FAECALIBACTERIUM PRAUSNITZII И DESULFOVIBRIO PIGER ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИИ ДИАБЕТА И ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА Российский патент 2021 года по МПК C12N1/21 C12N1/20 A61K35/74 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится вообще к медицине. Конкретнее, изобретение относится к применению синергетических пробиотических бактерий как интервенции в интересах здоровья. Изобретение относится к способу, который поддерживает рост и колонизацию в организме человека штамма вида Faecalibacterium prausnitzii.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

По оценкам, в организме взрослого человека микробные клетки численно превосходят человеческие клетки порядка десять к одному. Однако эти сообщества остаются в большей степени неисследованными, причем совсем неизвестно их влияние на развитие, физиологию, иммунитет, питание и здоровье человека.

Традиционная микробиология сосредоточена на исследовании отдельных видов как изолированных звеньев. Однако многие, если не большинство, никогда не были успешно выделены в виде жизнеспособных образцов для анализа, поскольку, возможно, их рост зависит от специфической микросреды, которая не воспроизведена экспериментально. Из видов, которые выделены, анализы организации генома, картин экспрессии генов и физиология обмена веществ редко распространяются до межвидовых взаимоотношений или взаимоотношений микроб-хозяин. Успехи в технологиях секвенирования ДНК создали новое поле исследования, названное метагеномикой, создавая возможность всесторонней проверки сообществ микроорганизмов, даже состоящих из некультивируемых организмов. Вместо проверки геномов отдельных бактериальных штаммов, которые культивированы в лаборатории, метагеномный подход допускает анализ генетического материала, полученного от полных сообществ микроорганизмов, собранных из природной среды. Например, микробиом кишки дополняет наш собственный геном с метаболическими функциями, что влияет на обмен веществ человека и таким образом может играть важную роль в здоровом состоянии и при заболевании.

Полагают, что изменение этих бактерий в кишечнике играет роль во многих хронических и дегенеративных заболеваниях. Имеется растущая масса доказательств, которая подкрепляет и поясняет то, что называют «теорией дисбиоза».

Термин «дисбиоз» изначально придумал Нобелевский лауреат Илья Мечников для описания изменившихся патогенных бактерий в кишечнике. Дисбиоз иногда определяют как «качественные и количественные изменения в микрофлоре кишечника, ее метаболической активности и локальном распределении». Таким образом, дисбиоз является состоянием, обычно ассоциированным с микробным разнообразием, при котором микробиота вызывает вредные действия через, например,

- качественные и количественные изменения в самой микрофлоре кишечника;

- изменения в ее метаболической активности и

- изменения в ее локальном распределении.

Гипотеза дисбиоза устанавливает, что современное питание и образ жизни, а также применение антибиотиков и различных антимикробных средств в окружающей среде ведет к нарушению нормальной кишечной микробиоты. Эти факторы приводят к изменениям в бактериальном метаболизме, а также чрезмерному росту потенциально патогенных микроорганизмов. Теперь полагают, что измененная микробиота играет роль при некоторых болезненных состояниях, включая расстройства, подобные синдрому раздраженной толстой кишки (IBS), воспалительному заболеванию кишечника (IBD), подагре, паучиту, хронической болезни почек, псориазу, немощи и различным заболеваниям обмена веществ, включая ожирение и диабет типа 2.

Диабет типа 2 (T2D) является метаболическим нарушением, характеризующимся гипергликемией и недостатками в секреции и действии инсулина. T2D распространяется по всему миру, и по оценке в 2030 году им будут поражены 350 миллионов человек. Это хроническое заболевание ассоциируется со многими метаболическими и сердечнососудистыми сопутствующими патологиями и повышенной смертностью от сердечнососудистых осложнений. Равно тревожит факт, что примерно половина пациентов с T2D является вновь зарегистрированными, и многие из них имеют сердечнососудистые осложнения на момент установления диагноза. Задолго до развития диабета могут появиться ухудшенная переносимость глюкозы (IGT) и другие метаболические нарушения. Так как фармакологические средства и вмешательства в образ жизни могут ослабить или отсрочить диабет, особенно у субъектов с IGT, раннее обнаружение индивидуумов с опасностью T2D является важным для предупреждения и снижения расходов на медицинское обслуживание.

T2D является результатом комплексных взаимодействий генов с окружающей средой, и идентифицировано несколько факторов риска, включая возраст, семейный анамнез, питание, малоподвижный образ жизни и ожирение. Вновь добавленные факторы, ассоциированные с составом микробиоты, включая присутствие бактерий конкретных родов и видов в желудочно-кишечном тракте человека, одни или в комбинации с другими показателями, такими как индекс массы тела (BMI), отношение талии к бедрам (WHR), окружность талии (WC) и специфические маркеры, можно использовать для более точного предсказания того, имеется ли у индивидуума опасность развития диабета типа 2. Также можно использовать информацию, относящуюся к специфическим изменениям состава микробиоты для формулирования опций вмешательства для коррекции специфического дисбиоза с использованием некоторых пробиотических продуктов.

Микробиота кишечника представляется как фактор окружающей среды, который влияет на обмен веществ в организме и чувствительность к инсулину и, как также обнаружено, изменяется при ожирении. Однако соотношение между микробиотой кишечника и T2D до недавнего времени в больших группах не исследовалось, например, в исследовании Karlsson et al. (Nature, June 6, 2013). Кроме того, лишь недавно некоторые маркеры микробиоты кишечника ассоциируются с T2D, например, в метагеномном исследовании больных диабетом в Китае, опубликованном Qin et al. (Nature, Sep 26, 2012).

Во время беременности - обычно примерно на 24 неделе - у многих женщин развивается гестационный диабет (GDM). Из предыдущих историй болезни гестационным диабетом известно, что он представляет собой опасность развития позднее диабета типа 2. Высокие гликемические уровни во время беременности или после родов являются вескими предсказаниями развития диабета у женщин. Относительная гипергликемия типично показывает некоторую степень инсулинорезистентности и дисфункции бета-клеток, которые можно наблюдать у таких женщин даже с нормальной массой тела и переносимостью глюкозы.

Идентификация и лечение женщин с GDM также являются важными для минимизации материнской и неонатальной смертности, преэклампсии и проблем с высокими нагрузками при родах. Многие иммунные и метаболические изменения, происходящие во время нормальной беременности, схожи с изменениями, описанными также при метаболическом синдроме. Микробиота кишечника может, как описано выше, играть роль при различных заболеваниях, ассоциированных с метаболическим синдромом. Исследование Koren et al. (Cell. 2012 August 3), показало, что микробиота кишечника резко изменяется от первого (Т1) до третьего (Т3) триместров.

Воспалительное заболевание кишечника (IBD) вовлекает в хроническое воспаление весь или часть пищеварительного тракта. IBD в первую очередь включает неспецифический язвенный колит и болезнь Крона. Оба обычно включают тяжелую диарею, боль, усталость и потерю массы. Многочисленные данные обвиняют кишечные бактерии в стадиях инициации и амплификации IBD.

Подагра обычно характеризуется возвратными вспышками артрита с покраснением, болезненностью, раздражением и опуханием сустава. Это ассоциируется с болью, которая типично приходит быстро. Лежащий в основе механизм включает повышенные уровни мочевой кислоты в крови, и диагноз можно подтвердить возможностью увидеть кристаллы в суставной жидкости или тофусе. Причиной подагры является комбинация питания и генетических факторов. В последнее десятилетие подагра становится более обычной, и возрастание в появлении и рецидивах подагры вероятно отражается в демографических факторах. Примечательными среди таких факторов являются возросшая продолжительность жизни и связанные с возрастом сердечнососудистые, метаболические и почечные болезни среди населения; использование лекарственных средств, которые изменяют баланс уратов, как непредусмотренное следствие лечения таких хронических расстройств; и возросшее потребление пищевых продуктов и пищевых добавок, которое вносит вклад в развитие ожирения и сахарного диабета.

Паучит представляет собой воспаление выстилки кармана, который создается хирургически при лечении неспецифического язвенного колита и некоторых других заболеваний. Карман изнутри присоединен к области как раз выше ануса для удержания продуктов выделения перед их выведением. Паучит является наиболее часто наблюдаемым длительным осложнением илеоанального анастомоза (IPAA). Симптомы могут включать диарею, абдоминальную боль и боль в суставах, судороги, лихорадку, повышенное число дефекаций, фекальную утечку в ночное время, недержание кала и сильное ощущение необходимости дефекации. Большинство пациентов с острым паучитом реагируют на начальную терапию антибиотиками, но приблизительно 60 процентов имеют по меньшей мере один рецидив.

Хроническая болезнь почек, иногда также называемая хронической почечной недостаточностью, характеризуется постепенной утратой почечной функции и также определяется как присутствие повреждения почек (обычно определяемое как выделение белка с мочой≥30 мг/сутки или эквивалентное) или пониженная функция почек (определяемая как оцениваемый уровень гломерулярной фильтрации [eGFR] <60 мл/мин/1,73 м2) в течение трех или более месяцев независимо от причины. Когда хроническая болезнь почек достигает стадии развития, в организме могут накапливаться опасные уровни жидкости, электролитов и продуктов жизнедеятельности. Доступное лечение хронической болезни почек фокусируется на замедлении развития повреждения почек. Хроническая болезнь почек может прогрессировать до конечной стадии почечной недостаточности, которая является фатальной без искусственной фильтрации (диализа) или пересадки почки.

Псориаз является обычным хроническим нарушением кожи, которое характеризуется бляшками анормальной кожи. Эти бляшки могут быть красными, зудящими и чешуйчатыми. Псориаз вообще рассматривают как генетическое заболевание, которое запускается факторами внешней среды. Не существует доступного лечения заболевания, но имеются различные обработки, которые могут способствовать регулированию и балансу симптомов.

Немощь является обычным гериатрическим синдромом, который включает повышенную опасность катастрофического ухудшения здоровья и функций у престарелых людей. Не существует золотого стандарта для диагностирования немощи, однако у немощных пациентов часто присутствует повышенный груз симптомов и лекарственной запутанности и пониженная переносимость медицинских вмешательств.

Связь между микробиотой кишечника и энергетическим гомеостазом и воспалением и их роль в патогенезе ожирения все более выясняется. Результаты, полученные на животных моделях, а также на людях, соединяют измененный состав микробиоты с развитием ожирения по нескольким механизмам.

Вид бактерий Faecalibacterium prausnitzii является одним из наиболее распространенных видов в экосистеме кишечника человека и является важным поставщиком различных метаболитов в эпителий кишечника. Низкое или уменьшенное число Faecalibacterium ассоциируется с, например, IBD, подагрой, паучитом, хронической болезнью почек, псориазом, немощью и также T2D и GDM. Некоторые предлагают использовать некоторые источники субстратов, которые промотируют рост полезных бактерий, такие как, например, углерод, так называемые пробиотики, включая инулин, как путь повышения биомассы, например, Faecalibacterium. Одной из возможных проблем такого подхода является то, что, во-первых, в желудочно-кишечном тракте должны присутствовать специфические штаммы Faecalibacterium, во-вторых, пробиотик должен достигать того места, где находятся намеченные штаммы Faecalibacterium, и в-третьих, и это важно, пробиотик также может «кормить» другие бактерии, которые могут быть весьма нежелательными, особенно когда необходимо таргетная интервенция.

Предпочтительным подходом для интервенции должен быть пробиотический продукт, содержащий желательные штаммы, и предпочтительно также на таком пути промотируется их активность и повышается их биомасса в соответствующем месте желудочно-кишечного тракта. Однако бактерии, такие как Faecalibacterium, весьма трудно колонизируются после доставки в кишечник человека. Другим барьером при изоляции и культивировании представителей микробиоты кишечника для разработки новых потенциальных пробиотиков является сложность среды кишечника в смысле различных ниш и обитателей. Также некоторые микробы кишечника перекрестно питаются от других микробов и также могут требовать некоторых факторов роста от хозяина. Предполагается, что настоящее изобретение решит эту проблему.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Предполагается, что все термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, обычно придаваемые им в технике. В целях ясности, некоторые термины также определяются ниже.

Во всем тексте термин «диабет типа 2» (T2D) используется как относящийся к метаболическому расстройству, характеризующемуся гипергликемией, инсульнорезистентностью и относительным ухудшением секреции инсулина.

Термин «метагеномика» относится к применению современных генетических методов для исследования сообществ микробных организмов непосредственно в их естественной окружающей среде в обход необходимости изоляции и лабораторного культивирования отдельных видов.

«Пробиотики» представляют собой живые микроорганизмы, которые, когда вводятся в адекватных количествах, приносят пользу для здоровья хозяина.

«Синергия» представляет собой взаимодействие двух или больше агентов (например, двух или больше различных микроорганизмов), сущностей, факторов или веществ таким образом, что их комбинированное действие - «синергетическое действие» является более сильным, чем сумма их действий по отдельности.

«Симбиозом» является тесная пролонгированная ассоциация между двумя или большим числом различных организмов различных видов, которые могут, но не обязательно, благоприятствовать каждому его члену.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и продуктам для интервенции в организмы млекопитающих пробиотиков, имеющих в основе некоторые анаэробные бактерии.

Основной целью изобретения является поддержание роста и колонизации у людей штамма вида Faecalibacterium prausnitzii путем использования электронных перекрестных помех и симбиоза между видами бактерий Faecalibacterium prausnitzii и Desulfovibrio piger (или другим штаммом, что также определено в настоящем описании). Симбиоз может привести к синергетическому действию большего продуцирования бутирата, чем одним F. prausnitzii, а также к получению возрастания биомассы или числа Faecalibacterium prausnitzii в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам усиления роста и колонизации (например, в желудочно-кишечном тракте, предпочтительно у людей) бактерий Faecalibacterium prausnitzii.

Другой основной целью изобретения является использование симбиотических штаммов для лечения и предупреждения заболеваний, ассоциированных с пониженным продуцированием бутиратов, или заболеваний, ассоциированных с пониженными или низкими уровнями Faecalibacterium prausnitzii. Таким образом, в одном воплощении настоящее изобретение относится к штамму Faecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii) и/или штамму Desulfovibrio piger (D. piger) для применения в терапии, например, в виде пробиотиков.

Другой целью изобретения является использование штамма D. piger (или другого штамма, описанного в настоящем описании) для лечения и/или предупреждения заболеваний, ассоциированных с пониженным продуцированием бутирата, или заболеваний, ассоциированных с пониженными или низкими уровнями Faecalibacterium prausnitzii. D. piger будет поддерживать эндогенный F. prausnitzii.

В настоящем изобретении можно использовать любой соответствующий штамм Faecalibacterium prausnitzii. Faecalibacterium prausnitzii является анаэробной бактерией, и в частности, соответствующие штаммы Faecalibacterium prausnitzii будут иметь (i) способность продуцировать бутират. Кроме того, соответствующие штаммы Faecalibacterium prausnitzii будут иметь одну или несколько (например, 1 или 2) или предпочтительно все способности, такие как (ii) потребление ацетата, (iii) продуцирование внеклеточных электронов и (iv) продуцирование лактата. В некоторых воплощениях используются штаммы с характеристиками (i), (ii) и (iv). Штаммы со способностью продуцировать лактат (в частности, высокие или существенные уровни лактата), являются особенно предпочтительными. Типично штаммы Faecalibacterium prausnitzii ферментируют глюкозу, что приводит, например, к конверсии глюкозы в лактат и бутират.

Даже хотя в настоящем изобретении можно использовать любой соответствующий штамм Faecalibacterium prausnitzii, авторы изобретения идентифицировали некоторые уникальные функции при сравнении различных штаммов Faecalibacterium prausnitzii. Штаммы с наличием фермента L-лактатдегидрогеназы (или штаммы, содержащие ген L-лактатдегидрогеназы, который в свою очередь приводит к продуцированию или экспрессии активного фермента) обеспечивают бактерии с более хорошими свойствами для продуцирования лактата и являются более предпочтительными, так как это является более благоприятным для штамма D. Piger в их синергитическом соотношении. Примеры генов L-лактатдегидрогеназы или ферментов определяются как ЕС 1.1.1.27 гены/ферменты.

Особенно предпочтительный штамм Faecalibacterium prausnitzii для использования в настоящем изобретении обозначен в настоящем описании как штамм Faecalibacterium prausnitzii FBT-22, и депонирован по Будапештскому соглашению в DSMZ (DSMZ Института Лейбница - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstr., 7B, D-38124 Braunschweig, Германия) 20 октября 2015 и получил инвентарный номер DSM 32186. Этот отдельный штамм имеет L-лактатдегидрогеназу и показывает более высокое продуцирование лактата по сравнению с другими штаммами Faecalibacterium prausnitzii. Чем больше лактата обеспечивается во время роста, тем больше субстрата для D. piger, и следовательно поддерживается их взаимодействие.

Этот штамм, например, изолированный штамм, и его применение в терапии, например, в качестве пробиотика, например, для лечения заболеваний, описанных в настоящем описании в других местах, составляет еще один другой аспект изобретения.

Другим предпочтительным штаммом Faecalibacterium prausnitzii для использования в настоящем изобретении является штамм, обозначенный А2-165, который доступен от DSMZ (DSMZ Института Лейбница - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstr., 7B, D-38124 Braunschweig, Германия) и имеет инвентарный номер DSM 1767.

Подобным образом для компонента штамма Desulfovibrio piger предусмотрено, что можно использовать любой соответствующий штамм Desulfovibrio piger. Desulfovibrio piger является анаэробной бактерией и, в частности, соответствующий штамм Desulfovibrio piger будет иметь одну или несколько (например, 1 или 2) или предпочтительно все характеристики, представляющие собой (i) продуцирование ацетата, (ii) потребление лактата и (iii) наличие способности быть акцептором электронов (например, восстанавливать дополнительно сульфат до сульфида). В некоторых воплощениях используются штаммы с характеристиками (i) и (ii). Такие штаммы вообще могут превращать лактат в ацетат. Так как такие определенные характеристики Desulfovibrio piger важны для симбиоза с бактериями Faecalibacterium prausnitzii, предусматривается, что любой другой вид бактерий (т.е., альтернативные штаммы), которые имеют такие характеристики, также можно использовать в настоящем изобретении. Особенно предпочтительный штамм Desulfovibrio piger для использования в настоящем изобретении обозначен в настоящем описании как штамм Desulfovibrio piger FBT-23 и депонирован по Будапештскому соглашению в (DSMZ Института Лейбница - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Inhoffenstr., 7B, D-38124 Braunschweig, Германия) 20 октября 2015, и получил инвентарный номер DSM 32187.

Этот штамм, например, изолированный штамм, и его применение в терапии, например, в качестве пробиотика, например, для лечения заболеваний, описанных в настоящем описании в другом месте, составляет еще один другой аспект изобретения.

Предпочтительно штаммы Faecalibacterium prausnitzii и Desulfovibrio piger (или альтернативные) используют вместе как комбинированную терапию.

Предпочтительно штаммы для использования в настоящем изобретении являются изолированными штаммами, например, штаммами, которые выделены из организма человека или животного. Такие штаммы отделены таким образом от других штаммов микроорганизмов или других примесей из организма человека или животного, из которого их выделили, например, являются чистыми культурами, за исключением того, когда два или больше изолированных штаммов смешаны или объединены для использования в настоящем изобретении.

Когда два штамма взаимодействуют (например, штаммы Faecalibacterium prausnitzii и Desulfovibrio piger, описанные выше), например, культивируются совместно (сокультивируются) или вводятся вместе или иначе приходят в контакт друг с другом, тогда продуцирование бутирата возрастает, когда присутствуют оба штамма, по сравнению с продуцированием бутирата одним штаммом Faecalibacterium prausnitzii. Предпочтительно эффект возрастания продуцирования бутирата является синергетическим действием. При необходимости для продуцирования бутирата можно выбрать условия или среду, в которых происходит взаимодействие или контакт между двумя штаммами, используемыми в изобретении.

Таким образом, еще одно воплощение изобретения относится к композиции или продукту, включающим штаммы Faecalibacterium prausnitzii и Desulfovibrio piger (или альтернтивные), определенные в настоящем описании, или по отдельности или в комбинации. Предпочтительными комбинациями бактерий являются комбинации, которые дают появление синергетического действия на продуцирование бутирата, когда штаммы действуют совместно друг с другом. Такое взаимодействие является формой симбиоза.

Как изложено в общих чертах выше, штаммы и их комбинации, описанные в настоящем описании, имеют терапевтическую применимость и могут использоваться при лечении или предупреждении любого заболевания, при котором будет благоприятным повышенное продуцирование бутирата, или любого заболевания, при котором будет благоприятным возрастание числа или колонизации бактерий Faecalibacterium prausnitzii. Соответствующие заболевания таким образом включают любое заболевание, ассоциированное с пониженными уровнями бутирата, например, пониженным продуцированием бутирата (или истощением или утратой бутирата), вызванным, например, уменьшением или истощением микроорганизмов, которые продуцируют бутират, например, заболевание, ассоциированное с пониженным или низким числом или уменьшившимися количествами бактерий Faecalibacterium prausnitzii, или вызванное, например, уменьшением продуцирования бутирата микроорганизмами, которые продуцируют бутират. С другой стороны, штаммы и их комбинации, описанные в настоящем описании, можно использовать при лечении или предупреждении любого заболевания, ассоциированного с уменьшением или истощением микроорганизмов, которые продуцируют бутират, например, заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом или уменьшившимися количествами бактерий Faecalibacterium prausnitzii. Эти заболевания типично являются заболеваниями желудочно-кишечного (GI) тракта.

Обращение к пониженным уровням, пониженному продуцированию или истощению или низким уровням или низким числам и т.д. будет легко понято и определено специалистом, например, путем сравнения с уровнями, найденными в соответствующем контроле, например, у здорового пациента. Таким образом, такие уровни или числа и т.д. можно рассматривать как ниже нормальных или субнормальные или анормальные или иначе, менее распространенные, чем нормальные. Предпочтительно такие уменьшения (и конечно другие уменьшения или снижения или отрицательные действия, упоминаемые в настоящем описании в другом месте) являются измеримыми уменьшениями, предпочтительно, они являются значимыми уменьшениями, предпочтительно клинически значимыми или статистически значимыми уменьшениями, например, со значением вероятности≤0,05 при сравнении с соответствующим контрольным уровнем или значением.

Действительно, когда в настоящем описании описываются значимые изменения, предпочтительно, чтобы такие изменения являлись статистически значимыми изменениями, например, со значением вероятности≤0,05 при сравнении с соответствующим контрольным уровнем или значением.

Примеры заболеваний описаны в настоящем описании еще и в другом месте и включают T2D, GDM, ожирение, подагру, паучит, хроническую болезнь почек, псориаз, немощь, IBD, IBS, абдоминальную боль, ассоциированную с IBS, и констипацию (или заболевания, ассоциированные с констипацией). Предпочтительными для лечения заболеваниями являются T2D или GDM. Другим предпочтительным заболеванием или состоянием для лечения является дисбиоз.

Таким образом, при альтернативном взгляде, настоящее изобретение относится к терапевтическим методам лечения или предупреждения T2D, GDM, ожирения, подагры, паучита, хронической болезни почек, псориаза, немощи, IBD, IBS, абдоминальной боли, ассоциированной с IBS, или констипации (или заболеваний, ассоциированных с констипацией), или лечения или предупреждения других заболеваний или состояний, описанных в настоящем описании (например, дисбиоза), или лечения или предупреждения болезней обмена веществ, включающим введение пробиотических штаммов, описанных в настоящем описании.

Во всех воплощениях, описанных в настоящем описании, термин «заболевание, ассоциированное с» также может соответствовать «заболеванию, характеризующемуся».

Симбиотические и предпочтительно синергетические действия двух штаммов друг на друга приводят к повышенному продуцированию бутирата и усиленному росту и колонизации бактерий Faecalibacterium prausnitzii в GI тракте, посредством чего ослабляется и лечится заболевание. Предпочтительно штаммы отбирают таким образом, что общее продуцирование бутирата обоими штаммами, когда они присутствуют вместе (например, в сокультуре, или когда вводятся вместе), больше, чем продуцирование бутирата, наблюдаемое с одними бактериями Faecalibacterium prausnitzii, и является предпочтительно синергетическим, т.е., общее продуцирование бутирата обоими штаммами большее (повышенное), предпочтительно значимо большее (повышенное), чем сумма отдельных уровней продуцирования бутирата.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к штамму Faecalibacterium prausnitzii, описанному в настоящем описании, и штамму Desulfovibrio piger (или альтернативному штамму), описанному в настоящем описании, для применения в терапии путем комбинированного, последовательного или отдельного введения.

Изобретение также относится к продукту или композиции, включающим штамм Faecalibacterium prausnitzii и штамм Desulfovibrio piger (или альтернативный штамм), описанные в настоящем описании, как комбинированному препарату для раздельного, одновременного или последовательного применения при лечении или предупреждении заболеваний, определенных в настоящем описании в другом месте.

Таким образом, настоящее изобретение относится к штамму Faecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii) и штамму Desulfovibrio piger (D. piger) (или альтернативному штамму), описанным в настоящем описании, для применения при изготовлении лекарственного средства или композиции для лечения заболеваний, описанных в настоящем описании, например, заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями продуцирования бутирата в GI тракте (например, из-за уменьшения или истощения микроорганизмов, которые продуцируют бутират, например, заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом или обедненной массой бактерий Faecalibacterium prausnitzii, или снижением продуцирования бутирата микроорганизмами, которые продуцируют бутират, или других заболеваний, описанных в настоящем описании в другом месте.

При альтернативном взгляде, настоящее изобретение относится к штамму Faecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii) и штамму Desulfovibrio piger (D. piger) (или альтернативному штамму), описанным в настоящем описании, для применения при изготовлении лекарственного средства или композиции для лечения заболеваний, описанных в настоящем описании, например, заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями продуцирования бутирата в GI тракте (например, из-за уменьшения или истощения микроорганизмов, которые продуцируют бутират, например, заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом или обедненной массой бактерий Faecalibacterium prausnitzii, или снижением продуцирования бутирата микроорганизмами, которые продуцируют бутират, или других заболеваний, описанных в настоящем описании в другом месте.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению продуктов, штаммов или композиций, описанных в настоящем описании, при изготовлении лекарственного средства или композиции для применения при лечении или предупреждении заболеваний, описанных в настоящем описании.

При альтернативном взгляде, настоящее изобретение относится к способу лечения у пациента заболевания, описанного в настоящем описании, например, заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями продуцирования бутирата в GI тракте (например, из-за уменьшения или истощения микроорганизмов, которые продуцируют бутират, например, заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом или обедненной массой бактерий Faecalibacterium prausnitzii, или снижением продуцирования бутирата микроорганизмами, которые продуцируют бутират), или других заболеваний, описанных в настоящем описании в другом месте, причем указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного количества штамма Faecalibacterium prausnitzii (F. prausnitzii) и штамма Desulfovibrio piger (D. piger) (или альтернативного штамма).

Введение пробиотических штаммов в указанных способах лечения и применениях по изобретению (или в любых других способах лечения или терапевтических применениях, описанных в настоящем описании) субъектам, нуждающимся в лечении, осуществляют в фармацевтически или физиологически эффективных количествах. Таким образом, указанные способы и применения могут включать дополнительную стадию идентификации субъекта, нуждающегося в лечении.

Во всех воплощениях, описанных в настоящем описании, предпочтительными для лечения заболеваниями являются T2D или GDM. Предпочтительными штаммами для применения в терапии или при лечении заболеваний, описанных в настоящем описании, и в частности T2D или GDM, являются штамм Faecalibacterium prausnitzii DSM 32186 и штамм Desulfovibrio piger DSM 32187, которые также можно использовать в комбинации. Другим предпочтительным штаммом Faecalibacterium prausnitzii является штамм А2-165 (DSM 17677).

Как указано выше, еще один аспект изобретения относится к штамму D. piger (или альтернативному штамму, как описано выше) для применения при лечении или предупреждении заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями бутирата, или заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом бактерий Faecalibacterium prausnitzii.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к штамму D. piger (или альтернативному штамму, как описано выше) для применения при изготовлении лекарственного средства или композиции для лечения заболеваний, описанных в настоящем описании.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения у пациента заболевания, описанного в настоящем описании, причем указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного количества штамма Desulfovibrio piger (или альтернативного штамма, как описано выше).

Предпочтительные воплощения для указанных способов и применений, например, предпочтительных штаммов Desulfovibrio piger (или альтернативных штаммов), и предпочтительных заболеваний описаны в настоящем описании еще в другом месте. В таких воплощениях введение D. piger будет усиливать или повышать (например, повышать биомассу или число или повышать иначе рост или колонизацию, как описано в настоящем описании еще в другом месте) эндогенные F. prausnitzii у пациента или субъекта, например, в желудочно-кишечном тракте пациента или субъекта.

Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны для читателя, и предполагается, что эти цели и преимущества входят в объем настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1

Фигура 1 показывает ферментативный путь, используемый микробиотой кишечника в кишечнике человека.

Фигура 2

Фигура 2 показывает симбиоз между F. prausnitzii и Desulfovibrio piger.

Фигура 3

Фигура 3 показывает сравнительные профили изолята FBT-22 и типичного штамма А2-165 F. prausnitzii в физиологически релевантной среде для выращивания из сердечно-мозговой вытяжки (LYBHI), по оси y мM.

Фигура 4

Фигура 4 показывает метаболические профили монокультуры типичного штамма А2-165 F. prausnitzii и совместной культуры с D. piger в среде для выращивания LYBHI, по оси y мM.

Фигура 5

Фигура 5 показывает метаболические профили монокультуры изолята FBT-22 F. prausnitzii и совместной культуры с D. piger в среде для выращивания LYBHI, по оси y мM.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И

ЕГО ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВОПЛОЩЕНИЯ

Как указано выше, описанное изобретение относится к способам и продуктам, основанным на некоторых анаэробных бактериях, для пробиотических интервенций в организмы млекопитающих.

Можно увидеть, что в предпочтительных воплощениях изобретения вводят комбинацию или смесь пробиотических бактерий (комбинированная терапия). Такие смеси или композиции пробиотических бактерий можно вводить вместе в единой (одной и той же) композиции или вводить раздельно (например, в различных продуктах или композициях). Если их вводят раздельно, тогда такое введение может быть последовательным или одновременным. Однако раздельное введение образует часть одной и той же терапевтической схемы или способа.

В воплощениях, где введение двух штаммов раздельное или последовательное, предпочтительно, чтобы введение осуществлялось одно за другим в разумной временной рамке. Например, раздельное введение предпочтительно осуществляют одно за другим в пределах часов (например, одного часа) или минут (например, в пределах 15 или 30 минут), наиболее предпочтительно в настолько короткой временной рамке, насколько возможно (включая одновременное или эффективно одновременное введение). Предпочтительно два штамма пробиотических бактерий вводят совместно в единой композиции.

В воплощениях, в которых в смеси в единой композиции используют более одного штамма пробиотических бактерий, или используют более одного штамма пробиотических бактерий, но вводят их раздельно, можно использовать любое соответствующее отношение бактерий при условии, что пробиотическая функция штаммов (например, повышенное продуцирование бутирата и предпочтительно синергетическое действие на продуцирование бутирата) сохраняется до полезной степени. Такие отношения может легко определить специалист в данной области техники. Например, такую комбинацию двух штаммов (например, F. Prausnitzii: D. piger (или альтернативный штамм)) можно использовать при отношении 1:10, 1:5, 1:1, 5:1 или 10:1 или где-нибудь между этими предельными значениями, например, 1:1. Такие отношения также можно использовать в продуктах, наборах, композициях и т.д. по изобретению, как описано в настоящем описании в другом месте.

Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинированным терапиям с использованием по меньшей мере двух щтаммов пробиотических бактерий, предпочтительно, в которых штаммы имеют симбиотическое и предпочтительнее синергетическое действие друг на друга, в частности, в смысле повышенного продуцирования бутирата.

Такое синергетическое действие (или фактически усиленное действие) можно легко измерить in vitro для того, чтобы отобрать соответствующие комбинации бактерий, например, измеряя уровни продуцирования бутирата каждым одним отдельным штаммом с помощью соответствующего анализа и затем оценивая, является ли продуцирование бутирата штаммами в комбинации (например, при совместном культивировании или иной возможности взаимодействовать друг с другом) более высоким, и предпочтительно значимо более высоким, чем сумма уровней продуцирования бутирата отдельными штаммами. Простое возрастание (предпочтительно значимое возрастание) продуцирования бутирата также можно измерить таким путем. Соответствующие анализы можно выполнить в анаэробных условиях. Примеры соответствующих методов описаны в примерах.

В терапевтических методах и применениях, описанных в настоящем описании, штаммы вводят в соответствующих дозах, препаратах и т.д. таких, что продуцирование бутирата в GI тракте млекопитающего возрастает. Кроме того, предпочтительно повышается число бактерий Faecalibacterium prausnitzii (например, повышается биомасса Faecalibacterium prausnitzii) или улучшается рост и колонизация бактерий Faecalibacterium prausnitzii в GI тракте.

Предпочтительно такие возрастания (и фактические другие возрастания, улучшения или положительные действия, упомянутые в других местах в настоящем описании) являются измеримыми возрастаниями и т.д. (в соответствующем случае), предпочтительнее они являются значимыми возрастаниями, предпочтительно клинически значимыми или статистически значимыми возрастаниями, например, со значением вероятности≤0,05 при сравнении с соответствующим контрольным уровнем или значением (например, при сравнении с субъектом без лечения или получавшим плацебо или при сравнении со здоровым или нормальным субъектом, или с тем же субъектом до лечения).

Способы и применения по настоящему изобретению подходят для предупреждения заболеваний, а также для лечения заболеваний. Таким образом, профилактическое лечение также охватывается изобретением. По этой причине в способах и применениях по настоящему изобретению лечение также включает профилактику или предупреждение в соответствующем случае.

Способы и применения по изобретению можно осуществить для любого млекопитающего (пациента или субъекта), например, людей или любого скота, домашнего или лабораторного животного. Конкретные примеры включают мышей, крыс, свиней, кошек, собак, овец, кроликов, коров и обезьян. Однако предпочтительным млекопитающим является человек.

В другом аспекте изобретение относится к наборам или фармацевтической упаковке. Таким образом, настоящее изобретение относится к набору или фармацевтической упаковке, включающим (или состоящим из)

(i) штамм Faecalibacterium prausnitzii, определенный в настоящем описании, и

(ii) штамм Desulfovibrio piger (или альтернативнй штамм), определенный в настоящем описании,

или набору или фармацевтической упаковке, включающим (или состоящим из)

штамм Desulfovibrio piger (или альтернативнй штамм), определенный в настоящем описании, например, для усиленного роста эндогенных F. prausnitzii, как описано в настоящем описании в другом месте.

Как описано в настоящем описании в другом месте, два штамма, образующие отдельные компоненты набора, можно вводить в виде отдельных компонентов или можно объединить вместе перед введением. В альтернативных воплощениях набора два штамма могут быть предоставлены вместе в виде единого компонента набора или упаковки. Предпочтительно такие наборы или упаковки предназначены для применения в способах и применениях по настоящему изобретению, например, для применения при лечении заболеваний, определенных в настоящем описании. Набор или упаковка также необязательно включает инструкции по введению компонентов или инструкции по использованию набора или упаковки.

В более ранних исследованиях показано, что бактериальные изменения, наблюдаемые при диабете типа 2 (T2D), влияют не на общий состав микробиоты, а на распространенность ограниченного числа видов. Конкретно существует сокращение бактерий, продуцирующих эфир короткоцепной жирной кислоты бутират, и такое истощение продуцирующих бутират бактерий также снижает уровни вторичных желчных кислот. Оказывается, что это справедливо также при заболевании гестационном диабете (GDM) и других связанных с метаболизмом заболеваниях. Сообщается, что Faecalibacterium, которая является продуцентом бутирата с противовоспалительным действием, также истощенная при воспалительном заболевании кишечника, в среднем менее распространена у беременных женщин с GDM на третьем триместре (Т3).

На основании своих исследований на здоровых людях и людях с заболеваниями с использованием метагеномного анализа авторы изобретения выделили несколько штаммов Faecalibacterium prausnitzii из человеческих фекалий и отобрали наиболее обещающие штаммы как потенциальные пробиотические штаммы для дальнейшей разработки. На основании таких исследований в настоящем описании в другом месте описаны соответствующие штаммы Faecalibacterium prausnitzii для использования в настоящем изобретении. Предпочтительным штаммом является FBT-22 (DSM 32186). Этот отдельный штамм имеет ген L-лактатдегидрогеназы и показывает более высокое продуцирование лактата по сравнению с другими штаммами Faecalibacterium prausnitzii. Действительно, как упоминалось в настоящем описании в другом месте, штаммы со способностью продуцировать лактат (в частности, высокие или значимые уровни лактата) являются особенно предпочтительными. Примерами соответствующих уровней продуцирования лактата штаммами для использования в изобретении являются уровни, которые являются достаточными для наличия биологического действия, например, положительного действия на рост D. рiger при совместном культивировании. Примерами уровней являются уровни по меньшей мере в 10 мM, 20 мM, 30 мM, 40 мM, 50 мM или 60 мM, например, когда штаммы культивируют в соответствующей среде для выращивания, например, PGM или LYBHI, как описано в примерах. Примерами высоких уровней продуцирования лактата являются уровни по меньшей мере в 35 мM, 40 мM, 45 мM, 50 мM, 55 мM или 60 мM, например, когда штаммы культивируют в соответствующей среде для выращивания, например, PGM или LYBHI, как описано в примерах. Штаммы, которые содержат ген L-лактатдегидрогеназы (или экспрессируют активный фермент L-лактатдегидрогеназу), являются особенно предпочтительными.

Как упоминалось в настоящем описании в другом месте, штаммы Faecalibacterium prausnitzii со способностью продуцировать бутират, являются особенно предпочтительными. Примеры соответствующих уровней продуцирования бутирата штаммами для использования в изобретении являются уровни, которые являются достаточными для наличия биологического действия, например, положительного действия на T2D или другие заболевания, описанные в настоящем описании. Примерами уровней являются уровни по меньшей мере в 3 мM, 5 мM, 7 мM, 10 мM или 15 мM, или до 10 мM или 15 мM, например, когда штаммы культивируют в соответствующей среде для выращивания, например, PGM или LYBHI, как описано в примерах. Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, уровень продуцирования бутирата повышается, предпочтительно значимо повышается, когда штамм Faecalibacterium prausnitzii присутствует в комбинации со штаммом D. piger (или альтернативными штаммами), по сравнению с продуцированием бутирата одними Faecalibacterium prausnitzii. Предпочтительно наблюдается синергетическое возрастание. Примерами уровней возрастания являются по меньшей мере 1,5 раза, 2,0 раза, 2,5 раза, 3,0 раза или 3,5 раза.

F. prausnitzii является наибодее распространенной бактерией в человеческой кишечной микробиоте здоровых взрослых людей, представляя до свыше 5% всей бактериальной популяции. За последние пять лет все больше исследований четко показывают важность этой высоко метаболически активной комменсальной бактерии как компонента микробиоты здорового человека. Изменения в распространенности F. prausnitzii связаны с дисбиозом при некоторых расстройствах у людей.

F. prausnitzii является бактерией, крайне чувствительной к кислороду (EOS) и с трудом культивируемой даже в анаэробных условиях. Основными конечными продуктами ферментации глюкозы штаммами F. prausnitzii являются формиат, лактат и существенные количества бутирата (>10 мМ бутирата in vitro).

Некоторые наблюдения дают понимание основы взаимодействий хозяин-микроб F. prausnitzii в кишечном барьере. Штамм

- продуцирует бутират,

- ферментирует глюкозу,

- потребляет ацетат,

- способен продуцировать внеклеточные электроны, например, способен выдыхать электроны для акцепторов внеклеточных электронов через рибофлавин,

- использует глюкозу как донора электронов и флавин как медиатора.

Рассматривая распространенность и рост F. prausnitzii в здоровом кишечнике, авторы изобретения предположили, что поблизости должны иметься другие бактерии, которые могут действовать симбиотически и поддерживать рост F. prausnitzii. Таким образом, с помощью идентифицированных характеристик авторы изобретения искали бактерии, которые потребляют лактат, продуцируют ацетат и также способны действовать как акцепторы электронов. На основании таких характеристик можно выбрать штамм, который вместе с F. prausnitzii действует симбиотически. Один возможный кандидат обнаружен в Desulfovibrio piger (и особенно предпочтительным штаммом Desulfovibrio piger является FBT-23 (DSM 32187)). Однако любые другие штаммы с такими свойствами (т.е., альтернативные штаммы) также можно использовать.

Desulfovibrio является одним из первых описанных родов и вероятно наиболее тщательно исследованным родом среди сульфатвосстанавливающих бактерий. Они являются сульфатвосстанавливающими, неферментирующими, анаэробными грамотрицательными бациллами, характеризующимися наличием пигмента десульфовиридина, который флуоресцирует красным светом при щелочном рН и сине-зеленым при кислотном рН в длинноволновом УФ-свете. Штаммы D. piger никогда не выделяли из организма человека, и их можно считать естественными обитателями кишечного тракта, где распространены сульфаты.

Некоторые свойства штамма указаны далее.

- Конвертирует лактат или потребляет лактат - восстановленный ферментативный метаболит микробов, в менее восстановленный продукт ацетат.

- Конверсия лактата в ацетат высвобождает электроны, что восстанавливает сульфат до сульфида.

- Цитохромы Desulfovibrio могут действовать как акцепторы электронов из окружающей восстановленной среды или бактерий и использовать для восстановления сульфата до сульфида.

К изумлению авторов изобретения, когда бактериальная клетка F. prausnitzii находится поблизости от бактериальной клетки D. piger, существует уникальный обмен электронами и симбиоз между F. prausnitzii и D. piger. Это новое открытие используется в изобретении путем получения продуктов на основе комбинации выбранных штаммов двух видов для поддержания роста и колонизации у людей штамма F. prausnitzii. В другом возможном продукте может использоваться одна D. piger для введения, например, людям для поддержания роста эндогенной F. prausnitzii.

Симбиоз между двумя видами можно частично описать так, как следует далее, см. фигуру 2.

- F. prausnitzii превращает глюкозу в лактат и бутират, потребляет ацетат и продуцирует внеклеточные электроны.

- D. piger превращает лактат в ацетат и акцептирует электроны еще для восстановления сульфата до сульфида.

- Конечными результатами являются более хороший рост обоих микроорганизмов и большее продуцирование бутирата, что показывает синергетическое действие.

Взаимодействие подтверждается демонстрацией более высокого накопления бутирата в сокультурах F. prausnitzii и D. piger (см. пример 4).

Симбиоз приводит к желательному росту и усиленному продуцированию бутирата F. prausnitzii (см. пример 4), используемой, согласно описанному изобретению, для пробиотической интервенции людям в опасности или с имеющимся дисбиозом в их кишечной микробиоте (например, дисбиозом желудочно-кишечной микробиоты), когда сокращаются продуцирующие бутират бактерии, как при T2D или GDM.

Соответствующие пробиотические штаммы для использования в изобретении можно получить или выделить из любого млекопитающего, которое способно страдать от или является чувствительным к дисбиозу желудочно-кишечной микробиоты, в частности, с заболеваниями T2D, GDM, ожирением, подагрой, паучитом, хронической болезнью почек, псориазом, немощью, IBD, IBS, абдоминальной болью, ассоциированной с IBS, и констипацией, или другими заболеваниями, описанными в настоящем описании. Люли являются предпочтительным источником. Соответствующие типы образцов, из которых получают соответствующие пробиотические бактерии, должны быть хорошо известны специалистам в данной области техники. Однако предпочтительными являются образцы фекалий. Соответствующими условиями культивирования являются анаэробные условия. Соответствующую культуральную среду могут выбрать специалисты в данной области техники, например, среду PGM или LYBHI или другую среду, как описано в примерах.

Также предметом изобретения являются способы, наборы, системы, композиции и продукты для указанного симбиоза.

Таким образом, штаммы (или их комбинации), описанные в настоящем описании, могут принимать форму соединения (агента) или композиции, например, фармацевтического соединения или композиции или соединения или композиции для питания.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к композиции или препарату, включающим штамм F. prausnitzii, описанный в настоящем описании, и штамм D. piger или альтернативный бактериальный штамм, описанный в настоящем описании, который имеет одну или несколько характеристик из (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) способности быть акцептором электронов; и

по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из группы, включающей носитель, разбавитель или эксципиент (например, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент), пищевой продукт или пищевую добавку или дополнительное терапевтическое средство или питательное вещество. Таким образом, указанные композиции можно получить в виде фармацевтических композиций или в виде питательных композиций, например, пищевого продукта.

Изобретение также относится к применениям штаммов, композиций и препаратов, описанных в настоящем описании.

Соответствующий тип введения и состав штаммов, композиций, препаратов и т.д. выбирают в зависимости от области заболевания. Предпочтительным типом введения является пероральный или ректальный, однако в равной степени соответствующей может быть внутривенная или внутримышечная инъекция.

Соответствующие дозы штаммов, композиций и препаратов по изобретению, определенных в настоящем описании, могут легко выбрать или определить специалисты в зависимости от расстройства, от которого лечат, типа введения и конкретного препарата. Например, дозировку и схему введения выбирают так, чтобы пробиотические бактерии (или комбинация бактерий), вводимые субъекту согласно настоящему изобретению, могли привести к благоприятному для лечения или здоровья действию (например, повышению уровней бутирата в желудочно-кишечном тракте или усилению роста бактерий F. prausnitzii в желудочно-кишечном тракте, или лечению заболевания). Таким образом, в воплощениях изобретения, где вводят два различных штамма бактерий, соответствующую дозу каждой бактерии выбирают так, что когда присутствуют оба штамма, наблюдают благоприятное для лечения или здоровья действие. Например, можно использовать суточные дозы одной или каждой бактерии в целом 10⁴-10¹², например, 10⁵-10¹⁰, или 10⁶-10⁸, или 10⁸-10¹⁰ КОЕ бактерий. Предпочтительная суточная доза одной или каждой бактерии составляет в целом примерно 10⁸ или 10⁹ КОЕ, например, 10⁷-10¹⁰ или 10⁸-10¹⁰ или 10⁸-10⁹.

Таким образом, изобретение относится к композициям или препаратам или наборам, содержащим штаммы, определенные в настоящем описании. Предпочтительные продукты или композиции включают замороженные, высушенные вымораживанием, лиофилизованные или высушенные бактерии и, предпочтительно, в формате стандартной дозы, например, капсулы или таблетки или геля. Предпочтительные продукты или композиции будут содержать как штамм F. prausnitzii, так и шатмм D. piger (или альтернативный штамм). Соответствующие отношения и дозы (например, в форме чисел бактерий или КОЕ) для использования в таких продуктах и т.д., описаны в настоящем описании в другом месте и в примерах. В такие продукты и т.д. также могут быть включены другие компоненты, например, консерванты (например, глицерин), стабилизаторы, желирующие агенты и/или криопротекторы. В некоторых воплощениях такие дополнительные компоненты являются искусственными веществами.

Как видно на фигуре 1, теоретически продуцирование гомоацетата, гомоформиата и лактата являются энергетически эффективными путями в смысле передачи электронов, когда в качестве донора электронов используют глюкозу. Гомобутирогенез дает 4 моля избыточных электронов на моль глюкозы, в то время как конверсия лактата в ацетат дает 4 моля электронов на моль продуцированного ацетата. Продуцирование пропионата из глюкозы дает избыток в 10 молей электронов. Во время ферментации эта диспропорция электронов уравновешивается смешанными кислотной ферметацией и продуцированием газов. Некоторые микробы выдыхают электроны для внеклеточных акцепторов электронов, таких как нитрат, сульфат или нерастворимые комплексы металлов. Кроме того, кислород может действовать как косвенный акцептор электронов, так как некоторые кишечные микробы могут потреблять кислород в небольших количествах. Общий результат микробных активностей генерирует богатую электронами окружающую среду в кишечнике человека или животного, которая держит общий редокс-потенциал отрицательным. Такая с недостатком кислорода восстанавливающая окружающая среда благоприятствует росту строгих анаэробов в просвете кишечника. Несмотря на тот факт, что существует непрерывный приток кислорода через переваривание пищи и диффузию из слизистой кишечника, общий редокс-потенциал кишечника остается отрицательным, са -300 мВ.

Терапевтические применения изобретения, определенные в настоящем описании, включают ослабление, предупреждение или облегчение релевантного расстройства или симптомов расстройства (например, могут привести к модуляции симптомов заболевания). Такие релевантные расстройства описаны в настоящем описании в другом месте, например, расстройства, ассоциированные с потерей или истощенным продуцированием бутирата, или расстройства, ассоциированные с пониженным или низким числом F. prausnitzii, как например, при болезнях T2D, GDM, ожирении, подагре, паучите, хронической болезни почек, псориазе, немощи, IBD, IBS, абдоминальной боли, ассоциированной с IBS, и констипации. Ослабление, предупреждение или облегчение расстройства или его симптомов можно измерить с помощью любого соответствующего анализа. Предпочтительно ослабление или облегчение расстройства или его симптомов является клинически и/или статистически значимым, предпочтительно со значением вероятности <0,05. Такое ослабление, предупреждение или облегчение расстройства или его симптомов, как правило, определяют, сравнивая с соответствующим контрольным субъектом или популяцией, например, здоровым субъектом или субъектом без лечения или с лечением плацебо, или базовым уровнем у отдельного субъекта до лечения.

Соответствующий тип введения и состав терапевтического средства выбирают в зависимости от лечения. Предпочтительным типом введения пробиотических бактерий или других добавок является пероральный или ректальный путь.

Симбиотические комбинации или даже любые комбинации пробиотических бактерий, описанных в настоящем описании, можно получить в жидкостях на масляной основе (например, среднецепных триглицеридах) с использованием лиофилизованного материала.

Предпочтительная жизнеспособность каждого штамма в исходном материале колеблется от 10⁶ КОЕ/г до 10¹⁰ КОЕ/г.

Введение субъектам можно достичь любым типом доставки, включая энтеросолюбильные капсулы, капсулы с отсроченным или регулируемым высвобождением, мягкие гелевые капсулы (например, жевательные капсулы), капсулы с энтеросолюбильным покрытием или капсулы в капсулах.

Введения можно достичь через форму дозировки саше на основе ALU-ALU с осушающими покрытиями.

Соответствующие дозировки терапевтических средств, определенных в настоящем описании, можно выбрать с помощью стандартных методов в зависимости от определенного средства, возраста, массы и состояния пациента, типа введения и соответствующего препарата.

Способы лечения и предупреждения по изобретению, описанному в настоящем описании, можно выполнить для любого типа субъекта или млекопитающего, которое способно страдать от дисбиоза, например, дисбиоза желудочно-кишечной микробиоты, особенно при болезнях T2D, GDM, ожирении, подагре, паучите, хронической болезни почек, псориазе, немощи, IBD, IBS, абдоминальной боли, ассоциированной с IBS, и констипации. Эти способы, как правило, осуществляют для людей.

Далее приводятся некоторые примеры изобретения, которые не предназначены для ограничения применения изобретения, но подробно показывают практические примеры того, как можно использовать изобретение.

ПРИМЕР 1

Изоляция Faecalibacterium prausnitzii и Desulfovibrio piger в виде совместной культуры

Неожиданно Faecalibacterium prausnitzii, FBT-22 (DSM 32186), и штамм Desulfovibrio piger FBT-23 (DSM 32187) выделили из фекалий здорового волонтера микробиологическим методом выделения чистых культур в строгих анаэробных условиях (5% H₂, 15% CO₂ и 80% N₂) с использованием камеры Coy. Используют среду Postgate (PGM) как обычную культуральную среду для изоляции и культивирования.

PGM содержит (г/л) дикалийфосфат: 0,5 г; хлорид аммония: 1; лактат натрия: 3,5; дрожжевой экстракт: 1; аскорбат: 0,1; цистеин: 0,5; хлорид натрия: 1; пептон: 10; сульфат натрия: 1; хлорид кальция дегидрат: 1; сульфат магния: 2; гептагидрат сульфата железа(2): 0,5. Сульфат натрия, гептагидрат сульфата магния, хлорид кальция дегидрат автоклавируют по отдельности, в то время как гептагидрат сульфата железа(2) стерилизуют фильтрацией, фильтр 0,22 мкм, и добавляют после автоклавирования и смешивания всех компонентов. Конечный рН среды доводят 1 N NaOH или 1 N HCl до 7,2±0,2.

Среду автоклавируют при 100 кПа при 121°С в течение 15 мин.

Среда не содержит глюкозу, которая является первоочередным требованием для роста F. prausnitzii, однако содержит относительно высокие количества лактата. Повторное субкультивирование приводит к изоляту D. piger и F. prausnitzii.

ПРИМЕР 2

Альтернативная изоляция штамма F. prausnitzii

Штамм F. prausnitzii изолируют из фекалий здорового волонтера микробиологическим методом выделения чистых культур в строгих анаэробных условиях (5% H₂, 15% CO₂ и 80% N₂) с использованием камеры Coy. Обычная культуральная среда для изоляции содержит (г/л) дрожжевой экстракт: 2,5; казитон: 10; глюкозу: 4,5; хлорид натри: 0,9; дикалийфосфат: 0,45; дигидрофосфат калия: 0,45; сульфат аммония: 1,32; бикарбонат натрия: 4 г; цистеин: 1; резазурин: 0,001; гемин: 0,01. Смесь витаминов содержит 10 мкг биотина, 10 мкг кобаламина, 30 мкг п-аминобензойной кислоты, 50 мкг фолиевой кислоты и 150 мкг пиридоксамина. Конечные концентрации ионов короткоцепных жирных кислот (SCFA) в среде составляют 33 мМ ацетата, 9 мМ пропионата и 1 мМ каждого из изобутирата, изовалерата и валерата. Все компоненты добавляют асептически, в то время как пробирки продувают СО₂. Неустойчивые при нагревании витамины стерилизуют фильтрацией, фильтр 22 мкм, и добавляют после автоклавирования среды, и получают конечную концентрацию тиамина 0,05 мкг.мл^-1 и рибофлавина 0,05 мкг.мл^-1. Конечный рН среды доводят 1 N NaOH или 1 N HCl до 7,2±0,2. Среду автоклавируют при 100 кПа при 121°С в течение 15 мин.

ПРИМЕР 3

Альтернативная изоляция штамма Desulfovibrio piger

Штамм Desulfovibrio piger изолируют из фекалий здорового волонтера микробиологическим методом выделения чистых культур в строгих анаэробных условиях (5% H₂, 15% CO₂ и 80% N₂) с использованием камеры Coy. Используют среду Postgate (PGM) как обычную культуральную среду для изоляции и культивирования.

Среда Postgate содержит (г/л) дикалийфосфат: 0,5 г; хлорид аммония: 1; лактат натрия: 3,5; дрожжевой экстракт: 1; аскорбат: 0,1; цистеин: 0,5; хлорид натрия: 1; пептон: 10; сульфат натрия: 1; хлорид кальция дегидрат: 1; сульфат магния: 2; гептагидрат сульфата железа(2): 0,5. Сульфат натрия, гептагидрат сульфата магния, хлорид кальция дегидрат автоклавируют по отдельности, в то время как гептагидрат сульфата железа(2) стерилизуют фильтрацией, фильтр 0,22 мкм, и добавляют после автоклавирования и смешивания всех компонентов. Конечный рН среды доводят 1 N NaOH или 1 N HCl до 7,2±0,2.

Среду автоклавируют при 100 кПа при 121°С в течение 15 мин.

ПРИМЕР 4

Геномное секвенирование Faecalibacterium prausnitzii DSM 32186

Целью этого исследования является секвенирование генома пробиотического кандидата Faecalibacterium prausnitzii DSM 32186 для идентификации факторов, важных для метаболических взаимодействий между Faecalibacterium prausnitzii DSM 32186 и Desulfovibrio piger DSM 32187.

Экспериментальная процедура и результаты

Секвенирование и сборка

Культуру штамма F. prausnitzii DSM 32186 собирают, и изолируют ДНК. Изолированную ДНК секвенируют на приборе Pacific Biosciences RS в SciLifeLab Uppsala, Швеция. Секвенирование генерирует 73071 ридов с длиной ридов N50 17241 пара оснований (п.о.). Риды последовательности собирают с использованием PacBio SMRTPortal и версии 3 HGAP протокола сборки (Chinetal.,2013). Используют параметры по умолчанию за исключением установки размера оцененного генома до 3 Mп.о.. Сборка приводит к одному контигу в 2915013 п.о. со средним покрытием 197. Собранную структуру закольцовывают, удвоенные замыкающие концы подравнивают с помощью пакета AMOS (Treangenetal.,2002), и начало хромосомы устанавливают к стартовому кодону гена DnaA. Для улучшения сборки и слитых при образовании кольца концов генерированную кольцевую хромосому используют в качестве эталона в протоколе версии 1 SMRTPortal Resequence, по которому риды PacBio снова картируют к этому стандарту, и получают консенсусную последовательность. Эту консенсусную последовательность используют для дальнейших анализов.

Начальное название гена и аннотация NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (Angiuolietal.,2008) показывают, что собранная молекула содержит неестественно высокое число генов со сдвигом рамки считывания (489 из всех 2767 генов). Ручная проверка сборки показывает, что сдвиг рамки считывания происходит во фрагментах секвенирования гомополимера Gs или Cs с длиной примерно 6 п.о.. Для того, чтобы смягчить проблему гомополимера, тот же образец ДНК отправляют на секвенирование с использованием технологии Illumina на GATCBiotech.

В целом прибор Illumina Hiseq генерирует 7624279 парных концевых ридов с длиной рида 126 п.о.. Используют Trimmomatic 0.36 (Bolgeretal.,2014) для контроля качества ридов и фильтрования адаптерных последовательностей. В целом в анализе downstream используют 6424651 высококачественных концевых ридов. Высококачественные риды выравнивают с генерированной PacBio консенсусной последовательностью с помощью bowtie2 2.2.9 (LangmeadandSalzberg,2012) с использованием параметров по умолчанию за исключением допуска вставки длиной 600 п.о. (-X 600). Из пар высококачественных ридов 90,2% выравниваются с геномом соответственно, и общая степень выравнивания составляет 99,75%. Выравнивание подают на Pilon (Walkeretal.,2014) 1.18 (https://github.com/broadinstitute/pilon/releases) для коррекции сборки. Pilon осуществляет 1074 коррекций для сборки, причем подавляющее большинство составляют единичные вставки или G или C.

Конечная структура генома Faecalibacterium prausnitzii DSM 32186 содержит 2905188 пар оснований, представлена NCBI и получила инвентарный номер CP015751.

Аннотация генома

Геномная последовательность аннотирована NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline, и в целом 2737 гена найдено на хромосоме, из которых 2608 являются генами, кодирующими белки, 86 генами РНК и 43 псевдогенами. Геном содержит 6 полных 5S, 16S и 23S рибосомных генов и 64 гена тРНК.

Уникальный генетический потенциал по сравнению с другими секвенированными геномами F. prausnitzii

Геном F. prausnitzii DSM 32186 аннотирован Rapid Annotation с использованием Subsystem Technology (RAST) Server (http://rast.nmpdr.org/). Сравнением аннотации генов в секвенированных геномах F. prausnitzii A2-165, SL3/3, KLE1255, L2-6 и M212 с F. prausnitzii DSM 32186 идентифицированы уникальные функции, перечисленные далее в таблице 1.

Особый интерес представляет L-лактатдегидрогеназа, которая не обнаружена ни в каком другом штамме F. prausnitzii. Этот белок A8C61_00370 в DSM 32186 не имеет близкого гомолога в других секвенированных геномах F. prausnitzii, и поиск с выравниванием последовательностей с помощью BLAST с базой данных NCBI nr идентифицирует L-лактатдегидрогеназы из Eubacterium, Oribacterium и Roseburia как близкородственные последовательности. L-Лактатдегидрогеназа A8C61_00370 вероятно перенесена в F. prausnitzii DSM 32186 горизонтальным переносом генов, так как находится в прямой близости к геномному острову, идентифицированному инструментом онлайн IslandViewer 3 (Dhillonetal.,2015) (http://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/). Экспериментальные данные показывают, что штамм DSM 32186 во время роста продуцирует больше лактата, который является субстратом для D. Piger, и следовательно поддерживает их взаимодействие.

Таблица 1. Уникальные аннотации генов в F. prausnitzii DSM 32186 по сравнению со следующими секвенированными геномами F. prausnitzii. Названия штаммов жирным шрифтом конкретизируют штамм, в отношении которого DSM 32186 имеет уникальные функции.

M212:SL3/3 Сахарозофосфорилаза (EC 2.4.1.7) L-Аланин-DL-глутаматэпимераза тРНК (5-метиламинометил-2-тиоуридилат)метилтрансфераза (EC 2.1.1.61) Бета-лактамаза (EC 3.5.2.6) A2-165:L2-6 Серин-гидроксиметилтрансфераза (EC 2.1.2.1) CRISPR-ассоциированная геликаза Cas3 CRISPR-ассоциированный белок, семейство Cas5e CRISPR-ассоциированный белок, семейство Cse1 CRISPR-ассоциированный белок, семейство Cse2 CRISPR-ассоциированный белок, семейство Cse3 CRISPR-ассоциированный белок, семейство Cse4 Рибонуклеотидредуктаза класса Ia (аэробная), субъединица альфа (EC 1.17.4.1) Рибонуклеотидредуктаза класса Ia (аэробная), субъединица бета (EC 1.17.4.1) ДНК-примаза/геликаза, фагассоциированная Регулятор реакций автолиза LytR Холинсвязывающий белок A A2-165:M212 Предполагаемая прогнозированная металзависимая гидролаза Регулятор транскрипции, семейство MerR A2-165:SL3/3 UDP-N-ацетилглюкозамин-2-эпимераза (EC 5.1.3.14) KLE1255:L2-6 L-Аспарагиназа I цитоплазматическая (EC 3.5.1.1) Альфа-галактозидаза (EC 3.2.1.22) Система PTS, мальтоза и глюкозоспецифический компонент IIB (EC 2.7.1.69) Система PTS, мальтоза и глюкозоспецифический компонент IIC (EC 2.7.1.69) Ацетальдегиддегидрогеназа (EC 1.2.1.10) тРНК S(4)U 4-тиоуридинсинтаза (образователь ThiI) KLE1255:M212 Белок биосинтеза капсулярного полисахарида Выкачивающий насос семейства множественной резистентности и выведения токсинов (MATE) YdhE/NorM, гомолог KLE1255:SL3/3 Аденинспецифическая метилтрансфераза (EC 2.1.1.72) Субъединица метилирования системы рестрикции-модификации типа III (EC 2.1.1.72) Фактор РНК-полимеразы, сигма-54, RpoN A2-165:KLE1255 Предполагаемая эстераза Марганецзависимая белковая тирозинфосфатаза (EC 3.1.3.48) Гидролаза (суперсемейство HAD) в кластере с DUF1447 Предполагаемый ДНК-связывающий белок в кластере с системой рестрикции-модификации типа I Токсин стабилизации репликона RelE/StbE L2-6:M212:SL3/3 Семейство фосфоглицератмутазы A2-165:M212:SL3/3 Галактоза, пермеаза ArsB/NhaD-подобная анионпермеаза KLE1255:L2-6:M212 Белок KefA системы выкачивания калия KLE1255:L2-6:SL3/3 Галактозид-O-ацетилтрансфераза (EC 2.3.1.18) Антагонист антисигма-фактора В RsbV KLE1255:M212:SL3/3 Хоризматмутаза I (EC 5.4.99.5) Система транспорта N-ацетил-D-глюкозамина ABC, белок пермеаза 1 Белок деградации пектина KdgF Переносчик глицерол-3-фосфата ABC, периплазматический глицерол-3-фосфат-связывающий белок (TC 3.A.1.1.3) Компонент внутренний мембранный белок транслоказа YidC, длинная форма Термостойкая карбоксипептидаза 1 (EC 3.4.17.19) Белок VapB (антитоксин к VapC) A2-165:KLE1255:L2-6 Биполярная ДНК-геликаза HerA Рибосомассоциированный белок теплового шока, вовлеченный в рецикл субъединицы 50S (паралог S4) Метилтрансфераза биосинтеза убихинона/менахинона UbiE (EC 2.1.1.-) тРНК-специфическая 2-тиоуридилаза MnmA A2-165:KLE1255:M212 Белок волокна хвоста фага A2-165:L2-6:M212:SL3/3 Основной белок хвоста фага NADH-дегидрогеназа (EC 1.6.99.3) KLE1255:L2-6:M212:SL3/3 YdjC-подобный белок системы целлобиоза-фосфотрансфераза Лактоза и галактоза-пермеаза, семейство транслокаторов GPH Псевдоуридин-5 и №39; фосфатаза (EC 3.1.3.-) Удвоенный компонент АТФазы MtsB активизирующего модуля метионин-регулируемого переносчика ECF Субстратспецифический компонент MtsA метионин-регулируемого переносчика ECF Трансмембранный компонент MtsC активизирующего модуля метионин-регулируемого переносчика ECF Основной белок фагового капсида Аминопептидаза C (EC 3.4.22.40) Регулятор транскрипции семейства Rrf2, группа III Белок-токсин YoeB A2-165:KLE1255:M212:SL3/3 Олиго-1,6-глюкозидаза (EC 3.2.1.10) Соактиватор экспрессии гена профага IbrB Белок стабилизации репликона TTE0858 (антитоксин к TTE0859) A2-165:KLE1255:L2-6:M212:SL3/3 Мальтодекстрин-глюкозидаза (EC 3.2.1.20) Мальтоза-O-ацетилтрансфераза (EC 2.3.1.79) L-Лактатдегидрогеназа (EC 1.1.1.27) Переносчик мальтозы/мальтодекстрина ABC, субстратсвязывающий периплазматический белок MalE Холинкиназа (EC 2.7.1.32) Холинпермеаза LicB Холинфосфатцитидилтрансфераза (EC 2.7.7.15) Липополисахарид-холинфосфотрансфераза LicD1 (EC 2.7.8.-) Альфа-L-Rha-альфа-1,3-L-рамнозилтрансфераза (EC 2.4.1.-) Однонитевая экзонуклеаза, ассоциированная с комплексом Rad50/Mre11 Эндонуклеаза ошибочно спаренных оснований ДНК MutH Эндонуклеаза ошибочно спаренных оснований очень коротких пэтчей (G-T-специфическая) Транспортная АТФаза Mg(2+) белок C Соактиватор экспрессии гена профага IbrA Малая субъединица фаговой терминазы Белок инициации репликации фага тРНК-Ala тРНК-Arg тРНК-Asn тРНК-Asp тРНК-Cys тРНК-Gln тРНК-Glu тРНК-Gly тРНК-His тРНК-Ile тРНК-Leu тРНК-Lys тРНК-Met тРНК-Phe тРНК-Pro тРНК-Ser тРНК-Thr тРНК-Trp тРНК-Tyr тРНК-Val Белок биогенеза цитохром с-типа DsbD, белок дисульфидредуктаза (EC 1.8.1.8) Переносчик глицин-бетаина OpuD Белок HtrA протеаза/шаперон Бета-лактамаза класса C и другие пенициллинсвязывающие белки L2-6 Фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамид-риботидизомераза (EC 5.3.1.16) АТФ-фосфорибозилтрансфераза (EC 2.4.2.17) Регуляторная субъединица АТФ-фосфорибозилтрансферазы (EC 2.4.2.17) Гистидинолдегидрогеназа (EC 1.1.1.23) Гистидинофосфат-аминотрансфераза (EC 2.6.1.9) Субъедининца имидазолглицеролфосфат-синтазы - амидотрансферазы (EC 2.4.2.-) Субъедининца имидазолглицеролфосфат-синтазы - циклазы (EC 4.1.3.-) Имидазолглицеролфосфат-дегидратаза (EC 4.2.1.19) Целлобиозофосфорилаза (EC 2.4.1.-) Цитратсинтаза (si) (EC 2.3.3.1) N-Ацетилмурамоил-L-аланин-амидаза (EC 3.5.1.28) Эпимераза NAD(P)HX Алкогольдегидрогеназа (EC 1.1.1.1) Изоцитратдегидрогеназа [NADP] (EC 1.1.1.42) Рекомбинантный белок ингибитор MutS2 Фосфат:ацил-ACP ацилтрансфераза PlsX Репрессор CsoR оперона copZA Система транспорта C4-дикарбоксилата TRAP-типа, малый компонент пермеаза M212 Предполагаемая тРНК-m1A22-метилаза Портальный белок фага SL3/3 АТФ-зависимая геликаза CPE1197 семейства DinG Альфа-аспартил-дипептидаза пептидаза E (EC 3.4.13.21) A2-165 Бета-глюкозидаза (EC 3.2.1.21) Антитерминатор оперона бета-глюкозида bgl, семейство BglG Транспортер мальтозы/мальтодекстрина ABC, белок пермеаза MalF Транспортер мальтозы/мальтодекстрина ABC, белок пермеаза MalG Глицеролкиназа (EC 2.7.1.30) Тирозиновая протеинкиназа EpsD (EC 2.7.10.2) Трансмембранный модулятор тирозиновая протеинкиназа EpsC Альфа-D-GlcNAc-альфа-1,2-L-рамнозилтрансфераза (EC 2.4.1.-) Система транспорта TRAP-типа, малый компонент пермеаза, прогнозированный транспортер N-ацетилнейрамината Определяющий форму стержня белок RodA РНК-связывающий белок Jag 3,4-Дигидрокси-2-бутанон-4-фосфат-синтаза (EC 4.1.99.12) 5-Амино-6-(5-фосфорибозиламино)урацил-редуктаза (EC 1.1.1.193) 6,7-Диметил-8-рибитиллюмазин-синтаза (EC 2.5.1.78) Диаминогидроксифосфорибозиламинопиримидин-деаминаза (EC 3.5.4.26) GTP-циклогидролаза II (EC 3.5.4.25) Эубактериальная/эукариотная рибофлавин-синтаза (EC 2.5.1.9) Хромосомный белок разделения smc (2E,6E)-Фарнезилдифосфат-синтаза (EC 2.5.1.10) Диметилаллилтрансфераза (EC 2.5.1.1) Октапренилдифосфат-синтаза (EC 2.5.1.90) Липидный носитель: UDP-N-ацетилгалактозаминилтрансфераза (EC 2.4.1.-) Ферроксидаза (EC 1.16.3.1) Железосвязывающий ферритинподобный белок антиоксидант Неспецифический ДНК-связывающий белок Dps Супероксидредуктаза (EC 1.15.1.2) Регулятор транскрипции, семейство Crp/Fnr KLE1255 Ундекапренилфосфат-галактозофосфотрансфераза (EC 2.7.8.6) Белок-токсин YafQ Цепь D формиатдегидрогеназы (EC 1.2.1.2)

ПРИМЕР 5

Оценка синергетического действия

Для того, чтобы оценить синергетическое действие, используют совместную культуру из примера 1. Как альтернативу, штамм F. prausnitzii FBT-22 (DSM 32186) из примера 2 культивируют совместно со штаммом D. piger FBT-23 (DSM 32187) из примера 3 в среде postgate в строгих анаэробных условиях.

Среда Postgate содержит (г/л) дикалийфосфат: 0,5 г; хлорид аммония: 1; лактат натрия: 3,5; дрожжевой экстракт: 1; аскорбат: 0,1; цистеин: 0,5; хлорид натрия: 1; пептон: 10; сульфат натрия: 1; хлорид кальция дегидрат: 1; сульфат магния: 2; гептагидрат сульфата железа(2): 0,5. Сульфат натрия, гептагидрат сульфата магния, хлорид кальция дегидрат автоклавируют по отдельности, в то время как гептагидрат сульфата железа(2) стерилизуют фильтрацией, фильтр 0,22 мкм, и добавляют после автоклавирования и смешивания всех компонентов. Конечный рН среды доводят 1 N NaOH или 1 N HCl до 7,2±0,2.

Среду автоклавируют при 100 кПа при 121°С в течение 15 мин.

Это приводит к следующим данным (таблица 2), иллюстрирующим синергетическое действие штаммов при продуцировании бутиратов.

Таблица 2. Кратность изменений в профиле жирных кислот

Формиат Ацетат Бутират Лактат Чистая PGM 1 1 1 1 D. piger (D. p) FBT-23 0,8 118,5 1,1 0 F. prausnitzii (F. p) FBT-22 0,9 1,4 7,1 1,1 F. p FBT-22+D. p FBT-23 0,8 122,7 25,2 0

ПРИМЕР 6

Получение продукта, содержащего оба штамма

В настоящем исследовании авторы изобретения отдельно вырастили штамм F. prausnitzii FBT-22 (DSM 32186) и штамм D. piger FBT-23 (DSM 32187) в PGM в строгих анаэробных условиях.

PGM содержит (г/л) дикалийфосфат: 0,5 г; хлорид аммония: 1; лактат натрия: 3,5; дрожжевой экстракт: 1; аскорбат: 0,1; цистеин: 0,5; хлорид натрия: 1; пептон: 10; сульфат натрия: 1; хлорид кальция дегидрат: 1; сульфат магния: 2; гептагидрат сульфата железа(2): 0,5. Сульфат натрия, гептагидрат сульфата магния, хлорид кальция дегидрат автоклавируют по отдельности, в то время как гептагидрат сульфата железа(2) стерилизуют фильтрацией, фильтр 0,22 мкм, и добавляют после автоклавирования и смешивания всех компонентов. Конечный рН среды доводят 1 N NaOH или 1 N HCl до 7,2±0,2.

Среду автоклавируют при 100 кПа при 121°С в течение 15 мин.

После врастания бактерий в стационарную фазу клетки промывают в дистиллированной воде и затем концентрируют с использованием центрифуги для чувствительного материала. Полученную суспензию каждого штамма измеряют в аликвотах, содержащих 1 E+9 КОЕ, и затем смешивают друг с другом в отношении 1:1. Затем продукт хранят в 20% глицерине и держат при -80°C.

ПРИМЕР 7

Метаболические профили типичного штамма Faecalibacterium prausnitzii A2-165 (DSM 17677) и Faecalibacterium prausnitzii FBT-22 (DSM 32186) в физиологически релевантной среде LYBHI

Детальные метаболические профили штаммов Faecalibacterium prausnitzii отображены на фигуре 1 и фигуре 2. Из вышеуказанных фигур очевидно, что при ферментации глюкозы F. prausnitzii может продуцировать бутират как основной SCFA и потребляет ацетат. Кроме того, эти бактерии продуцируют лактат, формиат и ацетат.

Сравнительные метаболические профили типичного штамма Faecalibacterium prausnitzii A2-165 (DSM 17677) и Faecalibacterium prausnitzii FBT-22 (DSM 32186) в физиологически релевантной среде LYBHI показывают, что эти две бактерии являются метаболически различными (кратность изменения SCFA показана в таблице 3). Потребление глюкозы и продуцирование бутирата при сравнении почти схожие, однако два штамма различаются по продуцированию лактата (фигура 3).

Состав физиологически релевантной среды для выращивания LYBHI:

среда LYBHI (среда из сердечно-мозговой вытяжки с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта) (Oxoid, UK) с добавлением 1 мг/мл целлобиозы (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland), 1 мг/мл мальтозы (Sigma-Aldrich) и 0,5 мг/мл цистеина (Sigma-Aldrich).

Полные углеродный и электронный балансы приводятся в таблице 4.

ПРИМЕР 8

Метаболические профили монокультуры и сокультуры типичного штамма Faecalibacterium prausnitzii A2-165 (DSM 17677) и штамма Desulfovibrio piger FBT-23 (DSM 32187) в среде LYBHI

Синергетическое действие типичного штамма Faecalibacterium prausnitzii A2-165 и штамма Desulfovibrio piger FBT-23 оценивают в среде LYBHI (состав описан в примере 7).

Как видно на фигуре 2, лактат, продуцированный F. prausnitzii, используется D. piger как донор электронов, и vice versa, ацетат, генерированный D. piger, может быть использован F. prausnitzii для продуцирования бутирата.

В среде LYBHI в условиях сокультивирования продуцирование бутирата повышено в 1,5 раза, и продуцирование лактата снижено в 2,3 раза (фигура 4, таблица 3). Это показывает благоприятное действие сокультуры/перекрестного питания, т.е., повышенное продуцирование бутирата.

Полные углеродный и электронный балансы приводятся в таблице 4.

ПРИМЕР 9

Метаболические профили монокультуры и сокультуры Faecalibacterium prausnitzii FBT-22 (DSM 32186) и штамма Desulfovibrio piger FBT-23 (DSM 32187) в среде LYBHI

Синергетическое действие Faecalibacterium prausnitzii FBT-22 и штамма Desulfovibrio piger FBT-23 оценивают в среде LYBHI (состав описан в примере 7).

В среде LYBHI в условиях сокультивирования продуцирование бутирата повышается в 2,1 раза, и накопление лактата снижается в 2 раза (фигура 5, таблица 3). Это показывает, что имеет место перекрестное питание и синергетическое действие.

Полные углеродный и электронный балансы приводятся в таблице 4.

Таблица 3. Кратность изменения SCFA изолята Faecalibacterium prausnitzii и типичного штамма A2-165 в физиологически релевантной среде для роста из сердечно-мозговой вытяжки (LYBHI). Данные иллюстрируют синергетическое действие различных штаммов при продуцировании бутирата

Бутират Ацетат Лактат Чистая среда LYBHI 1,0 1,0 1,0 D. piger FBT-23 (D. p) 1,0 3,5 0,4 F. prausnitzii FBT-22 (F. p) 4,2 0,0 14,1 F.p+D.p 7,5 1,8 7,1 Типичный штамм F. prausnitzii (F. p A2165) 5,0 0,0 8,8 F.p A2-165+D.p 6,8 0,0 3,8

Таблица 4. Углеродный и электронный баланс монокультуры, сокультур Faecalibacterium prausnitzii FBT-22 (DSM 32186), Faecalibacterium prausnitzii A2-165 (DSM 17677) и штамма Desulfovibrio piger FBT-23 (DSM 32187).

Выход углерода и электронов Среда для роста, бакт. штаммы и их соответств. комбинации Бутират Лактат Формиат Ацетат Глюкоза % Число углерода (C) /моль 4 3 1 2 6 Выход Число электронов (e^-)/ моль 20 12 2 8 24 Среда BHI F. prausnitzii A2-165 (DSM 17677) мM 9,9 29,8 0,0 0,0 -14,6 мM C 40 89 0 0 -88 141 мM e^- 198 357 0 0 -351 158 F. prausnitzii A2-165 (DSM 17677)+D. piger FBT-23 (DSM 32187) мM 14,6 12,6 3,2 0,0 -15,0 мM C 58 38 3 0 -90 110 мM e^- 292 151 6 0 -360 125 F. prausnitzii FBT-22 (DSM 32186) мM 7,8 48,3 0,0 0,0 -15,0 мM C 31 145 0 0 -90 196 мM e^- 156 579 0 0 -360 204 F. prausnitzii FBT-22 (DSM 32186)+D. piger FBT-23 (DSM 32187) мM 16,5 24,1 0,0 0,0 -15,0 мM C 66 72 0 2 -90 151 мM e^- 329 289 0 10 -360 169

Предложенная группа изобретений относится к биотехнологии. Предложено применение бактерий штамма Faecalibacterium prausnitzii и бактериального штамма Desulfovibrio piger для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом бактерий Faecalibacterium prausnitzii, применение штамма Desulfovibrio piger при лечении или предупреждении заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями бутирата, где указанный штамм Desulfovibrio piger имеет одну или несколько из характеристик из: (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов и где указанный штамм Desulfovibrio piger повышает продукцию бутирата в желудочно-кишечном тракте посредством синергетического действия штаммов Desulfovibrio piger и Faecalibacterium prausnitzii, композиция для лечения предупреждения заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями бутирата, или заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом бактерий Faecalibacterium prausnitzii, включающая штамм Faecalibacterium prausnitzii и бактериальный штамм Desulfovibrio piger и набор, содержащий Faecalibacterium prausnitzii и Desulfovibrio piger, Группа изобретений позволяет повысить рост и колонизацию бактерий штамма Faecalibacterium prausnitzii. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 5 ил., 4 табл., 8 пр.

1. Применение штамма Faecalibacterium prausnitzii и бактериального штамма Desulfovibrio piger для повышения роста и колонизации бактерий Faecalibacterium prausnitzii в желудочно-кишечном тракте, где указанный бактериальный штамм Desulfovibrio piger имеет одну или несколько характеристик из: (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов, и где повышение роста и колонизации бактерий Faecalibacterium prausnitzii в желудочно-кишечном тракте является синергетическим действием указанных двух штаммов в результате присутствия бактериального штамма Desulfovibrio piger, и где применение указанных двух штаммов повышает уровни бутирата в желудочно-кишечном тракте.

2. Применение штамма Faecalibacterium prausnitzii и бактериального штамма Desulfovibrio piger для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом бактерий Faecalibacterium prausnitzii, где указанный бактериальный штамм Desulfovibrio piger имеет одну или несколько характеристик из: (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов и где повышение роста и колонизации бактерий Faecalibacterium prausnitzii в желудочно-кишечном тракте является синергетическим действием указанных двух штаммов в результате присутствия бактериального штамма Desulfovibrio piger.

3. Применение штамма Faecalibacterium prausnitzii и бактериального штамма Desulfovibrio piger для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями бутирата в желудочно-кишечном тракте, где указанный бактериальный штамм Desulfovibrio piger имеет одну или несколько характеристик из: (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов, где применение указанных двух бактериальных штаммов повышает уровни бутирата в желудочно-кишечном тракте и где повышение уровня бутирата в желудочно-кишечном тракте является синергетическим действием указанных двух штаммов в результате присутствия бактериального штамма Desulfovibrio piger.

4. Применение по любому из пп.1-3, где указанные штаммы вводят вместе в комбинации или последовательно, или раздельно.

5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный штамм имеет все характеристики (i)-(iii).

6. Применение по любому из пп. 1-5, где указанный штамм Faecalibacterium prausnitzii имеет (i) способность продуцировать бутират и, необязательно, одну или несколько характеристик из (ii) способности потреблять ацетат, (iii) способности продуцировать внеклеточные электроны и (iv) способности продуцировать лактат.

7. Применение по п.5 или 6, где указанный штамм Faecalibacterium prausnitzii имеет все характеристики (i)-(iv) и/или указанный штамм Desulfovibrio piger имеет все характеристики (i)-(iii).

8. Применение по любому из пп. 1-7, где указанный штамм Faecalibacterium prausnitzii содержит ген L-лактатдегидрогеназы.

9. Применение по любому из пп. 1-8, где, когда присутствуют оба штамма, продуцирование бутирата возрастает по сравнению с продуцированием одним штаммом Faecalibacterium prausnitzii.

10. Применение по п.9, где действие по возрастанию продуцирования бутирата является синергетическим действием.

11. Применение по любому из пп. 1-10, где указанный штамм Faecalibacterium prausnitzii представляет собой DSM 32186 или DSM 17677 и/или штамм Desulfovibrio piger представляет собой DSM 32187.

12. Применение по любому из пп. 1-11, где указанное применение приводит к повышенному росту и колонизации бактерий Faecalibacterium prausnitzii в желудочно-кишечном тракте.

13. Применение по любому из пп. 1-12, где указанное заболевание выбирают из группы, включающей дисбиоз, диабет типа 2, гестационный диабет, ожирение, подагру, паучит, хроническую болезнь почек, псориаз, немощь, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника, абдоминальную боль, ассоциированную с синдромом раздраженного кишечника, констипацию и заболевания, ассоциированные с констипацией.

14. Применение по п.13, где указанное заболевание представляет собой диабет типа 2 или гестационный диабет.

15. Применение штамма Desulfovibrio piger при лечении или предупреждении заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями бутирата, где указанный штамм Desulfovibrio piger имеет одну или несколько из характеристик из: (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов и где указанный штамм Desulfovibrio piger повышает продукцию бутирата в желудочно-кишечном тракте посредством синергетического действия штаммов Desulfovibrio piger и Faecalibacterium prausnitzii.

16. Применение штамма Desulfovibrio piger при лечении или предупреждении заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом бактерий Faecalibacterium prausnitzii, где указанный штамм Desulfovibrio piger имеет одну или несколько характеристик из: (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов и где указанный штамм Desulfovibrio piger повышает рост и колонизацию бактерий Faecalibacterium prausnitzii посредством синергетического действия штаммов Desulfovibrio piger и Faecalibacterium prausnitzii.

17. Применение по п.15 или 16, где указанный штамм Desulfovibrio piger представляет собой DSM 32187 и/или указанное применение определено в любом из пп. 12-14.

18. Композиция для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с пониженными уровнями бутирата, или заболевания, ассоциированного с пониженным или низким числом бактерий Faecalibacterium prausnitzii, включающая штамм Faecalibacterium prausnitzii и бактериальный штамм Desulfovibrio piger, который имеет одну или несколько характеристик из (i) продуцирования ацетата, (ii) потребления лактата и (iii) наличия способности быть акцептором электронов.

19. Композиция по п.18, где указанные штаммы являются штаммами, определенными в любом из пп. 3-10.

20. Набор, включающий

(i) штамм Faecalibacterium prausnitzii и

(ii) бактериальный штамм Desulfovibrio piger, который имеет одну или более из характеристик: (i) продуцирование ацетата, (ii) потребление лактата и (iii) наличие способности быть акцептором электронов,

где указанный набор повышает рост и колонизацию бактерий Faecalibacterium prausnitzii или продукцию бутирата в желудочно-кишечном тракте посредством синергетического действия между указанными штаммами.

21. Набор по п.20, где указанные штаммы являются штаммами, определенными в любом из пп. 3-10.