Способ оценки прямой контактной токсичности частиц микропластика на модели выделенных моноядерных лейкоцитов периферической крови Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 

Микропластик (МП) - это частицы пластика размером от 0,1 мкм до 5 мм [1]. Установлено, что МП может попадать в организм человека через желудочно-кишечный тракт, кожу и дыхательные пути [2]. В 2022 году впервые опубликованы результаты работы, продемонстрировавшие наличие МП в крови человека [3]. Судьба частиц МП в организме человека и последствия их действия все еще остаются спорными и малоизученными, что требует разработки способов оценки биологических эффектов МП.

Эффекты частиц МП могут быть обусловлены их физическими свойствами (размером, формой, длиной), химическими свойствами (наличием добавок и типом полимера), концентрацией или слоем микробной биопленки [4]. В ряде исследований подчеркивалась способность частиц МП оказывать токсическое действие на энергетический и липидный обмен, вызывать окислительный стресс и хроническое воспаление, обусловленное активацией иммунных клеток [5]. С учетом вышесказанного, практический интерес представляет возможность быстрой оценки биологических эффектов МП непосредственно на клетки иммунной системы.

Проточная цитометрия с визуализацией (ПЦВ) - это гибридная технология, объединяющая преимущества цитометрии и микроскопии. ПЦВ позволяет значительно увеличить количество исследуемых клеток без привязки значений флуоресцентных параметров к их пространственным распределениям и морфологическим особенностям клетки [6]. Подход, предлагаемый Park et al. [7] демонстрирует возможность оценки эффектов МП на иммунных клетках атлантического лосося (Salmo salar) при помощи цитофлуометрии с визуализацией, но ограничен потребностью в культивировании клеток в условиях клеточной лаборатории, что увеличивает продолжительность исследования до нескольких суток. Мы предлагаем впервые использовать ПЦВ для быстрой оценки прямого контактного токсического действия частиц МП на иммунные клетки человека, для этого мы предлагаем использовать мононуклеарные лейкоциты периферической крови, которые наиболее доступны в рутинной клинической практике [8].

Для изучения биологических эффектов МП на иммунные клетки крови в настоящее время используются различные способы и подходы.

Известен способ изучения токсических эффектов МП на лимфоциты крови с использованием показателей, характеризующих нарушение стабильности клеточного ядра и коэффициента клеточного цитостаза, характеризующего процент снижения жизнеспособности клеток по результатам микроскопии окрашенных и фиксированных клеток [9]. Hwang et al. оценивали биологические эффекты микропластика на клеточных линиях тучных клеток и фибробластов, а также мононуклеарах крови с использованием конфокальной микроскопии [10]. Данные подходы имеют значимые ограничения, обусловленные особенностями подготовки к исследованию: необходимость фиксации клеток параформальдегидом, а также обработка тритоном Х-100 непосредственно перед конфокальной визуализацией, что способно значимо искажать показатели жизнеспособности клеток. Также ограничением микроскопических методов анализа является невозможность исследовать популяции с большими выборками, содержащими тысячи событий, и использование не более 3-4 флуоресцентных меток [6]. В сравнении с указанными способами использование ПЦВ в рамках предлагаемого способа позволяет сократить время пробоподготовки, исследовать популяции с большим количеством клеток, не требуется обработка клеток с помощью средств, способных искажать показатели жизнеспособности.

Известен способ, в котором Kik et al. и Ballesteros et al., 2020 продемонстрировали возможность применения проточной цитометрии для обнаружения токсических эффектов МП на мононуклеары периферической крови [11, 12]. Преимуществами метода проточной цитометрии являются: 1) способность за короткий срок обрабатывать миллионы событий; 2) возможность единовременно использовать несколько флуоресцентных маркёров [6]. Ограничением конвенциональной проточной цитометрии является невозможность проследить биологические эффекты частиц МП при их прямом контакте в отдельных клетках, а для выявления интернализации частиц необходимо дополнительно использовать микроскопические методы исследования. В сравнении с конвенциональной проточной цитометрий использование ПЦВ в рамках предлагаемого способа позволяет проследить биологические эффекты частиц МП при их прямом контакте в отдельных клетках, а также выявить интернализацию частиц.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения прямой контактной токсичности частиц микропластика с использованием моноядерных лейкоцитов периферической крови при помощи проточной цитометрии с визуализацией, который характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью за счет флуоресцирующих антител, возможностью визуализировать прямой контакт частиц микропластика, меченых флуророфором с моноядерными лейкоцитами, быстротой определения.

Способ осуществляют следующим образом:

I Материалы

1. Буферы и среды

1.1. Фосфатно-солевой буфер (PBS)

1.2. Среда RPMI 1640

1.3. L-глутамин

1.4. 10% эмбриональная бычья сыворотка

2. Флуоресцентно-меченые антитела и реактивы

2.1. CD45-PE (Cloud-Clone Corp.)

2.2. 7-AAD (7-аминоактиномицин D (Biolegend))

2.3. Частицы микропластика с флуоресцентной меткой (Polystyrene Fluorescent Particles 1,7-2,2 μm, Light Yellow, High Intensity (Spherotech))

3. Оборудование и расходные материалы

3.1. Проточный цитофлуориметр с визуализацией Cytek® Amnis® FlowSight®, снабжённый синим лазером (488 нм, 60 мВт)

3.2. Гемоцитометр

3.3. Холодильник 6+2°С.

3.4. Термостат

3. 5. Пробирки Vacutainer® CPT™ - BD

3.6. Набор механических дозаторов переменного объема.

3.7. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема

3.8. Пробирки типа эппендорф

II. Порядок работы.

1. Забор крови производится у здоровых доноров с их письменного согласия.

2. Кровь забирают в пробирки Vacutainer® CPT™ - BD с разделительным гелем, гепарином и фиколлом.

3. Центрифугируют пробирки Vacutainer® CPT™ - BD при 3000 об/мин в течение 30 минут.

4. Аккуратно забирают слой с мононуклеарами автоматической пипеткой и добавляют к нему 6 мл теплого PBS с последующим центрифугированием при 1600 об/мин в течение 10 минут.

5. Полученный осадок снова отмывают с 6 мл теплого PBS при 1600 об/мин в течение 10 минут. После выделения мононуклеарных лейкоцитов полученную суспензию ресуспендируют в 1 мл среды RPMI-1640.

6. Измеряют количество клеток на гемоцитометре.

7. Далее происходит инкубация суспензии с концентрацией клеток 500 тыс/мл в термостате при 37°C с частицами полистирольного микропластика Polystyrene Fluorescent Particles 1,7-2,2 μm, Light Yellow, High Intensity (Spherotech) в концентрации 25 мкг/мл с разными временными промежутками и без частиц микропластика для контрольной группы.

8. За 15 минут до конца инкубации добавляется CD-45 PE (Cloud-Clone Corp.), за 5 минут до конца инкубации добавляется 7-AAD (Biolegend) в количестве, соответствующем рекомендациям производителя. Инкубация происходит в темноте.

III. Проведение анализа и учет результатов.

Анализ клеток ведут на проточном цитометре с визуализацией Amnis Flowsight (Cytek Biosciences) при помощи синего лазера (488 нм, 60 мВт), на средней скорости потока с использованием программного обеспечения INSPIRE®.

Анализируют 10000 событий. Для анализа полученных данных применяют программное обеспечение IDEAS®.

На фиг. 1 представлена стратегия гейтирования при анализе жизнеспособности CD-45 положительных клеток, контактирующих с частицами микропластика.

На фиг. 1 представлены диаграммы жизнеспособности моноядерных лейкоцитов крови при контакте с частицами микропластика, где:

A - Выделение области единичных клеток (Single cells) по таким признакам как Area (площадь) и Aspect Ratio (сферичность), соответствующим морфологии МЯЛ.

B - Выделение клеток в фокусе с использованием функции IDEAS ® gradient RMS, которая помогает выбирать высококачественные изображения со среднеквадратичными значениями выше 50.

C - Выделение CD-45- положительных клеток, их разделение на живые/мертвые при помощи витального красителя 7-AAD.

D - Выделение CD-45- положительных клеток, контактирующих с частицами микропластика с использованием функции IDEAS ® Internalization Wizard.

E - Разделение CD-45- положительных клеток, контактирующих с частицами микропластика на живые/мертвые при помощи витального красителя 7-AAD.

Для контрольной серии стратегия гейтирования включает только графики А, B, C (Фиг. 1).

На основании полученных результатов проточной цитометрии с визуализацией рассчитывают относительный коэффициент прямой контактной токсичности микропластика по формуле:

,

где:

A - % жизнеспособных моноядерных лейкоцитов CD45+, контактирующих с частицами микропластика в опытной пробе;

B - % жизнеспособных моноядерных лейкоцитов CD45+ в контрольной пробе.

Относительный коэффициент прямой контактной токсичности микропластика обратно пропорционален отношению % жизнеспособных моноядерных лейкоцитов CD45+, контактирующих с частицами микропластика в опытной пробе к % жизнеспособных моноядерных лейкоцитов CD45+ в контрольной пробе.

Пример использования:

Исследовался коэффициент прямой контактной токсичности частиц полистирольного микропластика Polystyrene Fluorescent Particles 1,7-2,2 μm, Light Yellow, High Intensity (Spherotech) в концентрации 25 мкг/мл и 5 мкг/мл при 4-часовом in vitro воздействии на моноядерные лейкоциты периферической крови здоровых доноров (n=4).

= 0,19 - коэффициент прямой контактной токсичности микропластика в концентрации 5 мкг/мл при 4-х часовом воздействии

= 0,31- коэффициент прямой контактной токсичности микропластика в концентрации 25 мкг/мл при 4-х часовом воздействии

Таким образом, при 4-х часовом воздействии более токсичной является концентрация микропластика 25 мкг/мл, чем 5 мкг/мл.

Список литературы

1. Cox K.D., Covernton G.A., Davies H.L., Dower J.F., Juanes F., Dudas S.E. Human Consumption of Microplastics. Environ. Sci.Technol. 2019 (53). 7068-7074.

2. Zhang Q., Xu E.G., Li J., Chen Q., Ma L., Zeng, E.Y., Shi H. A Review of Microplastics in Table Salt, Drinking Water, and Air:Direct Human Exposure. Environ. Sci. Technol. 2020(54). 3740-3751.

3. Leslie H. A. et al. Discovery and quantification of plastic particle pollution in human blood // Environment international. - 2022. - Т. 163. - С. 107199.

4. Campanale C., Massarelli C., Savino I., Locaputo V., Uricchio V.F. A Detailed Review Study on Potential Effects of Microplastics and Additives of Concern on Human Health. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2020(17). 1212.

5. Ferrante M, Cristaldi A, Oliveri Conti G. Oncogenic Role of miRNA in Environmental Exposure to Plasticizers: A Systematic Review. Journal of Personalized Medicine. 2021; 11: 500.

6. Basiji D. et al. Imaging flow cytometry: methods and protocols. - Springer New York, 2016. (Basiji, D., et al. Imaging flow cytometry: methods and protocols. Eds. Natasha S. Barteneva, and Ivan A. Vorobjev. Springer New York, 2016).

7. Park, Youngjin et al. “Imaging Flow Cytometry Protocols for Examining Phagocytosis of Microplastics and Bioparticles by Immune Cells of Aquatic Animals.” Frontiers in immunology vol. 11 203. 18 Feb. 2020, doi:10.3389/fimmu.2020.00203.

8. Бельских Э. С. и др. Исследование окислительного стресса и функции митохондрий в мононуклеарных лейкоцитах крови у больных с хроническим бронхитом и с хронической обструктивной болезнью легких //Наука молодых-Eruditio Juvenium. - 2018. - Т. 6. - №. 2. - С. 203-210.

9. Jangsun, H., Daheui, C., Seora, H., Jung, S.Y., Jonghoon, C., Jinkee, H., 2020. Potential Toxicity of Polystyrene Microplastic Particles. Scientific Reports, vol. 10. Nature Publisher Group.

10. Hwang, J., Choi, D., Han, S. et al. Potential toxicity of polystyrene microplastic particles. Sci Rep 10, 7391 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-64464-9.

11. Kik, K.; Bukowska, B.; Krokosz, A.; Sici'nska, P. Oxidative Properties of Polystyrene Nanoparticles with Different Diameters in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (In Vitro Study). Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 4406. https://doi.org/10.3390/ijms22094406.

12. Ballesteros S. et al. Genotoxic and immunomodulatory effects in human white blood cells after ex vivo exposure to polystyrene nanoplastics //Environmental Science: Nano. - 2020. - Т. 7. - № 11. - С. 3431-3446.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу оценки прямой контактной токсичности частиц микропластика на модели выделенных моноядерных лейкоцитов периферической крови, включающему применение проточной цитометрии с визуализацией. С этой целью у исследуемого субъекта забирают венозную кровь, из которой выделяют суспензию мононуклеаров, инкубируют суспензию мононуклеаров в среде RPMI 1640 с частицами микропластика с флуоресцентной меткой и параллельно инкубируют контрольную суспензию мононуклеаров в среде RPMI 1640 без частиц микропластика с флуоресцентной меткой, после чего проводят исследование методом проточной цитометрии с визуализацией с использованием общего лейкоцитарного маркера CD45 и витального красителя 7-AAD. Изобретение позволяет получить относительную количественную оценку прямой контактной токсичности частиц микропластика в отношении моноядерных лейкоцитов периферической крови. 1 ил., 1 пр.

Способ оценки прямой контактной токсичности частиц микропластика на модели выделенных моноядерных лейкоцитов периферической крови, включающий применение проточной цитометрии с визуализацией, отличающийся тем, что выделяют взвесь моноядерных лейкоцитов крови, инкубируют в течение четырех часов выделенные моноядерные лейкоциты крови с использованием среды RPMI 1640 в виде пары проб, при этом контрольная проба - без частиц микропластика с флуоресцентной меткой, опытная проба - с частицами микропластика с флуоресцентной меткой, сравнивают опытную и контрольную пробы методом проточной цитофлуориметрии с визуализацией с использованием общего лейкоцитарного маркера CD45 и витального красителя 7-AAD с определением контактной токсичности по формуле

,

где – коэффициент прямой контактной токсичности частиц микропластика;

A - доля жизнеспособных моноядерных лейкоцитов CD45+, контактирующих с частицами микропластика в опытной пробе, выраженная в %;

B - доля жизнеспособных моноядерных лейкоцитов CD45+ в контрольной пробе, выраженная в %, при этом, чем больше значение , тем выше прямая контактная токсичность исследуемых частиц микропластика.