Синергетическое действие SMN1 и miR-23a при лечении спинальной мышечной атрофии Российский патент 2025 года по МПК A61K35/761 A61P21/00 C12N15/113 C12N15/12 C12N15/861 C12N7/01 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящая заявка относится к области биотехнологии, вирусологии, генетики и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте для получения генотерапевтического вирусного препарата, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 (белок выживаемости моторных нейронов) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a, экспрессионной кассете и вектору на ее основе, а также к рекомбинантному вирусу на основе AAV9 (аденоассоциированный вирус 9 серотипа) для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках, фармацевтической композиции, которая включает данный рекомбинантный вирус, и различным вариантам применения вышеуказанного рекомбинантного вируса и вышеуказанной композиции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Спинальная мышечная атрофия (CMA/SMA) относится к группе нервно-мышечных заболеваний и характеризуется преимущественно аутосомно-рецессивным типом наследования. На сегодняшний день, как правило, под термином СМА понимается наиболее распространенная форма заболевания, развивающаяся вследствие мутаций и (или) делеций в гене SMN1 (survival motor neuron 1 - ген фактора выживания мотонейрона-1), расположенном на длинном плече 5-й хромосомы (5q11.2-q 13.3) (Lefebvre et al., Cell (1995) 80:155-165). Заболевание сопровождается дегенерацией двигательных нейронов в вентральном (переднем) роге спинного мозга и/или стволе головного мозга, что ведет к гипотонии проксимальных групп мышц, отвечающих за основные двигательные навыки, например, ползание, ходьбу, удержание головы, а также к нарушению глотания и дыхания (Sumner С.J., NeuroRx (2006) 3:235-245). Таким образом, у пациентов со СМА большой риск развития дыхательной недостаточности и присоединения интеркуррентных заболеваний.

Генная терапия представляет собой перспективный способ лечения спинальной мышечной атрофии.

Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы считаются эффективными для генной терапии ЦНС, поскольку они обладают подходящим профилем токсичности и иммуногенности, их можно использовать в трансдукции нервных клеток, и они способны опосредовать длительную экспрессию в ЦНС.

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой (20 нм), неспособный к самостоятельной репликации, безоболочечный вирус. У человека и приматов описано множество различных серотипов AAV. Геном аденоассоциированного вируса содержит (+ или -) одноцепочечную ДНК (ssDNA) длиной около 4,7 тысяч нуклеотидов. На концах молекулы геномной ДНК располагаются инвертированные концевые повторы (англ. inverted terminal repeats, ITRs). Геном содержит две открытые рамки считывания (англ. ORF): Rep и Сар, содержащие в себе несколько альтернативных рамок считывания, кодирующих различные белковые продукты. Продукты Rep имеют важное значение для репликации AAV, при этом ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1:1:10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:10405-10410). При образовании рекомбинантного вектора AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ITR, упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, не входят в кассету. Рекомбинантный AAV считается самым безопасным и одним из наиболее широко используемых вирусных векторов для переноса генов in vivo. Векторы могут инфицировать клетки из тканей множества типов, обеспечивая мощную и устойчивую трансгенную экспрессию. Они также являются непатогенными и имеют низкий профиль иммуногенности (High KА et al., «rAAV human trial experience» Methods Mol Biol. 2011; 807:429-57).

Международные заявки WO 2017106354 (A1), WO 2010129021 (A1), WO 2015060722 (A1), WO 2017066579 (A1), WO 2015158749 (A2) описывают различные варианты AAV с геном SMN1 и их применение.

Описание изобретения

Авторами изобретения была разработана выделенная нуклеиновая кислота для получения генотерапевтического вирусного препарата, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a, экспрессионная кассета и вектор на ее основе, а также рекомбинантный вирус на основе AAV9 для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках, фармацевтическая композиция, которая включает данный рекомбинантный вирус, и различные варианты применения вышеуказанного рекомбинантного вируса и вышеуказанной композиции. Авторы изобретения неожиданно установили, что miR-23a усиливает функциональное действие эффекта SMN1 in vitro и установили синергетический эффект SMN1 и miR-23a при лечении СМА в животной модели данной болезни.

Краткое описание изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте для получения генотерапевтического вирусного препарата, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 (белок выживаемости моторных нейронов) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, включает микроРНК miR-23a, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, включает нуклеиновую кислоту, кодирующую микроРНК miR-23a, которая включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, которая включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40); нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и правый (второй) ITR.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится кэкспрессионному вектору, который включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот или любую из вышеуказанных кассет.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу на основе AAV9 (аденоассоциированный вирус 9 серотипа) для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках, который включает капсид и любую из вышеуказанных кассет.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 включает белок VP1 AAV9.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN 1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и правый (второй) ITR.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки гена SMN1 в целевые клетки, которая включает любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для доставки гена SMN1 в целевые клетки.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для выживаемости субъекта, который имеет спинальную мышечную атрофию и/или не имеет полнофункциональных копий гена SMN1.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для обеспечения белком SMN1 субъекта, который имеет спинальную мышечную атрофию и/или не имеет полнофункциональных копий гена SMN1.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для лечения спинальной мышечной атрофии у субъекта, который имеет спинальную мышечную атрофию.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу модуляции двигательной функции у субъекта с нарушением двигательных нейронов, включающий введение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции в клетки субъекта.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу обеспечения белком SMN субъекта со спинальной мышечной атрофией, включающий введение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции в клетки субъекта, нуждающегося в этом.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки гена SMN1 в целевые клетки субъекта со спинальной мышечной атрофией, включающий введение любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции в клетки субъекта.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения спинальной мышечной атрофии у субъекта, который включает ведение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции субъекту со спинальной мышечной атрофией.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий экспрессию SMN1 на уровне мРНК после нокдауна SMN1 с помощью siRNA и трансдукции вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a. Клетки U-87 были трансфецированы 20 нмоль/л siRNA, специфичной к SMN 1 (или контрольной siRNA), после чего трансдуцированы вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a при MOI=400000. Через 120 ч после трансдукции количество копий гена SMN1 в каждом образце было определено с помощью количественной ПЦР (n=3). Также было определено количество копий гена домашнего хозяйства GAPDH. Все полученные количества для SMN1 были нормализованы на количества копий гена GAPDHv. каждом образце. Представлены данные по нормализованному среднему количеству копий SMN1 с указанием стандартного отклонения.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий экспрессию SMN на уровне белка после нокдауна SMNJ с помощью siRNA и трансдукции вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a. Клетки U-87 были трансфецированы 20 нмоль/л siRNA, специфичной к SMN1 (или контрольной siRNA), после чего трансдуцированы вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a при MOI=400000. Через 120 ч после трансдукции количество белка SMN в каждом образце было определено с помощью ИФА (n=3). Все полученные количества белка SMN (в пг) были нормализованы на общее количество белка в каждом образце (в мкг). Представлены данные по нормализованному среднему количеству белка SMN, с указанием стандартного отклонения.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий экспрессию miR-23a после нокдауна SMN1 с помощью siRNA и трансдукции вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a. Клетки U-87 были трансфецированы 20 нмоль/л siRNA, специфичной к SMN1 (или контрольной siRNA), после чего трансдуцированы вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a при MOI=400000. Через 120 ч после трансдукции количество miR-23a относительно количества копий гена GAPDH в каждом образце было определено с помощью количественной ПЦР (n=3), по методу ΔΔC_T. Представлены данные по нормализованному среднему количеству miR-23a, с указанием стандартного отклонения. Относительное количество miR-23a в нетрансфецированном и нетрансдуцированном контроле принято за 100%.

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий экспрессию Senataxin после нокдауна SMN1 с помощью siRNA и трансдукции вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a. Клетки U-87 были трансфецированы 20 нмоль/л siRNA, специфичной к SMN1 дикого типа (или контрольной siRNA), после чего трансдуцированы вирусами AAV9-GFP, AAV9-GFP-miR-23a, AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a при MOI=400000. Через 120 ч после трансдукции количество Senataxin относительно количества белка Vinculin в каждом образце было определено с помощью Western blot. Представлен график нормализованной экспрессии Senataxin относительно Vinculin в экспериментальных образцах с указанием стандартных отклонений (n=3). Относительное количество Senataxin в нетрансфецированном и нетрансдуцированном контроле принято за 100%.

Для фигур 1-4:

siNEG это негативный контроль siRNA,

siSMN1 это siRNA для SMN1.

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий кривые выживания мышей модели СМА, инъецированных вирусами AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a. Также показаны кривые выживания животных, инъецированных плацебо, и контрольных мышей дикого типа (из того же помета, что и опытные).

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

«Выделенный» означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в животном, не являются «выделенными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются «выделенными». Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать, по существу, в очищенной форме или могут существовать в неприродном окружении, таком как, например, генетически модифицированной клетке.

Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.

Термин «геном» относится к полному генетическому материалу организма.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Белок (Пептид)

В настоящем описании термины «пептид», «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не существует ограничений по максимальному количеству аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится и к коротким цепям, также общепринято обозначаемым в этой области, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки, множество типов которых существует. «Полипептиды» включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитные белки. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.

Молекулы нуклеиновых кислот

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.

Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

Аденоассоциированный вирус (AAV)

Вирусы семейства Parvoviridae представляют собой небольшие ДНК-содержащие вирусы животных. Семейство Parvoviridae может быть разделено на два подсемейства: Parvovirinae, представители которого инфицируют позвоночных животных, и Densovirinae, представители которого инфицируют насекомых. К 2006 году были описаны 11 серотипов аденоассоциированного вируса (Mori, S. ET AL., 2004, «Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein», Virology, T. 330 (2): 375-83). Все известные серотипы могут инфицировать клетки многих видов тканей. Тканевая специфичность определяется серотипом белков капсида, поэтому векторы на основе аденоассоциированого вируса конструируют, задавая необходимый серотип. Дополнительная информация по парвовирусам и другим представителям Parvoviridae описана в литературе (Kenneth I. Berns, «Parvoviridae: The Viruses and Their Replication», Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996)).

Геномная организация всех известных серотипов AAV очень сходна. Геном AAV представляет собой линейную одноцепочечную молекулу ДНК, которая содержит менее чем примерно 5000 нуклеотидов (нт) в длину. Инвертированные концевые повторы (1TR) фланкируют уникальные кодирующие нуклеотидные последовательности репликации неструктурных белков (Rep) и структурных белков (Сар). Ген Сар кодирует белки VP (VP1, VP2 и VP3), которые образуют капсид. Концевые 145 нуклеотидов являются самокомплементарными и организованы таким образом, что может быть сформирован энергетически стабильный внутримолекулярный дуплекс, образующий Т-образную шпилечную структуру. Такие шпилечные структуры функционируют как точки начала репликации ДНК вируса, являясь праймерами для клеточного ДНК-полимеразного комплекса. После инфекции клеток млекопитающих AAV дикого типа (wtAAV) гены Rep (например, Rep78 и Rep52) экспрессируются с помощью Р5 промотора и Р19 промотора, соответственно, и оба белка Rep выполняют определенную функцию в репликации генома вируса. Сплайсинг в открытой рамке считывания Rep (Rep ORF) приводит к экспрессии фактически четырех белков Rep (например, Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40). Однако было показано, что несплайсированная мРНК, кодирующая белки Rep78 и Rep52, является достаточной для продукции вектора AAV в клетках млекопитающих.

Вектор

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту.

Как применяют в настоящем описании, термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, запускаемую ее промотором.

Применение

«Генная терапия» представляет собой вставку генов в клетки и/или ткани субъекта для лечения заболевания, обычно, наследственных заболеваний, при этом дефектный мутантный аллель заменяется или дополняется функциональным аллелем.

«Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, термин «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.

В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению.

«Заболевание» является состоянием здоровья субъекта, где субъект не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают, то здоровье субъекта продолжает ухудшаться.

Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

Терапевтически эффективным количеством» или «эффективным количеством» считается количество вводимого терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.

Подробное описание изобретения

Нуклеиновая кислота

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте для получения генотерапевтического вирусного препарата, которая содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 (белок выживаемости моторных нейронов) с аминокислотной последовательностью и нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a.

В некоторых вариантах вышеуказанная нуклеиновая кислота используется для получения генотерапевтического вирусного препарата, который представляет собой экспрессионный вектор по изобретению или рекомбинантный вирус на основе AAV9 по изобретению.

«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты нуклеазы. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

Специалисту в данной области будет очевидно, что белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, включает нуклеотидную последовательность

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, включает микроРНК miR-23a, которая имеет нуклеотидную последовательность

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, включает нуклеиновую кислоту, кодирующую микроРНК miR-23a, которая включает нуклеотидную последовательность

Вышеуказанная нуклеиновая кислота, которая кодирует микроРНК miR-23a, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4 является нуклеиновой кислотой до процессинга.

После процессинга нуклеиновая кислота, которая кодирует микроРНК miR-23a, имеет нуклеотидную последовательность

В некоторых вариантах выделенная нуклеиновая кислота, включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a.

Экспрессионная кассета. Экспрессионный вектор

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионной кассете, которая включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.

Термин «экспрессионная кассета» при использовании в данном документе, в частности, относится к фрагменту ДНК, который способен в соответствующей обстановке запускать экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, который включен в указанную экспрессионную кассету. При введении в клетку-хозяина экспрессионная кассета помимо прочего способна задействовать клеточные механизмы для транскрипции полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, в РНК, которая затем обычно дополнительно процессируется и, наконец, транслируется в представляющий интерес полипептид. Экспрессионная кассета может содержаться в экспрессионном векторе.

Термин «кассета, которая экспрессирует» или «экспрессионная кассета» при использовании в данном документе, в частности, относится к фрагменту ДНК, который способен в соответствующей обстановке запускать экспрессию полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, который включен в указанную экспрессионную кассету. При введении в клетку-хозяина экспрессионная кассета помимо прочего способна задействовать клеточные механизмы для транскрипции полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид, в РНК, которая затем обычно дополнительно процессируется и, наконец, транслируется в представляющий интерес полипептид. Экспрессионная кассета может содержаться в экспрессионном векторе.

Экспрессионная кассета по настоящему изобретению содержит в качестве элемента промотор. Термин «промотор», используемый в настоящем документе, в частности, относится к элементу ДНК, который способствует транскрипции полинуклеотида, с которым функционально связан промотор. Промотор может также составлять часть элемента «промотор/энхансер». Хотя физические границы между элементами «промотор» и «энхансер» не всегда ясны, термин «промотор» обычно относится к месту на молекуле нуклеиновой кислоты, с которым связывается РНК-полимераза и/или связанные с ней факторы, и с которого инициируется транскрипция. Энхансеры усиливают активность промотора во времени, а также пространственно. В данной области известно множество промоторов, которые транскрипционно активны в широком диапазоне типов клеток. Промоторы могут быть разделены на два класса: на тех, которые функционируют конститутивно, и тех, которые регулируются индукцией или снятием репрессии. Для экспрессии белка пригодны оба класса. Промоторы, которые используются для продукции высокого уровня полипептидов в эукариотических клетках и, в частности, в клетках млекопитающих, должны быть сильными и, предпочтительно, должны быть активными в широком диапазоне типов клеток. Сильные конститутивные промоторы, которые способны запускать экспрессию во многих типах клеток, хорошо известны в данной области и, поэтому, нет необходимости в их подробном описании в данном документе. В соответствии с идеей настоящего изобретения предпочтительно использовать промотор цитомегаловируса (CMV). Промотор или промотор/энхансер, полученные из немедленной ранней (IE) области цитомегаловируса (hCMV) человека, в особенности подходят в качестве промотора в экспрессионной кассете по настоящему изобретению. Немедленная ранняя (IE) область цитомегаловируса (hCMV) человека и полученные из нее функциональные запускающие экспрессию фрагменты и/или функциональные усиливающие экспрессию фрагменты, например, описаны в ЕР 0173177 и ЕР 0323997, а также хорошо известны в данной области. Таким образом, несколько фрагментов немедленной ранней (IE) области hCMV могут использоваться в качестве промотора и/или промотора/энхансера. Согласно одному варианту осуществления изобретения промотор CMV человека используется в экспрессионной кассете по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и правый (второй) ITR.

В некоторых вариантах левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы) имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах CMV (цитомегаловирусный) энхансер имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах CMV (цитомегаловирусный) промотер имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1) имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека) имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40) имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах правый (второй) ITR имеет следующую последовательность нуклеиновой кислоты:

В некоторых вариантах экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с нуклеотидной последовательностью

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, который включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот или любую из вышеуказанных кассет.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих). В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы» («вектор экспрессии» или «экспрессионный вектор»)).

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют).

Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать лидерный пептид (или сигнальный пептид), который облегчает выработку белка-интереса клеткой-хозяином. Ген белка-интереса может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца белка-интереса. Лидерным пептидом (или сигнальным пептидом) может быть лидерный пептид иммуноглобулина или иной лидерный пептид (то есть, лидерный пептид белка не иммуноглобулиновой природы).

Помимо генов SMN1 и микроРНК miR-23a по данному изобретению, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию гена SMN1 и гена микроРНК miR-23a в клетке-хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP)), вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина.

Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме-хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

В контексте настоящего описания термин «промотор» или «регуляторная последовательность транскрипции» или «регуляторная последовательность» относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который контролирует транскрипцию одной или нескольких кодирующих последовательностей, и который расположен против направления считывания информации относительно направления транскрипции от сайта инициации транскрипции кодирующей последовательности, а также который структурно идентифицируется по наличию сайта связывания для ДНК-зависимой РНК-полимеразы, сайтов инициации транскрипции и других последовательностей ДНК, включающих, без ограничения, сайты связывания фактора транскрипции, сайты связывания репрессора и активатора белка, а также любые другие последовательности нуклеотидов, известные специалистам в данной области, которые непосредственно или опосредованно регулируют уровень транскрипции с данным промотором. «Конститутивный» промотор представляет собой такой промотор, который активен в большинстве тканей в обычных физиологических условиях и условиях развития. «Индуцибельный» промотор представляет собой промотор, который подвергается физиологической регуляции или регуляции в ходе развития, например, при воздействии химического индуктора. «Тканеспецифичный» промотор активен только в конкретных типах тканей или клеток.

Термины «энхансеры» или «энхансер», используемые в изобретении, могут относиться к последовательности ДНК, которая расположена как смежная с последовательностью ДНК, кодирующей рекомбинантный продукт. Энхансерные элементы обычно расположены в 5'-направлении от промоторного элемента или могут быть расположены ниже или в пределах кодирующей последовательности ДНК (например, последовательности ДНК, транскрибированной или транслированной в рекомбинантный продукт или продукты). Таким образом, энхансерный элемент может быть расположен на расстоянии 100 пар оснований, 200 пар оснований или 300 или больше пар оснований перед последовательностью ДНК, которая кодирует рекомбинантный продукт, или после этой последовательности. Энхансерные элементы могут увеличивать количество экспрессируемого рекомбинантного продукта от последовательности ДНК, превышая экспрессию, обусловленную одиночным промоторным элементом. Специалистам в данной области техники доступно множество энхансерных элементов.

Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.

В одном из вариантов настоящего изобретения «экспрессионный вектор» относится к вектору, содержащему одну или несколько интересующих полинуклеотидных последовательностей, интересующих генов или «трансгенов», которые фланкированы парвовирусными или инвертированными концевыми повторяющимися последовательностями (ITR).

Ни кассета, ни вектор по изобретению не содержит нуклеотидные последовательности генов, кодирующих неструктурные белки (Rep) и структурные белки (Сар) аденоассоциированного вируса.

Рекомбинантный вирус на основе AAV9 (аденоассоциированный вирус 9 серотипа)

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу на основе AAV9 (аденоассоциированный вирус 9 серотипа) для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках, который включает капсид и любую из вышеуказанных кассет.

Термин «рекомбинантный вирус на основе AAV» (или «вирусоподобная частица на основе AAV», или «рекомбинантный вирусный штамм AAV», или «рекомбинантный вектор AAV», или «вектор rAAV») в контексте настоящего описания относится к вышеуказанной экспрессионной кассете (или вышеуказанному экспрессионному вектору), которая заключена внутри капсида AAV.

Ген Сар, помимо других альтернативных продуктов, кодирует 3 капсидных белка (VP1, VP2 и VP3). Белки VP1, VP2 и VP3 находятся в соотношении 1:1:10, образуя икосаэдрический капсид (Xie Q. et al. The atomic structure of adeno-associated virus (AAV-2), a vector for human gene therapy. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99:10405-10410). Транскрипция этих генов начинается с одного промотора, р40. Молекулярная масса соответствующих белков (VP1, VP2 и VP3) составляет 87, 72 и 62 кДа, соответственно. Все три белка транслируются с одной мРНК. После транскрипции пре-мРНК может подвергаться сплайсингу двумя разными способами, при этом вырезается более длинный или более короткий интрон и образуются мРНК различной нуклеотидной длины.

При образовании рекомбинантного вируса на основе AAV (rAAV) кассета экспрессии, фланкированная ИКП (ITR), упаковывается в капсид AAV. Гены, необходимые для репликации AAV, как было указано выше, не входят в кассету.

ДНК экспрессионной кассеты упакована в вирусный капсид в виде одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК) длиной приблизительно 3000 нуклеотидов. После инфицирования клетки вирусом, одноцепочечную ДНК конвертируют в форму двухцепочечной ДНК (дцДНК). Только дцДНК могут использовать белки клетки, которые транскрибируют содержащийся ген или гены в РНК.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP1 AAV9.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP1 AAV9, имеющий следующую аминокислотную последовательность

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP2 AAV9.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP2 AAV9, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP2 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 с одной или несколькими точечными мутациями.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP3 AAV9.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP3 AAV9, имеющий следующую аминокислотную последовательность

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP3 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 с одной или несколькими точечными мутациями.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1, VP2 и VP3 AAV9.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, VP2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 и VP3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, VP2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 с одной или несколькими точечными мутациями и VP3 с аминокислотной последовательностью SEQ IDNO: 9 с одной или несколькими точечными мутациями.

Под «несколькими точечными мутациями» подразумеваются две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять точечных замен.

Особенно предпочтительные варианты включают замены (мутации), которые являются консервативными по природе, т.е. те замены, которые имеют место в семействе аминокислот, которые объединены по их боковым цепям. В частности, аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Например, достаточно обосновано предсказание о том, что выделенная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серии или схожая консервативная замена аминокислоты на структурно родственную аминокислоту не окажет важного влияния на биологическую активность. Например, полипептид, представляющий интерес, может включать вплоть до приблизительно 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, при условии, что желаемая функция молекулы остается незатронутой.

Вариант точечных мутаций в последовательностях белков VP1, VP2 или VP3 AAV9 с помощью аминокислотных замен представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в белке VP1, VP2 или VP3 AAV9 на другой аминокислотный остаток.

Консервативные замены показаны в табл. А под заголовком «предпочтительные замены».

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и правый (второй) ITR.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ IDNO: 7, VP2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 и VP3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и правый (второй) ITR.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, VP2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 с одной или несколькими точечными мутациями и VP3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN 1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и правый (второй) 1TR.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, VP2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 и VP3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, а экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.

В некоторых вариантах рекомбинантный вирус на основе AAV9 имеет капсид, который включает белки VP1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 с одной или несколькими точечными мутациями, VP2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 с одной или несколькими точечными мутациями и VP3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9 с одной или несколькими точечными мутациями, а экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.

Фармацевтическая композиция

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для доставки гена SMN1 в целевые клетки, которая включает любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

Действующее вещество в вышеуказанной композиции находится в эффективном количестве, например, в биологически эффективном количестве.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный вирус на основе AAV9 по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или в других фармацевтических агентах, адъювантах, разбавителях и т.д. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть или твердым, или жидким, таким как стерильная апирогенная вода или стерильный апирогенный фосфатно-солевой буферный раствор. Для введения путем ингаляции носитель является вдыхаемым и предпочтительно находится в твердой или жидкой дисперсной форме. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или солевые растворы и/или буферы.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV9 по изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы.

«Фармацевтически приемлемым» считается материал, который не имеет биологических или других противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансфекции клетки ex vivo или для введения in vivo рекомбинантного вируса на основе AAV9 по изобретению непосредственно субъекту.

Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.

Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента.

Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату вектора на основе rAAV9, проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.

Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8°С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.

Применение

Авторы изобретения неожиданно установили, что miR-23a усиливает функциональное действие эффекта SMN1 in vitro и установили синергетический эффект SMN1 и miR-23a при лечении СМА в животной модели данной болезни.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для доставки гена SMN1 в целевые клетки.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для выживаемости субъекта, который имеет спинальную мышечную атрофию и/или не имеет полнофункциональных копий гена SMN1.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для обеспечения белком SMN1 субъекта, который имеет спинальную мышечную атрофию и/или не имеет полнофункциональных копий гена SMN1.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции для лечения спинальной мышечной атрофии у субъекта, который имеет спинальную мышечную атрофию.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу модуляции двигательной функции у субъекта с нарушением двигательных нейронов, включающий введение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции в клетки субъекта.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу обеспечения белком SMN субъекта со спинальной мышечной атрофией, включающий введение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции в клетки субъекта, нуждающегося в этом.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки гена SMN1 в целевые клетки субъекта со спинальной мышечной атрофией, включающий введение любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции в клетки субъекта.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения спинальной мышечной атрофии у субъекта, который включает ведение терапевтически эффективного количества любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе AAV9 или вышеуказанной композиции субъекту со спинальной мышечной атрофией.

Под отсутствием полнофункциональных копий гена SMN1 подразумеваются инактивирующие мутации или делеции во всех копиях гена SMN1 в геноме, которые приводят к потере или дефекту функции гена SMN1.

Под субъектом подразумевают любое животное, которое поддается воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

Под субъектом, нуждающимся в доставке гена SMN1 в целевые клетки, или субъектом, нуждающимся в обеспечении белком SMN1, или субъектом, нуждающимся в доставки гена SMN1 в целевые клетки, подразумевается субъект, который имеет спинальную мышечную атрофию или субъект, который имеет инактивирующие мутации или делеции в гене SMN1, которые приводят к потере или дефекту функции гена SMN 1.

Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.

Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV9 по данному изобретению локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.

Рекомбинантный вирус на основе AAV9 вводят в организм в эффективном количестве. Рекомбинантный вирус на основе AAV9 предпочтительно вводят в организм в биологически эффективном количестве. «Биологически эффективное» количество рекомбинантного вируса представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать инфекцию (или трансдукцию) и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке. Если вирус вводят в клетку in vivo (например, вирус вводят субъекту, как описано ниже), «биологически эффективное» количество вирусного вектора представляет собой количество, которое достаточно, чтобы вызвать трансдукцию и экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-мишени.

Дозировки вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV9 по данному изобретению будут зависеть от способа введения, конкретного вирусного вектора и их можно определять рутинными способами. Примерными дозами для достижения терапевтического эффекта являются вирусные титры, составляющие по меньшей мере примерно 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶ трансдуцирующих единиц или больше, предпочтительно приблизительно от 10⁹ до 10¹⁵ трансдуцирующих единиц, еще более предпочтительно 10¹⁴ трансдуцирующих единиц на килограмм.

Клетка для введения вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе AAV9 по изобретению может быть клеткой любого типа, включая в себя без ограничения, моторные нейроны или прочие ткани нервной системы, эпителиальные клетки (например, эпителиальные клетки кожи, дыхательных путей и кишечника), печеночные клетки, мышечные клетки, клетки селезенки, фибробласты, эндотелиальные клетки и тому подобное.

Вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе AAV9 по изобретению не используется для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека.

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Материалы и общие методы

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей. Вкратце, плазмидную ДНК нарабатывали для дальнейших манипуляций в клетках Е. coli, выращиваемых под селективным давлением с антибиотиками для того, чтобы плазмиды не терялись в клеточной популяции. Плазмидную ДНК выделяли из клеток коммерческими наборами, измеряли концентрацию и использовали для клонирования с помощью обработки эндонуклеазами рестрикции или методами ПЦР-амплификации. Фрагменты ДНК лигировали между собой с помощью лигаз и трансформировали в бактериальные клетки для отбора клонов и дальнейших наработок. Все полученные генетические конструкции подтверждали по паттернам рестрикции и полным секвенированием по Сэнгеру.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 1000 п. н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем ренатурации олигонуклеотидов друг на друге с последующей ПЦР-амплификацией с крайних праймеров. В результате получали смесь фрагментов, включая нужный. Фрагменты клонировали по сайтам рестрикции в промежуточные векторы, после чего последовательности ДНК субклонированных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сэнгеру. Анализ последовательностей ДНК и белков и обработку данных о последовательностях осуществляли в программе SnapGene 4.2 и выше для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.

Культивирование клеточных культур

В экспериментах были использованы клеточные линии НЕК293 (Human Embryonic Kidney clone 293) и U-87 MG (глиобластома человека). Клетки культивировались в стандартных условиях при 37°С и 5%С0₂, на полной питательной среде DMEM с добавлением 10% FBS и антибиотика. Для культивирования HSMC культуральный пластик предварительно покрывался коллагеном (Gibco). Пересев клеток осуществлялся при достижении 80-90% конфлюентности. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью окраски Trypan Blue и камеры Горяева либо с помощью окраски PI и проточной цитометрии.

Трансфекция клеток siRNA

Коммерческую siRNA, специфичную к гену SMN1, вместе с неспецифичным контролем заказывали у производителя (ThermoFisher Scientific).

Клеточные линии засеивали накануне трансфекции в 6-луночные планшеты таким образом, чтобы они достигали 70-80% конфлюентности к моменту трансфекции. Трансфекцию осуществляли с помощью коммерческих наборов для липофекции по протоколу производителя. Через 24 ч после трансфекции осуществляли трансдукцию (см. ниже). Через 120 ч после трансдукции клетки обрабатывали растворами трипсина или аналогичными, снимали с подложки, отмывали в фосфатном буфере и собирали для дальнейшего анализа экспрессии целевых генов и белков. Для контроля уровня нокдауна белка SMN ставили иммуно-ферментный анализ (ИФА).

Все образцы ставили в трех экспериментальных повторностях.

Анализ генной экспрессии

Экспрессию SMN1 на уровне мРНК, а также экспрессию miR-23a проверяли с помощью количественной ПЦР. Вкратце, использовали праймеры и пробу, специфичные к нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SMN 1. Для miR-23a использовали коммерческий набор для специфичной к процессированной miR-23a количественной ПЦР (Thermo Fisher Scientific). Для контроля количества исходной РНК использовали праймеры и пробу, специфичные к гену домашнего хозяйства GAPDH. Для каждого набора праймеров и проб строили калибровочные кривые с применением известного количества копий линеаризованной плазмидной ДНК, содержащей амплифицируемую последовательность соответствующего гена. Анализ экспрессии осуществляли, определяя по калибровочным кривым количество копий SMN1 и GAPDH в каждом образце, после чего нормализовали количество копий SMN1 на 10000 копий GAPDH. Полученные значения сравнивали между собой для различных образцов в рамках одного эксперимента.

Определение экспрессии белка SMN

Для определения количества общего белка использовали набор Thermo Fisher Scientific. Клеточные осадки лизировали, полученные лизаты вносили в лунки микропланшета вместе со стандартными разведениями BSA с известной концентрацией. К образцам добавляли рабочий реагент, инкубировали. По окончанию инкубации измеряли абсорбцию при длине волны 562 нм на микропланшетном ридере. Концентрацию общего белка в исследуемых образцах рассчитывали по кривой стандартного образца BSA. Далее, лизаты разводили до концентрации общего белка 10 м кг/мл.

Оценку содержания белка SMN в клетках проводили посредством иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческого набора Abcam согласно инструкции производителя. В лунки микропланшета, покрытые антителами к SMN, вносили исследуемые образцы и стандарты с известной концентрацией. После инкубации и промывки, в каждую лунку добавляли специфичные к SMN поликлональные антитела для детекции, инкубировали, отмывали. Вносили вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, инкубировали. Излишки реагентов смывали и добавляли ТМВ субстрат. После короткой инкубации ферментативную реакцию останавливали с помощью стоп-реагента. Оптическую плотность окрасившегося в желтый цвет продукта измеряли спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Количество SMN в исследуемых образцах определяли по калибровочному графику зависимости оптической плотности от концентрации SMN в стандартах.

Определение экспрессии мишени SMN - белка Senataxin (функциональный тест)

Белок Senataxin - полифункциональный фермент, участвующий в разрешении ДНК-РНК структур, называемых R-loops и возникающих в процессе транскрипции в отсутствие или при недостаточной экспрессии белка SMN. В литературе была показана прямая корреляция между уровнями экспрессии SMN и Senataxin, и непрямая активация Senataxin является одной из функций SMN. В связи с этим изменение экспрессии Senataxin было использовано в качестве функционального теста для SMN.

Уровень экспрессии Senataxin определяли с помощью метода Western blot. Вкратце, клетки лизировали буфером RIPA с добавлением коктейля ингибиторов протеаз после экспериментального воздействия (трансфекция, транедукция, инкубация), получив образцы белковых лизатов. Образцы наносили на 10% полиакриламидный денатурирующий гель, после чего осуществляли перенос белков на мембрану PVDF.

Мембрану инкубировали в течение 1 часа в растворе 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в буфере TBS-T, после чего раствор BSA заменяли на раствор 1% BSA в TBS-T с добавлением первичных антител, специфичных к Senataxin. Через 2 часа инкубации отмывали мембрану 3 раза раствором 1% BSA в TBS-T и добавляли раствор вторичных антител в TBS-T с 1% BSA. Использовали вторичные антитела, конъюгированные с ферментом пероксидазой хрена.

Вторичные антитела отмыли 3 раза раствором 1% BSA в TBS-T, после чего проявили белковый сигнал на мембране, использовав субстрат для хемилюминисценции и систему визуализации гелей. Полученные изображения сохраняли в цифровом формате и анализировали интенсивность сигнала с помощью программного обеспечения системы визуализации гелей.

В качестве контроля для нормализации использовали белковый сигнал гена домашнего хозяйства винкулина. Окрашивание на него проводили аналогично.

Сборка и очистка вирусных частиц рекомбинантных векторов AAV

Для сборки вирусных частиц AAV, содержащих ген SMNJ или контрольный ген GFP, использовали упаковочные клетки НЕК293, в которые трансфецировали с использованием полиэтиленимина 3 плазмиды:

1. Плазмида, содержащая геном AAV с кассетой для экспрессии трансгена (SNMJ, GFP, SMN1+miR-23a или GFP+miR-23a);

2. Плазмида для экспрессии гена Сар серотипа AAV9 и гена Rep серотипа AAV2. Каждый ген с помощью альтернативных рамок считывания кодирует несколько белковых продуктов;

3. Плазмида для экспрессии генов аденовируса Ad5, необходимых для сборки и упаковки капсидов AAV.

Через 72 часа клетки лизировали и проводили очистку и концентрирование вирусных частиц с помощью методов фильтрации и хроматографии. Титр вирусных частиц определяли с помощью количественной ПЦР с праймерами и пробой, специфичными к участку рекомбинантного вирусного генома и выражали в виде количества копий вирусных геномов на 1 мл.

Трансдукции клеточных культур

Клеточную линию U-87 засевали аналогично экспериментам для трансфекции, ставили трансфекцию с siRNA, после чего добавляли препарат с вирусными частицами и через 120 ч клетки анализировали. Эффективность трансдукции считали, анализируя процент GFP + клеток.

Для используемых культур предварительно были поставлены эксперименты с проверкой эффективности трансдукции. Кратко, препарат вируса AAV9-GFP трансдуцировали в клеточные линии в различных соотношениях клеток и вирусных частиц. Отношение количества вирусных частиц и клеток называют multiplicity of infection (MOI). MOI вируса AAV9-GFP варьировали от 50000 до 1000000. В результате для линии U-87 была выбрана оптимальная MOI, равная 400000. Дальнейшие работы с трансдукцией U-87 проводили с такой MOI для всех вирусов.

После трансдукции анализ экспрессии генов и белков осуществляли как описано выше.

Все образцы ставили в трех экспериментальных повторах.

Инъекция вирусных препаратов в мышиную модель спинальной мышечной атрофии (СМА)

Вирусные частицы AAV9-SMN1, AAV9-GFP, AAV9-SMN1-miR-23a и AAV9-GFP-miR-23a использовали для инъекции в мышей модельной линии СМА. Данные мыши не экспрессируют ген Smn мыши, но имеют в своем геноме по одной копии гена SMN2 человека и гена SMN1 человека с отсутствующим 7 экзоном (SMN1Δ7). Без вмешательства или при инъекции плацебо такие мыши рождаются, но плохо набирают вес после рождения и погибают в среднем через 21 день.

Мышей модельной линии генотипировали в первый день после рождения, после чего мышей, не содержащих ни одной копии гена Smn, инъецировали системно (в хвостовую вену) либо плацебо (раствор, не содержащий вирусных частиц, но содержащий буфер для их разведения), либо одним из вирусов с дозой 3,2×10¹⁴ вг/кг веса. После этого содержали животных в стандартных условиях и ежедневно замеряли их вес, а также строили кривые выживаемости. Через 90 дней после инъекции выживших животных забивали для анализа тканей и прекращали эксперимент.

Пример 1. Сборка генетических конструкций, несущих рекомбинантный геном AAV и кодирующих гены SMN1, GFP и miR-23a

Последовательность гена SMN1 была получена путем амплификации со специфическими праймерами с кДНК, синтезированной на основе тотальной РНК клеток НЕK293, либо собрана из серии олигонуклеотидов (см. выше). В процессе амплификации с 5'-конца гена была добавлена последовательность Kozak и сайт рестрикции ClaI, а с 3'-конца - сайт рестрикции XbaI. После этого последовательность гена SMN1 была клонирована рестриктазно-лигазным методом по сайтам ClaI и XbaI в коммерческую конструкцию pAAV-GFP Control plasmid (VPK-402) от CellBiolab (США), с заменой гена GFP на SMN1, в результате была получена конструкция pAAV-SMN1.

В полученные ранее плазмиды pAAV-GFP и pAAV-SMN1 встроили дополнительную кассету для экспрессии miR-23a. Дополнительная кассета для экспрессии miR-23a состоит из промотора, гена интереса (miR-23a, получен с использованием ПЦР с геномной ДНК клеточной линии Huh7) и сигнала полиаденилирования. Целевые вектора были получены путем линеаризации по сайту PmlI векторов-реципиентов (pAAV-GFP, pAAV-SMN1) и последующим встраиванием экспресионной кассеты с miR-23a по липким концам.

Конечный вектор содержит все необходимые элементы для экспрессии гена и сборки в составе генома рекомбинантного AAV:

1. Терминальные повторы ITR на концах последовательности, которая инкапсидируется в вирусный капсид;

2. Кассету для экспрессии целевого гена (промотор, энхансер, интрон, последовательность Kozak, трансген, сайт полиаденилирования);

3. При наличии, кассету для экспрессии miR-23a (промотор, кассету микроРНК на основе miR-30, кодирующую прямую и обратную цепи miR-23a, сигнал полиаденилирования);

4. Ориджин бактериальной репликации и ген устойчивости к антибиотику для наработки плазмидной ДНК в бактериальных клетках.

Пример 2. Создание вирусных препаратов, экспрессируюндих SMN1 и miR-23a

Плазмиды pAAV-SMN1, pAAV-GFP, pAAV-SMN1-miR-23a, pAAV-GFP-miR-23a вместе с остальными плазмидами, необходимыми для получения вирусных частиц рекомбинантного AAV (см. выше), были использованы для биопроцесса получения AAV. В качестве серотипа использовали серотип AAV9 дикого типа или с различными мутациями. Во всех случаях сравнение свойств вирусных частиц проводили только в случае идентичности используемого серотипа и мутаций капсида, если они присутствовали. Все серотипы на базе AAV9, дикого типа или с мутациями, в дальнейшем обозначаются как AAV9 без указания мутаций.

В результате биопроцесса были получены рекомбинантные вирусные частицы, обозначенные как AAV9-SMN1, AAV9-GFP, AAV9-SMN1-miR-23a, AAV9-GFP-miR-23a. После определения титров вирусных частиц, все 3 препарата с одинаковыми MOI равными 400 тысяч были использованы для трансдукции пермиссивных клеток - U-87, предварительно (за 24 ч до этого) трансфицированных siRNA против SMN1 или siRNA с неспецифической последовательностью. Дальнейший анализ проводили только в том случае, если эффективность трансдукции GFP составляла не менее 70%.

После успешной трансдукции клетки снимали с подложки, отмывали в фосфатном буфере и анализировали экспрессию SMN1 на уровне мРНК и белка SMN как описано выше. Было показано, что при трансдукции вирусами AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a экспрессия SMN1 превышала эндогенный уровень по мРНК (табл. 1, фиг. 1) и восстанавливалась до эндогенного уровня (наблюдаемого в контроле без siRNA, специфичной к SMN1) на уровне белка (табл. 2, фиг. 2).

Также был определен уровень экспрессии miR-23a в образцах после трансдукции. Было показано значительное превышение экспрессии miR-23a в образцах, трансдуцированных вирусами AAV9-SMN1-miR-23a, AAV9-GFP-miR-23a. В остальных образцах экспрессия miR-23a не отличалась от эндогенной. Трансфекция siRNA против SMN1 не влияла на экспрессию miR-23a (табл. 3, фиг. 3).

Отметим, что изменение экспрессии SMNJ при нокдауне или восстановлении с помощью вирусного препарата не влияло на экспрессию miR-23a. Также, гиперэкспрессия miR-23a не оказывала влияния на экспрессию SMN1.

Пример 3. Функциональная оценка SMN1 и miR-23a in vitro после трансдукции

Описанная выше схема эксперимента по нокдауну SMN1 и восстановлению его экспрессии с помощью трансдукции вирусными частицами была использована для оценки функциональной кооперации SMN1 и miR-23a in vitro. Среди множества функций SMN1, данный белок ответственен за правильное разрешение ДНК-РНК дуплексов, возникающих в процессе транскрипции. При этом основным белком, участвующим в разрешении дуплексов, является Senataxin, который, по литературным данным, непрямым образом активируется SMN. Таким образом, можно считать активацию Senataxin функциональным тестом активности SMN в клетках.

Уровень экспрессии Senataxin в образцах определяли с помощью метода Western blot. Было обнаружено, что при нокдауне экспрессии SMN экспрессия Senataxin также снижалась примерно в 2 раза, а при восстановлении экспрессии SMN вирусом AAV9-SMN1 возвращалась на эндогенный уровень. При трансдукции контрольным вирусом AAV9-GFP-miR-23a также наблюдалась тенденция к незначительному увеличению экспрессии Senataxin в случае нокдауна SMN, однако оно не было статистически достоверным. Важно отметить, что при трансдукции вирусом AAV9-SMN1-miR-23a экспрессия Senataxin не только восстанавливалась до эндогенного уровня на фоне нокдауна эндогенного SMN, но и увеличивалась статистически достоверно в 1,5-2 раза (табл. 4, фиг. 4).

Это свидетельствует о наличии синергетического эффекта SMN и miR-23a на экспрессию Senataxin, превышающего эффект как miR-23a, так и SMN по отдельности на регуляцию данного гена.

Пример 4. Синергетический эффект SMN1 и miR-23a при лечении животных мышиной модели СМА

Вирусные препараты AAV9-SMN1 и AAV9-SMN1-miR-23a инъецировали в хвостовую вену модельных мышей СМА в первый день после рождения с дозой 3,6×10¹⁴ вг/кг. В качестве контролей использовали раствор без вирусных частиц (плацебо) и группу мышей-сиблингов дикого типа, не имевших фенотипа СМА в силу экспрессии у них Smn. Далее строили функции выживаемости мышей во всех группах. По достижении момента, когда было возможно определить медианы времени выживания для всех групп, медианы были посчитаны.

Наибольшим образом фенотип СМА был исправлен в группе, инъецированной вирусом AAV9-SMN1-miR-23a. Медиана времени выживания для группы составила 55 дней. Этот результат значимо отличался от группы, инъецированной вирусом AAV9-SMN1, где медиана времени выживания составила 21 день. Для мышей, инъецированных плацебо, медиана составила 16 дней после рождения (фиг. 5). Данный результат свидетельствует о наличии синергетического эффекта SMNJ и miR-23a при лечении СМА в животной модели данной болезни.

--->

Sequence listing

<110> LLC "ANABION"

<120> Synergistic effect of SMN1 and miR-23a in treating spinal muscular atrophy

<150> RU2021102051

<151> 29.01.2021

<160> 17

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 294

<212> PRT

<213> Natural Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of SMN1 protein

<400> 1

Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu

1 5 10 15

Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp

20 25 30

Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala

35 40 45

Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly

50 55 60

Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser

65 70 75 80

Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp

85 90 95

Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr

100 105 110

Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr

115 120 125

Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro

130 135 140

Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu

145 150 155 160

Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser

180 185 190

Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

210 215 220

Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro

225 230 235 240

Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp

245 250 255

Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr

260 265 270

His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg

275 280 285

Cys Ser His Ser Leu Asn

290

<210> 2

<211> 882

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid sequence encoding SMN1 protein

<400> 2

atggccatga gcagcggcgg cagcggcggc ggcgtgcctg agcaagagga cagcgtgctg 60

ttcagaagag gcaccggcca gagcgacgac agcgacatct gggacgacac cgccctgatc 120

aaggcctacg acaaggccgt ggccagcttc aagcacgccc tgaagaacgg cgacatctgc 180

gagaccagcg gcaagcccaa gaccaccccc aagagaaagc ccgccaagaa gaacaagagc 240

cagaagaaga acaccgccgc cagcctgcag cagtggaagg tgggcgacaa gtgcagcgcc 300

atctggagcg aggacggctg catctacccc gccaccatcg ccagcatcga cttcaagaga 360

gagacctgcg tggtggtgta caccggctac ggcaacagag aggagcagaa cctgagcgac 420

ctgctgagcc ccatctgcga ggtggccaac aacatcgagc agaacgccca agagaacgag 480

aacgagagcc aagtgagcac cgacgagagc gagaacagca gaagccccgg caacaagagc 540

gacaacatca agcccaagag cgccccctgg aacagcttcc tgccccctcc cccccctatg 600

cccggcccta gactgggccc tggcaagcct ggcctgaagt tcaacggccc ccccccccct 660

cctcctcctc ctcctcctca cctgctgagc tgctggctgc cccccttccc cagcggccct 720

cctatcatcc ctcctccccc ccccatctgc cccgacagcc tggacgacgc cgacgccctg 780

ggcagcatgc tgatcagctg gtacatgagc ggctaccaca ccggctacta catgggcttc 840

agacagaacc agaaggaggg ccggtgcagc cacagcctga ac 882

<210> 3

<211> 73

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> microRNA miR-23a

<400> 3

ggccggcugg gguuccuggg gaugggauuu gcuuccuguc acaaaucaca uugccaggga 60

uuuccaaccg acc 73

<210> 4

<211> 648

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid sequence encoding microRNA miR-23a (prior to processing)

<400> 4

catgcaagtt gctgtagcct ccttgtcccg catgggccct ctaggtatct ctgcctctcc 60

agtcctgggg ctggaacgga gggcacagct aggctccagc tccccgtgtg gtggctcctg 120

catatgagaa aagagcttcc ctgtgatcaa aggaagcatc tggggacctg gaggggaggt 180

gtccccaaat ctcattacct cctttgctct ctctctcttt ctcccctcca ggtgccagcc 240

tctggccccg cccggtgccc ccctcacccc tgtgccacgg ccggctgggg ttcctgggga 300

tgggatttgc ttcctgtcac aaatcacatt gccagggatt tccaaccgac cctgagctct 360

gccaccgagg atgctgcccg gggacggggt ggcagagagg ccccgaagcc tgtgcctggc 420

ctgaggagca gggcttagct gcttgtgagc agggtccaca ccaagtcgtg ttcacagtgg 480

ctaagttccg ccccccaggc cctcacctcc tctggccttg ccgcctgtcc cctgctgccg 540

cctgtctgcc tgccatcctg ctgcctggcc tccctgggct ctgcctcccg tgcctactga 600

gctgaaacac agttggtttg tgtacactgg ctcagttcag caggaaca 648

<210> 5

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid sequence encoding microRNA miR-23a (following processing)

<400> 5

ggccggctgg ggttcctggg gatgggattt gcttcctgtc acaaatcaca ttgccaggga 60

tttccaaccg acc 73

<210> 6

<211> 3972

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nucleic acid sequence of the expression cassette (complete)

<400> 6

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccgcac gcgtctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 180

ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 240

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 300

caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 360

cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 420

ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 480

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 540

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 600

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 660

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctcgtttag 720

tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagacacc 780

gggaccgatc cagcctccgc ggattcgaat cccggccggg aacggtgcat tggaacgcgg 840

attccccgtg ccaagagtga cgtaagtacc gcctatagag tctataggcc cacaaaaaat 900

gctttcttct tttaatatac ttttttgttt atcttatttc taatactttc cctaatctct 960

ttctttcagg gcaataatga tacaatgtat catgcctctt tgcaccattc taaagaataa 1020

cagtgataat ttctgggtta aggcaatagc aatatttctg catataaata tttctgcata 1080

taaattgtaa ctgatgtaag aggtttcata ttgctaatag cagctacaat ccagctacca 1140

ttctgctttt attttatggt tgggataagg ctggattatt ctgagtccaa gctaggccct 1200

tttgctaatc atgttcatac ctcttatctt cctcccacag ctcctgggca acgtgctggt 1260

ctgtgtgctg gcccatcact ttggcaaaga attgggattc gaacatcgat tgtaattcat 1320

gagccaccat ggccatgagc agcggcggca gcggcggcgg cgtgcctgag caagaggaca 1380

gcgtgctgtt cagaagaggc accggccaga gcgacgacag cgacatctgg gacgacaccg 1440

ccctgatcaa ggcctacgac aaggccgtgg ccagcttcaa gcacgccctg aagaacggcg 1500

acatctgcga gaccagcggc aagcccaaga ccacccccaa gagaaagccc gccaagaaga 1560

acaagagcca gaagaagaac accgccgcca gcctgcagca gtggaaggtg ggcgacaagt 1620

gcagcgccat ctggagcgag gacggctgca tctaccccgc caccatcgcc agcatcgact 1680

tcaagagaga gacctgcgtg gtggtgtaca ccggctacgg caacagagag gagcagaacc 1740

tgagcgacct gctgagcccc atctgcgagg tggccaacaa catcgagcag aacgcccaag 1800

agaacgagaa cgagagccaa gtgagcaccg acgagagcga gaacagcaga agccccggca 1860

acaagagcga caacatcaag cccaagagcg ccccctggaa cagcttcctg ccccctcccc 1920

cccctatgcc cggccctaga ctgggccctg gcaagcctgg cctgaagttc aacggccccc 1980

ccccccctcc tcctcctcct cctcctcacc tgctgagctg ctggctgccc cccttcccca 2040

gcggccctcc tatcatccct cctccccccc ccatctgccc cgacagcctg gacgacgccg 2100

acgccctggg cagcatgctg atcagctggt acatgagcgg ctaccacacc ggctactaca 2160

tgggcttcag acagaaccag aaggagggcc ggtgcagcca cagcctgaac tgatctagag 2220

tcgacctgca gaagcttgcc tcgagcagcg ctgctcgaga gatctacggg tggcatccct 2280

gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc 2340

ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta 2400

tggggtggag gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct 2460

gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct 2520

ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg 2580

catgcatgac caggctcagc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat 2640

tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat 2700

tgctgggatt acaggcgtga accactgctc ccttccctgt ccttctgatt ttgtaggtaa 2760

ccactagaga aatgttctgg cacctgcact tgcactgggg acagcctatt ttgctagttt 2820

gttttgtttc gttttgtttt gatggagagc gtatgttagt actatcgatt cacacaaaaa 2880

accaacacac agatgtaatg aaaataaaga tattttattg cggccgctgt tcctgctgaa 2940

ctgagccagt gtacacaaac caactgtgtt tcagctcagt aggcacggga ggcagagccc 3000

agggaggcca ggcagcagga tggcaggcag acaggcggca gcaggggaca ggcggcaagg 3060

ccagaggagg tgagggcctg gggggcggaa cttagccact gtgaacacga cttggtgtgg 3120

accctgctca caagcagcta agccctgctc ctcaggccag gcacaggctt cggggcctct 3180

ctgccacccc gtccccgggc agcatcctcg gtggcagagc tcagggtcgg ttggaaatcc 3240

ctggcaatgt gatttgtgac aggaagcaaa tcccatcccc aggaacccca gccggccgtg 3300

gcacaggggt gaggggggca ccgggcgggg ccagaggctg gcacctggag gggagaaaga 3360

gagagagagc aaaggaggta atgagatttg gggacacctc ccctccaggt ccccagatgc 3420

ttcctttgat cacagggaag ctcttttctc atatgcagga gccaccacac ggggagctgg 3480

agcctagctg tgccctccgt tccagcccca ggactggaga ggcagagata cctagagggc 3540

ccatgcggga caaggaggct acagcaactt gcatggccgc agctttttgc aaaagcctag 3600

gcctccaaaa aagcctcctc actacttctg gaatagctca gaggccgagg cggcctcggc 3660

ctctgcataa ataaaaaaaa ttagtcagcg atggggcgga gaatgggcgg aactgggcgg 3720

agttaggggc gggatgggcg gagttagggg cgggactatg gttgctgact aattgagatg 3780

cagggccgct ccaagtacct cccgtacctt aagtgcggac cgagcggccg caggaacccc 3840

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 3900

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 3960

gctgcctgca gg 3972

<210> 7

<211> 736

<212> PRT

<213> Natural Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of AAV9 protein VP1

<400> 7

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 8

<211> 599

<212> PRT

<213> Natural Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of AAV9 protein VP2

<400> 8

Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro

1 5 10 15

Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys

20 25 30

Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro

35 40 45

Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu

50 55 60

Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly

65 70 75 80

Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln

85 90 95

Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu

100 105 110

Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser

115 120 125

Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp

130 135 140

Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp

145 150 155 160

Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu

165 170 175

Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn

180 185 190

Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe

195 200 205

Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu

210 215 220

Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr

225 230 235 240

Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser

245 250 255

Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn

260 265 270

Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser

275 280 285

Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp

290 295 300

Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn

305 310 315 320

Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val

325 330 335

Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val

340 345 350

Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly

355 360 365

Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly

370 375 380

Pro Ala Met Ala Ser His Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu

385 390 395 400

Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val

405 410 415

Asp Ala Asp Lys Val Met Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr

420 425 430

Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln

435 440 445

Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile

450 455 460

Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro

465 470 475 480

Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro

485 490 495

Leu Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile

500 505 510

Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp

515 520 525

Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val

530 535 540

Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro

545 550 555 560

Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe

565 570 575

Ala Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr

580 585 590

Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

595

<210> 9

<211> 534

<212> PRT

<213> Natural Sequence

<220>

<223> Amino acid sequence of AAV9 protein VP3

<400> 9

Met Ala Ser Gly Gly Gly Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala

1 5 10 15

Asp Gly Val Gly Ser Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp

20 25 30

Leu Gly Asp Arg Val Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro

35 40 45

Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly

50 55 60

Gly Ser Ser Asn Asp Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly

65 70 75 80

Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp

85 90 95

Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn

100 105 110

Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly

115 120 125

Val Lys Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr

130 135 140

Asp Ser Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly

165 170 175

Tyr Leu Thr Leu Asn Asp Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe

180 185 190

Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn

195 200 205

Phe Gln Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr

210 215 220

Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln

225 230 235 240

Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln

245 250 255

Gln Thr Leu Lys Phe Ser Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln

260 265 270

Gly Arg Asn Tyr Ile Pro Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser

275 280 285

Thr Thr Val Thr Gln Asn Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala

290 295 300

Ser Ser Trp Ala Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro

305 310 315 320

Ala Met Ala Ser His Lys Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser

325 330 335

Gly Ser Leu Ile Phe Gly Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp

340 345 350

Ala Asp Lys Val Met Ile Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn

355 360 365

Pro Val Ala Thr Glu Ser Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser

370 375 380

Ala Gln Ala Gln Ala Gln Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu

385 390 395 400

Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile

405 410 415

Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu

420 425 430

Met Gly Gly Phe Gly Met Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys

435 440 445

Asn Thr Pro Val Pro Ala Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys

450 455 460

Leu Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu

465 470 475 480

Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu

485 490 495

Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala

500 505 510

Val Asn Thr Glu Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg

515 520 525

Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

530

<210> 10

<211> 130

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> left-hand (first) ITR (inverted terminal repeats)

<400> 10

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 11

<211> 304

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> CMV (Cytomegalovirus) enhancer

<400> 11

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catg 304

<210> 12

<211> 204

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> CMV (Cytomegalovirus) promoter

<400> 12

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180

tgggaggtct atataagcag agct 204

<210> 13

<211> 493

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> intron of hBG1 gene (hemoglobin subunit gamma 1)

<400> 13

cgaatcccgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa 60

gtaccgccta tagagtctat aggcccacaa aaaatgcttt cttcttttaa tatacttttt 120

tgtttatctt atttctaata ctttccctaa tctctttctt tcagggcaat aatgatacaa 180

tgtatcatgc ctctttgcac cattctaaag aataacagtg ataatttctg ggttaaggca 240

atagcaatat ttctgcatat aaatatttct gcatataaat tgtaactgat gtaagaggtt 300

tcatattgct aatagcagct acaatccagc taccattctg cttttatttt atggttggga 360

taaggctgga ttattctgag tccaagctag gcccttttgc taatcatgtt catacctctt 420

atcttcctcc cacagctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 480

aaagaattgg gat 493

<210> 14

<211> 479

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> polyadenylation signal of hGH1

(polyadenylation signal (poly(A)) of human growth hormone)

<400> 14

acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300

tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479

<210> 15

<211> 202

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> SV40 promoter (simian virus 40 promoter)

<400> 15

tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 60

ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atcgctgact aatttttttt atttatgcag 120

aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 180

gcctaggctt ttgcaaaaag ct 202

<210> 16

<211> 154

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> SV40 polyadenylation signal (simian virus 40 polyadenylation signal)

<400> 16

aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta 60

ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc 120

cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt ctct 154

<210> 17

<211> 141

<212> DNA

<213> Natural Sequence

<220>

<223> right-hand (second) ITR

<400> 17

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к генотерапевтическим препаратам на основе гена SMN1, и может быть использовано в медицине в терапии спинальной мышечной атрофии (СМА). Предложена выделенная нуклеиновая кислота для получения генотерапевтического вирусного препарата для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках млекопитающих, которая содержит в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеиновую кислоту, кодирующую белок SMN1, и нуклеиновую кислоту, кодирующую микроРНК miR-23a. Кроме этого, предложены содержащие указанную нуклеиновую кислоту экспрессионные кассета и вектор, а также рекомбинантный вирус на основе AAV9 (аденоассоциированного вируса 9 серотипа). Изобретение обеспечивает усиление функционального действия SMN1 in vitro при использовании гена SMN1 в комбинации с miR-23a в составе генотерапевтического препарата, что может быть использовано при лечении СМА. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Выделенная нуклеиновая кислота для получения генотерапевтического вирусного препарата для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках млекопитающих, которая содержит в направлении от 5'-конца к 3'-концу нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 (белок выживаемости моторных нейронов) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.

2. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

3. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где нуклеиновая кислота, которая кодирует микроРНК miR-23a, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.

4. Экспрессионная кассета, которая включает нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-3.

5. Экспрессионная кассета по п. 4, включающая следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и

правый (второй) ITR.

6. Экспрессионная кассета по п. 5, которая включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.

7. Экспрессионный вектор, который включает нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-3 или кассету по любому из пп. 4-6.

8. Рекомбинантный вирус на основе AAV9 (аденоассоциированный вирус 9 серотипа) для экспрессии гена SMN1 в целевых клетках млекопитающих, который включает

1) капсид AAV9 и

2) нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-3 или экспрессионную кассету по любому из пп. 4-6.

9. Рекомбинантный вирус на основе AAV9 по п. 8, где капсид включает белок VP1 AAV9.

10. Рекомбинантный вирус на основе AAV9 по п. 9, где капсид включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.

11. Рекомбинантный вирус на основе AAV9 по пп. 8-10, где капсид включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, а экспрессионная кассета включает следующие элементы в направлении от 5'-конца к 3'-концу:

левый (первый) ITR (инвертированные концевые повторы);

CMV (цитомегаловирусный) энхансер;

CMV (цитомегаловирусный) промотер;

интрон гена hBG1 (ген субъединицы гемоглобина гамма-1);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок SMN1;

сигнал полиаденилирования hGH1 (сигнал полиаденилирования гена гормона роста человека);

SV40 промотор (промотор вируса обезьяны 40);

нуклеиновую кислоту, которая кодирует микроРНК miR-23a;

сигнал полиаденилирования SV40 (сигнал полиаденилирования вируса обезьяны 40) и

правый (второй) ITR.

12. Рекомбинантный вирус на основе AAV9 по п. 8, где капсид включает белок VP1 AAV9, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, а экспрессионная кассета включает нуклеиновую кислоту с SEQ ID NO: 6.