Питательная среда для выделения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе Faecalibacterium prausnitzii (варианты) Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии, биотехнологии, и может использоваться для выделения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду, микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе Faecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii) в кишечнике человека. Кроме того, изобретение может быть использовано в научно-исследовательских целях при изучении таких микроорганизмов.

Актуальность

Микробиота кишечника человека представляет собой комплексное и динамическое микробное сообщество бактерий, грибов и вирусов [1, 2, 3]. В совокупности она поддерживает здоровье и регулирует иммунную систему хозяина [3]. Изменения в микробном составе связаны с большим числом патологий, таких как сахарный диабет, ожирение, колоректальный рак и воспалительные заболевания кишечника [3, 4]. Особо важную роль в поддержании здоровья человека играют виды бактерий, которые метаболизируют не перевариваемые человеком пищевые волокна с образованием короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК). Помимо того, что эти метаболиты являются питательными субстратами для других бактерий, они также оказывают благоприятное влияние на слизистую кишечника [5, 6]. Благодаря их роли в метаболическом и иммунологическом гомеостазе и поддержании целостности кишечного барьера, они представляют интерес для терапии, в частности воспалительных заболеваний кишечника. Точный патогенез таких заболеваний еще неизвестен. Поэтому лечение основано главным образом на сдерживании иммунной системы [6] более или менее нацеленным путем. Тем не менее, результаты такого подхода неудовлетворительны, и только 30% пациентов достигают и сохраняют клиническую и эндоскопическую ремиссию [7, 8]. Принимая во внимание важную роль микробиоты в патогенезе этих заболеваний, были предложены новые терапевтические подходы, регулирующие или замещающие кишечную микробиоту с целью восстановления нормального взаимодействия между иммунной системой и микробиомом кишечника [9]. Однако такие подходы, как использование пребиотиков, пробиотиков, антибиотиков и фекальной микробной трансплантации до настоящего времени имеют противоречивые результаты.

Накопление знаний о важности кишечной микробиоты для здоровья привели к поиску пробиотиков следующего поколения с лучшим отбором и составом вводимых штаммов [10]. Для вышеупомянутых целей КЦЖК и продуцирующие их микроорганизмы могли бы оказаться незаменимыми.

Многие члены микробиоты кишечника способны получать углерод и энергию при ферментации сложных углеводов, не перевариваемых самим человеком [11]. Этот процесс ферментации приводит к продукции КЦЖК в толстом кишечнике [11]. Тремя основными КЦЖК, производимыми бактериями кишечника, являются ацетат, пропионат и бутират, представляющие собой алифатические карбокси-кислоты, содержащие 1 карбокси-концевой атом углерода и соответственно 1, 2 и 3 углерода в алифатической цепи [6]. Последние достижения метагеномики позволили описать бактерии, отвечающие за продукцию КЦЖК [5]. Пути продукции ацетата широко распространены среди классов бактерий, поэтому концентрации этого метаболита в просвете кишечника достигают высоких величин [12], напротив, пути получения бутирата и пропионата более консервативны и субстрат-специфичны [5]. Пропионат можно получить двумя путями: сукцинатным путем, используемым Bacteroidetes и Negativicutes (Firmicutes phylum), и пропандиоловым путем, используемым Lachnospiraceae [12]. Продукция бутирата опосредуется ключевыми ферментами: бутираткиназой или бутирил СоА: ацетат СоА-трансферазой [6]. Большинство продуцентов бутирата, в том числе F. prausnitzii, Eubacterium rectale (E. rectale) и Eubacterium hallii (E. hallii) используют последний путь, тогда как известно, что лишь несколько бутирогенных таксонов, таких как Coprococcus comes (С. comes) и Coprococcus eutactus (C. eutactus), используют бутираткиназный путь [5, 13].

Таким образом, ацетат в кишечнике продуцирует большое число бактерий различной таксономической принадлежности. Продуцентами бутирата являются F. prausnitzii, Roseburia spp, Ruminococcus spp, Eubacterium spp, Coprococcus spp, Akkermansia muciniphila (A. muciniphila). [14].

Пропионат в кишечнике вырабатывают следующие бактерии: Lactobacillusplantarum (L. plantarum), Bacteroides thetaiotaomicron (B. thetaiotaomicron), Bacteroides vulgatus (B. vulgatus), Ruminococcus obeum (R. obeum), Coprococcus catus (C. catus), A. muciniphila, Veillonellaparvula (V. parvula) [15], E. hallii [19].

Уровень техники

До настоящего времени такие продуценты КЦЖК, как F. prausnitzii, Roseburia spp, Ruminococcus spp, Eubacterium spp, Coprococcus spp, A. muciniphila, представляют собой труднокультивируемые бактерии, требующие для роста строгого анаэробиоза и особых питательных сред. Для их выращивания в настоящее время созданы специальные питательные среды, прописанные в американской и немецкой коллекциях микробиологических культур (American Type Culture Collection (ATCC), German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)).

В настоящее время для выделения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду, микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе F. prausnitzii предлагаются следующие питательные среды:

1. Питательная среда на основе рубленного мяса с углеводами (среда №110 DSMZ) Состав: говяжий фарш, 1 N раствор NaOH, казитон, дрожжевой экстракт, мальтоза, D-глюкоза, целлобиоза, K₂HPO, раствор Na-резазурина, растворимый крахмал, L-цистеингидрохлорид, гемин, витамин К₁ или К₃, агар при необходимости.

2. Питательная среда YCFA (модифицированная). Состав: казитон, дрожжевой экстракт, глюкоза, MgSO₄×7 Н₂О, CaCl₂×2 H₂O, K₂HPO, KH₂PO, NaCl, резазурин, NaHCO₃, L-цистеин-HCl, гемин; летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая, изомасляная, п-валерьяновая, изовалерьяновая); витаминный раствор (биотин, фолиевая кислота, пиридокеингидрохлорид, тиамингидрохлорид × 2 H₂O, рибофлавин, никотиновая кислота, D-Ca-пантотенат, витамин В₁₂, р-аминобензойная кислота, липоевая кислота).

3. Питательная среда - модифицированный усиленный клостридиальный бульон. Состав: триптоза, дрожжевой экстракт, говяжий экстракт, глюкоза, растворимый крахмал, NaCl, ацетат натрия, L-цистеингидрохлорид.

4. Питательная среда для выделения, накопления и транспортировки F. prausnitzii VTR2RF, созданная на основе коммерчески доступной среды. Состав среды: коммерчески доступная анаэробная среда Versa TREK REDOX 2 (Trek Diagnostic Systems, Cleveland-OH), 30% отфильтрованной жидкости рубца, 0,5% дрожжевого экстракта, 5 мг/л гемина, 1 мг/л. целлобиозы, 1 мг/мл мальтозы и 0,5 мг/мл L-цистеина [16].

5. Питательная среда для культивирования F. prausnitzii с добавлением олигосахарида 1-кестозы. Состав: казеиновый перевар, дрожжевой экстракт, L-цистин, NaCl, тиогликолевая кислота, триптофан, гемин, витамин К1, олигосахарид 1-кестоза (патент US 20190070204 A1 "Proliferative agent for faecalibacterium") [17].

6. Питательная среда для выделения F. prausnitzii методом сокультивирования с E. coli, вырабатывающей ростовые факторы для F. prausnitzii (патент WO 2012/162496 А1 "Microbial growth factors") [18]. Состав: сердечно-мозговая вытяжка, дрожжевой экстракт, цистеин и гемин.

Рассмотрев представленные варианты питательных сред, мы пришли к выводу, что наиболее близкой по технической сущности и практическому выходу к предлагаемым нами питательным средам для культивирования строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду микроорганизмов, в том числе F. prausnitzii - продуцентов КЦЖК является среда №110 DSMZ на основе рубленого мяса, которую мы использовали в качестве прототипа. Недостатком данной среды является ее труднодоступность и высокая себестоимость. Предлагаемая нами питательная отличается тем, что вместо дорогостоящих реагентов среды №110 DSMZ: Na-резазурина, а также углевода целлобиозы, гемина, мальтозы и крахмала используется жидкость рубца крупного рогатого скота (КРС).

Технической проблемой, которая решается заявленным изобретением, является создание питательных сред, обеспечивающих эффективное выделение строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе F. prausnitzii в условиях экономии и импортозамещения, их хранение, накопление биомассы при создании пробиотиков следующего поколения, при фекальной трансплантации.

Указанная техническая проблема решается следующим образом. Для получения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе F. prausnitzii из фекалий человека мы модифицировали среду для выделения F. prausnitzii, предлагаемую Институтом Лейбница (Германия), включив в нее рубцовую жидкость крупного рогатого скота, являющуюся источником летучих жирных кислот и углеводов, что позволило исключить дорогостоящие ингредиенты - углевод целлобиозу и гемин, а также мальтозу, крахмал и Na-резазурин. Помимо F. prausnitzii на модифицированной нами среде был получен рост и других бактерий, требующих особых условий культивирования со строгим анаэробиозом: Roseburiafaecis (R. faecis), Anaerostipes hadrus (A. hadrus), C. comes, C. eutactus, Blautia sp, Blautia massiliensis (B. massiliensis), Blautia wexlerae (B. wexlerae), Christensenella minuta (C. minuta), Ruminococcus sp, Ruminococcus faecis (Rum. faecis), Ruminococcus gnavus (R. gnavus), Dorea longicatena (D. longicatena), Holdemanella sp., A. muciniphila, большинство из которых является продуцентами КЦЖК. Предлагаемая питательная среда (жидкий и полотный - агаризованный варианты) позволит существенно расширить возможности метода культуромики, используемого для выделения максимального спектра микроорганизмов, особенно из числа трудно культивируемых облигатных анаэробов при исследовании микробиоты различных биотопов человека.

Кроме того, жидкий вариант данной среды может применяться в качестве среды накопления биомассы перспективных пробиотических штаммов строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду микроорганизмов - продуцентов КЦЖК при создании пробиотических препаратов нового поколения, а также для хранения данных микроорганизмов в низкотемпературных условиях (-80°С).

Таким образом, предметом изобретения по первому варианту его осуществления является жидкая питательная среда следующего состава:

Говяжий фарш обезжиренный500 г Говяжий фарш обезжиренный500 г Дистиллированная вода1000 мл Дистиллированная вода1000 мл 1 N раствор NaOH 25 мл Панкреатический гидролизат казеина30 г Панкреатический гидролизат казеина30 г Дрожжевой экстракт5 г Дрожжевой экстракт5 г K₂HPO₄ 5 г D-глюкоза4 г -глюкоза4 г Жидкость рубца20 мл Жидкость рубца20 мл L-цистеингидрохлорид0,5 г -цистеингидрохлорид0,5 г Раствор витамина K₁ (менадиона)5 мл (2 мг/мл). (менадиона)5 мл (2 мг/мл).

По второму варианту осуществления изобретения предмет изобретения представляет собой питательную среду того же состава, но дополненную бактериологическим агаром в количестве 12 г/л.

Техническим результатом, достигаемым при использовании заявленного изобретения, является простота и надежность эффективного выделения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе F. prausnitzii.

Рекомендуемый порядок приготовления сред.

Получение и обработка рубцовой жидкости

Рубцовую жидкость получает ветеринар из рубца живой коровы через назо-гастральный зонд. Жидкость фильтруют через двойной слой марли, разливают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 15 минут при 20 тыс об/мин. Супернатант отбирают для дальнейшей работы, аликвотируют по 20 мл и хранят при -20°С. Перед использованием аликвоту подвергают медленному оттаиванию при температуре +4-8°С.

Приготовление питательной среды

К 500 граммам обезжиренного говяжьего фарша добавляли 1000 мл дистиллированной воды и 25 мл 1 N раствора NaOH (ОАО Сода, Россия). Полученную смесь доводили до кипения и варили на медленном огне с перемешиванием в течение 15 минут. Затем мясной бульон охлаждали до комнатной температуры, при необходимости удаляли верхний слой жира, отфильтровывали через марлю и доводили объем полученного раствора до 1000 мл. К раствору добавляли 30 г панкреатического гидролизата казеина (ГНЦ ПМБ, Россия), 5 г дрожжевого экстракта (ГНЦ ПМБ, Россия), 5 г K₂HPO₄ (РусХим, Россия), 4 г D-глюкозы (декстрозы) (Hobbyhelper, Россия), 20 мл рубцовой жидкости. Для получения плотной питательной среды дополнительно добавляли 12 г агара бактериологического (HiMedia, Индия). Полученную смесь доводили до кипения, охлаждали до 70°С в атмосфере 100% N₂. После насыщения раствора азотом в анаэробной камере Bactron-300 (Sheldon Manufacturing, USA) в условиях бескислородной атмосферы, содержащей 10% H₂, 10% СО₂ и 80% N₂, добавляли 0,5 г L-цистеингидрохлорида (AHA International, Китай) и доводили рН полученного раствора до 7,0. Среду переливали во флаконы и герметично закупоривали для последующего автоклавирования при 121°С в течение 15 минут. После охлаждения до 50°С в условиях анаэробной камеры добавляли 5 мл раствора витамина К₁ с концентрацией 2 мг/мл (HiMedia, Индия), перемешивали и разливали среду в чашки Петри диаметром 90 мм слоем высотой 4-5 мм. Перед применением готовую среду оставляли на 1 сутки в условиях анаэробной камеры и использовали в прередуцированном виде. При необходимости хранения чашки Петри помещали в микроанаэростат типа GasPak в условиях анаэробной камеры, герметично закупоривали и перемещали на хранение в холодильник при +4-8°С.

Использование изобретения осуществляется следующим образом.

I Вариант (жидкая питательная среда). По первому варианту изобретения данная питательная среда может быть использована в качестве среды накопления для наработки биомассы в научных целях и при создании пробиотических препаратов. Кроме того, жидкую питательную среду с добавлением криоконсерванта (например, 16% глицерина) можно использовать для хранения таких микроорганизмов в низкотемпературных условиях (-80°С).

II Вариант (агаризованная питательная среда). По второму варианту осуществления изобретения плотная агаризованная питательная среда используется для культивирования и получения чистых культур уникальных трудно культивируемых микроорганизмов. На поверхность прередуцированной питательной среды в чашке Петри в условиях анаэробной камеры наносят образец фекалий человека в 9-12-ом разведении и инкубируют при температуре 37°С в течение 48 часов в строго анаэробных условиях. После инкубирования выросшие колонии оценивают визуально и наносят на мишень для видовой идентификации методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS), например, с помощью масс-спектрометра Microflex с программным обеспечением MaldiBioTyper версии 4.1 (Bruker Daltoniks, Германия) или секвенирования 16S РНК.

Достижение указанного технического результата подтверждается следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Проверка ростовых свойств плотной питательной среды на клинических изолятах микроорганизмов.

Для оценки ростовых свойств предлагаемой плотной питательной среды проведено сравнение роста культур F. prausnitzii, R. faecis, A. hadrus, С. comes, C. eutactus, Blautia spp, B. massiliensis, B. wexlerae, Rum. faecis, R. gnavus, D. longicatena, Holdemanella sp., Alistipes shahii, C. minuta, A. muciniphila на заявленной питательной среде и среде №110 с целлобиозой, мальтозой, крахмалом и гемином (DSMZ). Результаты представлены в таблице 1.

ПРИМЕР 2. Проверка жизнеспособности культур, замороженных при -80°С в заявленной среде по первому варианту осуществления (жидкая среда) и в тиогликолевом бульоне.

Для оценки выживаемости (хранимоспособности) культур F. prausnitzii, R. faecis, A. hadrus, С. comes, C. eutactus, Blautia spp, B. massiliensis, B.wexlerae, Ruminococcus sp, Rum. faecis, R. gnavus, D. longicatena, Holdemanella sp., C. minuta, A. muciniphila в заявленной жидкой питательной среде при хранении в низкотемпературных условиях (-80°С) готовили инокулюм плотностью 10⁹ КОЕ/мл, добавляли криопротектор (16% глицерина) и замораживали. Параллельно готовили инокулюм указанных микроорганизмов той же концентрации в тиогликолевой жидкой питательной среде, также дополненной 16% глицерином, и подвергали заморозке в тех же температурных условиях. Через 1 месяц хранения замороженные образцы размораживали в холодильнике при +4 - +8°С и высевали количественно (0,1 мл суспензии) на плотный вариант заявленной питательной среды и культивировали 48 часов при 37°С в условиях строгого анаэробиоза, затем проводили подсчет выросших колоний в пересчете на 1 мл среды, использованной для хранения. Результаты представлены в таблице 2.

ПРИМЕР 3. Накопление биомассы продуцентов КЦЖК в заявленной жидкой среде и в среде 110 DSMZ.

Для оценки возможности использования заявленной жидкой питательной среды для накопления биомассы F. prausnitzii и других указанных микроорганизмов - продуцентов КЦЖК использовали метод количественной оценки. Предварительно на заявленной плотной питательной среде получали чистые культуры микроорганизмов, готовили инокулюм с концентрацией 10⁷ КОЕ/мл, затем 100 мкл инокулировали в 9,9 мл заявленной жидкой питательной среды (полученная конечная концентрация исследуемых культур - 10⁵ КОЕ/мл) и культивировали в условиях строгого анаэробиоза при 37°С в течение 24 часов. После завершения культивирования 100 мкл жидкой среды с выросшими культурами наносили на поверхность плотной питательной среды и проводили подсчет выросших колоний в пересчете на 1 мл среды и сравнивали с исходной концентрацией (10⁵ КОЕ/мл). Результаты исследования показаны в таблице 3.

Список литературы

1. Sara Deleu, Kathleen Machiels, Jeroen Raes, Kristin Verbeke, Séverine Vermeire. Short chain fatty acids and its producing organisms: An overlooked therapy for IBD? EBioMedicine. Part of the Lancet discovery science. REVIEW| VOLUME 66, 103293, APRIL 01, 2021.

2. Stange E.F., Schroeder B.O. Microbiota and mucosal defense in IBD: an update. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2019; 13: 963-976.

3. Vrancken G., Gregory A.C., Huys G.R.B., Faust K., Raes J. Synthetic ecology of the human gut microbiota. Nat Rev Microbiol. 2019.

4. Eisenstein M.A slow-motion epidemic. Nature. 2016; 540 (S98-S99).

5. Morrison D.J., Preston T. Formation of short chain fatty acids by the gut microbiota and their impact on human metabolism. Gut Microbes. 2016; 7: 189-200.

6. Venegas D.P. Short chain fatty acids (SCFAs) mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frow / Immunol. 2019; 10.

7. Pagnini C., Pizarro T.T., Cominelli F. Novel pharmacological therapy in inflammatory bowel diseases: beyond anti-tumor necrosis factor. Front Pharmacol. 2019; 10: 1-11.

8. Schreiner P. Mechanism-based treatment strategies for IBD: cytokines, cell adhesion molecules, JAK inhibitors, gut flora, and more. Inflamm Intestinal Dis. 2019; 4: 79-96.

9. Pigneur B., Sokol H. Fecal microbiota transplantation in inflammatory bowel disease: the quest for the holy grail. Mucosal Immunol. 2016; 9: 1360-1365.

10. El Hage R., Hernandez-Sanabria E., Van de Wiele T. Emerging trends in ‘smart probiotics’: Functional consideration for the development of novel health and industrial applications. Front Microbiol. 2017; 8: 1-11.

11. Hugenholtz F., Mullaney J.A., Kleerebezem M., Smidt H., Rosendale D.I. Modulation of the microbial fermentation in the gut by fermentable carbohydrates. Bioactive Carbohydr Dietary Fibre. 2013; 2: 133-142

12. Louis P., Flint H.J. Formation of propionate and butyrate by the human colonic microbiota. Environ Microbiol. 2017; 19: 29-41.

13. Den Besten G. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 2013; 54: 2325-2340.

14. Kunal Maniar, Dibyajyoti Banerjee. The gut metabolome in obesity: role of short chain fatty acids // Microbiome and metabolome in diagnosis, therapy and other strategic applications, 2019.

15. Racha Ei Hage, Emma Hernandez-Sanabria, Marta Calatayud Arroyo et al. Propionate-producing consortium restores antibiotic-induced dysbiosis in a dynamic in vitro model of the human intestinal microbial ecosystem. // Front Microbiol 2019; 10; 1206.

16. Carla Foditsch, ¹Thiago M.A. Santos, ²Andre G.V. Teixeira, ¹Richard V.V. Pereira, ¹Juliana M. Dias, ¹Natália Gaeta, ¹and Rodrigo C. Bicalho^{1 '}Isolation and Characterization of Faecalibacterium prausnitzii from Calves and Piglets. PLoS One. 2014; 9(12): e116465.

17. Патент US 20190070204 A1 "Proliferative agent for faecalibacterium".

18. Патент WO 2012/162496 A1 "Microbial growth factors".

19. Guhathakurta, Sampurna, "Optimization Of Growth Conditions Of "eubacterium Hallii" As A Potential Probiotics" (2017). Wayne State University Theses. 563.

Изобретение относится к области биотехнологии. Жидкая питательная среда содержит, г/л: говяжий фарш обезжиренный 500 г, дистиллированную воду 1000 мл, 1 N раствор NaOH 25 мл, панкреатический гидролизат казеина 30 г, дрожжевой экстракт 5 г, K₂HPO₄ 5 г, D-глюкозу 4 г, жидкость рубца 20 мл, L-цистеингидрохлорид 0,5 г, раствор витамина K₁ (менадиона) 5 мл (2 мг/мл), рН 7,0, плотная питательная среда имеет тот же состав и дополнена бактериологическим агаром - 12 г. Изобретение позволяет эффективно выделить строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду, микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе F. prausnitzii, накопить биомассу при создании пробиотиков следующего поколения при фекальной трансплантации. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Жидкая питательная среда для выделения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду, микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе Faecalibacterium prausnitzii, включающая на 1 л дистиллированной воды: говяжий фарш обезжиренный 500 г, 1 N раствор NaOH 25 мл, панкреатический гидролизат казеина 30 г, дрожжевой экстракт 5 г, K₂НРО₄ 5 г, D-глюкозу 4 г, раствор витамина K₁ менадиона, отличающаяся тем, что дополнительно включает рубцовую жидкость крупного рогатого скота, L-цистеингидрохлорид и раствор витамина K₁ менадиона в концентрации 2 мг/мл при следующем содержании исходных компонентов в 1 л дистиллированной воды:

Говяжий фарш обезжиренный 500 г 1 N раствор NaOH 25 мл Панкреатический гидролизат казеина 30 г Дрожжевой экстракт 5 г K₂НРО₄ 5 г D-глюкоза 4 г Жидкость рубца 20 мл L-цистеингидрохлорид 0,5 г Раствор витамина K₁ (менадиона) в концентрации 2 мг/мл 5 мл

2. Плотная питательная среда для выделения строго анаэробных, крайне чувствительных к кислороду, микроорганизмов-продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, в том числе Faecalibacterium prausnitzii, включающая говяжий фарш обезжиренный 500 г, 1 N раствор NaOH 25 мл, панкреатический гидролизат казеина 30 г, дрожжевой экстракт 5 г, K₂НРО₄ 5 г, D-глюкозу 4 г, раствор витамина K₁ менадиона, отличающаяся тем, что дополнительно включает рубцовую жидкость крупного рогатого скота, L- цистеингидрохлорид, агар бактериологический и раствор витамина K₁ менадиона в концентрации 2 мг/мл 5 мл при следующем содержании исходных компонентов в 1 л дистиллированной воды:

Говяжий фарш обезжиренный 500 г 1 N раствор NaOH 25 мл Панкреатический гидролизат казеина 30 г Дрожжевой экстракт 5 г K₂HPO₄ 5 г D-глюкоза 4 г Жидкость рубца 20 мл L-цистеингидрохлорид 0,5 г Раствор витамина K₁ (менадиона) в концентрации 2 мг/мл 5 мл Агар бактериологический 12 г