caacaagacc 180

tataagactg tgaccatctc agaccatggc actgtgactt acaatgggtc aatttgtgga 240

gatgaccaga atggccctaa gatagctgtc cagtttggtc caggattcag ctggattgcc 300

aacttcacca aggcagccag cacctacagc attgactctg tgtccttctc ctacaacaca 360

ggagacaaca ccactttccc tgatgcagag gacaaaggta tcctgactgt ggatgagttg 420

ctggcaatca ggatcccact gaacgatctg ttcaggtgca actcactgtc cactctggaa 480

aagaatgatg tggtgcagca ctattgggat gtgctagtcc aggcctttgt ccagaatggg 540

actgtgtcaa ctaatgagtt cctgtgtgac aaggacaaga caagcactgt agcccccact 600

atccatacca cagtacctag ccccaccact actccaaccc ccaaggagaa gcctgaggct 660

ggcacctact cagtgaacaa tgggaatgac acctgtttgc tggccactat gggactccaa 720

ctgaacatca cccaggacaa agtggcctct gtgatcaata tcaatcccaa caccacccac 780

agcactgggt cctgcagaag ccacactgcc ctcctgaggc tcaactcatc aactatcaag 840

tacttggatt ttgtgtttgc agtgaagaat gagaacagat tctacctcaa agaggtcaac 900

atttcaatgt acctggtgaa tgggagtgtg ttctccattg ctaacaacaa cctgagctac 960

tgggatgccc ctctgggctc ctcatacatg tgcaacaagg aacagactgt gagtgtgtca 1020

ggggccttcc agatcaacac ttttgacctg agagtgcagc cctttaatgt gacacaggga 1080

aagtacagca ctgctcagga gtgcagcctg gatgatgaca ctatcctgat ccctatcatt 1140

gtgggggcag gcctgtctgg actcattatt gtgattgtga ttgcctatgt gatagggaga 1200

aggaagtctt atgctggata ccagaccctg taa 1233

<210> 10

<211> 3384

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pRRL.PPT.EFS.tcirg1h.wpre vector sequence

<400> 10

ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60

ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120

gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180

gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtgtcgtga 240

cgcgggatcc gccaccatgg gctccatgtt tcggagcgag gaggtggccc tggtccagct 300

ctttctgccc acagcggctg cctacacctg cgtgagtcgg ctgggcgagc tgggcctcgt 360

ggagttcaga gacctcaacg cctcggtgag cgccttccag agacgctttg tggttgatgt 420

tcggcgctgt gaggagctgg agaagacctt caccttcctg caggaggagg tgcggcgggc 480

tgggctggtc ctgcccccgc caaaggggag gctgccggca cccccacccc gggacctgct 540

gcgcatccag gaggagacgg agcgcctggc ccaggagctg cgggatgtgc ggggcaacca 600

gcaggccctg cgggcccagc tgcaccagct gcagctccac gccgccgtgc tacgccaggg 660

ccatgaacct cagctggcag ccgcccacac agatggggcc tcagagagga cgcccctgct 720

ccaggccccc ggggggccgc accaggacct gagggtcaac tttgtggcag gtgccgtgga 780

gccccacaag gcccctgccc tagagcgcct gctctggagg gcctgcagag gcttcctcat 840

tgccagcttc agggagctgg agcagccgct ggagcacccc gtgacgggcg agccagccac 900

gtggatgacc ttcctcatct cctactgggg tgagcagatc ggacagaaga tccgcaagat 960

cacggactgc ttccactgcc acgtcttccc gtttctgcag caggaggagg cccgcctcgg 1020

ggccctgcag cagctgcaac agcagagcca ggagctgcag gaggtcctcg gggagacaga 1080

gcggttcctg agccaggtgc taggccgggt gctgcagctg ctgccgccag ggcaggtgca 1140

ggtccacaag atgaaggccg tgtacctggc cctgaaccag tgcagcgtga gcaccacgca 1200

caagtgcctc attgccgagg cctggtgctc tgtgcgagac ctgcccgccc tgcaggaggc 1260

cctgcgggac agctcgatgg aggagggagt gagtgccgtg gctcaccgca tcccctgccg 1320

ggacatgccc cccacactca tccgcaccaa ccgcttcacg gccagcttcc agggcatcgt 1380

ggatgcctac ggcgtgggcc gctaccagga ggtcaacccc gctccctaca ccatcatcac 1440

cttccccttc ctgtttgctg tgatgttcgg ggatgtgggc cacgggctgc tcatgttcct 1500

cttcgccctg gccatggtcc ttgcggagaa ccgaccggct gtgaaggccg cgcagaacga 1560

gatctggcag actttcttca ggggccgcta cctgctcctg cttatgggcc tgttctccat 1620

ctacaccggc ttcatctaca acgagtgctt cagtcgcgcc accagcatct tcccctcggg 1680

ctggagtgtg gccgccatgg ccaaccagtc tggctggagt gatgcattcc tggcccagca 1740

cacgatgctt accctggacc ccaacgtcac cggtgtcttc ctgggaccct acccctttgg 1800

catcgatcct atttggagcc tggctgccaa ccacttgagc ttcctcaact ccttcaagat 1860

gaagatgtcc gtcatcctgg gcgtcgtgca catggccttt ggggtggtcc tcggagtctt 1920

caaccacgtg cactttggcc agaggcaccg gctgctgctg gagacgctgc cggagctcac 1980

cttcctgctg ggactcttcg gttacctcgt gttcctagtc atctacaagt ggctgtgtgt 2040

ctgggctgcc agggccgcct cggcccccag catcctcatc cacttcatca acatgttcct 2100

cttctcccac agccccagca acaggctgct ctacccccgg caggaggtgg tccaggccac 2160

gctggtggtc ctggccttgg ccatggtgcc catcctgctg cttggcacac ccctgcacct 2220

gctgcaccgc caccgccgcc gcctgcggag gaggcccgct gaccgacagg aggaaaacaa 2280

ggccgggttg ctggacctgc ctgacgcatc tgtgaatggc tggagctccg atgaggaaaa 2340

ggcagggggc ctggatgatg aagaggaggc cgagctcgtc ccctccgagg tgctcatgca 2400

ccaggccatc cacaccatcg agttctgcct gggctgcgtc tccaacaccg cctcctacct 2460

gcgcctgtgg gccctgagcc tggcccacgc ccagctgtcc gaggttctgt gggccatggt 2520

gatgcgcata ggcctgggcc tgggccggga ggtgggcgtg gcggctgtgg tgctggtccc 2580

catctttgcc gcctttgccg tgatgaccgt ggctatcctg ctggtgatgg agggactctc 2640

agccttcctg cacgccctgc ggctgcactg ggtggaattc cagaacaagt tctactcagg 2700

cacgggctac aagctgagtc ccttcacctt cgctgccaca gatgactagt aagtcgacgg 2760

atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt tatacccata tttgttctgt 2820

ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca aaatggtggg gcaatcattt 2880

acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg ccacaagaca aacatgttaa 2940

gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa cctctggatt acaaaatttg 3000

tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt acgctgtgtg gatatgctgc 3060

tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct ttcgttttct cctccttgta 3120

taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtccgtc aacgtggcgt 3180

ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg ggcattgcca ccacctgtca 3240

actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc acggcagaac tcatcgccgc 3300

ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc actgataatt ccgtggtgtt 3360

gtcggggaag ctgacgtcct ttcg 3384

<210> 11

<211> 830

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Met Gly Ser Met Phe Arg Ser Glu Glu Val Ala Leu Val Gln Leu Phe

1 5 10 15

Leu Pro Thr Ala Ala Ala Tyr Thr Cys Val Ser Arg Leu Gly Glu Leu

20 25 30

Gly Leu Val Glu Phe Arg Asp Leu Asn Ala Ser Val Ser Ala Phe Gln

35 40 45

Arg Arg Phe Val Val Asp Val Arg Arg Cys Glu Glu Leu Glu Lys Thr

50 55 60

Phe Thr Phe Leu Gln Glu Glu Val Arg Arg Ala Gly Leu Val Leu Pro

65 70 75 80

Pro Pro Lys Gly Arg Leu Pro Ala Pro Pro Pro Arg Asp Leu Leu Arg

85 90 95

Ile Gln Glu Glu Thr Glu Arg Leu Ala Gln Glu Leu Arg Asp Val Arg

100 105 110

Gly Asn Gln Gln Ala Leu Arg Ala Gln Leu His Gln Leu Gln Leu His

115 120 125

Ala Ala Val Leu Arg Gln Gly His Glu Pro Gln Leu Ala Ala Ala His

130 135 140

Thr Asp Gly Ala Ser Glu Arg Thr Pro Leu Leu Gln Ala Pro Gly Gly

145 150 155 160

Pro His Gln Asp Leu Arg Val Asn Phe Val Ala Gly Ala Val Glu Pro

165 170 175

His Lys Ala Pro Ala Leu Glu Arg Leu Leu Trp Arg Ala Cys Arg Gly

180 185 190

Phe Leu Ile Ala Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gln Pro Leu Glu His Pro

195 200 205

Val Thr Gly Glu Pro Ala Thr Trp Met Thr Phe Leu Ile Ser Tyr Trp

210 215 220

Gly Glu Gln Ile Gly Gln Lys Ile Arg Lys Ile Thr Asp Cys Phe His

225 230 235 240

Cys His Val Phe Pro Phe Leu Gln Gln Glu Glu Ala Arg Leu Gly Ala

245 250 255

Leu Gln Gln Leu Gln Gln Gln Ser Gln Glu Leu Gln Glu Val Leu Gly

260 265 270

Glu Thr Glu Arg Phe Leu Ser Gln Val Leu Gly Arg Val Leu Gln Leu

275 280 285

Leu Pro Pro Gly Gln Val Gln Val His Lys Met Lys Ala Val Tyr Leu

290 295 300

Ala Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Thr Thr His Lys Cys Leu Ile Ala

305 310 315 320

Glu Ala Trp Cys Ser Val Arg Asp Leu Pro Ala Leu Gln Glu Ala Leu

325 330 335

Arg Asp Ser Ser Met Glu Glu Gly Val Ser Ala Val Ala His Arg Ile

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Met Pro Pro Thr Leu Ile Arg Thr Asn Arg Phe Thr

355 360 365

Ala Ser Phe Gln Gly Ile Val Asp Ala Tyr Gly Val Gly Arg Tyr Gln

370 375 380

Glu Val Asn Pro Ala Pro Tyr Thr Ile Ile Thr Phe Pro Phe Leu Phe

385 390 395 400

Ala Val Met Phe Gly Asp Val Gly His Gly Leu Leu Met Phe Leu Phe

405 410 415

Ala Leu Ala Met Val Leu Ala Glu Asn Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala

420 425 430

Gln Asn Glu Ile Trp Gln Thr Phe Phe Arg Gly Arg Tyr Leu Leu Leu

435 440 445

Leu Met Gly Leu Phe Ser Ile Tyr Thr Gly Phe Ile Tyr Asn Glu Cys

450 455 460

Phe Ser Arg Ala Thr Ser Ile Phe Pro Ser Gly Trp Ser Val Ala Ala

465 470 475 480

Met Ala Asn Gln Ser Gly Trp Ser Asp Ala Phe Leu Ala Gln His Thr

485 490 495

Met Leu Thr Leu Asp Pro Asn Val Thr Gly Val Phe Leu Gly Pro Tyr

500 505 510

Pro Phe Gly Ile Asp Pro Ile Trp Ser Leu Ala Ala Asn His Leu Ser

515 520 525

Phe Leu Asn Ser Phe Lys Met Lys Met Ser Val Ile Leu Gly Val Val

530 535 540

His Met Ala Phe Gly Val Val Leu Gly Val Phe Asn His Val His Phe

545 550 555 560

Gly Gln Arg His Arg Leu Leu Leu Glu Thr Leu Pro Glu Leu Thr Phe

565 570 575

Leu Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Val Phe Leu Val Ile Tyr Lys Trp

580 585 590

Leu Cys Val Trp Ala Ala Arg Ala Ala Ser Ala Pro Ser Ile Leu Ile

595 600 605

His Phe Ile Asn Met Phe Leu Phe Ser His Ser Pro Ser Asn Arg Leu

610 615 620

Leu Tyr Pro Arg Gln Glu Val Val Gln Ala Thr Leu Val Val Leu Ala

625 630 635 640

Leu Ala Met Val Pro Ile Leu Leu Leu Gly Thr Pro Leu His Leu Leu

645 650 655

His Arg His Arg Arg Arg Leu Arg Arg Arg Pro Ala Asp Arg Gln Glu

660 665 670

Glu Asn Lys Ala Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Ala Ser Val Asn Gly

675 680 685

Trp Ser Ser Asp Glu Glu Lys Ala Gly Gly Leu Asp Asp Glu Glu Glu

690 695 700

Ala Glu Leu Val Pro Ser Glu Val Leu Met His Gln Ala Ile His Thr

705 710 715 720

Ile Glu Phe Cys Leu Gly Cys Val Ser Asn Thr Ala Ser Tyr Leu Arg

725 730 735

Leu Trp Ala Leu Ser Leu Ala His Ala Gln Leu Ser Glu Val Leu Trp

740 745 750

Ala Met Val Met Arg Ile Gly Leu Gly Leu Gly Arg Glu Val Gly Val

755 760 765

Ala Ala Val Val Leu Val Pro Ile Phe Ala Ala Phe Ala Val Met Thr

770 775 780

Val Ala Ile Leu Leu Val Met Glu Gly Leu Ser Ala Phe Leu His Ala

785 790 795 800

Leu Arg Leu His Trp Val Glu Phe Gln Asn Lys Phe Tyr Ser Gly Thr

805 810 815

Gly Tyr Lys Leu Ser Pro Phe Thr Phe Ala Ala Thr Asp Asp

820 825 830

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к способам генетической модификации гемопоэтических клеток. Предложено применение простагландина E2 (PGE2), полоксамера и протаминсульфата для усиления трансдукции рекомбинантным ретровирусным вектором. Композиции и способы согласно настоящему изобретению могут применяться в генной терапии, включая лечение моногенных генетических заболеваний и расстройств. 5 н. и 49 з.п. ф-лы, 18 ил., 2 табл., 5 пр.

1. Способ генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий:

(a) обеспечение гемопоэтических клеток;

(b) приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с полоксамером;

(c) приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с простагландином E2 (PGE2) или его производным;

(d) приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с фрагментом рекомбинантного фибронектина; и

(e) приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором.

2. Способ по п. 1, где рекомбинантный ретровирусный вектор представляет собой рекомбинантный лентивирусный вектор.

3. Способ по п. 1, где гемопоэтические клетки были подвергнуты манипуляциям.

4. Способ по п. 3, где гемопоэтические клетки представляют собой CD34- обогащенные клетки.

5. Способ по п. 1, где полоксамер выбран из группы, состоящей из полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

6. Способ по п. 5, где полоксамер представляет собой полоксамер 338.

7. Способ по п. 1, где PGE2 или его производное является модифицированным.

8. Способ по п. 7, где PGE2 или его производное представляет собой 16,16- диметил-PGE2 (dmPGE2).

9. Способ по п. 1, где PGE2 или его производное не является модифицированным.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фрагмент рекомбинантного фибронектина представляет собой RetroNectin™.

11. Способ по п. 1, где стадии приведения в контакт проводят в одно и то же время, или время их проведения частично совпадает.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где концентрация PGE2 или его производного составляет 5-30 мкг/мл.

13. Способ по п. 12, где концентрация PGE2 или его производного составляет приблизительно 10 мкг/мл.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где концентрация полоксамера составляет 200-1200 мкг/мл.

15. Способ по п. 14, где концентрация полоксамера составляет приблизительно 1000 мкг/мл.

16. Способ по любому из пп. 10-15, где концентрация протаминсульфата составляет 4-10 мкг/мл.

17. Способ по п. 16, где концентрация протаминсульфата составляет приблизительно 4 мкг/мл.

18. Способ усиления опосредованной рекомбинантным ретровирусным вектором генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий:

(a) приведение гемопоэтических клеток в контакт ex vivo с эффективным количеством PGE2 или его производного, с эффективным количеством полоксамера и эффективным количеством фрагмента рекомбинантного фибронектина; и

(b) приведение указанных гемопоэтических клеток в контакт с рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий представляющий интерес ген или кодирующий представляющий интерес полипептид,

где эффективность вирусной трансдукции указанного рекомбинантного ретровирусного вектора повышена по сравнению с трансдукцией гемопоэтических клеток указанным рекомбинантным ретровирусным вектором в отсутствие указанного PGE2 или его производного, указанного полоксамера и фрагмента рекомбинантного фибронектина.

19. Способ по п. 18, дополнительно включающий приведение гемопоэтических клеток в контакт ex vivo с эффективным количеством протаминсульфата.

20. Способ по п. 18, где представляющий интерес ген восполняет дефект в гене, связанный с моногенным генетическим заболеванием или расстройством.

21. Способ по п. 19, где представляющий интерес ген или представляющий интерес полипептид выбран из группы, состоящей из RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1.

22. Способ по п. 18, где способ предотвращает или облегчает моногенное генетическое заболевание или расстройство.

23. Способ по п. 22, где моногенетическое заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы и инфантильного злокачественного остеопороза.

24. Способ по п. 18, где гемопоэтические клетки представляют собой CD34- обогащенные клетки, необязательно гемопоэтические клетки, клетки, полученные из костного мозга (BM), клетки, полученные из пуповинной крови (CB) или мобилизованные клетки периферической крови (mPB).

25. Способ опосредованной рекомбинантным ретровирусным вектором генетической модификации гемопоэтических клеток, включающий:

(a) получение CD34-обогащенных клеток из биологического образца, полученного от субъекта, получавшего Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) или его аналог и/или плериксафор; и

(b) генетическую модификацию указанных CD34-обогащенных клеток рекомбинантным ретровирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий ген группы комплементации анемии Фанкони (FANC), ITGB2, пируваткиназу типа R, OSTM1, TCIRG1, или ген, кодирующий их функциональный вариант или фрагмент, и функционально связанную с ним последовательность активного в эукариотических клетках промотора;

где стадия генетической модификации включает приведение указанных CD34- обогащенных клеток в контакт с указанным рекомбинантным ретровирусным вектором, PGE2, полоксамером и полипептидом рекомбинантного фибронектина или его вариантом.

26. Способ по п. 25, где биологический образец представляет собой периферическую кровь.

27. Способ по п. 25 или 26, где аналог Г-КСФ представляет собой филграстим, сарграмостим или пегфилграстим.

28. Способ по любому из пп. 25-27, где CD34-обогащенные клетки выбраны из группы, состоящей из гемопоэтических клеток, клеток, полученных из костного мозга (BM), клеток, полученных из пуповинной крови (CB) или мобилизованных клеток периферической крови (mPB).

29. Способ трансдукции гемопоэтической клетки лентивирусным вектором, включающий культивирование указанной клетки в жидкой среде, содержащей лентивирусный вектор, где указанная жидкая среда содержит полоксамер, простагландин E2 (PGE2) или его производное и фрагмент рекомбинантного фибронектина.

30. Способ по п. 29, где жидкая среда содержит протаминсульфат.

31. Способ трансдукции гемопоэтической клетки лентивирусным вектором, включающий:

(a) обеспечение лентивирусного вектора в растворе, содержащем полоксамер, простагландин E2 (PGE2) или его производное и фрагмент рекомбинантного фибронектина;

(b) обеспечение гемопоэтических клеток в жидкой культуральной среде; и

(c) добавление указанного раствора к указанной жидкой культуральной среде.

32. Способ по п. 31, где жидкая среда содержит протаминсульфат.

33. Способ по любому из пп. 25-32, где лентивирусный вектор представляет собой рекомбинантный лентивирусный вектор.

34. Способ по любому из пп. 25-33, где гемопоэтические клетки были подвергнуты манипуляциям.

35. Способ по любому из пп. 25-34, где гемопоэтические клетки представляют собой CD34-обогащенные клетки.

36. Способ по любому из пп. 25-35, где полоксамер выбран из группы, состоящей из полоксамера 288, полоксамера 335, полоксамера 338 и полоксамера 407.

37. Способ по любому из пп. 25-35, где полоксамер представляет собой полоксамер 338.

38. Способ по любому из пп. 25-37, где PGE2 или его производное является модифицированным.

39. Способ по любому из пп. 25-38, где PGE2 или его производное представляет собой 16,16-диметил-PGE2 (dmPGE2).

40. Способ по любому из пп. 25-39, где PGE2 или его производное не является модифицированным.

41. Способ по любому из пп. 25-40, где концентрация PGE2 или его производного составляет 5-30 мкг/мл.

42. Способ по любому из пп. 25-41, где концентрация PGE2 или его производного составляет приблизительно 10 мкг/мл.

43. Способ по любому из пп. 25-42, где концентрация полоксамера составляет 200-1200 мкг/мл.

44. Способ по любому из пп. 25-43, где концентрация полоксамера составляет приблизительно 1000 мкг/мл.

45. Способ по любому из пп. 25-44, где концентрация протаминсульфата составляет 4-10 мкг/мл.

46. Способ по любому из пп. 25-45, где концентрация протаминсульфата составляет приблизительно 4 мкг/мл.

47. Способ по любому из пп. 25-46, где лентивирусный вектор содержит последовательность, кодирующую представляющий интерес полипептид, выбранный из группы, состоящей из RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A и OSTM1.

48. Способ по любому из пп. 25-47, где гемопоэтические клетки представляют собой гемопоэтические клетки, клетки, полученные из костного мозга (BM), клетки, полученные из пуповинной крови (CB) или мобилизованные клетки периферической крови (mPB).

49. Популяция CD34-обогащенныx гемопоэтических клеток для использования в лечении моногенного генетического заболевания или расстройства, выбранного из группы, состоящей из анемии Фанкони, дефицита адгезии лейкоцитов I типа, дефицита пируваткиназы и инфантильного злокачественного остеопороза, содержащая по меньшей мере 80% генетически модифицированных гемопоэтических клеток, где указанная популяция клеток была получена способом по любому из пп. 29-32 и где генетически модифицированные клетки содержат последовательность, кодирующую RPK, ITGB2, FANCA, FANCC, FANCG, TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A или OSTM1, где

последовательность восполняет дефект в гене, связанный с моногенным генетическим заболеванием или расстройством.

50. Популяция CD34-обогащенныx гемопоэтических клеток по п. 49, где гемопоэтические клетки содержат клетки, полученные из костного мозга (BM), клетки, полученные из пуповинной крови (CB) или мобилизованные клетки периферической крови (mPB).

51. Популяция CD34-обогащенныx гемопоэтических клеток по п. 49 или 50 для использования в лечении дефицита пируваткиназы, где генетически модифицированные гемопоэтические клетки содержат последовательность, кодирующую RPK.

52. Популяция CD34-обогащенныx гемопоэтических клеток по п. 49 или 50 для использования в лечении дефицита адгезии лейкоцитов I типа, где генетически модифицированные гемопоэтические клетки содержат последовательность, кодирующую ITGB2.

53. Популяция CD34-обогащенныx гемопоэтических клеток по п. 49 или 50 для использования в лечении анемии Фанкони, где генетически модифицированные гемопоэтические клетки содержат последовательность, кодирующую FANCA, FANCC или FANCG.

54. Популяция CD34-обогащенныx гемопоэтических клеток по п. 49 или 50 для использования в лечении инфантильного злокачественного остеопороза, где генетически модифицированные гемопоэтические клетки содержат последовательность, кодирующую TCIRG1, CLCN7, TNFSF11, PLEKHM1, TNFRSF11A или OSTM1.